다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

Developmental Biology
 

Summary

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

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Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (123), e55587, doi:10.3791/55587 (2017).

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Abstract

심근 세포는 이제 인간 배아 및 인간 유래 다 능성 줄기 세포 (hPSC) 모두로부터 높은 효율로 유도 될 수 있습니다. hPSC- 유도 된 심근 세포 (hPSC-CMs)는 인간의 심혈관 질환, 특히 부정맥 증후군을 모델링하는데 큰 가치를 갖는 것으로 점차 인식되고있다. 그들은 약물 반응을 예측하기위한 시험 관내 시스템과의 관련성을 보여 주었고, 이는 약물 스크리닝 및 발견, 안전 약리학 및 아마도 개인화 된 약에 유용 할 수있다. 이것은 hiPSCs로서 환자 또는 감수성이있는 개체로부터 hPSC-CM을 유도함으로써 촉진 될 것이다. 그러나 모든 응용 분야에서 hPSC-CM 전기적 특성에 대한 정확한 측정 및 분석은 심장 이온 채널 돌연변이 및 / 또는 이온 채널을 목표로하는 약물로 인한 변화를 확인하고 갑작스런 심장사를 유발할 수있는 필수 요소입니다. 수동 패치 클램프에 비해 다중 전극 배열 (MEA) 장치는중 ~ 고 처리량 레코딩이 가능합니다. 이 프로토콜은 hPSC-CM의 2D 세포 배양을 작은 응집체 및 단일 세포로 분리하고 자발적 전기 활동을 현장 잠재력으로 기록하기 위해 MEA에 플레이트하는 방법을 설명합니다. QT 및 RR 간격과 같은 특정 매개 변수를 추출하기 위해 기록 된 데이터를 분석하는 방법도 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 매개 변수의 변화는 심 부정맥을 담당하는 돌연변이를 가지고있는 hPSC-CM 및 특정 약물의 첨가에 따라 심장 독성 위험을 가진 사람의 검출을 허용 할 것으로 예상됩니다.

Introduction

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)는 분화를 통해 인체의 모든 세포 유형을 자체 갱신하고 생성 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. hPSC를 여러 개의 심혈 관계 (심실, 심방, 심박동기 같은 심근 세포)로 분화시키는 방법에 대한 자세한 프로토콜은 3 , 4 , 5 , 6 , 7에 설명되어 있습니다. Cardiomyocytes는 전기적으로 활성 세포이며 그들의 electrophysiological 활동에 대한 자세한 지식은 심장 발달과 질병 8 이해에 매우 유익한 수 있습니다. 환자 특정 hiPSC 유래 cardiomyocytes (hiPSC-CMs)는 긴 QT 증후군을 포함하여 몇몇 심장 부정맥의 세포질, 분자 및 전기 특징을 만들고 공부하기 위하여 성공적으로 이용되었습니다(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugada 증후군 14 및 카테콜아민 성 다형성 심실 빈맥 15,16 . 또한 치료 적 개입을 되풀이하고 세포 병리학 적 표현형 10 , 15 , 20 , 21 , 22 를 구제하기 위해 병에 걸린 hiPSC-CM에 여러 약물이 추가되었습니다. 보다 최근에 WT hiPSC-CM을 기반으로 한 스크리닝 플랫폼이 인간의 시스템이 약물 발견의 초기 단계 인 23 , 24 , 25 의 필요성에 대응하여 개발되었다. 설치류의 심근 세포는 hu이온 채널 표현과 생물 물리학에 능숙 26 .

이를 위해 중 ~ 고 처리량 응용에 적합한 기술을 개발하고 구현하고 있습니다. 여기에는 막 전위, Ca 2+ 과도 현상 및 변형의 광학 기록, 임피던스 측정 (세포 수축성의 간접 측정) 및 세포 외 필드 전위 (FP) 측정이 포함됩니다 (참고 자료 24 참조). Multi-electrode Arrays (MEA) 장치는 단층 또는 심근 세포의 작은 클러스터에 의해 생성되고 형성되는 전기적 파형 신호 (또는 FP)를 기록 할 수 있습니다. FP 윤곽은 심장 활동 잠재력 및 심전도 (ECG) 기록 27 과 어느 정도 일치합니다. 그들은 전형적으로 Na + 유입 및 막 탈분극 (R / Q 피크)에 대응하는 초기 급속 상향 행정을 나타내며, 느린 파 / 고원 위상은 Ca2+ 유입 및 우세한 K + 유출 (T 피크)에 상응하는 재분극 단계를 포함한다. FP 파형의 섭동은 특정 활동 전위 단계의 변화와 상관 관계가 있습니다 28 .

upstroke 속도와 resting 막 잠재력과 같은 매개 변수에 대한 action potential의 patch clamp 기록은보다 유익 할 수 있지만, 중간 및 높은 처리량 규모의 실험에서는 수작업 측정이 불가능하며 자동화 된 패치 클램프는 최근 hPSC에만 적용되었습니다 -CM 29 . 그러나 MEA에 대한 장기간의 기록으로 인해 화합물에 대한 급성 및 만성 노출을 연구 할 수 있으므로 hPSC-CM 플랫폼을 약물 스크리닝, 발견 24 , 30 및 안전 약리학 31 , 32에 사용할 수 있습니다. 이것은 미래의 정밀도 또는 perso의 약속을 유지합니다.처방 된 약 33 .

이 프로토콜의 목적은 MEA 칩에 hPSC-CM을 분리 및 도금하고 FP를 측정하는 데 필요한 정보를 제공하는 것입니다. 이 절차에서는 각 단계가 최적화되어 해리 후 최적의 세포 생존 및 회복, MEA 플레이트에 대한 최적의 세포 부착 및 매개 변수의 표준 분석 및 정량화를 보장합니다. 특히, 세포 외 FP 기록, QT 및 RR 간격 분석, 약물 효과 평가에 대한 절차가 설명되고 예시됩니다.

Protocol

1. 용액 및 시약의 준비

  1. 표 1 에 설명 된 시약을 결합하여 저 인슐린, 소 혈청 알부민, 폴리 비닐 알콜, 필수 지방 (LI - BPEL) 매체 34 , 35 , 36 을 사용하여 hPSC - CM 배양 배지를 준비합니다. 0.22 μm의 기공 필터를 통해 매체를 여과하고 최대 2 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
  2. -80 ° C에서 200 μg / mL 농도, 분액 및 저장소에 도달 멸균 증류수 5 ML에 인간 재조합 fibronectin의 1 MG를 재구성하여 인간 재조합 fibronectin 주식 솔루션을 준비하십시오.
  3. 1 g의 효소 세제 분말을 100 mL의 웜 (~ 40-45 ° C)에 녹여 마이크로 어레이 칩에서 잔류 세포를 제거 할 수 있도록 1 % (w / v) 효소 세제 용액 (재료 참조) 탈 이온수. 용액을 식히고 4 ° C에서 보관하십시오 f또는 최대 1 년.

2. MEA 칩의 멸균 (그림 1A)

참고 : MEA의 여러 가지 구성이 단일 또는 다중 우물 형식으로 제공됩니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 8 x 8 격자 배열로 60 개의 기록 전극을 포함하는 단일 챔버 MEA를 사용합니다 (재료 참조). 전극 직경은 30 μm, 전극 간 거리는 200 μm입니다. 하나의 기준 전극도 존재한다.

  1. 탈 이온수로 칩을 완전히 헹굽니다.
  2. 오토 클레이브 수있는 유리 페트리 접시 안에 MEA 칩을 넣어. 알루미늄 호일로 접시를 싸십시오.
  3. 실험실 압력솥에서 칩을 6 분 동안 소독하십시오. 개봉하기 전에 식기가 식도록하십시오.
    참고 : 또는 칩을 실온에서 15-30 분 동안 80 % (v / v) 에탄올 1 mL에 담그면 멸균 될 수 있습니다.
  4. 세포 배양 후드에 칩을 놓고표면을 약 30 분 동안 자외선에 노출시킵니다.

3. MEA 칩의 코팅 (그림 1B 및 1C)

  1. 표준 10cm Ø 플라스틱 무균 페트리 접시 안에 깨끗한 칩을 넣으십시오.
  2. 페트리 접시에 8 ML 멸균 증류수를 추가하여 가습기에 넣을 때 칩의 배양 매체의 작은 볼륨을 방지 할 수있는 가습 챔버를 형성하십시오.
  3. 전극 배열이있는 칩의 중앙에 심근 세포가 있는지 확인하기 위해 맞춤형 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 링 ( 그림 1B )을 사용하십시오. (PTFE 링은 이전에 80 % 에탄올에 저장되어 있습니다.) 배양 후드에서 에탄올에서 고리를 제거하고 뚜껑이없는 멸균 페트리 접시에 넣고 링을 후드에서 말리십시오.
  4. 화염 멸균 된 핀셋을 사용하여 하나의 MEA 칩 내부에 마른 링을 배치하십시오 ( 그림 1C ).
    참고 : 또는 핀셋을 씻고 80 % 에탄올을 사용하여 건조시킵니다.n 조직 배양 후드를 사용하기 전에.
  5. 인간 재조합 fibronectin 주식 (증류수 200 μg / ML)의 한 분량을 해동하고 40 μg / ML의 작업 솔루션을 얻기 위해 칼슘 2 + 및 MG 2 + 와 PBS에 희석. 링 내부에 40 μg / mL fibronectin 50 μL를 첨가하여 전극을 코팅하십시오.
    참고 : 인간 재조합 fibronectin을 이용한 코팅은 최적의 hPSC-CM 부착을 보장합니다. 그러나, 소의 피브로넥틴 또는 세포 외 기질 단백질 혼합물과 같은 다른 유형의 코팅 단백질이 사용될 수있다.
  6. 10cm Ø 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑을 닫고 조심스럽게 배양기에 MEA 칩이 들어있는 접시를 전송하십시오. 37 ° C에서 적어도 1 시간 동안 또는 4 ° CO / N에서 인큐베이션하십시오.
  7. MEA 칩이 들어있는 접시를 세포 배양 후드로 옮깁니다. MEA 칩을 사용하기 전에 P200 피펫 또는 PTFE 링을 변위시키지 않고 후드의 진공 시스템을 사용하여 50 μL의 피브로넥틴을 흡입하십시오. PLA 사용이 단계를위한 팁. 접시 내부에 단단한 물체 ( 예 : 피펫 팁)가 닿지 않도록하십시오. 그러면 전극이 손상 될 수 있습니다.
    참고 : 이렇게하면 MEA 칩의 수명이 연장됩니다.
  8. LI-BPEL 배지 ( 표 1 및 재료 참조) 950 μL를 부드럽게 첨가하여 균등하게 분포되고 링이 부풀지 않도록하십시오. 인큐베이터에 접시를 반납하십시오.

4. hPSC-CM 분리 및 도금 (그림 2)

참고 : 여기에 설명 된 프로토콜은 분화 시작 후 ~ 18 일 사이토킨 34 를 사용하여 단층 배양에서 분화 된 hPSC-CM을 사용합니다. 그러나 2D 및 3D hPSC-CM 문화에 적합한 것으로 입증되었습니다. 이전 또는 이후 시점에서 차별화 된 배양 물을 사용할 때, 해리 효소 ( 표 2 참조)의 배양 시간을 조절하는 것이세서리. 다음 부피는 12-well plate format (3.8 cm 2 )의 단일 well을 의미합니다.

  1. hPSC-CMs 배양 물에서 배지를 잘 뽑으십시오.
  2. 조직 문화 후드에서 일하는 동안, 문화를 씻어 칼슘 2 + / MG 2 + 없이 1-2 ML / 잘 PBS를 추가합니다. PBS를 대기음.
  3. 해리 효소 500 μL / 잘 추가합니다. 37 ° C에서 5 분 동안 품어 라.
  4. 효소를 희석하기 위해 1 mL의 LI-BPEL /를 잘 넣으십시오. 부드럽게 P1000 피펫을 사용하여 scratching하여 hPSC-CM의 단층을 분리하십시오. 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
  5. 남아있는 세포와 세포 덩어리를 모두 모으기 위해 1 mL LI-BPEL로 잘 헹구십시오.
  6. 5 ~ 6 ML의 최종 볼륨에 도달 LI - BPEL의 또 다른 2-3 ML을 추가하고 세포 덩어리를 해리하기 위해 5 ML 피펫으로 3-5x 위아래로 부드럽게 피펫.
    참고 : 세포 생존에 영향을 미치기 때문에이 시점에서 단일 세포로의 해리는 필요하지 않습니다. 작은 클러스터의 존재는높은 세포 생존 능력을 보장합니다.
  7. 300 X g에서 3 분 동안 실온에서 세포를 원심 분리한다.
  8. 잉여 액의 대부분을 제거하려고하지만 세포 펠렛을 제거하지 않고 상등액을 제거한다.
  9. 250 ㎕의 LI-BPEL에 세포 펠렛을 Resuspend (P1000을 사용하고 매우 부드럽게 pipetting).
  10. 전극 배열 상단에있는 PTFE 링의 중심에 직접 세포 현탁액을 pipetting하여 MEA 당 세포 현탁액 ~ 50 μL (최대 5 MEA까지 12 웰 플레이트 중 하나에서 준비 할 수 있음)를 분배하십시오.
    참고 :이 단계에서 세포는 세포 클러스터의 존재로 인해 계산하기가 어렵고 사용 된 hPSC-CM 소스에 따라 MEA 당 총 세포 수는 크게 달라질 수 있습니다. 도금을하는 동안 해리 된 세포 구름이 전극 영역을 덮고 있는지 확인하십시오.
  11. 조심스럽게 37 ℃에서 배양기로 MEA를 옮기고 세포가 O / N을 부착하도록하십시오.

5. 링 제거 및 중간 재신선도 (그림 3)

  1. 도금 후 1 일째, 살균 된 핀셋을 사용하여 살균 환경에서 링을 조심스럽게 제거하십시오 ( 그림 3A-3B ).
  2. 80 % (v / v) 에탄올로 링을 헹구고 신선한 80 % (v / v) 에탄올이 들어있는 50 mL 튜브에 보관하십시오.
  3. 부드럽게 MEA 칩에서 매체의 500 μL를 제거하고 신선한 LI - BPEL 500 μL를 추가합니다.
  4. 37 ℃에서 배양기로 MEA를 옮긴다.
    참고 : 세포는 반지 제거 및 중간 변화 ( 그림 3C ) 1-7 일 후에 치기 시작해야합니다.
  5. 링 제거 후 1 ~ 7 일 동안 MEA에서 hPSC-CM의 전기적 활동을 측정합니다.

6. 신호 품질 확인 (그림 4)

  1. 컴퓨터를 켜고 MEA 설정에 연결된 소프트웨어 제품군 (TCX-Control, MC_MEA Select 및 MC_Rack)을 실행하십시오. 생리 온도 측정을 기록하려면 TCX-Control에서 37 ° C로 온도를 설정하십시오.
  2. MEA 칩 f가 들어있는 접시를 꺼냅니다.창업 보육 센터에서. 뚜껑을 열고 MEA 칩을 꺼내고 티슈 위에 올려 놓아 잔여 물을 흡수합니다.
  3. 조심스럽게 접시의 외부 접촉부를 티슈로 닦고 100 % (v / v) 에탄올로 적신 면봉을 사용하여 신호 잡음을 유발할 수있는 잔여 물이나 이물질을 제거하십시오.
  4. MEA 플레이트를 가열 된 (37 ° C) 기록 헤드 스테이지로 옮겨 자발적인 활동을 감지하십시오 ( 예 : 하드웨어 : Table of Materials , 소프트웨어 : MC_Rack).
    1. MC_Rack 열기 : '편집'→ 'MC_Card 추가'를 클릭하여 새 프로토콜을 만듭니다. 프로토콜에 다른 레코더 및 디스플레이 창을 추가하려면 '편집'드롭 다운 메뉴를 사용하십시오.
      참고 : 적어도 10 kHz의 샘플링 주파수가 권장됩니다. 우리가 사용하는 프로토콜에는 전체 MEA 칩의 전체 레이아웃이있는 Longterm Display Tool과 마약 효과를 포착하기위한 필수 스파이크 분류기가 있습니다.n 실시간. Spike Cutout은 'Pre Trigger'가 20ms, 'Post Trigger'가 800ms, 'Dead Time'이 2ms로 조정됩니다. 실험을 시작하기 전에 프로토콜을 '.rck'파일로 저장하고 다시 불러올 수 있습니다.
  5. '재생'버튼을 클릭하여 재생 모드에서 프로토콜을 시작하십시오.
    참고 :이 시점에서 6.5 단계에서 저장된 프로토콜을 다시로드 할 수 있습니다. MC_Rack에서 '파일'→ '열기'를 클릭하여 프로토콜 (.rck 파일 확장명)을로드하십시오.
  6. 신호에 R 피크와 T 피크가 명확하게 보이는 경우에는 적응 단계를 완료하기 위해 10 ~ 15 분 정도 기다리십시오. 양호한 품질 추적과 나쁜 품질 추적의 예가 그림 4나와 있습니다.
    참고 : 전극에서 T 피크가 감지되지 않으면 실험을 진행하지 마십시오. 대개 이것은 hPSC-CM의 불량한 전기적 활동 또는 전극에 대한 세포의 부적절한 부착의 결과입니다.

7. 예를 시작하십시오.periment 및 녹음

  1. '기록'을 클릭 한 다음 '재생'을 클릭하고 기준 상태에서 10 분 동안 데이터를 수집하여 정상 상태를 결정합니다. 분석을 위해 나중에 쉽게 식별하고 내보낼 수 있도록 최상의 신호를 갖는 전극에 주석을 답니다.
  2. 약물 반응 평가를 위해 매 10 분마다 약물의 농도를 증가 시키십시오. 예를 들어, 1 μM의 최종 농도에서 hERG 차단제 E4031을 첨가하십시오. 이를 위해 배지 100 μL를 제거하고 배양액에 용해 된 10 μM E4031의 같은 부피를 첨가하십시오.
    참고 : 이전에 Cavero와 동료 31 에 의해 입증 되었 듯이, 약물 반응 곡선을 크게 바꿀 수 있기 때문에 약물이 용해되는 양을 현명하게 선택하는 것이 중요합니다.
  3. 관심있는 다른 모든 약물 농도에 대해 7.2 단계를 반복하십시오.
  4. 프로토콜의 끝에서 녹음을 마치려면 '중지'를 클릭하십시오.

8.재사용을위한 MEA 청소

  1. 실험 녹음이 끝나면 P1000 피펫으로 가볍게 꺼내십시오. 접시 내부를 만지지 마십시오. 전극이 손상 될 수 있습니다. 현지 안전 수칙에 따라 폐기하십시오.
  2. 세척 병을 사용하여 탈 이온수로 MEA 칩을 헹구고 3-4x 세척 단계를 반복합니다.
    참고 :이 시점에서 셀이 칩에서 완전히 분리 될 필요는 없습니다.
  3. 각 잘 효소 세제 솔루션 1 % (V / V) 1 ML을 추가하고 세포 분리 및 세포 제거를 허용 4 ° C에서 O를 품어.
  4. 하루 후, MEA 칩을 탈 이온수로 완전히 헹구어 효소 세제 용액과 잔여 세포를 제거하고 1 mL의 탈 이온수를 첨가합니다. Clean MEA 칩은 4 ° C의 탈 이온수에 담가 보관할 수 있습니다.

9. 데이터 내보내기

  1. MEA 설정에 연결된 MC_Data Tool 소프트웨어를 엽니 다.
  2. '파일'→ 'MC 열기'를 클릭하십시오.디'.
  3. '도구'→ 'MCD를 ABF로 변환'을 클릭하십시오 .
  4. 분석을 위해 내보낼 최상의 녹음 신호가있는 전극을 선택하십시오. 내 보낸 파일을 저장할 디렉토리를 선택하고 '저장'을 클릭하십시오. 수출 절차는 수출 된 전극의 수와 기록 파일의 총 크기에 따라 수 분이 소요될 수 있습니다.

10. 데이터 분석

  1. 전기 생리학 데이터 수집 및 분석 프로그램 ( 예 : pClamp)을 다운로드하여 설치하십시오. 완료되면 분석 소프트웨어 ( 예 : Clampfit)를 실행하십시오.
  2. RR 간격 계산 (그림 5).
    1. 두 개의 수직 커서를 배치하여 추적 영역에서 관심 영역을 정의하십시오. '이벤트 감지'→ '임계 값 검색'을 선택하십시오. 수평 커서는 그림 5A 와 같이 정량화되어야하는 모든 이벤트를 교차해야합니다.
    2. 클릭 &# 39 OK '를 선택한 다음'전체 범주 수락 '을 선택하십시오. 그런 다음 소프트웨어는 추적을 통해 모든 적합한 이벤트를 검색합니다. 이벤트 위에 파란색 표시가 있습니다.
    3. 기본 이벤트 감지 창에서 매개 변수를 조정하여 자동 선택의 감도를 조정하십시오.
    4. 모든 이벤트가 자동으로 식별되면 결과 창 (창 → 결과)으로 이동하여 빈도 데이터가 포함 된 "간섭 간격"열을 복사하십시오 ( 그림 5B ).
  3. QT 간격 계산 (그림 6-9) :
    1. 정상 상태에서 하나의 FP 바로 앞에 하나의 커서를 놓습니다. '이벤트 감지'→ '템플릿 생성'을 선택하십시오 ( 그림 6 ) .
    2. FP가 올바르게 식별되었는지 확인하고 '추가'를 클릭하십시오. 템플릿이 하단 패널으로 이동합니다.
    3. 템플릿을 '.atf'파일로 저장하십시오.파일. 이러한 방법으로 전체 레코딩 동안 소프트웨어가 검색 할 템플릿 추적이 생성되었습니다 ( 그림 7 ). 약물 효과로 인해 FP의 모양이 변경 될 수 있으므로 각 조건에 대해 하나의 템플릿을 만듭니다. 필요한 경우 두 개의 커서 내에 최대 10.000 포인트를 포함하도록 추적을 약간 필터링하십시오.
    4. 템플릿이 '.atf'확장자로 저장되면 '이벤트 감지'→ '템플릿 검색'을 선택하고 템플릿을로드합니다.
    5. 선택한 간격의 모든 FP를 정확하게 식별하려면 "템플리트 일치 임계 값"을 조정하십시오.
    6. 모든 이벤트가 올바르게 식별되면 새로운 '.abf'파일에 저장하십시오.
  4. 분석 소프트웨어로 파일을 열고 Q / R과 T 피크 모두에 대해 '피크 시간'을 자동으로 계산하십시오 ( 그림 8, 9 ). 흔적이 매우 시끄 럽다면 필터를 적용하십시오. QT 간격을 계산하여 QT 간격을 계산하십시오.선택한 스프레드 시트 편집기에서 T 값의 Q / R 값

Representative Results

해리와 도금 후 하루가 지나면 hPSC-CM 층이 MEA 챔버의 중심을 덮는 고밀도의 흰색 필름으로 보입니다 ( 그림 3A ). 링을 제거한 후에 ( 그림 3B ),   층은 제 위치에 있어야하고 광학 현미경 검사는 (계약) hPSC-CM 층 ( 그림 3C )으로 덮인 MEA 전극을 보여줍니다. 세포의 물리적 및 전기적 결합으로 인해 하나의 전극 (황금 전극) 만 분석에 사용됩니다.

또는 배아 체 또는 미세 조직과 같은 3D 구조로 작업 할 때 이들을 도금하여 물리적 및 전기적으로 연결을 해제 할 수 있습니다. 현미경에서의 육안 검사는 클러스터 간의 물리적 연결이 없음을 확인할 수 있었고 MEA에서의 비 동기화 된 R 파는 전기적 결합을 확인하지 못했습니다. 이 c여러 독립 전극을 분석 할 수 있습니다.

FP 트레이스의 일반적인 기록은 그림 4나와 있습니다. 특히, 좋은 양질의 흔적은 Na + 유입 및 막 탈분극 (R / Q 피크), K + 유출 (T 피크)에 해당하는 명확한 재분극 단계 및 높은 신호 대 잡음비 ( 그림 4A , 왼쪽 : Y 축 스케일 및 그림 4B 참고 ). 나쁜 품질의 흔적 ( 그림 4A , 중간)은 hPSC-CM이 MEA 판이나 약한 hPSC-CM 전기 활동에 부착하지 못한 결과 일 수 있습니다. 더 나은 부착을 위해 1-3 일을 기다리면 신호가 개선 될 수 있습니다. 그러나 신호 개선이 보이지 않으면 실험에서이 MEA를 제외하는 것이 좋습니다. 노이즈 필터링 ( 그림 4A , 오른쪽)은 필터링 후 분석 될 수 있습니다.

그림 5A, 5B )이 표시된 화면을 육안으로 검사하여 식별 할 수 있습니다. 수직 커서에 의해 정의 된 시간 간격 내에 각 피크에 해당하는 파란색 표시가 있어야합니다. 프로그램에서 하나 이상의 피크를 식별하지 못하면 수평 커서를 이동하고 분석을 다시 실행하거나 탐지 설정을 조정하십시오. 마찬가지로, QT 간격의 성공적인 분석은 FP 검출을 보여주는 화면의 육안 검사 ( 그림 7 )로 확인할 수 있습니다. 수직 커서에 의해 정의 된 시간 간격 내에서, 각 FP 검출에 대응하는 청색 마크가 존재해야한다. 프로그램이 하나 이상의 FP를 식별하지 못하는 경우 FP 템플릿을 재정의하거나 ( 그림 6 ) 탐지 설정을 조정하고 분석을 다시 실행하십시오.

추출 된 개별 FP 추적 또는 그 평균 ( Figure 8)은 그림 9 에서와 같이 특정 설정으로 QT 간격 값을 얻는 데 사용할 수 있습니다. QT-RR 관계의 분석은 병 및 WT hPSC 계통 ( 그림 10A ) 및 QT 간격 보정의 필요성 및 / 또는 효과를 평가하는 데 의미가 있으며 ( 그림 10B-10D ) 의미가 있습니다. LPS를 유발하는 돌연변이가있는 hPSC-CM은 WT 대조군에 비해 QT 간격이 연장되었다 ( 그림 11A ). hERC 차단제로 hPSC-CM을 처리하면 QT 간격이 연장됩니다 ( 그림 11B ). 반대로, hERG 활성화 제로 치료하면 QT 간격이 짧아집니다 ( 그림 11C ). 마지막으로, hPSC-CM의 치는 빈도에 영향을 미치는 약물 치료는 RR 간격의 변화로 볼 수 있어야한다 ( 그림 11D , RR 간격 단축).

그림 1 />
그림 1 : MEA 칩의 살균 및 코팅. ( A ) MEA 칩을 오토 클레이브 가능한 유리 페트리 접시에 넣고 알루미늄 호일로 싸서 6 분 동안 찌기, 30 분간 UV에 노출시키는 것을 포함한 멸균 과정을 나타내는 계획. ( B ) 사용자 정의 PTFE 링의 위쪽 (왼쪽 패널) 및 측면 (중간 패널) 뷰. 링은 1.2cm의 외경을 가지며 MEA 칩 중앙에 위치 할 수있는 4 개의 플랩과 내경 0.4cm (오른쪽 패널)를 포함합니다. ( C ) 표준 플라스틱 페트리 접시에 칩을 배치하고, MEA 챔버 외부에 8 mL의 탈 이온수를 첨가하고, 챔버의 중간에 PTFE 링을 위치시키고, 피브로넥틴으로 전극 어레이를 코팅하는 것을 포함하는 MEA 칩의 제조를 나타내는 개략도 . 배양 시간 후, 피브로넥틴을 제거하고 배양 배지로 대체한다.t = "_ blank">이 그림의 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : hPSC-CM의 해리 및 도금. hPSC-CM 효소 해리, 원심 분리, 재현 탁 및 MEA 챔버의 중앙에 도금 과정을 나타내는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : hPSC-CM 레이어가있는 MEA 칩 ( A ) 고리와 hPSC-CM 층을 포함하는 MEA 칩의 평면도. 링 제거 후의 MEA 칩의 측면도 ( B ). ( C ) 마이크로 - 표면에 도금 된 hPSC-CM 층의 명 시야 이미지.전극 배열; 배율 4 배. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : hPSC-CM의 MEA 기록. ( A ) MEA로 기록 된 대표적인 흔적은 R / Q 및 T 피크가 높은 신호 대 잡음비 (왼쪽)와 명확하게 보이는 R / Q 및 T 피크 (중간)가없는 품질이 좋지 않은 흔적, R / Q 및 T 피크가 명확하게 보이지만 신호 대 잡음 비율이 낮은 잡음이있는 추적 (오른쪽). ( B ) hPSC-CM을 사용하여 MEA 실험 중에 기록 될 수있는 상이한 형태의 우수한 품질의 FP 추적의 대표적인 예. 음영 영역은 분석 중에 측정 된 QT 간격을 나타냅니다. MEA의 FP는 첫 유도체e를 사용하여, 우리는 적색 점선으로 도시 된 FP 트레이스의 적분을 완전한 동작 전위 재분극에 가까운 T 파 선택의 이론적 증명으로 계산했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : RR 간격 계산. ( A ) 분석 소프트웨어 (Table of Materials 참조)를 사용하여 자동 피크 검출 (상단)과 데이터 추출 (하단)으로 RR 간격 분석의 예. 수직 커서는 관심있는 시간 간격을 식별하고 수평 커서는 파란색 표시로 감지되고 식별되는 모든 이벤트를 교차시킵니다. ( B ) 확대 된 열은 RR 간격을 계산하기 위해 사용 된 추출 된 데이터를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : FP 템플릿 생성. 단일 FP 전후에 세로 커서를 사용하여 템플리트 선택 예제. 이 템플릿은 FP 자동 식별에 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7 : FP 템플릿 자동 식별. 두 개의 수직 커서에 의해 정의 된 간격을 통한 템플리트 검색 예제. 감지 된 모든 이벤트는 파란색 표시로 식별되며 자동으로 전체 이벤트입니다.y는 인세 트에 겹쳐있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8 : FP 매개 변수의 정량화. 첫 번째 두 커서 내에서 수동으로 식별 된 R 피크와 마지막 두 커서 내에서 수동으로 식별 된 T 피크를 사용하여 저장된 이벤트 분석 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
그림 9 : 분석 창. R 피크를 검출하기 위해 통계 창에서 사용되는 매개 변수. T 피크의 검출을 위해서, 커서와 (필요한 경우) po를 변경하십시오희귀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
그림 10 : QT-RR 관계. ( A ) WT (LQT1 corr )와 긴 QT 증후군 유형 1 (LQT1 R190Q ) hPSC-CM 사이의 QT 간격과 RR 간격의 다른 관계의 예. 음영 영역은 RR 간격의 동일한 시프트가 LQT1 병에 걸린 라인의 QT 간격에서 더 큰 변화를 생성하므로 부정맥 감수성을 증가시킬 수 있음을 보여줍니다. ( B ) 7 가지 hPSC 라인의 CM에서 MEA에서 측정 된 보정되지 않은 QT와 RR 간격 사이의 관계. Bazett ( C ) 또는 Fridericia ( D ) 공식에 대한 QT 보정의 효과는 QT-RR의 기울기 변화가 terval 관계. 참고 문헌 30 에서 채택한 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 11
그림 11 : 질병 또는 약물 유발 QT 및 RR 간격 변화. ( A ) 긴 - QT 증후군 (LQTS) 돌연변이를 지닌 환자로부터 유래 된 hPSC-CM의 QT 간격 연장의 예는 동위 원소 성 WT 대조군과 비교된다. ( B ) 약리학 적 hERG 차단시 hPSC-CM에서 QT 간격 연장의 예. ( C ) 증가하는 hERG 활성제로 치료할 때 QT 간격이 짧아짐. 화살표는 단축의 방향을 나타냅니다. ( D ) 약물 유발 RR 간격 단축의 예. 패널 (C)는 참고 문헌> 30. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저 인슐린, BSA, 폴리 비닐 알콜, 필수 지질 (LI-BPEL)
구성 요소 수량 100 mL
IMDM 43 mL
F12 43 mL
아스 코르 빈산 2- 인산 (증류수 중 5 mg / mL) 1 mL
세포 배양 보충제 (L- 글루타민의 직접적인 대체물) 1 mL
페니실린 / 스트렙토 마이신 0.5mL
페놀 레드 1 mg
단백질없는 Hybridoma Medium-II (PFHMII) 5 mL
BSA (IMDM 중 10 중량 %) 2.5 mL
PVA (증류수 중 5 % wt / vol) 2.5 mL
화학적으로 정의 된 지질 농축액 (CDLC) 1 mL
인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 - 에탄올 아민 (ITS-X) 100X 0.1 mL
α-Monothioglycerol (1 mL IMDM에 13 μL) 0.3 mL
시약을 결합하고, 0.22 μm의 기공 필터로 걸러 내고 4 ° C에서 배지를 2 주 동안 보관하십시오.

표 1 : Li-BPEL 매체 구성.

Discussion

이 프로토콜은 MEA를 사용하여 FP를 측정하기 위해 hPSC-CM을 해리하고 준비하는 방법을 보여줍니다. hPSC-CM은 일반적으로 FP로 측정 할 수있는 자발적인 전기적 활동을 나타내며 박동 빈도, QT 간격 지속 시간 및 부정맥과 관련하여 의미있는 데이터를 제공 할 수 있습니다.

2D 심장 분화 된 문화의 해리는 MEA에 박동 층을 재생성하기 위해 필요하며 중요한 단계입니다. 반복적 인 피펫 팅 및 / 또는 공격적인 해리 효소 처리에 의한 기계적 스트레스는 높은 세포 사망률, MEA 플레이트에 부착 실패, 자발적인 전기 활동의 결핍을 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단층 배양에 최적화되었습니다. 그러나 EB 접종 후 PBS 세척 및 해리 효소와의 더 긴 배양 시간과 같은 3 차원 (3D) 배양 물 ( 예, 배아 체 또는 EB)에 대해서도 유사한 접근법을 사용할 수있다. 수입2D 및 3D 차별화 된 배양 모두에서 차별화 된 세포가 오래 될수록 배양 시간이 길어질수록 세포 외 기질 침착이 증가하기 때문에 세포를 분리 할 수 ​​있습니다.

FP 매개 변수를 정량화하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 심장 활성 약물의 용량 - 반응 곡선을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에 Cavero et al. 도 31 에서, 약물의 출발 농도는 MEA 측정의 결과에 중대한 영향을 미칠 수있다. 따라서 결과의 정확성과 신뢰성을 높이기 위해 다음과 같이 제안합니다 : 1) 비가역 활성제 / 차단제의 경우, 테스트 할 약물이 들어있는 비교적 많은 양의 배지를 사용하십시오. 보다 자세하게는, MEA 칩으로부터 중간 부피의 10-50 %를 제거하고, 약물이 이전에 적절한 농도로 용해 된 동일한 부피의 매질을 첨가한다. 이 경우, 최종 약물 농도를 계산할 때,배지 제거 후 농도의 변화. 2) 가역적 활성제 / 차단제의 경우 100X 스톡 용액에서 각 약물 용량을 10 μL 씩 추가합니다.

심장 분화 프로토콜의 대부분은 심실 형태가 가장 많이 드러나는 노드 형, 심방형 및 심실 형 심근 세포의 다양한 혼합 인구를 초래합니다. 이는 특정 심근 세포 아형에 영향을 미치는 심장 질환 또는 심장 아형 특이 적 이온 채널에 작용하는 약물을 모델링 할 때 한계가 될 수 있습니다. 여러 연구가 심장 분화 3 , 5 , 37 , 38 동안 더 많은 통제 된 규격을 지시하기위한 조건을 최적화했지만, 그것들의 더 넓은 적용 가능성은 여전히 ​​조사 중에있다.

또한, 분화의 가변 효율 (상이한 실험 및 di다른 hPSC 라인) 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 관찰 될 수 있습니다. 표면 단백질 발현 35 , 45 (형광 보조 세포 정렬 또는 자기 비드 선택 46 , 47 ) 및 대사 선택 44 , 48 을 기반으로하는 심근 세포 강화 전략은 유전자 변형 또는 전기 신호를 개선하기 위해 hPSC-CM의 hPSC 선 도금 이전 수정.

hPSC-CMs가 인간 성인 cardiomyocytes 4 , 49 에 비해 악명 높게 미성숙하더라도, 그들은 r에서 귀중하다는 것을 입증했다특정 질병 관련 변화 ( 예 : 채널 병증) 19 , 20 , 50 및 약물 유발 반응 ( 예 : 심장 이온 채널 차단제) 4 , 51을 찾아 내고 식별. 또한, 미성숙 세포는 해리가 더 쉽고 해리 및 도금 후 성숙한 심근 세포보다 회복되기 때문에 hPSC-CM 미성숙이 이점으로 간주 될 수 있습니다. 그러나 예를 들어 요약 할 수 있습니다. 늦은 발병 심장병을 예방하고 성숙한 심근 세포의 약물 반응을 충실하게 재현하기 위해서는보다 성숙한 기계적, 대사 적 및 전기적 hPSC-CM 상태를 얻어야한다. 이러한 세포를 성숙시키는 방법은 배양 시간 연장, 기계적 변형 ( mechanical strain ) 53 , 전기적 페이싱 ( 54) , 작은분자 55 , 3D 배양 56 , 다른 세포 유형 57 과의 공동 배양, 심지어 이들 접근법의 조합 58 ; 지금까지이 접근법들 중 어느 것도 성인과 같은 표현형을 갖지 못했다.

미성숙 기능의 일부로 hPSC-CM은 전기적 자동성을 나타냅니다. 여기에서 QT 및 RR 간격을 정확하게 정량화하는 방법에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 자연스러운 전기적 활동 측정의 한 가지 한계는 hPSC-CM이 다른 비트 주파수를 표시 할 때 QT 간격을 비교하는 것이 어려울 수 있다는 것입니다. 이 경우 Bazett 또는 Fridericia의 공식을 사용하여 빈도에 대한 QT 간격을 수정할 수 있습니다. 그러나 이전에보고 된 바와 같이, 교정 방법 자체로 인한 가능한 편향을 배제하기 위해 원시 및 교정 데이터 모두에 대해 QT 간격 대 RR 간격을 플로팅하여 장축 회귀 분석을 수행하는 것이 좋습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 이전에 설명한 방법 59 , 60 과 함께 hPSC-CM FP의 절차 및 분석을 표준화하고 데이터 재현성을 개선하며 실험실 간 결과를 더 잘 비교할 수 있도록 도와줍니다.

Disclosures

CLM은 Pluriomics의 공동 설립자이자 고문입니다. 게시 비용의 일부는 다중 채널 시스템에서 다뤄졌습니다.

Acknowledgements

이 연구는 CVON (HUSTCARE) : 네덜란드 심장 혈관 연구 구상 (네덜란드 심장 재단, 네덜란드 의료 센터 연합회, 네덜란드 건강 연구 개발기구 및 네덜란드 왕립 과학원)의 지원을 받았다. 유럽 ​​연구위원회 (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). hPSC 심장 분화에 도움을 주신 E. Giacomelli (LUMC)에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet/laminar flow-hood Cleanair
MEA2100 in vitro recording system Multi Channel Systems
CO2 cell-culture incubator Sanyo MCO-15A
Centrifuge Hitachi himac-CT6EL
Leica stereomicroscope Leica Microsystems MS5
Handheld pipetman (P-10 (10 μL), P-200 (200 μL), P-1000 (1,000 μL)) Gilson International
Filter tips (10 μL, 200μL, 1,000μL) Corning 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL)
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) Millipore SCGVU02RE
Sterile plastic pipette Greiner Bio-One 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
Tweezers Dumont
Autoclavable Petri dishes VWR/ Duran Group 391-0860
MEA chip Multi Channel Systems MEA200/30iR-Ti-gr
Phosphate-buffered Saline (PBS) calcium, magnesium Thermo Fisher Scientific 14040-091
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-169
Human recombinant fibronectin Tebu-Bio J64560
Custom-made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings LUMC: department of Instrument Development
Dissociation enzyme - TrypLE Select 1x Thermo Fisher Scientific 12563-029
Tergazyme enzyme detergent Sigma-Aldrich Z273287-1EA
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230-089
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for LI-BPEL medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 21056-023
F12 nutrient mixture (Ham) Thermo Fisher Scientific 31765-027
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-038
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070-063
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Protein-free Hybridoma Medium-II (PFHMII) Thermo Fisher Scientific 12040-077
Bovine Serum Albumin (BSA) Bovogen Biologicals Australia BSAS05
Poly(Vinyl Alcohol) (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Chemically-defined Lipid Concentrate (CDLC) Thermo Fisher Scientific 11905-031
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100x Thermo Fisher Scientific 51599-056
α-Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
Name Company Software version Comments
MC_Rack Multi Channel Systems 4.6.2 Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems)
TCX Control Multi Channel Systems 1.3.4
MEA Select Multi Channel Systems 1.3.0
MC_Data Tool Multi Channel Systems 2.6.15 Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.)
Clampfit Molecular Devices 7.0.0 Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code.

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References

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