באמצעות תמסורת אופטית יוצאת דופן לכמת סמנים לב בנסיוב אדם

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

עבודה זו מתאר שיטה ליתוגרפיה nanoimprinting ליצור מערכים חישה באיכות גבוהה עובד על העיקרון של תמסורת אופטית יוצאת דופן. החיישן הוא בעלות נמוכה, עמיד, קל לשימוש, ניתן לזהות טרופונין לב אני בנסיוב בריכוזים הרלוונטית קלינית (99th אחוזון הקיצוץ ∼10-400 pg/mL, בהתאם וזמינותו).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Patra, A., Ding, T., Hong, M., Richards, A. M., Wong, T. I., Zhou, X., Drum, C. L. Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum. J. Vis. Exp. (130), e55597, doi:10.3791/55597 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

עבור פלטפורמה biosensing כי בשלב של טיפול (POC) הגדרות הרלוונטיות הקלינית, מכריעים assay רגישות, הפארמצבטית ויכולת לפקח באופן אמין analytes רקע של נסיוב אדם.

ליתוגרפיה Nanoimprinting (אפס) נעשה שימוש כדי לבדות, במחירים נמוכים, חישה אזורים גדולים כמו 1.5 מ"מ x 1.5 מ"מ. השטח חישה עשוי באיכות גבוהה מערכים של nanoholes, כל אחד עם שטח של-140 nm2. הפארמצבטית נהדר של ניל אפשרו להעסיק אסטרטגיה שבב אחד, אחד-מדידה על 12 משטחים המיוצרים באופן אינדיבידואלי, עם וריאציה צ'יפ לצ'יפס-מינימלי. האסימונים תהודה (LSPR) nanoimprinted מקומי פלזמון משטח נבדקו בהרחבה על היכולת למדוד באופן אמין bioanalyte בריכוזים משתנה מ- 2.5 עד 75 ננוגרם למ"ל בינות הרקע של מתחם biofluid-in הנסיוב הזה במקרה, אנושי. דיוק גבוה של אפס מאפשר הדור של שטחים גדולים חישה, אשר בתורו מבטלת את הצורך מיקרוסקופ, כפי ביוסנסור הזה ניתן לממשק בקלות עם מקור אור מעבדה זמין נפוץ. ביולוגיים אלה ניתן לזהות טרופונין לב בנסיוב עם רגישות גבוהה, על גבול של זיהוי (לוד) של 0.55 ng/mL, אשר הרלוונטית קלינית. הם גם מראים סטיית צ'יפ לצ'יפס-נמוך (בשל האיכות הגבוהה של תהליך ייצור). התוצאות הן commensurable עם immunosorbent מקושרים-אנזים הנמצא בשימוש נרחב assay (אליסה)-לפי מבחני, אך הטכניקה משמרת את היתרונות של פלטפורמת חישה מבוסס LSPR (קרי, amenability ועד המזעור ריבוב, שהופך אותו יותר ריאלי עבור יישומים POC).

Introduction

חיישנים כימיים בהתבסס על מערכים nanohole היו נושא חקירות רבות מאז הדו ח הראשון על שידור אופטי רגיל (EOT) פורסם ע י Ebbesen. et al. ב 19981. כאשר אור שפוגע מערכים תקופתי של מבנים nanohole של הגל משנה מידות, תמסורת משופרת מתרחשת באורכי גל מסוימים. דבר זה מתרחש כאשר האירוע אור זוגות עם בלוך משטח polariton (BW-SPP) ו/או לשפות אחרות משטח plasmons (LSP)2.

העיקרון הפיזי הבסיסי לנצלה כאשר biosensing עם מערכים תקופתי כזה היא פשוטה. ספיחה של מולקולות אל או בקרבת הממשק של מתכת משתנה קבוע דיאלקטרי של המדיום בקשר עם המתכת, בתורו ומזיזה את המיקום של הלהקות שידור בספקטרום. ניתן להתאים את הספקטרום עצמה על ידי ננו-הנדסה צורה, גודל, ההפרדה מרחק3,4,5. על ידי עיצוב, חיישנים בהתבסס על EOT יש להקות אופייני שלהם ספקטרה המאפשרים הקצאות6,7,8 במהלך החקירה של אירועים איגוד מולקולרית. זהו יתרון מכריע על פלטפורמות תהודה (SPR) זמינים מסחרית פלזמון משטח.

חיישנים באמצעות EOT בדרך כלל כרוכים מקור אור אופטית מיושר כך קרן מקבילות הוא האירוע על פני חישה. טכניקות ליצירת משטחים גדולים nanohole, כגון תבניות פולימר שיתוף ו הפרעות-ליתוגרפיה nanosphere, יש עניים הפארמצבטית9. בשל מגבלות אלה במדויק בדיית משטחים גדולים המציגים את התופעה EOT, במיקרוסקופ אופטי נדרשה כראוי למקם את מקור האור ואת גלאי. כדי לפשט את הטכניקה, ליתוגרפיה באיכות גבוהה nanoimprinting הועסק (אפס)10 . זו אפשרה הייצור של חיישן גדול פני שטחים11 (מ מסולם), להסיר את הצורך מיקרוסקופ לחפש את פני השטח חישה על שבב. במקום זאת, חיישן זה יכול לממשק בקלות עם כבל סיב אופטי סיבים סטנדרטי.

מאז הפסגות שידור למערך הזה nanohole הכלולים הנראה לאזור-סגול (ניר), זה מתאים באופן מושלם כדי חישה איגוד אירועים עבור מולקולות סביבה מימית. הפעולה אופטי הצפוי של המערך nanohole היה מדומה. התוצאה אומתה מכן באמצעות מחקרים עם נוזלים של השבירה סטנדרטי אינדקסים (RI). מערך זה שימש אז כדי למדוד את הריכוז של טרופונין לב אני (cTnI) על רקע מורכב בנסיוב אדם. cTnI הוא תקן זהב קליניים לאבחון של אוטם אקוטי.

באמצעות חיישן זה, אפשרי לזהות ולכמת cTnI בנסיוב אדם על מגבלה של זיהוי (לוד) של 0.55 ng/mL, וזו הרלוונטית קלינית. הזיהוי זה יותר מהר מאשר הכי נפוץ טכנולוגיה בתחום זה, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה). יתר על כן, השטח חישה יכול בקלות להיות מחדש, לכן לעשות בה שימוש חוזר. לפיכך, עבודה זו מדגים את ההבטחה של מערכים nanohole כטכנולוגיה מעשית בשלב של טיפול (POC) עבור biosensing בתוך biofluids מורכבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור של חיישן, רכישת הנתונים

  1. הכנת כייר ניקל
    1. המעיל 220 ננומטר בעובי שכבה של קרן אלקטרונים שלילי להתנגד על רקיק 600 מיקרומטר בעובי 4-in סיליקון. כתוב את המערך nanohole מעוצב על זה וופל באמצעות מערכת ליתוגרפיה של אלומת אלקטרונים.
      1. כדי להאיץ את e-קרן לכתוב, לכתוב את דפוסי עם dotmap נמוך (N) של 20 אלף עבור כל גודל שדה מיקרומטר 300 (א) (קרי, שם הן נקודות 0.4 מיליארד ממופה על כל אזור2 מיקרומטר 300, כל נקודה גם ייחשפו על ידי e-הקורה או לא בהתאם לעיצוב תבנית). הגדר את מינון החשיפה להתנגד e-קרן בשביל להתנגד µC 110 ס מ−2 ולכתוב -זרם (I) של 800 הפלסטינית.
        הערה: בכתב e-קרן, מינון החשיפה (D) נשלטת על ידי הזמן חשיפה עבור כל נקודה (Tנקודה), המחושב על-ידי Equation 1 . מינון החשיפה ב µC 110 ס מ−2, הזמן המגורים e-קרן אור על כל נקודה חשוף היא 0.5 µs12. כיוון המערך לוכדת שטח של 1.8 מ מ2, ישנם בסך הכל 36 כתמים של 300-מיקרומטר2 שדה באזורים תפרו יחד למערך nanohole גדולים, זהב אחד טופס.
    2. לפתח את להתנגד במועט כשהפחד צורן 4 אינץ בפתרון מפתח עבור 10 s ולתת כשהפחד להתייבש באוויר.
    3. להפקיד שכבת זרע של מתכת, כגון ניקל, נחושת או אלומיניום, על פרוסת סיליקון סיליקון.
    4. Electroplate כשהפחד מערכת ציפוי באמבט sulfamate ניקל. לבצע את electroplating בשני שלבים. בשלב הראשון, שנמשך 95 דק ', שימוש צפיפות זרם של מיט 0.7 A−2; זה לגמרי ממלא את nanopatterns ניקל. בשלב השני, שנמשך 125 דקות, להשתמש A 12 מיט−2 כדי להגיע מיקרומטר 300 כמו העובי עובש ניקל הסופי (20 ננומטר). ודא כי ערך ה-pH הוא ב- 3.5-3.8 הטמפרטורה ב 52-54 ° C.
    5. להפריד את התבנית ניקל המצע סיליקון על-ידי החלת כוח מכני עדין. להשרות את התבנית ניקל בערך 100 מ של photoresist חיובי להסרת ריאגנט בן לילה כדי לשטוף את השאריות מן להתנגד e-קרן.
    6. זה ב 100 מעלות צלזיוס במשך 3 ח' להאכיל כייר ניקל לתנור ויבש לנקות אותו בפלזמה תצריב המערכת עם גז2 או ב- 10 sccm ו- 100 W למשך 3 דקות.
  2. ייצור של זהב ננו-מבנה
    1. מעיל כייר ניקל ב 150 µL של heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane (FDTS) הרכבה עצמית חד שכבתי (SAM) ציפוי המכונה ב- 80 מעלות צלזיוס.
      הערה: זה יהוו שכבת דבק אנטי, אשר יאפשר את פרידה התבנית photoresist ("demolding") לאחר השלמת השלב nanoimprinting. הפעם ואידוי שלהן צריך להיות 180 s, וזמן התגובה צריכה להיות 900 s.
    2. זאבה את nanopatterns על ב 4 - וופל זכוכית זה מצופה בשכבה ננומטר בעובי 300 של אפס צילום-לריפוי לעמוד בשימוש של ננו-imprinter בלחץ של 10 בר, לטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות...
    3. להעביר את התבנית של photoresist, כשהפחד זכוכית אור UV לריפוי המערכת, photocure עם 75 ס מ mW-2 של חשיפה UV ב-30 s.
      הערה: אם כל השלבים מולאו כראוי כייר ניקל צריך בקלות להיות demolded מ photoresist.
    4. יון תגובתי תצריב (RIE) מערכת, לבצע איכול ריק של photoresist על המצע זכוכית, עם תזרים גז2 O של sccm 10, 50 W 2 s כדי לחשוף את הזכוכית על האזורים עם כניסות.
    5. להפקיד 5 ננומטר בעובי שכבה של כרום (Cr) עבור אדהזיה מתכת ו- 100 ננומטר שכבה של זהב (Au) עבור החיישן plasmonic על כשהפחד זכוכית במכונת התצהיר קרינה. השתמש בקצב התצהיר של 1 Å s− 1 עבור Cr ו- 2 Å s− 1 עבור Au.
    6. לבצע ההמראה של photoresist על ידי פלזמה2 O תצריב למשך 3 דקות ולאחריו שלב 15-s sonification אצטון.
    7. חותכים לקוביות את הדגימה לתוך הצ'יפס 5 מ מ × 5 מ מ. המערך nanohole לכבוש את מרכזי 2 מ מ × 2 מ מ של השבב.
  3. רכישת הנתונים
    1. להרכיב את המערכת כדי להפוך את המידות אופטי כך קרן אור לבן, יציאה עד לסופו של סיבים אופטיים משדר היא ממוקדת, והוא האירוע על פני חיישן (מערך nanohole) ב- 90°.
      הערה: אור מועבר דרך המערך כולו nanohole.
    2. לאסוף את האות המשודר עם סיבים אופטיים מקלט ולתעד אותה עם ספקטרומטר UV-גלוי הפועלים בטווח של 300 עד 1,000 ננומטר.
    3. הגדר הפעם הרכישה לכל אחת מהמסגרות 20 מסגרות גב' ממוצע 100 כדי להשיג את הספקטרום הסופי כדי להנמיך את הרעש במידות.
    4. השתמש בתוכנה ההתוויה כדי לנתח את הנתונים בהתבסס על הפסגות שידור שזוהה בעבר (באמצעות שיטה מבוססת-לורנץ).

2. חיישן בצובר רגישות הבדיקה

  1. להפקיד את הנוזל RI סטנדרטי לתוך התא נוזלי, עם רי משתנה מ- 1.31 ל 1.39.
  2. לטבול את השבב חיישן בתוך הנוזל RI סטנדרטי, ליישר אותה בעזרת קרן אור לבן. להשיג את הספקטרום שידור.
  3. השבב חיישן אחרי כל מדידה עם ריאגנט surface-active ניקוי יבש ונקי זה עם גז חנקן.

3. חיישן שינוי פני השטח

  1. לפני כל שינוי כימי, לנקות את האסימונים חיישן על ידי טבילה רציפים ב אלכוהול איזופרופיל, אצטון ומים יונים. יבש בטמפרטורת החדר זרם של גז חנקן יבש.
  2. דגירה האסימונים חיישן ב פתרון ethanolic של 0.4 מ מ 10-carboxy-1-decanethiol ו- 1.6 מ מ 1-octanethiol במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: זה יהוו אמין-תגובתי הרכבה עצמית חד שכבתי (SAM).
  3. השתמש אתנול כדי לשטוף היטב ויבשה בטמפרטורת החדר.
  4. להכין תערובת של 75 מ מ sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) carbodiimide 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) 15 מ מ (EDC). לטבול את הצ'יפס, ולהניחו למשך 15 דקות.
    הערה: זה יהיה להפעיל קבוצה קרבוקסילית של סאם.
  5. במקום 50 µL של µg/mL 200 נוגדן אנטי טרופונין פתרון שנעשו במאגר אצטט pH 4.5 על פני חיישן, דגירה למשך 30 דקות.
  6. לבטל את אסטרים unreacted במועט השבב חיישן בפתרון ethanolamine-HCl 1 מ' למשך 15 דקות.
  7. שוטפים את השבב עם מים יונים ומייבשים אותו בזרם של גז חנקן יבש בטמפרטורת החדר.

4. cTnI Assay

  1. לחסום כל איגוד שאינם ספציפיים על-ידי spotting 100 µL של 1% פתרון אלבומין שור (BSA) על גבי המשטח.
תקופת דגירה של 15 דקות.
  • יש לשטוף את האסימונים חיישן שלוש פעמים בתמיסת באגירה פוספט (PBS). הכנס את השבב לתוך התא מדידה כדי להקליט את הספקטרום שידור.
    הערה: זהו הספקטרום הפניה.
  • במקום 50 µL של cTnI רגיל על גבי משטח השבב, דגירה בסביבה לחה למשך 30 דקות.
  • לשטוף את האסימונים חיישן שלוש פעמים בפתרון PBS והוספתו לתוך התא מדידה כדי להקליט את הספקטרום שידור.
    הערה: זהו הספקטרום שלאחר מחייב.
  • להטביע את השבבים 50 מ מ גליצין-HCl (pH 2) עבור 1 דקות, ואז לשטוף בתמיסה PBS שלוש פעמים לחדש את פני השטח של שבב. למדוד את הספקטרום שידור ב- PBS כדי לאמת את ההצלחה של השלב התחדשות.
  • 5. פני השטח פלזמון תהודה (SPR) מדידה

    1. להפעיל את שבב חיישן SPR מרובבת במערכת SPR עם מאגר PBS-T.
      הערה: ההרכב של מאגר PBS-T הוא 20 מ מ נה-פוספט, 150 מ מ NaCl ו 0.05% Tween 20. ה-pH הוא 7.4.
    2. השתמש cTnI סטנדרטים הנוגדן, כפי שמתואר בשלב 4.
    3. להפעיל 3 מתוך 6 הערוצים עם תערובת של EDC (0.2 מ') sulfo-NHS (M 0.05) עבור 5 דק לבצע זריקה 5 דקות של µg/mL 50 נוגדן 560, זריקה 5-מין של פתרון ethanolamine-HCl 1 מ'.
    4. לסובב את שבב חיישן 90 ° ולהזריק את הסטנדרטים cTnI בריכוזים שונים (75, 30, 7.5 ו 2.5 ng/mL).
    5. להתבונן הבניין כדי הנוגדן בנקודות של אינטראקציה על השבב בזמן אמת באמצעות מדידה SPR.
    6. צור מחדש את השבב באמצעות הזרקת 50 מ מ גליצין-HCl (pH 2) עבור 1 דקות.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    הגדרת אופטי עבור המידות מוצג איור 1A. תמונה של המערך nanohole בפועל הוא נתון איור 1B. כדי להבין את הפיזיקה נהיגה תהליך חישה, שימש את תוכנת סימולציה COMSOL כדי לדמות את ההתפלגות של השדה plasmonic סביבה מימית. התוצאות של הסימולציה היו קשורות ואז המדידה בפועל. מחקר שפורסם בעבר מכיל פירוט ההנחות עשה ואת הפרמטרים המשמשים את הסימולציה11,13. הממדים הפיזיים המשמש כדי לדמות את השדה plasmonic עבור המערך nanohole היתה כדלקמן: p = 400 nm, D = 150 ננומטר, ו- T = 100 ננומטר. הקליטה ואפקטים פיזור גם נלקחים בחשבון14 בעת חישוב הספקטרום שידור. הקשת מדומה מושווה הספקטרום השפעול נמדד באיור 1C. את מדומה והן ספקטרום נמדד להעביר את קיום ארבע להקות מ-450 850 ננומטר. הלהקה-495 ננומטר מקביל המעבר interband של זהב. שלוש להקות עוקבות, מעתה בשם להקות I-III בסדר עולה לפי אורך גל, ממוקמים 560 nm, 645 ננומטר, 712 nm, בהתאמה. להקות I-III נצפו שיהיה מקובל היישור הלהקות השפעול נמדד, הממוקמת 558 nm, 638 ננומטר, 724 ננומטר. כפי nanoholes מפוברק כמעט מעגלי בכושר, הלהקות האלה לא צריך להיות רגיש קיטוב האור התקרית. בנוסף, ההדמיה COMSOL מאפשר את פריט חזותי ישיר של התפלגות שדה-להקות אלה שבו הם מופיעים בתא יחידה של מבנה תקופתי (איור 1D). היחידה על סרגל הצבע היא התפלגות שדה אופטי (V/m) המתבטא בקנה מידה יומן. העוצמה הגבוהה ביותר נצפתה היה בסביבות 4.7 (V 50,119/m). לעומת האינטנסיביות של שכיחות שימוש בהדמיה (4,340 V/m), הגודל הזה מייצג שיפור שדה 11.5-fold. השדות האלקטרו-מגנטיים ללהקות ש-i ו- III נרשמו נקודתית על פני המצע זכוכית. לעומת זאת, הלהקה השנייה בעיקר מקומי על השפה העליונה של nanohole ואף נבחר איתור bioanalyte. איור 1E מדגים ספקטרום שידור של המערך nanohole נוזלים של אינדקסים השבירה ידוע, אשר ומגוונות 1.31 ל 1.39. שלוש להקות שידור, המתאים להקות אני II, III, נצפו בטווח הספקטרום של 400-900 ננומטר. משמרת אדום נצפתה עם שינוי RI. סדר הגודל של המשמרת בעקבות הלהקה רצף II > הלהקה אני > הלהקה השלישי. איור 1F היא איחוד של האדום שנצפה משמרות של להקות I, II, ו- III. הרגישות בצובר מחושב עבור הלהקה הייתי nm 322/RIU ללהקה השני היה nm 345/RIU, ללהקה השני היה nm 202/RIU.

    איור 2A מכיל את הסכמה של התופעה חישה בפעולה. איור 2B מציג את השינוי ספקטרום שידור אחרי מולקולות טרופונין לב לאגד השטח שבב functionalized. בריכוזים נמוכים, יש משמרת ליניארי בלהקה עם רמת טרופונין. משמרת התנוחה הלהקה יכול להיות מותאם היטב איזותרמה מחייב עם ערך2 R של 0.995. על התבוננות מקרוב, 30 ננוגרם למ"ל נראה הריכוז בו איזותרמה מציין תחילתה של רוויה (איור 2C).

    איור 3 א מציג את sensorgram מן האינטראקציה של סרום עם משטח השבב של שבב GLC ששונה התקנה XPR36. לכידתו של cTnI מוצג על ידי עליית האות. לאחר מכן, הדיסוציאציה של cTnI במדיום PBST (1 x PBS, tween 0.05% 20) ניתן לראות גם האות תקטן מ- 120-660 ש Injecting גליצין (הפתרון התחדשות) עבור 1 דקות צמצמה את האות ל- 0, המציין את ההתחדשות של המשטח חישה דרך ההתנתקות מלאה של cTnI. Sensorgram עבור האגודה עוקבות של cTnI אל פני השטח שבב regenerated מוצג על שיבוץ של איור 3A. באותו הפרוטוקול (קרי, אנו ממליצים גליצין פתרון 1 דקות) שימש להתחדש על פני מערך nanohole. איור 3B מראה המיקום של הלהקה 2 משמרות בחזרה למיקומו המקורי, ובכך מאשרת להצלחת השלב התחדשות.

    Figure 1
    איור 1 : אפיון של המערך nanohole. (א) פשוטה סכמטי של ההתקנה ניסיוני. (B) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה של המערך nanohole. (ג) השוואה בין הספקטרום מדומה הספקטרום השפעול נמדד שידור סביבה מימית. הפצה (D) ליד השדה כפי מדומה ב- COMSOL ללהקות I ו- III, ראה תצוגת חתך הרוחב. האדום מייצג את התפלגות שדה-חזק יותר. יחידת שמוצג על סרגל הצבע היא | E |, ההתפלגות של השדה אופטי, נלקח בקנה מידה יומן. (E) הנמדד השפעול ספקטרה שידור של המערך nanohole בסביבות עם שבירה תקן נוזלים (1.31 ל 1.39). (F) לרשימת תפוצה רגישויות הלהקות שלושה הילוכים (I-III) לשינויים RI נמדד הנראה למגוון ניר. ריבוע שחור: הלהקה אני, עיגול אדום: הלהקה השנייה, משולש כחול: להקת השלישי. האיור השתנה מ דינג. et al. 14 תחת רישיון CC על ידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 2
    איור 2 : המערך nanohole משמש ביוסנסור. תיאור סכמטי של המערך nanohole בשימוש כמו ביוסנסור לגילוי cTnI (א). (B) בשינוי השידור קשת החיישן בעת אינטראקציה עם האדם cTnI-ריכוז 30 ננוגרם למ"ל על רקע של סרום. כחול: לפני אינטראקציה, אדום: לאחר אינטראקציה. המעגל מנוקד מציין את הלהקה במעקב. (ג) המשמרת בגל ללהקה II בריכוזים שונים של טרופונין (2.5 ng/mL, 7.5 ng/mL, 30 ננוגרם למ"ל ו 75 ng/mL).קווי השגיאה להראות את סטיית התקן בקרב n = 3 צ ' יפס המשמש עבור כל אחת מהמידות. האיור השתנה מ דינג. et al. 14 תחת רישיון CC על ידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 3
    איור 3 : התחדשות של המשטח חיישן. (א) sensorgram SPR מ XPR36 מציג ההזרקה של analyte (cTnI) ואחריו ההזרקה של גליצין לחדש את פני השטח של חיישן. זיהוי עוקבות מדידות של ריכוזים שונים של cTnI רקע סרום מוצגים על שיבוץ. הבר האדום מייצג את הערך הראשוני, בעוד הבר השחור מציג את המידה לאחר לרגנרציה של פני השטח עם פרוטוקול שתוארה בטקסט. (B) התזוזה בממוצע אורכי הגל של הלהקה נצפתה לאחר התחדשות של שבב ביוסנסור nanohole. Σ: סטיית התקן של משמרות באורך הגל של המיקום הלהקה. האיור השתנה מ דינג. et al. 14 תחת רישיון CC על ידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    הדמיית האינטראקציה בין האירוע האור nanostructures את עושה את זה ניתן לזהות הפסגה המתאים (בספקטרום שידור), shift אשר ניתן להקליט כפונקציה של ריכוז analyte. חשוב לציין כי הלוקליזציה של הלהקות לגבי המבנה של החיישן הוא חיוני כדי הבחירה של הלהקה נכון, ניתן לעקוב במשמרת שלו לחוש את analyte. הפריט החזותי יכולה להיות מושגת באמצעות סימולציות. זה חיוני גם העיצוב של האופטימלית מבנה המאפשר את biosensing של analytes. כפי שניתן לראות כאן, להקות I ו- III מותאמים על הממשק זכוכית-זהב, ולכן הן לא שימושי עבור biosensing. רכיב LSPR הבולטים ניתן לצפות בלהקה II. זה מראה באורך קצר דעיכה, הוא מקומי על שפת nanoholes. בתור שכזה, זה משאיל את עצמו היטב כדי בשימוש עבור חישה analyte ריכוזים. איכות nanostructures מפוברק על המערך כולו חיוני גם האיכות של ספקטרה שנאספו. מבנים לא אחיד תציג חפצי אמנות.

    פיזור ונמרצים להיערכותם הקליטה ליצור חפצי במדידה מימית. היחס הכללי אות לרעש גם מופרעת על ידי הנוכחות של המדיום מימית. במקרה ישנם מספר להקות מתאימים ניתן לנטר את משמרות של מי עבור biosensing, יש לקחת בחשבון את הנקודות הבאות. ב- sub 600 אורכי גל nm, הספקטרום שידור הנצפה מושפע במידה ניכרת ספיגת החלבון, פיזור חלקיקים. מצד שני, שימוש אורכי גל גדול יותר מאשר 900 ננומטר יכול ליצור בלבול על-ידי הסתרת את האותות המשמשים כבסיס חשוב שמקורם האירועים מחייבת, כמו באזור, הספיגה על ידי מים גדל עם אורך גל. לכן, עבור מערכות חישה analytes בסביבה מימית, הלהקה השנייה הינו ממוקם בצורה אופטימלית מבחינת אורך הגל. יכול להיות שנצפו על סטייה קטנה במדידה של הלהקה עמדה. זו נגרמת על ידי גודל חיישן גדול. בעוד החיישן גדול מיתרגם בסופו של דבר קצר רכישת פעמים כי כל הפיקסלים זיהוי עכשיו לראות זרימה גדולה יותר-יותר-הרגיל של פוטונים, זה גם באופן שלילי משפיע הרעש. למעשה, אם האוסף אות לא מתבצע כהלכה מיזוג נתונים בצורה לא אופטימלית המיועד, ניתן לצפות הרבה רעש. על ידי חישוב ממוצע של האות שנאספו מעל 100 מסגרות15, ניתן להוריד את רמת הרעש. אמנם יש דרכים אחרות כדי להפיק אותות LSPR, בעיקר מן חלקיקי זהב16, המערך nanohole הוא הרבה יותר ריאלי ליישם בתבנית ניידת עם מיקרופלואידיקה. כל המתקן יכול לשמש ליישומים POC בגלל הקלות של אוטומציה של התהליך כולו, האפשרות של התחדשות פני השטח חישה.

    פרוטוקול נסיוני זה תוכנן כדי למזער את ניסיוני שגיאה באמצעות מצב הילוכים במקום השתקפות. זה חותך חפצי אמנות האפשר משינויים זווית-של-שכיחות. חשוב גם לציין את מהות שלב 3.4, קריטי כאשר הנוגדן הוא תפור על פני השטח חיישן. זה חיוני כדי לשמר את תגובתיות של sulfo-NHS והן EDC. גם נמצא כי המעבר מ- NHS כדי sulfo-NHS היה קריטי עבור יציבות משופרת. אם הדגימות לשימוש חוזר, אחסון תחת חנקן נוזלי מומלץ. הטכנולוגיה פלטפורמה אשר מוצג כאן ניתן לעקוב אחר סמנים קליניים בשינוי פני השטח המתאים.

    עד כה, החדירה של חיישנים LSPR הוגבלה על ידי המגבלות על היכולת ליצור משטחי מגיב על פני שטחים גדולים עם הפארמצבטית דומה לזה של תעשיית מוליך למחצה. משטחים חישה גדולים יכולים להיות לממשק בקלות עם אופטיקה סטנדרטי וחסכונית. דיוק בתהליך ייצור גם להפחית את צ'יפ לצ'יפס-השונות, צוואר בקבוק קריטי שיפור באמינות המדידות, אשר הוא קריטי בקביעת קליני. בהקשר של מכשיר רפואי, בו מידות טורי נדרשים, הפארמצבטית של התחדשות פני השטח חיונית גם. זה גם הוכח כי פרוטוקול אופטימלית עבור התחדשות פני השטח חישה יכול להיות נוסדה בשנת פלטפורמה SPR זמינים מסחרית, אז בהצלחה לתרגם את המערך nanohole. ניתן לחשב בקלות היעילות של התחדשות עבור המערך nanohole, ההתאמה של פני השטח regenerated למדידות חוזר יכול להיות מוערך. בעת יצירת כימיה משטח עמיד שינוי והתחדשות פרוטוקולים, חיישנים LSPR יכול להיות רגיש אך פשוט פלטפורמה לגילוי bioanalyte בזמן אמת. קל לחזות מראש שלה השפעה משמעותית על הטיפול בחולה. זה כדי לציין רגישות מוחלטת של החיישן אינו יכול להתאים הבדיקות מבוססות-אליסה המתקדמים ביותר. כמה אסטרטגיות הגברה צריך להיות מתוכנן להגדיל את הרגישות. אפילו במתכונתה הנוכחית, טכנולוגיה זו מייצג שיפור משמעותי ביחס nanoimprinted הוקמה LSPR פרוטוקולים, כיוון שהוא מגדיר מגבלה נמוכה יותר חדש איתור ללא תווית סמן לב וכלי דם באמצעות שידור מבוסס אופטי כיוונון. הטכנולוגיה מתפתח לקראת יישום מעקב בזמן אמת של סמנים ביולוגיים חשובים קלינית מרובים. שיפורים נוספים רכישת נתונים (למשל, גלאי עם רזולוציה טובה יותר), עיבוד אותות הבאים יכול לעזור חיישנים מבוססי LSPR להשיג זאת.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

    Acknowledgments

    AP מאשר התמיכה של פרופ T Venkatesan, הבמאי, הננו נוס, יוזמה ננוטכנולוגיה ו- Office של סגן נשיא (באוניברסיטה הלאומית של סינגפור) (R-398-000-084-646). למצ ח מאשר את התמיכה של סינגפור משרד של בריאות רפואי מחקר המועצה הארצית תחת שלה המטפל מדען מימון ערכה, NMRC/CSA/035/2012 ולאחר באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Electron Beam Lithography setup Elionix ELS 700
    o-Xylene Sigma Aldrich 95662
    EB resist Sumitomo NEB-22A2
    Developer reagent Shipley Company Microposit MF 321
    Electroplating machine Technotrans AG RD 50
    Photoresist stripper  Rohm and Haas Electronic Materials LLC Microposit Remover 1165
    Etching System Trion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl)trichlorosilane  Gelest (PA, USA) 78560-44-8
    SAM coater  Sorona Inc. AVC 150M
    Photo-curable NIL resist micro resist technology GmbH mr-UVCur21-300nm
    Light Curing System Dymax  Model 2000 Flood
    E-beam deposition machine Denton Explorer
    UV-visible spectrometer  Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Standard refractive index liquids  Cargill Inc (Cedar Grove, USA) 18032
    Plotting software Origin Origin Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol  Dojindo Laboratories (Japan) C385-10
    1-octanethiol  Sigma-Aldrich, MO, USA 471386
    Sulfo-N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  BioRad (CA, USA) 1762410
    Anti-troponin antibody 560 Hytest (Finland) 4T21
    Ethanolamine-HCl solution BioRad (CA, USA) 1762450
    Surface Plasmon Resonance setup BioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR chip BioRad GLC
    Human cTnI standard Phoenix Pharmaceuticals EK -311-05
    Glycine-HCl BioRad (CA, USA) 1762221

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391, (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200, (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10, (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89, (12), 121106 (2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452, (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4, (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5, (5), 818 (2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29, (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105, (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19, (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13, (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29, (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10, (3), 0120974 (2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84, (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85, (20), 9564-9571 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics