नेत्रगोलक ऊतक में प्रभावकारी मेमोरी टी कोशिकाओं में वृद्धि के साथ एक क्रोनिक ऑटोइम्यून ड्राई आई रॅट मॉडल

Immunology and Infection
 

Summary

इस रिपोर्ट में लुईस चूहों में चूहे की अश्रु ग्रंथि निकालने, अंडाकार, और पूर्ण फ्रींड के सहायक के साथ टीयूटी के माध्यम से लुईस चूहों में पुरानी प्रायोगिक ऑटोइम्यून सूखी आंखों को प्रेरित करने के तरीके का वर्णन किया गया है, जिसके बाद फोरेनिसल सबकोंन्क्टेक्टिवा और अश्रु ग्रंथियों में अश्रु ग्रंथि निकालने और ओवलबिमिन के इंजेक्शन के बाद किया गया। छह हफ्ते बाद

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Hou, A., Bose, T., Chandy, K. G., Tong, L. A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue. J. Vis. Exp. (124), e55592, doi:10.3791/55592 (2017).

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Abstract

सूखी नेत्र रोग एक बहुत ही सामान्य स्थिति है जो रोग और स्वास्थ्य संबंधी बोझ का कारण बनता है और जीवन की गुणवत्ता को कम करता है ऑटिमीम्यून सूखी आंख की स्थितियों का इलाज करने के लिए उपन्यास चिकित्सा विज्ञान का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त सूखी आंखों के पशु मॉडल की आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल एक पुरानी ऑटोइम्यून सूखी आँख चूहा मॉडल का वर्णन करता है। लुईस चूहों को एक पायस के साथ प्रतिरक्षित किया गया जिसमें अश्रु ग्रंथि निकालने, ओवलबिमिन, और फ्रींड के सहायक को पूरा किया गया था। अधूरे फ्रींड के सहायक में एक ही प्रतिजनों के साथ दूसरा प्रतिरक्षण दो सप्ताह बाद प्रशासित किया गया था। इन टीकाकरणों को पूंछ के आधार पर तलवार से संचालित किया गया था। ओक्यूलर की सतह और अश्रु ग्रंथियों पर अमीरों की प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने के लिए, अश्रु ग्रंथि निकालने और ओवलबिमिन को पहली प्रतिरक्षण के बाद 6 सप्ताह के दौरान उपकलागत उपकोनोन्ग्नेटिव्वा और अश्रु ग्रंथियों में अंतःक्षिप्त किया गया था। चूहों ने सूअर आंख की विशेषताओं को विकसित किया, जिनमें कमी आंसू उत्पादन शामिल था, आंसू स्थिरता में कमी आई और कॉर्नियल क्षति में वृद्धि हुई। प्रतिरक्षा समर्थकफ्लो साइमेट्रेट्री द्वारा दाखिल ने नेत्रगोलक में सीडी 3 + इफेरोर मेमोरी टी कोशिकाओं का एक प्रावधान दिखाया।

Introduction

शुष्क आंखों की बीमारी (डीईडी) आँसू और मृदु सतह की एक बहुसंख्यक बीमारी है जो परिणामस्वरूप असुविधा, दृश्यता अशांति, और फिल्म अस्थिरता आंसू, जिससे ओक्यूलर सतह को नुकसान हो सकता है। यह आंसू फिल्म की वृद्धि हुई osmolarity और नेत्र सतह 1 की सूजन के साथ है। डीईडी के साथ जुड़े लक्षण जलते हैं, डंकने लगते हैं, पीसते हैं, विदेशी शरीर उत्तेजना, फाड़, ओक्यूलर थकावट और सूखापन 2 , 3 । डीईडी के दो मुख्य कारण आंसू स्राव ग्रंथि और आंसू फिल्म 4 के अत्यधिक बाष्पीकरण द्वारा आंसू उत्पादन को कम कर रहे हैं। ऑक्सीम्यून बीमारियों, जैसे सजोग्रेन सिंड्रोम, सिस्टमिक ल्यूपस इरिथेमेटोसस, और रुमेटीइड गठिया के रोगियों में मीबोमियान ग्रंथियों को प्रतिरक्षा क्षति आंसू स्थिरता के लिए लिपिड की अभिव्यक्ति कम कर देता है। इसके अलावा, ओक्यूलर सतह को प्रतिरक्षा क्षति उत्पादित घट जाती हैसतह की कमजोरियों के लिए महत्वपूर्ण mucins पर साथ में, इन प्रक्रियाओं को संचयी रूप से पुरानी सूखी आँख 5 , 6 , 7 का कारण बनता है।

टीयर प्रतिस्थापन और विरोधी भड़काऊ थेरेपी थेरेपी के मुख्य आधार हैं। हालांकि, डीईडी ( यानी, कॉर्टिकोस्टेरॉयड और साइक्लोस्पोरिन) के लिए वर्तमान विरोधी भड़काऊ उपचार मोटे तौर पर इम्युनोसप्रेसर होते हैं, जिससे 8 , 9 , 10 के गंभीर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकते हैं। स्वत: प्रतिरक्षी सूखी आंख का इलाज करने के लिए उपन्यास अभिकर्मक एजेंटों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त पशु मॉडल की आवश्यकता है।

11 , 12 , 13 के विशिष्ट आनुवंशिक दोषों वाले चूहों, चूहों में विशिष्ट जीन 14 , 15 , और ट्रांसजेनिक चूहों की कमी होती है जो अत्यधिक मात्रा में इम्यूनोरगुलटऑरी जीन का प्रयोग ऑटोइम्यून सूखी आँख 16 , 17 के मॉडल के रूप में किया गया है। एंटीजन प्रेरित ऑटोइम्यून पशु मॉडल भी चूहों 18 , खरगोशों 19 , और चूहों 20 , 21 में सूचित किया गया है। यहां, हम पुरानी ऑटोइम्यून सूखी आंखों के एक एंटीजन प्रेरित मॉडल का वर्णन करते हैं। यह मॉडल दो पहले के मॉडल का एक संशोधन है; एक अमानवीय ग्रंथि का अर्क होता है, और दूसरा प्रयोगात्मक ग्रंथियों 20 , 21 से एक ऑटोैंटिजेन ( यानी, klk1b22) का इस्तेमाल करता था।

रोग 6 से 8 सप्ताह की महिला के लुटेरे चूहे के ओवलबिमीन के साथ चमड़े के नीचे की टीकाकरण से प्रेरित था, फ्रींड के सहायक को पूरा किया गया था और स्प्रैग-दावली चूहों ( चित्रा 1 ) से लापरवाह ग्रंथि अर्क के साथ एक पायस निकाला गया था। अपूर्ण फ्रींड के सहायक में एक ही प्रतिजन के साथ दूसरा प्रतिरक्षण थादो सप्ताह बाद प्रशासित अमाप ग्रंथि और ओक्यूलर सतह पर एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती करने के लिए, अश्रु ग्रंथि निकालने और ओवलबिमिन (1 मिलीग्राम / एमएल) का मिश्रण 6 वें -7 वें सप्ताह ( चित्रा 1 ) पर फोर्निसल सबकोंन्नेक्टिव और अश्रु ग्रंथियों में अंतःक्षिप्त किया गया था। 85% से अधिक चूहों ने सूक्ष्म आंखों की विशेषताओं को विकसित किया था, जो पहली प्रतिरक्षण के 70 दिनों बाद था। इन सुविधाओं में कम आंसू उत्पादन ( चित्रा 2 ), कॉर्नियल फ्लोरोसिसिन धुंधला हो जाना ( चित्रा 3 ) में वृद्धि हुई है, और आंसू स्थिरता ( चित्रा 4 ) में कमी आई है। प्रवाह कोशिका द्वारा सामान्य चूहों की आंखों में टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा रूपरेखा को सीडी 3 + प्रभावकार स्मृति टी कोशिकाओं ( आंकड़े 5 और 6 ) का एक प्रावधान दिखाता है। ऑटोइम्यून डीईडी के साथ चूहे सीडी 3 + प्रभावकार स्मृति टी कोशिकाओं में वृद्धि और भोले और केंद्रीय स्मृति टी कोशिकाओं ( 6 चित्रा

Protocol

जानवरों को संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला और ऑप्थाल्मिक और विज़न रिसर्च में पशु प्रयोग के लिए एआरवीओ स्टेटमेंट। अध्ययन प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल और सिंगहैल्थ की उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी थी।

1. अजीब ग्लेड एक्स्ट्रेक्ट की तैयारी

नोट: चूहे केटामाइन (75 मिलीग्राम / किग्रा) और जइलाइलिन (10 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्राटेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहे का संवेदनाहट किया गया था। उचित संज्ञाहरण को पैर की अंगुली की छिद्र और पूंछ की चोली द्वारा पुष्टि की गई थी। प्रत्येक प्रक्रिया के बाद सूखापन को रोकने के लिए आंखों की आंखों में नेत्र जेल लगाया गया था। संवेदनाहारी चूहों को दूर अवरक्त रोशनी में रखा गया ताकि वे पूरी तरह से ठीक हो जाएं जब तक कि वे गर्म हो जाएं। प्रक्रियाओं और पुनर्प्राप्ति समय के दौरान, शोधकर्ताओं द्वारा जानवरों की बारीकी से निगरानी की गई। उपयोग करने से पहले सभी सामग्री और शल्य चिकित्सा उपकरण बाँझ थे प्रयोग के अंत में, चूहों को पेंटोबारबिटल (80 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्राटेरेटोनियल इंजेक्शन द्वारा ख़त्म किया गया था।पूर्ण इच्छामृत्यु को कार्डियक पल्स की कमी और नेत्रगोलक को छूकर कोई ब्लिंक रिफ्लेक्स नहीं किया गया था। चूहे मानक परिस्थितियों में रखे गए थे: कमरे के तापमान, 21-23 डिग्री सेल्सियस; सापेक्षिक आर्द्रता, 30-70%; प्रकाश-अंधेरे चक्र, 12 घंटे (7 बजे से शाम 7 बजे तक)

  1. मेज के खिलाफ एक कान के साथ और अन्य का सामना करना पड़ रहा है, euthanized महिला Sprague- Dawley चूहों (8 सप्ताह से 16 सप्ताह की आयु सीमा) प्लेस, प्लेस। वसंत कैंची की एक जोड़ी के साथ उजागर कान के नीचे एक 10-मिमी चीरा श्रेष्ठ-नीची बनाओ। आसपास के संयोजी ऊतक से और जल निकासी नल से विच्छेदित करके अश्रु ग्रंथि निकालें।
    1. जरूरी तक -80 डिग्री सेल्सियस तक ग्रंथियों को स्टोर करें। बर्फ पर ग्रंथियों पिघलना कैंची के साथ बर्फ पर यथासंभव बारीकी से काट लें। पीसीबी के 150 μL को 1x प्रोटीज अवरोधक के साथ अश्रु ग्रंथि में जोड़ें।
  2. 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को 20 kHz पर 10 सेकंड में सेट करें, 10 से 30% आयाम पर बंद करें। बेटा अपकेंद्रित्र20 मिनट के लिए 13,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए मीठे नमूनों
  3. सतह पर तैरनेवाला पिपेट करें और उसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। सतह पर तैरनेवाला 1.5 एमएल ट्यूबों को विभाजित करने के लिए और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें निर्माता के निर्देशों के मुताबिक, प्रोटीन एकाग्रता को एक बिकिचोनिनिक एसिड परख 22 के साथ मिलाएं।

2. पायस और पेर्टुसिस विष की तैयारी

  1. पायसन
    1. 40 मिलीग्राम की गर्मी-मारे गए मिकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस एच 37 आरए को 10 मिलीलीटर में पूर्ण फ्रींड की सहायक में 1 मिलीग्राम / एमएल माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस एच 37 रा और अच्छी तरह मिलाएं।
      नोट: अंतिम पूर्ण फ्रींड के सहायक में 5 मिलीग्राम / एमएल माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग एच 37 रा है।
    2. ओवलबिमिन वजन, पीबीएस में भंग, और 2 मिलीग्राम / एमएल ओवलबिन युक्त 10 मिलीग्राम / एमएल लस्रामिल ग्रंथि निकालने वाला एंटीजन मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक जानवर के लिए 200 μL की एक इंजेक्शन मात्रा के लिए लक्ष्य, एक मास्टर मिश्रण बी तैयार करेंजानवरों की संख्या पर ased
    3. 50 एमएल ट्यूब के लिए अपूर्ण फ्रींड के सहायक या पूर्ण फ्रींड के सहायक को ट्रांसफर करना, यह सुनिश्चित करना कि प्रतिजन मिश्रण के सहायक की मात्रा 1: 1 अनुपात में है। एंटीजेन मिश्रण ड्रॉप-बाय-डिप को एडयूनेट में जोड़ें, जबकि उच्च गति के साथ झुकाव जो स्पिलज में न हो। सभी एंटीजन जोड़ने के बाद 5 मिनट के लिए वार्नेटिंग जारी रखें।
    4. पायसीकारी को 5 एमएल सिरिंज में स्थानांतरण करें और इसे सिरिंज कनेक्टर के माध्यम से 5 एमएल सिरिंज के साथ लिंक करें। मिश्रण को मिश्रण करने के लिए एक सिरिंज से दूसरे को पायस को दबाएं।
      नोट: पानी में रखा जाने पर एक छोटी बूंद एक क्षेत्र के रूप में बनी हुई है, तो पायस तैयार है। केवल हौसले से तैयार पायसन या पायस 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  2. पर्टुसिस विष
    1. 100 μg / μL की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 500 μL पानी में 50 μg प्रतिटिसिस विष का पुनर्निर्माण करना। टी को सुनिश्चित करने के लिए 30 एस के लिए कंटेनर को वोट देंऑक्सीन पूरी तरह से घुल जाता है
      नोट: निस्पंदन द्वारा निष्फल न करें, क्योंकि इससे सामग्री का नुकसान होगा। स्थिर नहीं रहो। यह समाधान कम से कम 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक सक्रिय रहता है।
    2. पीबीएस का उपयोग करते हुए 3 एनजी / μL के लिए 100 एनजी / μ एल प्रतिटिसिस विष को पतला। एक 27 जी सुई के साथ 1 एमएल लुएर-लॉक इंजेक्शन सिरिंज के लिए पतला उल्का विष का 100 μL स्थानांतरण करें।

3. लुईस चूहे के टीकाकरण

  1. दिन 0 पर, पायस कुछ बार मिश्रण। पायस के 200 μL को वितरित करें, जिसमें 1 एमजी का अम्लीय ग्रंथि निकालने और 200 माइक्रोग्राम ओवलबिन पूर्ण फ्रींड के सहायक में, 1-एमएल लुएर-लॉक सिरिंज में 27 जी सुइयों के साथ वितरित करें। एनेस्थेसिया के बिना चूहे की पूंछ के आधार पर पायस के नीचे पायस को इंजेक्षन करें।
    नोट: पूंछ को इंजेक्शन से पहले गरम करने की आवश्यकता नहीं है। हर चूहे को 1 मिलीग्राम का अश्रु ग्रंथि निकालने और 200 ग्राम ओवलबिन के साथ पूर्ण फ्रींड सहायक अभिकर्मकएच 500 माइक्रोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस H37Ra माइक्रोग्राम।
  2. 14 दिन पर, पायस के 200 μL को इंजेक्षन, जिसमें 1 एमजी का अमाप ग्रंथि निकालने और 200 ओग्लाबिन का ओवलबिन शामिल है, जो दिन के रूप में उसी तरह से होता है। पीटीएस के 100 μL में 300 एनजी प्रतिटिसिस विष को इंजेक्ट करते हैं। एक ही दिन पर प्रति चूहा।

4. एंटिजेन विशिष्ट प्रतिरक्षण कोशिकाओं की भर्ती करने के लिए एंटीजन मिश्रण की फोरेंसिकल सबकोंन्ग्टाटिवा और लैक्रमैल ग्लैंड में इंजेक्शन और स्थानीय सूजन का कारण

  1. प्रयोग में चूहों की संख्या के आधार पर ओवलबिमिन और अश्रु ग्रंथि निकालने की मात्रा की गणना करें। आवश्यक मात्रा में ओवलबिमिन लें और इसे चरण 1 में तैयार defrosted अश्रु ग्रंथि निकालने के साथ गठबंधन, 1 मिलीग्राम / एमएल ovalbumin और 1 मिलीग्राम / एमएल lacrimal ग्रंथि निकालने युक्त एंटीजन समाधान बना।
  2. इंट्राटेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा केटैमिन (75 मिलीग्राम / किग्रा) और जइलाइलिन (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों को एनेस्थेटेट करें। चुटकी के लिएयह सुनिश्चित करने के लिए कि चूंकि उचित संज्ञाहरण प्राप्त किया गया है ( अर्थात, चुटकी के बाद कोई उत्तरदायी आंदोलन नहीं देखा गया है) चूहों की तरह है। नेत्र के अपस्वास्थ्यिक उपकांदूक्टिवा में 5 μL प्रतिजन को इंजेक्ट करें। लापरवाह ग्रंथि में प्रतिजन 20 μL इंजेक्षन।

5. सूखी नेत्र सुविधाओं का आकलन

नोट: 5.1-5.3 के चरणों के लिए, संवेदनाहारी चूहों को धीरे-धीरे आंदोलन से बचने के लिए एक सपाट सतह पर एक सीधा स्थिति में एक हाथ से हाथ से रखा जाना चाहिए।

  1. फिनोल लाल धागा के साथ आंसू की मात्रा को मापें
    1. चूहे के निचले पलक को खींचने के लिए धागे को पकड़ने के लिए एक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। 1 मिनट के लिए लोअर फोर्निक्स के समीपस्थ कोने पर थ्रेड को रखें और फिर थ्रेड निकाल दें।
      नोट: आँसू रंग में धागे लाल का गीला हिस्सा बनाते हैं।
    2. थैली के गीले हिस्से की लंबाई की एक छवि को एक शासक के समीप मिलिमीटर चिह्नों के साथ ले लो। दसवीं ओ के लिए गीला लंबाई को मापेंएफए मिलीमीटर एक छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ( जैसे, इमेजजे)।
  2. कॉर्निया / आँसू चिकनाई को मापें
    1. अंगूठी प्रकाशक और एक कैमरा से लैस स्टीरियोमोरिकस्कोप के तहत चूहा रखें। चूहे कॉर्निया के 5 μL खारा को लागू करें। ऊपरी और निचले पलकों को मोटी उंगलियों के साथ ले जाने के द्वारा निष्क्रिय रूप से झपकी ~ 5 बार खारा फैलाने के लिए
    2. कॉर्निया सतह के मध्य में रिंग प्रकाशक को 1.6x बढ़ाई के नीचे फोकस करें। 10 एस के बाद फ़ोटो चित्र प्राप्त करें
      नोट: अंगूठी प्रकाशक जानवरों के कॉर्निया पर डॉट छवियों के दो परिपत्र पंक्तियों को प्रस्तुत करता है। Undistorted बिंदुओं की नियमित रिक्ति एक चिकनी कॉर्निया / आंसू परत का सुझाव देती है।
  3. फ्लोरोसिसिन धुंधला होने के साथ कॉर्नियल क्षति को मापें
    1. चूहे कॉर्निया में 0.2% फ्लोरोसिसिन के 2 μL जोड़ें। आँख की सतह पर फ्लोरोसिसिन डाई फैलाने के लिए उज्ज्वल उंगली से 3 गुना ऊर्ध्वाधर खुली और बंद करें।
    2. पृष्ठभूमि रोशनी बंद के साथ एक ओक्यूलर-इमेजिंग माइक्रोस्कोप के कोबाल्ट ब्लू फिल्टर ( यानी, ~ 400 एनएम) के तहत चित्र प्राप्त करें।
      नोट: बाद में पिछले प्रकाशनों से संशोधित एक ग्रेडिंग सिस्टम द्वारा चित्रों का विश्लेषण किया गया था 23 तब चित्रित किया गया, 0 से 2 तक हरे रंग के धब्बे की संख्या, क्षेत्र और तीव्रता के आधार पर चित्रों का विश्लेषण किया गया, जहां 0 उनकी अनुपस्थिति को इंगित करता है, 1 50 से कम स्थानों के मुंह से दबाना का संकेत देता है, और 2 में 50 से अधिक स्थानों की स्टेंकिंग का संकेत मिलता है।
  4. पेंटोबारबिटल (80 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्राटेरेटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से चूहों को कुचलना। कैंची का उपयोग करके ऊपरी और निचले पलकें निकालें संदंश के साथ परिक्रोसियों के ऊतकों पर नीचे धक्का द्वारा नेत्रगोलक को ठीक और बढ़ाएं। टी को छोडने से दुनिया को मुक्त करेंवह अन्तर्निहित मांसपेशियों, ऑप्टिक तंत्रिका, और उपस्नातक कंजाक्तिवा
  5. संदंश के साथ चूहे नेत्रगोलक की स्थिति को ठीक करें और इसे भूमध्य रेखा के साथ एक आवधिक चीरा के साथ खोलें। लेंस और कांच निकालें विच्छेदित आंखों को बर्फ पर 1.5 एमएल ट्यूब में रखो।
  6. चरण 1.1 में बताए अनुसार अश्रु ग्रंथियां लीजिए। फ्लो साइमेट्री विश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए डिब्बेटेड आंखों के ऊतकों और अश्रु ग्रंथियों को तुरंत प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें।
  7. कोलेजनज़ के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पृथक किया गया और द्वितीय पचन विधि 24 , 25 को प्रेषित किया गया। नेत्रगोलक के ऊतकों 26 में टी-सेल उप-जनसंपर्क को प्रोफाइल करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: एंटीबॉडी के पैनल हैं: एंटी-सीडी 45 एपीसी-साइनाइन 7 (ओएक्स -1), एडीडी-सीडी 3 बीवी 211 (1 एफ 4), एडी-सीडी 4 पीई-साइनाइन 7 (ओएक्स -35), एडीआई सीडी 45 आरसी एलेक्सा 647 (ओएक्स -22), एंटी -CD62 पीई (एचआरएल 1), सीडी -444 एफआईटीसी (ओएक्स -50), और व्यवहार्यता सेल डाई 7-एएडी। सीडी 45 + सीडी 3 में - जनसंख्या, भोले (सीडी 3 + सीडी 45 आरसी + ), प्रभावकारिता स्मृति (टी ईएम, सीडी 3 + सीडी 45 आरसी - सीडी 44 + सीडी 62 एल - ), और सेंट्रल मेमोरी (टी सीएम, सीडी 3 + सीडी 45 आरसी - सीडी 44 + सीडी 62 एल + ) टी कोशिका गेट ।

Representative Results

चित्रा 1 प्रयोग डिज़ाइन को दिखाता है 48 दिन और दिन के दोनों दिन, सूखी आंख के नैदानिक ​​लक्षणों का मूल्यांकन प्रतिरक्त चूहों में किया जाता है। फायर वॉल्यूम फिनोल लाल धागा के गीले भाग की लंबाई के द्वारा दर्शाया गया है। चित्रा 2 चित्रा 2 नियंत्रण से फिनोल लाल धागे के प्रतिनिधि छवियों और डीईडी चूहों से पता चलता है। डीईडी समूह में फिनोल रेड थ्रेड की लंबाई नियंत्रण समूह की तुलना में कम है, जिससे कम आंसू मात्रा का संकेत मिलता है।

फ्लोरेससेन क्षतिग्रस्त कॉर्नियल एपिथेलियम से बांधता है। इस प्रकार, कॉर्नियल क्षति कॉर्नियल फ्लोरोसिसिन धुंधला द्वारा मापा जाता है। डीईडी चूहों की कॉर्नियल सतह पर फ्लोरेससेन स्पॉट 0 से 2 तक वर्गीकृत किया गया था और चूहों को नियंत्रित करने की तुलना में। डीईडी के साथ चूहे नियंत्रण की चूहों ( चित्रा 3 ) से ज्यादा फ्लोरोसिसिन धुंधला हो जाते हैं, जो कॉर्नियल क्षति को सुझाव देते हैं।

कॉर्नियल चिकनाईडीईडी और नियंत्रण चूहों में अंगूठी प्रकाशक द्वारा मूल्यांकन किया गया था। यदि कॉर्नियल की सतह चिकनी होती है, तो उच्च आंसू स्थिरता के साथ, आंख की सतह पर रोशनी की अंगूठी की छवि गोल और परिपूर्ण होती है। छवि का विरूपण कम कॉर्नियल चिकनाई और एक अस्थिर आंसू फिल्म इंगित करता है। अंगूठी की विरूपण डिग्री 0 से 2 की श्रेणी में थी। डीआईडी ​​समूह ( चित्रा 4 ) में एक उच्च अंगूठी के विरूपण स्तर का उल्लेख किया गया था, जिससे कम आंसू स्थिरता का संकेत मिलता है।

चूहों को सूखी आंख के रूप में परिभाषित किया जाता है जब सूखी आंखों के कम से कम दो नैदानिक ​​लक्षण असामान्य होते हैं। 24 प्रतिरक्षित चूहों में, 21 चूहों ने दिन में डीईडी का विकास किया। परिणाम 70 के मुताबिक परिणाम के अनुरूप थे।

प्रवाह साइटमैट्री विश्लेषण से पता चलता है कि सामान्य चूहा नेत्रगोलक ऊतकों में प्रमुख टी-सेल सबसेट सबसे प्रभावशाली स्मृति टी कोशिकाओं ( चित्रा 5 ) है। डीईडी चूहों की आंखों में, सीडी 3 का ~ 70%+ टी कोशिकाएं प्रभावकारी स्मृति टी कोशिकाएं हैं, जबकि नियंत्रण चूहों में, यह संख्या ~ 50% है। डीईडी चूहों के नेत्रगोलक में नियंत्रण के चूहों ( चित्रा 6 ) की तुलना में काफी अधिक प्रभावशाली स्मृति टी कोशिकाएं हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रायोगिक डिजाइन के योजनाबद्ध एलजी: अश्रु ग्रंथि; डीईडी: सूखी आँख रोग; सीएफए: फ्रींड के सहायक को पूरा करें; आईएफए: अपूर्ण फ्रींड के सहायक इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: फेनोल रेड थ्रेड टेअर वॉल्यूम को मापता है फेनोल लाल धागा 1 मिनट के लिए चूहे की दोनों आँखों के समीपस्थ कोने में रखा जाता है और फिर हटा दिया जाता है। representativफिनाल लाल धागा की छवियों, एक शासक के साथ, दोनों नियंत्रण और डीईडी समूहों से चित्र दिखाए गए हैं। ImageJ का उपयोग फिनोल लाल धागे के गीले भाग की लंबाई को मापने के लिए किया गया था। स्केल बार = 1 मिमी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: फ्लोरोससेन स्टेनिंग द्वारा निर्धारित कॉर्नियल एपिथेलियल डेमेज की प्रतिनिधि छवियां प्रत्येक चूहा कॉर्निया को 0.2% फ्लोरोसिसिन के साथ 1 मिनट के लिए दाग दिया गया था और कम से कम 1 एमएल लवण के साथ प्लावित किया गया था। इमेजिंग माइक्रोस्कोप कोबाल्ट ब्लू लाइट के साथ छवियों को लिया गया था। पहला स्तंभ नियंत्रण कॉर्निया के प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है। दूसरे स्तंभ में डीईडी सुविधाओं के साथ चूहों से कॉर्नियल धुंधला होने के प्रतिनिधि चित्र शामिल हैं। हरे फ्लोरोसेंट स्पॉट कॉर्नियल एपिथेलिया से संकेत मिलता है एल नुकसान सभी छवियों को एक ही रंग पैमाने पर बनाया गया था। हरे रंग के धब्बे के क्षेत्र और घनत्व के अनुसार फ्लोरोसिसिन के धुंधले की मात्रा का ठहराव किया जाता था। स्केल बार = 1 मिमी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि कॉर्निया छवियों को रिंग प्रकाशक का प्रतिबिंब दिखा रहा है। चूहा कॉर्नियल / आंसू चिकनाई एक अंगूठी प्रकाश द्वारा मापा गया था। कब्जा किए गए चित्रों में अंगूठी की विरूपण डिग्री रिश्तेदार आंसू स्थिरता का एक उपाय है। बाईं कॉलम नियंत्रण जानवरों में प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है, और सही कॉलम सूखी आंखों को शामिल करने के बाद प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। स्केल बार = 1 मिमीAnk "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: फ्लोट साइटोमेट्री विश्लेषण से प्राप्त डॉट प्लॉट्स। नेत्रगोलक के ऊतकों से अलग टी कोशिकाओं एंटीबॉडी के एक पैनल के साथ दाग थे। सीडी 45 + सीडी 3 + 7 एएडी में - जनसंख्या, सीडी 3 + 7-एएडी -टी कोशिकाएं खोली गईं। सीडी 3 + 7-एएडी - टी कोशिकाओं में, भोले, केंद्रीय स्मृति और प्रभावकारिता स्मृति टी सेल आबादी निर्धारित की गई थी। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: नेत्रगोलक में टी-सेल सबपोपलेशन प्रोफ़ाइल सीडी 3 + सीडी 45 आरसी+ सात्विक टी कोशिकाओं, सीडी 3 + सीडी 45 आरसी - सीडी 44 + सीडी 62 एल - इफेक्टर मेमोरी टी (टी ईएम ) कोशिकाएं, और सीडी 3 + सीडी 45 आरसी - सीडी 44 + सीडी 62 एल + सेंट्रल मेमोरी टी (टी सीएम ) कोशिकाओं को सीडी 3 + टी कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। परिणाम 3 नियंत्रण चूहों और 6 डीईडी चूहों से हैं इसी तरह के परिणाम पृथक अश्रु ग्रंथियों (डेटा नहीं दिखाया गया) से टी कोशिकाओं के विश्लेषण से प्राप्त किए गए थे। अनपेक्षित छात्र के टी-टेस्ट का प्रयोग सांख्यिकीय तुलना के लिए किया गया था। त्रुटि सलाखों एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं * पी <0.05, ** p <0.01 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम पायस की एकरूपता सुनिश्चित करना है। अच्छी तरह से तैयार किए गए emulsions में, एंटीजन पूरी तरह से तेल के साथ लेपित हैं, इंजेक्शन एंटीजन और सतत प्रतिरक्षा उत्तेजना की धीमी गति से रिलीज सुनिश्चित करते हैं। इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण विशेषता लुईस चूहों का उपयोग है। लुईस चूहों को अन्य नस्लों 27 की तुलना में ऑटोइम्यून बीमारी के विकास के प्रति अधिक संवेदनशील होता है।

इस प्रोटोकॉल को दो पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है, जो या तो लैक्रमल ग्रंथि का इस्तेमाल केवल या पुनः संयोजक Klk1b22 20 , 21 वर्तमान प्रोटोकॉल में, ओवलबिमिन प्लस अश्रु ग्रंथि निकालने का उपयोग एंटीजन के रूप में किया जाता है, और एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाएं ऊपरी सतह और अश्रु ग्रंथि से आकर्षित होती हैं, स्थानीय ऊतक क्षति को प्रेरित करती हैं। प्रारंभिक प्रतिरक्षण के बाद सूखी आंख धीरे-धीरे विकसित होकर, दिन में 48% तक ~ 85% तक पहुंच जाता है। को एंटिजेनिक चुनौतीआंख और दिन 48 पर अश्रु ग्रंथि ने सूखी आंखों को बढ़ाया और यह सुनिश्चित करता है कि यह 70 वर्ष तक की पुरानी घटना है।

Klk- प्रेरित DED मॉडल में पुनः संयोजक Klk1b22 की तुलना में, वर्तमान मॉडल में इस्तेमाल किया अश्रु ग्रंथि निकालने और ओवलबिन सस्ता और प्राप्त करने में आसान है। अश्रु ग्रंथि निकालने में भी अन्य प्रोटीन होते हैं, Klk से अलग होते हैं, जो स्वत: प्रतिरक्षा को प्रेरित कर सकते हैं, इसलिए यह निकालने डीईडी उत्प्रेरण पर KML विधि से सैद्धांतिक रूप से अधिक शक्तिशाली है। हमने केवल अमाउंल्य ग्रंथि निकालने के साथ ही चूहों को निशाना बनाया है; यद्यपि डीआईडी ​​विकसित इन इम्युनिज्ड चूहों में, नियंत्रणों की तुलना में नेत्रगोलक के ऊतकों में प्रेरक मेमोरी टी कोशिकाओं में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं हुई थी।

इस तकनीक की सीमा यह है कि मॉडल को प्राप्त करने में 70 दिन लगते हैं। प्रभावकारी मेमोरी टी कोशिका सामान्य चूहा आंखों में मुख्य टी-सेल सबसेट हैं। इस मॉडल में, ऑटोइम्यून डीईडी नतीजे में सीडी 3 + इफेरोर मेमोरी टी कोशिकाओं में वृद्धि हुई है। ड्रग्स जो कि प्रीफ़ईंधन के प्रभाव को कम करने वाले टी कोशिकाओं, जैसे Kv1.3 पोटेशियम चैनल के चयनात्मक अवरोधकों को रोकना, इसलिए ऑटोममिने डीईडी 28 पर एक चिकित्सीय लाभ हो सकता है।

Disclosures

लेखकों का कोई रुचियों का टकराव नहीं है। एलटी को पहले वित्त पोषण और / या एल्कॉन, ऑलरगान, सैटेन, बाउश और लोम्ब, आइलेंस और आईएडेटेक से उपहार प्राप्त हुआ।

Acknowledgements

लेखकों ने जानवरों के निपटान में उनकी मदद के लिए सुश्री टिन मिन क्यूई और डॉ। वेलचैमी अमुथा बरट्टी और उनकी टीम का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा। यह काम NHIC-I2D-1409007, सिंगएचएल्थ फाउंडेशन एसएचएफ / एफजी 586 पी / 2014 और एनएमआरसी / सीएसए / 045/2012 द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermal Scientific 23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra  Becton, Dickinson and company 231141
complete Freund's adjuvant Becton, Dickinson and company 231131
ovalbumin Sigma-Aldrich A5503-10G
incomplete Freund's adjuvant  Sigma-Aldrich F5506-6X10ML
pertussis toxin  Sigma-Aldrich P7208-50UG
fluorescein sodium solution Bausch & Lomb U.K Limited NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sonicator Sonics  Vibra-Cell
phenol red thread Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. NA
Stereo microscope with ring light illuminator and camera Carl Zeiss NA
Micro IV microscope  Phoenix Research Labs NA

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References

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