Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen

Immunology and Infection
 

Summary

Die exponierte normale Okularoberfläche besteht aus Hornhaut und Bindehaut. Epithelzellen, Becherzellen und Immunzellen sind in der Bindehaut vorhanden. Hier wird eine nicht-invasive Technik der Impressionszytologie beschrieben, die eine Impressionszytologie-Vorrichtung und Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in der Bindehaut verwendet.

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Bose, T., Hou, A., Lee, R., Tong, L., Chandy, K. G. A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva. J. Vis. Exp. (125), e55591, doi:10.3791/55591 (2017).

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Abstract

Traditionell wird die Augenoberflächenzytologie mit Techniken wie Spachteltechnik und Pinseltechnik untersucht. Das Problem mit diesen Techniken ist, dass sie traumatische Läsionen auf der Oberfläche des Auges induzieren können, die zu Narbenbildung, Augenliddeformität, limbischen Stammzellmangel und in einigen Fällen zu großen Unannehmlichkeiten für das Subjekt führen können. Um diese klinischen Probleme zu vermeiden, wurde die Impressionszytologie (IC) entwickelt, um eine trockene Augenerkrankung und spätere Neoplasien, atopische Erkrankungen, Frühlings-Keratokonjubotitis und Keratokonjunktivitis sicca zu diagnostizieren. Typischerweise schneiden die Kliniker die Filterpapiere manuell in die erforderlichen Formen und wenden diese auf die Augenoberfläche an. Hier beschreiben wir, wie man IC mit einem handelsüblichen medizinischen Gerät durchführt. Diese Technik wird hier erklärt, gefolgt von der Immunphänotypisierung durch Durchflusszytometrie. Diese Technik erfordert weniger manuelle Handhabung und verursacht weniger Verletzung der Augenoberfläche.

Introduction

Die Impressionszytologie (IC) wurde erstmals 1977 von Thatcher et al 1 durchgeführt . Sie benutzten eine Plastikabdruckscheibe, um konjunktivale Zellen von Patienten anstatt anderer Techniken zu sammeln, die zu diesem Zeitpunkt wie Schaben, Tupfen oder Pipettieren 1 waren . Die gegenwärtige Technik des IC verwendet ein absorbierendes Filterpapier 2, um die Bulbar und die palpebrale Bindehaut zu prägen und die oberflächlichste Schicht von Bindehautzellen zu sammeln. Diese Zellen, die ihre letzte Stufe der Differenzierung erreicht haben, werden kontinuierlich in Tränen vergossen. Drei Hauptpopulationen von Zellen finden sich in IC-Proben: Epithelzellen 4 , Becherzellen 3 , 5 und Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe viz Epithel-assoziierten Effektor-T-Zellen oder dendritischen Zellen 6 . Okulare Oberflächenzellen in IC samPles können durch Mikroskopie, Immun-Blotting und Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) 7 analysiert werden. Durchflusszytometrie wurde vor kurzem verwendet, um Immunzellen zu analysieren, die durch Schaben der IC-Membran 8 gesammelt wurden. Interessanterweise wurde IC 6 , 9 verwendet, um viele okuläre Oberflächenkrankheiten einschließlich Keratokonjunktivitis sicca, Vitamin A-Mangel, Narben-Pemphigoid, atopische Erkrankung, überlegene limbische Keratokonjunktivitis, Frühlings-Keratokonjunktivitis und epitheliale Plattenepithelmetaplasie zu bewerten. IC wurde auch verwendet, um die Auswirkungen des Tragens von Kontaktlinsen, die Erkennung von Augenmikroben zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit und Toleranz von therapeutischen Interventionen in Längsschnittstudien zu untersuchen 10 , 11 , 12 .

Das medizinische Gerät (EyePrim) wird von einer Art von Poly unterstütztEthersulfon (PES) 0,2 μm Membran, die bisher für die Technik der okularen Eindruckzytologie mit Durchflusszytometrie (OSIC-Flow) validiert wurde und die Möglichkeit bietet, Längsproben zu verwenden, um die Progression der Krankheit und die Reaktion auf die Behandlung zu überwachen ( z Analyse von intraepithelialen Leukozyten, die als mutmaßliche Erkrankungsmarker für die progressive Bindehautfibrose im Schleimhautpemphigoid definiert wurden) 13 . Frühe Forscher verwendeten autoklavierte PES-Filter, die manuellen Eindruck erfordern. Infolgedessen war die Ausbeute variabel und bedienungsabhängig. Der Vorteil dieses medizinischen Gerätes ist die einfache Bedienung, der standardisierte Druck (Pa oder N / m 2 ) und ermöglicht Wiederholbarkeit, Reproduzierbarkeit und gleichbleibende zelluläre Erholung. Diese Technik ist in einer ambulanten Klinik nützlich, weil sie nicht chirurgisch, leicht durchführbar und schnell ist. Dies ist ein medizinisches Gerät der Klasse I gemäß der Richtlinie 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Es erfordert nurS topische Anästhesie während des Verfahrens, die die Aufrechterhaltung der Integrität der Augenoberfläche gewährleistet. Nach IC können Zellen sofort für die Durchflusszytometrie verarbeitet werden. Darüber hinaus ist es möglich, dass nicht-ophthalmologische Techniker und Krankenschwestern trainiert werden, um die Augenoberfläche zu probieren.

Trotz der Verbesserung der IC über andere Techniken, mehrere Herausforderungen bleiben. Zum Beispiel kann es aufgrund der Fläche der Probenahme und der regionalen Unterschiede in der bulbären Konjunktiva in Abhängigkeit von der Position des IC auftreten. Eine andere Variationsquelle ist auf die Anwendung unterschiedlicher Druckmengen während des IC zurückzuführen. Andere methodische Fragen beinhalten die Standardisierung der Zellverarbeitung: Hierbei handelt es sich um Dauer und Art der Fixierung und die Bedingungen der möglichen Lagerung, die die Stabilität des Probenmaterials beeinträchtigen können.

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, eine Methode der Isolierung der Okularabdruckproben zu entwickelnT ist einfach zu bedienen, nicht-invasiv und kann auf die immunologische Charakterisierung der klinischen Proben angewendet werden.

Protocol

Alle okulären Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von der Dry Eye Clinic in der Singapore National Eye Center von SingHealth Centralized Institutional Review Board und der Nanyang Technological University Institutional Review Board, Singapur genehmigt gesammelt.

HINWEIS: Die Probanden wurden klinischen Tests unterzogen, um das Ausmaß der Entzündung und die Schwere der Tränenfunktionsstörung zu beurteilen, bevor IC durchgeführt wurde. Klinische Tests beinhalteten die nicht-invasive Tränen-Auffrischungszeit (NI-TBUT) 14 und die Konjunktival-Rötung (Hyperämie) 15 , 16 mit einem diagnostischen Instrument, Schirmer-Test 17 , Standard Patient Evaluation of Eye Dryness (SPEED) Fragebogen 18 und Hornhaut Färbung 19

1. Sammlung von Okularproben durch IC

  1. Nach der Bestimmung des klinischen Status, anästhesierenDie Augen des Teilnehmers durch Anwendung von 1 - 2 Tropfen der topischen Anästhesie, Proparacainhydrochlorid, auf die überlegene bulbäre Konjunktiva und minderwertige Fornix. Warten Sie für 4 - 5 min für die stechende Empfindung des Anästhetikums zu tragen.
  2. Sammeln Sie Proben von sowohl nasalen als auch zeitlichen bulbären Konjunktiva mit zwei Impressionszytologiegeräten.
    HINWEIS: Ein Gerät wird für die Sammlung von zwei Impressionsmustern verwendet. Hier wurden zwei Geräte für die Sammlung von vier Impressionsmembranen verwendet.
    1. Positioniere das Eindruckzytologiegerät tangential auf die Bindehaut. Drücken Sie den Druckknopf vorsichtig und halten Sie ihn für 2 - 3 s.
      HINWEIS: Das Gerät kommt mit der Membran. Der Druck wird nach dem Drücken der Taste automatisch freigegeben. Es dauert nur wenige Sekunden, um den Druck freizugeben und das Gerät zu entfernen.
  3. Die Membran wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 1 ml Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) + 10% fötales Rinderserum enthält(FBS) + 1% Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)) durch ein Skalpell.
  4. Isoliere Zellen von der Membran des Gerätes durch kontinuierliches Schaben für etwa 1 min mit einer 10 μl Pipettenspitze.
    HINWEIS: Das Schaben ist abgeschlossen, wenn die Oberfläche der Membran uneben wird. Die Zellzahlen aus jeder Membran sind variabel (100 - 500 Zellen / Membran). Verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 2 - 3 Stunden der Sammlung.

2. Immunphänotypisierungszellen durch Durchflusszytometrie

  1. Die Zellen bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, um das Medium zu entfernen. Das Zellpellet wird mit 50 μl Durchflusszytometrie-Färbepuffer (phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) + 0,05% Rinderserumalbumin (BSA) resuspendiert.
  2. (PEC) -H7 (APC-H7) (SK3), CCR7-Phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE-Cyanin 7 (PE- & sub1; & sub0;), Cy7) -A und lebend / tote Zellmarke 7-ADD) bei Raumtemperatur für 20 - 30 min in derdunkel. Verwenden Sie Antikörper direkt aus dem Bestand nach dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Für die Antikörperkonzentration werden 2,5 μl CD3-BV510, 1,25 μl CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD und 10 μl CCR7-PE verwendet. Verwenden Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs), um die verschiedenen Konzentrationen von Antikörpern zu titrieren. Für die Titration nehmen Sie die im Protokoll des Herstellers erwähnte Antikörperkonzentration und verwenden ein halbes und ein Viertel der empfohlenen Konzentration. Verwenden Sie die minimale Konzentration von Antikörpern, um das Überlaufen auf andere Fluorochrom-Kanäle zu vermeiden. Es wurden klare Signale mit den erwähnten Konzentrationen von Antikörpern beobachtet. Die Kompensation wurde durchgeführt, indem PBMCs zunächst nach dem in Williams et al . 20 Zum Testen wurden PBMCs mit demselben Satz von Antikörpern inkubiert, die hier verwendet wurden und durch Vergleich einzelner und mehrfacher Antikörperflecken kompensiert wurden.
  3. Nach der Inkubation periOd, fügen Sie 1 ml Färbepuffer zum Röhrchen hinzu, mischen Sie gut und zentrifugieren Sie bei 450 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Zellen in 200 μl Färbepuffer resuspendieren.
  4. Führen Sie Proben auf einer Durchflusszytometrie Maschine.
    1. Bevor Sie die Daten erfassen, kalibrieren Sie die Durchflusszytometer-Kanalspannungen mit Zytometer-Setup und Tracking (CS & T) Perlen, um die Datenerfassung an verschiedenen Tagen nach den Anweisungen des Herstellers zu normalisieren.
      1. Öffnen Sie die Durchflusszytometrie Datenerfassungssoftware, klicken Sie auf "Setup & QC" -Taste, wählen Sie die richtige CS & T Perle Losnummer, laden Sie die Perlen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Start".
    2. Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen vorsichtig klopfen, bevor Sie Proben auf die Maschine legen. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware und klicken Sie auf "Vorschau". Wenn die Schwellenrate stabil ist, klicken Sie auf "Acquire". Überwachen Sie den Sample Level und klicken Sie auf "Stop", wenn die Samples ausgehen.
      HINWEIS: Erwerb von 10.000 Veranstaltungen pro Probe. Nach dem Erwerb von 10.000 Ereignissen generiere ein SSC-A- und FSC-A-Punkt-Plot im Arbeitsblatt.
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Polygon-Tor" und ziehen Sie ein Tor (dies ist P1) über alle Ereignisse mit einem FSC-A-Wert> 5 x 10 4 , um Schutt auszuschließen. Klicken Sie auf "Create dot plot" -Taste, um ein neues Punkt-Diagramm zu erstellen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Punkt-Blot, wählen Sie "Eigenschaften", um das Fenster "Plot-Editor" zu öffnen und dann "P1" zu wählen. Klicken Sie auf die FSC-A auf der X-Achse des P1-Punkt-Plots, ändern Sie sie auf CD3-BV510. Zeichnen Sie ein '' Polygon Gate '', um die CD3 + Population zu wählen und nennen Sie '' P2 ''.
      2. Klicken Sie auf "Create dot plot" -Taste, um ein neues Punkt-Plot zu erzeugen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dot-Blot, wählen Sie "Eigenschaften", um das Fenster "Plot-Editor" zu öffnen. Klicken Sie auf die FSC-A auf der x-Achse des P2-Punkt-Plots und ändern Sie sie auf 7-AAD. Zeichne ein '' Polygon Gate '' für 7-AAD-Population und wähle '' P3 ''. P3 hier ist CD3 +Lebende Zellen.
      3. Klicken Sie auf "Create dot plot" -Taste, um ein neues Punkt-Plot zu erzeugen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dot-Blot, wählen Sie "Eigenschaften", um das Fenster "Plot-Editor" zu öffnen. Klicken Sie auf CD3-BV510 auf x-Achse und CD4-APCH7 auf y-Achse des P3-Punkt-Plots. Zeichnen Sie Rechteck-Gates auf der oberen und unteren Seite des Quadranten und wählen Sie '' P4 '' bzw. '' P5 ''. P4 ist live CD3 + CD4 + und P5 ist Live CD3 + CD4 - T Zellen.
      4. Klicken Sie auf "Create dot plot" -Taste, um ein neues Punkt-Plot zu erzeugen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dot-Blot, wählen Sie "Eigenschaften", um das Fenster "Plot-Editor" zu öffnen. Klicken Sie auf die CD45RO PE-Cy7 auf der x-Achse und CCR7-PE auf der y-Achse der P4- und P5-Plots. Zeichnen Sie '' Quad Gate '' auf diesem Punkt Plot.
        HINWEIS: Obere linke Seite, obere rechte Seite, untere rechte Seite und untere linke Quadranten hier sind naiv, zentraler Speicher (T CM ), eFfector-Speicher (T EM ), endlich differenzierte Effektor-Speicher (T EMRA ) T-Zellen.

Representative Results

IC durch diese klinische Vorrichtung erlaubt uns, okuläre Oberflächen-Immunzellen zu isolieren, während die Augenoberfläche intakt gehalten wird. Abbildung 1 beschreibt, wie das IC durchgeführt wurde. Die verschiedenen Stellen des Auges, von denen die Proben gesammelt wurden, sind markiert. Abbildung 2 zeigt das repräsentative Ergebnis der Durchflusszytometrie, gesammelt von 10 gesunden Kontrollen. Für das Gating, verwenden Sie SSC und 7-AAD, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. 7-AAD-Zellen werden als lebende Zellen identifiziert. Diese lebenden Zellen sind ferner durch CD3 + - und CD4 + -Marker charakterisiert. Weiterhin wurden die CD4 + - und CD4-Populationen jeweils als Naive, T EM , T CM und T EMRA mit den CCR7- und CD45RO-Markern charakterisiert. Unter den CD3 + T-Zellen dominieren Effektorspeicher-T-Zellen in der menschlichen Augenoberfläche. In früheren eXperimente wurde auch gezeigt, dass CD8 + Speicherzellen die Hauptpopulationen in den konjunktivalen epithelialen T-Zellen unter den gesunden Individuen sind 20 . Abbildung 3 zeigt, dass CD4 + - und CD8 + -Effektor-Speicher-T-Zellen (T EM und T EMRA ) die Haupt-Teilmenge in der menschlichen Augenoberfläche in 10 gesunden Kontrollen sind. Jede in der Figur erwähnte Population wird mit ihrem Marker-Phänotyp und Namen (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ) benachrichtigt . Die Zahlen in Rot bezeichnen den Prozentsatz der Bevölkerung. Die Daten in dieser Figur sind als Mittelwert ± SEM dargestellt

Abbildung 1
Abbildung 1: Sammlung von IC-Proben aus der Ocular Surface durch das Impression Cytology Device. Proben wurden aus der Glühbirne gesammeltAr Region wie gezeigt.

Figur 2
Abbildung 2: Punktdiagramm mit Durchflusszytometrie. Live 7-AAD-Zellen wurden ausgewählt. Die CD3 + -Zellen wurden zuerst gated, und dann wurde diese Population in CD4 + und CD4 - Untergruppen gegossen. Die Proportionen von naiven (CCR7 + CD45RO - ), zentralen Speicher (CCR7 + CD45RO + ) und Effektor-Speicher (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO) wurden mit Hilfe von CCR7- und CD45RO-Markern ermittelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
FIgure 3: Immunzellen-Subtypen in CD4 + und CD8 + T Zellen der gesunden menschlichen Augenoberfläche. Verteilung von konjunktivalen CD4 + und CD8 + naiven, zentralen Speicher (T CM ) und Effektorgedächtnis (T EM und T EMRA ) Teilmengen bei gesunden menschlichen Kontrollen; Jeder Datenpunkt repräsentiert einen separaten individuellen Mittelwert ± SEM. Der Prozentsatz der Bevölkerung wird als rot unter dem Namen jeder der Populationen markiert. Der Gesamtprozentsatz der Population beträgt 98%, da die CD4 + T EMRA- Population nicht in das genannte Scatterplot aufgenommen wurde (modifiziert von Bose et al., 21 ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Dies ist eine einfache, schnelle und weniger invasive Technik, die in den ambulanten Kliniken für eine relativ schnelle Immunprofile verwendet werden kann, im Gegensatz zu den herkömmlichen Techniken wie Schaben, Tupfen, Pipettieren oder Absorbieren von Filterpapier 1 , 2 . Eine Variante dieser Technik wird bereits in Forschungseinrichtungen verwendet 22 . Die künftige Anwendung der vorgeschlagenen Methodik ist die Patientenschichtung in klinischen Studien mit Augenkrankheiten, insbesondere solchen, die eine Immunophenotypisierung erfordern.

Eine große Herausforderung bei dieser Technik sind die relativ wenigen Immunzellen, die nach der Eindrucksammlung und dem Schaben wiedergewonnen wurden. Die Gesamtzahl der CD3 + T-Zellen, die aus vier Impressionen pro Individuum gewonnen wurden, variierte von ~ 500 - 1.000 Zellen. Die okulären Proben wurden vor der Durchflusszytometrieanalyse für eine minimale Anzahl von Zeiten gewaschen, um einen weiteren Verlust der Zelle zu vermeidenS. Kritische Schritte und Herausforderungen, die innerhalb des Protokolls bleiben, sind eine effiziente Sammlung von Okularproben und ein korrektes Abkratzen der Membran, um höhere Zellzahlen zu erreichen. Trotzdem ist es unwahrscheinlich, dass diese Einschränkung auf einen bestimmten Immungyp-Phänotyp hindehnt. Die hier durchgeführte Fehlersuche zur Maximierung der Ausbeute an Zellen bestand darin, die Anzahl der Waschschritte nach und vor der Inkubation von Antikörpern zu reduzieren.

Es gibt andere Einschränkungen für die Verwendung von IC. Bei Patienten mit stark verhüllter oder fibrosierter Okularoberfläche, wie im Steven-Johnson-Syndrom, kann die zelluläre Ausbeute sogar noch geringer sein als in dieser Studie. Der Anteil der Immunzellen kann sich ändern, wenn die Proben anstatt analysiert werden am selben Tag gespeichert werden. Es ist schwer vorherzusagen, ob bestimmte Zelltypen resistenter gegenüber der Lagerung sind als andere. Frühere Studien berichteten über erhöhte Spiegel der HLA-DR-Expression in den Bindehaut-Epithelzellen 23 , so dass es sich um eine Inter-Um die Korrelation zwischen HLA-DR und den Ebenen der spezifischen Immunzellen zu bewerten. Immunzellen können auch mit dem Expressionsniveau von Chemokinen assoziiert sein. Diese Fragen sollten in zukünftigen Studien behandelt werden.

Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Nandini Nallappan und Sharon Yeo für die Unterstützung der technischen Schritte. Die Studie wurde von einem Start-Up Grant an KGC von Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University und von einem Senior Clinician Scientist Award von der Singapore Ministerium für Gesundheit National Medical Research Council (NMRC) an LT (NMRC / CSA / 045/2012) und durch einen Zuschuss aus dem NMRC und verwaltet vom National Health Innovation Center an KGC und LT (NHIC-12D-1409007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
anti-human CD3 BV510 BD Biosciences 563109
anti-human CD4 APCH7 BD Biosciences 641398
anti-human CD45RO PECy7 BD Biosciences 337168
7-AAD solution BD Biosciences 555816
anti-human CCR7 PE BD Biosciences 552176
Pippetes Eppendorf NA
Local Anaesthesia Alcaine NA
Fluorescein sodium solution Bausch & Lomb U.K Limited NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Keratograph 5M Oculus NA
Slit lamp BioMicroscope Haag Streit BM900
EyePrim Opia Technologies NA
FACS Verse BD BioSciences NA
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
GraphPad 6.0 Prism NA
FACSVerse analysis software BD NA

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References

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