मानव सीरम में हृदय के निशान यों तो असाधारण ऑप्टिकल संचरण का प्रयोग

Bioengineering

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Summary

यह काम एक nanoimprinting लिथोग्राफी विधि का वर्णन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले संवेदन arrays है कि असाधारण ऑप्टिकल संचरण के सिद्धांत पर काम करते हैं । the कम लागत, मजबूत, उपयोग करने के लिए आसान है, और नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर सीरम में कार्डियक ट्रोपोनिन मैं का पता लगा सकते हैं (९९वें शतमक कटऑफ ∼ 10-400 pg/

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Patra, A., Ding, T., Hong, M., Richards, A. M., Wong, T. I., Zhou, X., Drum, C. L. Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum. J. Vis. Exp. (130), e55597, doi:10.3791/55597 (2017).

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Abstract

एक संवेदन मंच के लिए बिंदु की देखभाल (POC) सेटिंग्स, परख संवेदनशीलता, reproducibility, और मज़बूती से मानव सीरम की पृष्ठभूमि के खिलाफ analytes निगरानी करने की क्षमता में नैदानिक प्रासंगिकता है महत्वपूर्ण हैं ।

Nanoimprinting लिथोग्राफी (शूंय) के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था, कम कीमत पर, संवेदन क्षेत्रों के रूप में बड़े रूप में १.५ mm x १.५ mm । संवेदन सतह nanoholes के उच्च निष्ठा arrays से बना था, के बारे में १४० एनएम के एक क्षेत्र के साथ प्रत्येक2। शूंय के महान reproducibility यह एक एक चिप, 12 व्यक्तिगत रूप से निर्मित सतहों पर एक माप रणनीति, ंयूनतम चिप के साथ चिप भिंनता को रोजगार संभव बना दिया । इन nanoimprinted स्थानीयकृत सतह plasmon अनुनाद (LSPR) चिप्स बड़े पैमाने पर उनके लिए मज़बूती से एक जटिल तरल पदार्थ की पृष्ठभूमि के बीच २.५ से ७५ एनजी/एमएल से अलग सांद्रता पर एक bioanalyte उपाय करने की क्षमता पर परीक्षण किया गया-इस मामले में, मानव सीरम । शूंय के उच्च निष्ठा बड़े संवेदन क्षेत्रों, जो बारी में एक खुर्दबीन की जरूरत को समाप्त की पीढ़ी में सक्षम बनाता है, के रूप में इस के रूप में इस तरह के सेंसर आसानी से एक सामांयतः उपलब्ध प्रयोगशाला प्रकाश स्रोत के साथ इंटरफेस किया जा सकता है । ये एक उच्च संवेदनशीलता के साथ सीरम में कार्डियक ट्रोपोनिन का पता लगाने कर सकते हैं, का पता लगाने की सीमा पर (लोद) ०.५५ एनजी/एमएल, जो नैदानिक रूप से प्रासंगिक है । वे भी कम चिप को दिखाने के लिए चिप विचरण (निर्माण प्रक्रिया की उच्च गुणवत्ता के कारण) । परिणाम व्यापक रूप से इस्तेमाल किया एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा)-परख के साथ commensurable रहे हैं, लेकिन तकनीक एक LSPR आधारित संवेदन मंच के लाभ (यानी, miniaturization और division के लिए सुविधा बरकरार रखती है, यह बना POC अनुप्रयोगों के लिए अधिक व्यवहार्य) ।

Introduction

रासायनिक nanohole arrays पर आधारित सेंसर असाधारण ऑप्टिकल ट्रांसमिशन (EOT) पर पहली रिपोर्ट के बाद से कई जांच का विषय रहा है Ebbesen एट अल द्वारा १९९८ में प्रकाशित किया गया था1। जब उप-तरंग दैर्ध्य आयामों की nanohole संरचनाओं के आवधिक सरणियों पर प्रकाश pings, बढ़ाया संचरण विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर होता है । यह तब होता है जब घटना प्रकाश जोड़ों के साथ Bloch-लहर सतह polariton (BW-एसपीपी) और/या स्थानीयकृत सतह plasmons (LSP)2

अंतर्निहित शारीरिक सिद्धांत का दोहन जब ऐसे आवधिक arrays के साथ संवेदन सरल है । सोखना पर या धातु के इंटरफेस के पास अणुओं की धातु के साथ संपर्क में मध्यम के ढांकता स्थिरांक परिवर्तन, बारी में स्पेक्ट्रम में संचरण बैंड के स्थान स्थानांतरण । स्पेक्ट्रम ही नैनो द्वारा समायोजित किया जा सकता है इंजीनियरिंग आकार, आकार, और जुदाई दूरी3,4,5। डिजाइन द्वारा, EOT पर आधारित सेंसरों उनके स्पेक्ट्रा में विशेषता बैंड है कि विशिष्ट कार्य6,7,8 आणविक बाध्यकारी घटनाओं की जांच के दौरान की सुविधा है । यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सतह plasmon अनुनाद (SPR) प्लेटफार्मों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है ।

EOT का उपयोग कर सेंसर आमतौर पर एक प्रकाश स्रोत ऑप्टिकली ऐसे गठबंधन शामिल है कि एक collimated बीम संवेदन सतह पर घटना है । तकनीक बड़ी nanohole उत्पंन करने के लिए सतहों, जैसे सह बहुलक टेंपलेट्स और हस्तक्षेप और nanosphere लिथोग्राफी, गरीब है reproducibility9। सही में इन सीमाओं के कारण बड़ी सतहों कि EOT घटना, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप दिखाने के लिए सही ढंग से प्रकाश स्रोत और डिटेक्टर की स्थिति की आवश्यकता थी बनाना । तकनीक को सरल बनाने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले nanoimprinting लिथोग्राफी (निल)10 कार्यरत थे । यह बड़े सेंसर सतह क्षेत्रों के उत्पादन में सक्षम11 (मिमी पैमाने), एक खुर्दबीन के लिए एक चिप पर संवेदन सतह के लिए देखने के लिए की जरूरत को हटाने । इसके बजाय, यह सेंसर आसानी से एक मानक फाइबर ऑप्टिक केबल के साथ इंटरफेस किया जा सकता है.

के बाद से इस nanohole सरणी के लिए संचरण चोटियों के निकट अवरक्त क्षेत्र (NIR) को दिखाई में समाहित कर रहे हैं, यह पूरी तरह से एक जलीय वातावरण में अणुओं के लिए बाध्यकारी घटनाओं संवेदन के लिए अनुकूल है । nanohole सरणी के ऑप्टिकल व्यवहार की उंमीद अनुकरणीय था । इसके बाद परिणाम मानक अपवर्तन सूचकांक (आरआई) के तरल पदार्थ के साथ अध्ययन के माध्यम से सत्यापित किया गया था । यह सरणी तो मानव सीरम के जटिल पृष्ठभूमि में कार्डियक ट्रोपोनिन I (cTnI) की एकाग्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. cTnI तीव्र रोधगलन के निदान के लिए नैदानिक स्वर्ण मानक है ।

इस सेंसर का उपयोग करना, यह पता लगाने के लिए संभव है और मानव सीरम में cTnI का पता लगाने की सीमा पर (लोद) ०.५५ एनजी/एमएल, जो नैदानिक रूप से प्रासंगिक है. पता लगाने के इस डोमेन में सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रौद्योगिकी की तुलना में बहुत जल्दी है, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) । इसके अलावा, संवेदन सतह आसानी से पुनर्जीवित किया जा सकता है और इसलिए पुनः प्रयोग किया । इसलिए, यह काम जटिल उपद्रवों के भीतर संवेदन के लिए एक व्यवहार्य बिंदु की देखभाल (POC) प्रौद्योगिकी के रूप में nanohole arrays के वादे को दर्शाता है ।

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Protocol

1. संवेदक और डेटा के अधिग्रहण का निर्माण

  1. निकली मोल्ड की तैयारी
    1. कोट एक २२० एनएम नकारात्मक इलेक्ट्रॉन बीम की मोटी परत एक ६०० µm-मोटी 4-सिलिकॉन वेफर में पर विरोध । इस वेफर पर एक इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर डिजाइन nanohole सरणी लिखें ।
      1. ई-बीम लिखने में तेजी लाने के लिए, प्रत्येक ३०० µm क्षेत्र आकार (एक) के लिए एक कम dotmap (N) 20k के साथ पैटर्न लिखें (यानी, वहां ४००,०००,००० प्रत्येक ३०० µm2 क्षेत्र पर मैप डॉट्स रहे हैं, और प्रत्येक डॉट या तो ई द्वारा उजागर किया जाएगा बीम या नहीं , पैटर्न डिजाइन पर निर्भर करता है) । ११० µC cm− 2 को प्रतिरोध के लिए ई-बीम का विरोध करें और ८०० pA के वर्तमान (I) पर लिखें ।
        नोट: ई-बीम लेखन में, जोखिम खुराक (डी) प्रत्येक डॉट के लिए जोखिम समय (टीडॉट), द्वारा परिकलित द्वारा नियंत्रित किया जाता है । Equation 1 ११० µC सेमी− 2पर एक्सपोज़र खुराक के लिए, प्रत्येक उजागर डॉट पर ई-बीम जमाये समय ०.५ µs12है । के बाद से सरणी १.८ mm2के एक क्षेत्र कब्जा, वहां ३०० के ३६ पैच की कुल रहे है-µm2 क्षेत्र के एक साथ सिले एक बड़े, सोने nanohole सरणी के रूप में क्षेत्रों ।
    2. 10 एस के लिए डेवलपर समाधान में 4 इंच सिलिकॉन वेफर विसर्जित और हवा में वेफर शुष्क दे द्वारा प्रतिरोध विकसित करना ।
    3. ऐसे निकेल, तांबा, या एल्यूमीनियम के रूप में एक धातु के एक बीज परत जमा, सिलिकॉन वेफर पर ।
    4. एक निकल sulfamate स्नान में एक चढ़ाना प्रणाली में वेफर बिजली । दो चरणों में विद्युत बाहर ले । ९५ मिनट तक चलने वाले पहले चरण में, ०.७ एक डीएम− 2के वर्तमान घनत्व का उपयोग करें; यह पूरी तरह से निकेल के साथ nanopatterns भरता है । दूसरे चरण में, १२५ मिनट तक टिकाऊ, 12 एक डीएम− 2 का उपयोग करने के लिए अंतिम निकल मोल्ड मोटाई (20 एनएम) के रूप में ३०० µm तक पहुंचने । सुनिश्चित करें कि पीएच मान ३.५-३.८ पर है और तापमान ५२-५४ डिग्री सेल्सियस पर है ।
    5. कोमल यांत्रिक बल लागू करके निकल मोल्ड सिलिकॉन सब्सट्रेट से अलग । दूर ई बीम प्रतिरोध से अवशेषों को धोने के लिए सकारात्मक photoresist हटाने के एजेंट के बारे में १०० मिलीलीटर में निकल मोल्ड सोख ।
    6. एक ओवन में निकल मोल्ड फ़ीड और 3 घंटे के लिए १०० ° c पर यह सूखी हे2 गैस के साथ एक प्लाज्मा नक़्क़ाशी प्रणाली में यह साफ 10 sccm और 3 मिनट के लिए १०० डब्ल्यू ।
  2. गोल्ड nanostructure का निर्माण
    1. कोट १५० heptadecafluoro के µ एल-1, 1, 2, 2-tetrahydrodecyl trichlorosilane (FDTS) में निकल मोल्ड पर एक स्व-विधानसभा monolayer (सैम) कोटिंग मशीन पर ८० डिग्री सेल्सियस ।
      नोट: यह एक विरोधी चिपकने वाला परत है, जो photoresist से मोल्ड की जुदाई सक्षम हो जाएगा फार्म ("" nanoimprinting कदम के पूरा होने के बाद मोल्ड ") होगा । vaporizing समय १८० एस होना चाहिए, और प्रतिक्रिया समय ९०० एस होना चाहिए ।
    2. एक 4 पर nanopatterns छाप-कांच वेफर में है कि एक ३०० एनएम-फोटो की मोटी परत के साथ लेपित किया गया है इलाज निल 10 बार के दबाव में एक नैनो-unprinter का उपयोग कर विरोध और ४० ° c के 10 मिनट के लिए तापमान ।
    3. मोल्ड हस्तांतरण, photoresist, और एक यूवी प्रकाश इलाज प्रणाली के लिए कांच वेफर और photocure 30 एस के लिए यूवी जोखिम के ७५ मेगावाट सेमी-2 के साथ ।
      नोट: यदि सभी कदम सही ढंग से पालन किया गया है, निकल मोल्ड आसानी से photoresist से ढाला जाना चाहिए ।
    4. एक प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (रिे) प्रणाली में, ग्लास सब्सट्रेट पर photoresist के एक खाली खोदना प्रदर्शन, के साथ एक हे2 गैस प्रवाह के साथ 10 sccm, पर ५० डब्ल्यू 2 एस के लिए इंडेंटेड क्षेत्रों पर शीशे का पर्दाफाश करने के लिए ।
    5. एक इलेक्ट्रॉन बीम जमाव मशीन में कांच वेफर पर plasmonic संवेदक के लिए धातु आसंजन और सोने की १०० एनएम परत के लिए (सीआर) क्रोमियम की एक 5 एनएम-मोटी परत जमा । Au के लिए 1 å s− 1 Cr और 2 å s− 1 के लिए एक जमाव दर का उपयोग करें ।
    6. एसीटोन में एक 15 एस sonification कदम के द्वारा पीछा 3 मिनट के लिए photoresist के द्वारा लिफ्ट-बंद करो ओ2 प्लाज्मा ।
    7. 5 मिमी × 5 मिमी चिप्स में नमूना पासा । nanohole सरणी मध्य 2 मिमी चिप के 2 मिमी × पर कब्जा होगा ।
  3. डेटा का अधिग्रहण
    1. उपकरण स्थापित करने के लिए ऑप्टिकल माप ऐसा है कि सफेद प्रकाश ट्रांसमीटर के अंत के माध्यम से बाहर निकलने की एक किरण ऑप्टिकल फाइबर collimated है और सेंसर सतह (nanohole सरणी) पर ९० डिग्री पर घटना है ।
      नोट: प्रकाश पूरे nanohole सरणी के माध्यम से फैलता है ।
    2. रिसीवर ऑप्टिकल फाइबर के साथ संचारित संकेत लीजिए और यह एक यूवी दिखाई स्पेक्ट्रोमीटर के साथ रिकॉर्ड ३०० से १,००० एनएम की सीमा के भीतर ऑपरेटिंग ।
    3. माप में शोर कम करने के लिए अंतिम स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए 20 ms. औसत १०० फ्रेम करने के लिए प्रत्येक फ्रेम के लिए अधिग्रहण समय निर्धारित करें ।
    4. पहले से पहचाने गए ट्रांसमिशन चोटियों पर आधारित डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्लॉटिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (एक Lorentz-आधारित पद्धति का उपयोग करके).

2. सेंसर थोक संवेदनशीलता परीक्षण

  1. तरल सेल में मानक आरआई तरल जमा, १.३१ से १.३९ के लिए अलग आरआई के साथ ।
  2. मानक आरआई तरल में सेंसर चिप विसर्जित और यह सफेद प्रकाश की किरण के साथ संरेखित करें । संचरण स्पेक्ट्रम प्राप्त करें ।
  3. एक सतह सक्रिय सफाई रिएजेंट के साथ प्रत्येक माप के बाद सेंसर चिप साफ है और यह नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी ।

3. सेंसर सतह संशोधन

  1. किसी भी रासायनिक संशोधनों से पहले, isopropanol, एसीटोन, और जल में अनुक्रमिक विसर्जन द्वारा सेंसर चिप्स साफ । सूखी नाइट्रोजन गैस की एक धारा में कमरे के तापमान पर सूखी ।
  2. कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए ०.४ मिमी 10-carboxy-1-decanethiol और १.६ मिमी 1-octanethiol के एक इथेनॉल समाधान में संवेदक चिप्स मशीन ।
    नोट: यह एक अमीन-प्रतिक्रियाशील स्वयं विधानसभा monolayer (सैम) फार्म का होगा ।
  3. इथेनॉल का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से कुल्ला और कमरे के तापमान पर सूखी ।
  4. ७५ mm sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-एन एच एस) और 15 मिमी 1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) का मिश्रण बनाएं । 15 मिनट के लिए इस मिश्रण में चिप्स विसर्जित कर दिया ।
    नोट: यह सैम के carboxylic समूह को सक्रिय करेगा ।
  5. स्पॉट ५० µ एल के २०० µ जी/एमएल एंटी ट्रोपोनिन एंटीबॉडी एक पीएच ४.५ एसीटेट बफर में संवेदक सतह और 30 मिनट के लिए मशीन पर बनाया समाधान ।
  6. 15 मिनट के लिए 1 M ethanolamine-HCl समाधान में सेंसर चिप विसर्जित करके अनप्रतिक्रिया एस्टर्स को निष्क्रिय करें ।
  7. पानी के साथ चिप कुल्ला और कमरे के तापमान पर सूखी नाइट्रोजन गैस की एक धारा में सूखी ।

4. cTnI परख

  1. सतह पर 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) समाधान के १०० µ l को खोलना द्वारा किसी भी गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को अवरोधित करना.
15 मिनट के लिए मशीन ।
  • सेंसर चिप्स तीन बार फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) समाधान में कुल्ला । संचरण स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करने के लिए माप सेल में चिप डालें ।
    नोट: यह संदर्भ स्पेक्ट्रम है ।
  • स्पॉट ५० चिप सतह और 30 मिनट के लिए एक नम वातावरण में मशीन पर cTnI मानक के µ एल ।
  • सेंसर चिप्स कुल्ला तीन बार पंजाब में समाधान और माप सेल में डालने के लिए पारेषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड ।
    नोट: यह बाद बाध्यकारी स्पेक्ट्रम है ।
  • ५० mM glycine-एचसीएल में चिप्स (पीएच 2) 1 मिनट के लिए जलमग्न और फिर पंजाबियों समाधान में कुल्ला करने के लिए तीन बार चिप सतह पुनर्जीवित करने के लिए । उत्थान के कदम की सफलता को सत्यापित करने के लिए पंजाब में पारेषण स्पेक्ट्रम को मापने ।
  • 5. सतह Plasmon अनुनाद (SPR) मापन

    1. पंजाब-टी बफर के साथ SPR सिस्टम पर मल्टीप्लेक्स्ड SPR सेंसर चिप चलाएं ।
      नोट: पंजाबियों की संरचना-टी बफर 20 मिमी Na-फास्फेट, १५० mm NaCl, और ०.०५% 20 के बीच है । पीएच ७.४ है ।
    2. cTnI मानक और एंटीबॉडी, चरण 4 में वर्णित के रूप में उपयोग करें ।
    3. 5 मिनट के लिए EDC (०.२ मीटर) और sulfo-एन एच एस (०.०५ एम) के मिश्रण के साथ 6 उपलब्ध चैनलों में से 3 को सक्रिय करें । ५० µ g/mL एंटीबॉडी ५६० का 5 मिन इंजेक्शन और 1 M ethanolamine-HCl सॉल्यूशन का 5-मिनट का इंजेक्शन निष्पादित करें ।
    4. ९० ° द्वारा सेंसर चिप घुमाएं और विभिंन सांद्रता (७५, 30, ७.५, और २.५ एनजी/एमएल) में cTnI मानकों सुई ।
    5. SPR readout के माध्यम से वास्तविक समय में चिप पर बातचीत के धब्बे पर एंटीबॉडी को विकार का निरीक्षण करें ।
    6. 1 मिनट के लिए ५० mM glycine-HCl (pH 2) इंजेक्ट करके चिप को पुनर्जीवित करें ।

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    Representative Results

    माप लेने के लिए ऑप्टिकल सेटअप चित्र 1aमें दिखाया गया है । वास्तविक nanohole सरणी की एक छवि आरेख 1bमें दी गई है । संवेदन प्रक्रिया ड्राइविंग भौतिकी समझने के लिए, COMSOL सिमुलेशन सॉफ्टवेयर एक जलीय वातावरण में plasmonic क्षेत्र के वितरण अनुकरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । अनुकरण से परिणाम तो वास्तविक माप से संबंधित थे. एक पहले से प्रकाशित अध्ययन किया मांयताओं का विवरण शामिल है और मानकों के अनुरूप11,13में इस्तेमाल किया । nanohole सरणी के लिए plasmonic फ़ील्ड का अनुकरण करने के लिए उपयोग किया गया भौतिक आयाम निम्नानुसार था: p = ४०० एनएम, डी = १५० एनएम, और टी = १०० एनएम । संचरण स्पेक्ट्रम की गणना करते समय अवशोषण और कैटरिंग प्रभाव भी खाते में14 लिया जाता है । नकली स्पेक्ट्रम चित्रा 1Cमें प्रयोग मापा स्पेक्ट्रम की तुलना में है । दोनों नकली और मापा स्पेक्ट्रा ४५० से ८५० एनएम के चार बैंड के अस्तित्व को व्यक्त करते हैं । ४९५ एनएम पर बैंड सोने की बैंड संक्रमण से मेल खाती है । तीन बाद के बैंड, आगे कहा जाता है कि तरंग दैर्ध्य के बढ़ते क्रम में बैंड I-III, ५६० एनएम, ६४५ एनएम, और ७१२ एनएम क्रमशः पर स्थित हैं । बैंड मैं-III के लिए स्वीकार्य संरेखण किया गया है करने के लिए प्रयोग मापा बैंड, ५५८ एनएम, ६३८ एनएम, और ७२४ एनएम पर स्थित है । के रूप में गढ़े nanoholes आकार में लगभग परिपत्र हैं, इन बैंड घटना प्रकाश के ध्रुवीकरण के प्रति संवेदनशील नहीं होना चाहिए । इसके अतिरिक्त, COMSOL सिमुलेशन इन बैंड के निकट क्षेत्र के वितरण के प्रत्यक्ष दृश्य सक्षम बनाता है के रूप में वे आवर्ती संरचना (चित्र 1 d) के एक इकाई कक्ष में घटित होगा. रंग पट्टी पर इकाई एक लॉग स्केल में व्यक्त ऑप्टिकल फील्ड वितरण (वी/एम) है । उच्चतम तीव्रता मनाया ४.७ के आसपास था (५०,११९ वी/ इस परिमाण के अनुकरण में इस्तेमाल किया घटना की तीव्रता की तुलना में (४,३४० V/, एक ११.५-गुना क्षेत्र में वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है । बैंड मैं और III के लिए विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र कांच सब्सट्रेट की सतह पर स्थानीयकृत थे. इसके विपरीत, बैंड द्वितीय मुख्य रूप से nanohole के शीर्ष रिम पर स्थानीयकृत था और bioanalyte का पता लगाने के लिए चुना गया था । चित्रा 1E nanohole सरणी के ज्ञात अपवर्तन सूचकांक है, जो १.३१ से १.३९ के लिए विभिंन में संचरण स्पेक्ट्रा दिखाता है । तीन संचरण बैंड, बैंड मैं, द्वितीय और III के लिए इसी ४००-९०० एनएम के स्पेक्ट्रम रेंज में मनाया गया । आरआई में बदलाव के साथ एक रेड शिफ्ट मनाया गया । बदलाव की भयावहता के बाद अनुक्रम बैंड II & #62; बैंड I & #62; बैण्ड III. चित्रा 1F बैंड मैं, द्वितीय और तृतीय के मनाया लाल बदलाव का एक समेकन है । बैंड के लिए गणना की थोक संवेदनशीलता मैं था ३२२ एनएम/RIU, बैंड द्वितीय के लिए था ३४५ एनएम/RIU, और बैंड द्वितीय के लिए २०२ एनएम/RIU था ।

    चित्र 2a कार्रवाई में संवेदन घटना के योजनाबद्ध होते हैं । चित्रा बी + हृदय ट्रोपोनिन अणुओं कार्यात्मक चिप सतह के लिए बाध्य करने के बाद संचरण स्पेक्ट्रा में परिवर्तन से पता चलता है. कम सांद्रता में, वहां ट्रोपोनिन स्तर के साथ बैंड में एक रैखिक बदलाव है । बैंड की स्थिति में बदलाव अच्छी तरह से ०.९९५ के एक आर2 मूल्य के साथ एक बाध्यकारी isotherm को लगाया जा सकता है । करीब अवलोकन पर, 30 एनजी/एमएल के लिए एकाग्रता है जिस पर isotherm संतृप्ति (चित्रा 2c) की शुरुआत इंगित करता है लगता है ।

    चित्रा 3 ए एक XPR36 सेटअप में एक संशोधित GLC चिप की चिप सतह के साथ सीरम की बातचीत से sensorgram से पता चलता है । cTnI का कब्जा सिग्नल में बढ़ोतरी करके दिखाया गया है. इसके बाद, एक PBST माध्यम में cTnI के पृथक्करण (1x पंजाबियों, ०.०५% के बीच 20) देखा जा सकता है के रूप में संकेत १२० से कम हो जाती है-६६० एस । इंजेक्शन glycine (पुनर्जनन समाधान) 1 मिनट के लिए 0 के लिए संकेत कम, संवेदन सतह के उत्थान का संकेत cTnI की पूरी संलिप्तता के माध्यम से । पुनर्जीवित चिप सतह के लिए cTnI के बाद एसोसिएशन के लिए sensorgram चित्रा 3ए के इनसेट में दिखाया गया है । एक ही प्रोटोकॉल (यानी, 1 मिनट के लिए glycine समाधान में डूब) nanohole सरणी सतह पुनर्जीवित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 3 बी पता चलता है कि बैंड 2 की स्थिति अपनी मूल स्थिति में वापस पाली, जिससे उत्थान कदम की सफलता की पुष्टि ।

    Figure 1
    चित्र 1 : nanohole सरणी के लक्षण वर्णन । () प्रयोगात्मक सेटअप के सरलीकृत योजनाबद्ध । () nanohole सरणी की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवि । () एक जलीय वातावरण में नकली स्पेक्ट्रम और प्रयोग मापी पारेषण स्पेक्ट्रम के बीच तुलना । () बैंड मैं और III के लिए COMSOL में नकली के रूप में निकट क्षेत्र वितरण, एक पार अनुभागीय दृश्य में देखा । लाल मजबूत निकट क्षेत्र वितरण का प्रतिनिधित्व करता है । रंग पट्टी में दिखाई गई इकाई है | ई ।, ऑप्टिकल फील्ड के वितरण, लॉग पैमाने में लिया । () मानक अपवर्तन सूचकांक तरल पदार्थ (१.३१ से १.३९) के साथ वातावरण में प्रायोगिक रूप से मापी गई nanohole सरणी का संचरण स्पेक्ट्रा । () तीन पारेषण बैंड (I-III) के बल्क संवेदनशीलता को NIR श्रेणी में दिखाई देने वाली आरआई में मापा जाता है । काला वर्ग: बैंड मैं, लाल वृत्त: बैंड द्वितीय, नीला त्रिभुज: बैंड III । यह आंकड़ा रिडिंग एट अल से संशोधित किया गया है । 14 लाइसेंस द्वारा एक प्रतिलिपि के अंतर्गत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2 : nanohole सरणी एक के रूप में प्रयोग किया जाता है । () nanohole सरणी के योजनाबद्ध cTnI का पता लगाने के लिए एक के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है । () सीरम की एक पृष्ठभूमि में एक 30 एनजी/एमएल एकाग्रता पर मानव cTnI के साथ बातचीत पर के संचरण स्पेक्ट्रम में परिवर्तन । ब्लू: बातचीत से पहले, लाल: बातचीत के बाद । डॉटेड सर्कल बैंड ट्रैक किया जा रहा इंगित करता है । () ट्रोपोनिन के विभिंन सांद्रता पर बैंड द्वितीय के लिए तरंग दैर्ध्य में बदलाव (२.५ एनजी/एमएल, ७.५ एनजी/एमएल, 30 एनजी/एमएल, और ७५ एनजी/त्रुटि पट्टियां प्रत्येक माप के लिए उपयोग किए गए n = 3 चिप्स के बीच मानक विचलन दिखाती हैं । यह आंकड़ा रिडिंग एट अल से संशोधित किया गया है । 14 लाइसेंस द्वारा एक प्रतिलिपि के अंतर्गत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3 : सेंसर सतह का पुनर्जनन. () analyte (cTnI) के इंजेक्शन को दिखाने XPR36 से एक SPR sensorgram के बाद सेंसर सतह को पुनर्जीवित करने के लिए glycine का इंजेक्शन. बाद में सीरम पृष्ठभूमि के खिलाफ cTnI के विभिन्न सांद्रता का पता लगाने माप इनसेट में दिखाया गया है । लाल पट्टी प्रारंभिक मान का प्रतिनिधित्व करती है, जबकि काली पट्टी पाठ में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ सरफ़ेस के उत्थान के बाद माप को दिखाती है । () एक nanohole के पुनर्जनन के बाद मनाया बैंड तरंग दैर्ध्य में बदलाव एक सेंसर चिप । σ: बैंड की स्थिति के तरंग दैर्ध्य में बदलाव के मानक विचलन । यह आंकड़ा रिडिंग एट अल से संशोधित किया गया है । 14 लाइसेंस द्वारा एक प्रतिलिपि के अंतर्गत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    घटना प्रकाश और nanostructures के बीच बातचीत का अनुकरण यह संभव (संचरण स्पेक्ट्रम में) उपयुक्त चोटी की पहचान करने के लिए बनाता है, जिसकी पारी analyte की एकाग्रता के एक समारोह के रूप में दर्ज किया जा सकता है. यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सेंसर की संरचना के संबंध में बैंड के स्थानीयकरण सही बैंड के चुनाव के लिए महत्वपूर्ण है, जिसका बदलाव analyte भावना को ट्रैक किया जा सकता है. दृश्य सिमुलेशन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । यह भी एक इष्टतम संरचना है कि analytes की संवेदन सक्षम बनाता है के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है । के रूप में यहां देखा, बैंड मैं और III गिलास सोने अंतरफलक पर स्थानीयकृत रहे है और इसलिए संवेदन के लिए उपयोगी नहीं हैं । एक प्रमुख LSPR घटक बैंड द्वितीय में मनाया जा सकता है । यह एक छोटे क्षय लंबाई से पता चलता है और nanoholes के रिम पर स्थानीयकृत है । इस तरह, यह ही अच्छी तरह से बख्शी analyte सांद्रता संवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है । पूरे सरणी पर गढ़े nanostructures की गुणवत्ता भी स्पेक्ट्रा एकत्र की गुणवत्ता के लिए आवश्यक है । गैर वर्दी संरचनाओं कलाकृतियों का परिचय देंगे ।

    कैटरिंग और अपरिहार्य अवशोषण एक जलीय माप में कलाकृतियों बनाते हैं । समग्र संकेत करने वाली शोर अनुपात भी जलीय मध्यम की उपस्थिति से परेशान है । मामले में कई उपयुक्त बैंड जिनकी शिफ्टों में संवेदना के लिए निगरानी की जा सकती है, निंनलिखित बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए । उप ६०० एनएम तरंग दैर्ध्य में मनाया संचरण स्पेक्ट्रम स्पष्ट रूप से प्रोटीन अवशोषण और कण बिखरने से प्रभावित है । दूसरी ओर, ९०० एनएम से बड़ा तरंग दैर्ध्य का उपयोग महत्वपूर्ण अंतर्निहित बाध्यकारी घटनाओं से उत्पंन संकेतों को छुपाने के भ्रम पैदा कर सकता है, के रूप में इस क्षेत्र में, तरंग दैर्ध्य के साथ पानी बढ़ता द्वारा अवशोषण । एक जलीय वातावरण में analytes संवेदन के लिए, इसलिए, बैंड II बेहतर तरंग दैर्ध्य के मामले में स्थित है । बैंड की स्थिति की माप में एक छोटा सा विचलन मनाया जा सकता है । यह बड़े सेंसर आकार के कारण होता है । जबकि बड़े संवेदक अंततः कम अधिग्रहण के समय में तब्दील हो क्योंकि पता लगाने पिक्सल के प्रत्येक अब फोटॉनों के एक बड़े से अधिक सामांय प्रवाह देखते हैं, यह भी नकारात्मक प्रभाव शोर । वास्तव में, अगर संकेत संग्रह ठीक से प्रदर्शन नहीं किया है और डेटा कंडीशनिंग नहीं इष्टतम डिजाइन, शोर का एक बहुत देखा जा सकता है । १०० फ्रेम पर एकत्र संकेत औसत से15, शोर स्तर कम किया जा सकता है. जबकि वहां अंय तरीके से LSPR संकेतों का उत्पादन कर रहे हैं, विशेष रूप से सोने नैनोकणों से16, nanohole सरणी बहुत अधिक microfluidics के साथ एक पोर्टेबल प्रारूप में लागू करने के लिए व्यवहार्य है । पूरी प्रक्रिया और संवेदन सतह को पुनः प्राप्त करने की संभावना के स्वचालन की आसानी की वजह से पूरे डिवाइस POC अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

    इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल को प्रतिबिंबित के बजाय संचरण मोड का उपयोग करके प्रयोगात्मक त्रुटि को कम करने के लिए डिजाइन किया गया है । इस कटौती के कोण से संभावित कलाकृतियों-घटना परिवर्तन । यह भी कदम ३.४, जब एंटीबॉडी सेंसर सतह को crosslinked है की महत्वपूर्ण प्रकृति बिंदु महत्वपूर्ण है । यह दोनों sulfo-एन एच एस और EDC की प्रतिक्रिया को संरक्षित करने के लिए आवश्यक है । यह भी पाया गया कि एन एच एस से sulfo के लिए स्विचन-एन एच एस में सुधार स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण था । यदि नमूने का उपयोग किया जा करने के लिए कर रहे हैं, तरल नाइट्रोजन के तहत भंडारण की सिफारिश की है । प्लेटफार्म प्रौद्योगिकी है कि यहां दिखाया गया है उपयुक्त सतह संशोधन के साथ अंय नैदानिक, मार्क्स पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

    इस प्रकार अब तक, LSPR सेंसरों की पैठ एक अर्धचालक उद्योग के समान reproducibility के साथ बड़े क्षेत्रों पर उत्तरदायी सतहों बनाने की क्षमता पर सीमाओं द्वारा प्रतिबंधित किया गया है. बड़े संवेदन सतहों आसानी से मानक और लागत प्रभावी प्रकाशिकी के साथ इंटरफेस किया जा सकता है । निर्माण की प्रक्रिया में परिशुद्धता भी चिप को कम होता-चिप विचरण, माप की विश्वसनीयता को बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण अड़चन है, जो एक नैदानिक सेटिंग में महत्वपूर्ण है. एक चिकित्सा उपकरण के संदर्भ में, जहां सीरियल माप की आवश्यकता है, सतह पुनर्जनन के reproducibility भी महत्वपूर्ण है । यह भी प्रदर्शित किया गया है कि संवेदन सतह को पुनः उत्पंन करने के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध SPR मंच में स्थापित किया जा सकता है और फिर सफलतापूर्वक nanohole सरणी के लिए अनुवादित । पुनर्जनन की दक्षता आसानी से nanohole सरणी के लिए गणना की जा सकती है, और दोहराने की माप के लिए पुनर्जीवित सतह की उपयुक्तता का आकलन किया जा सकता है । मजबूत सतह रसायन विज्ञान संशोधन और पुनर्जनन प्रोटोकॉल स्थापित करने पर, LSPR सेंसर वास्तविक समय bioanalyte का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील अभी तक सरल मंच हो सकता है । यह रोगी की देखभाल पर अपने महत्वपूर्ण प्रभाव की उंमीद आसान है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सेंसर की निरपेक्ष संवेदनशीलता सबसे उन्नत एलिसा आधारित परीक्षणों से मेल नहीं खाती । कुछ प्रवर्धन रणनीतियों संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए डिजाइन की जरूरत है । यहां तक कि अपने वर्तमान रूप में, इस प्रौद्योगिकी एक महत्वपूर्ण सुधार के सापेक्ष स्थापित nanoimprinted LSPR प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है, के रूप में यह लेबल के लिए एक नई निचली सीमा को परिभाषित करता है एक हृदय के एक संचरण का उपयोग कर के नि: शुल्क पता लगाने आधारित ऑप्टिकल सेटअप. प्रौद्योगिकी कई नैदानिक महत्वपूर्ण उपमार्क्स के वास्तविक समय की निगरानी के कार्यांवयन की दिशा में विकसित हो रही है । आगे डेटा अधिग्रहण में सुधार (जैसे, बेहतर संकल्प के साथ डिटेक्टरों) और बाद में संकेत प्रसंस्करण मदद कर सकता LSPR आधारित सेंसर इस हासिल ।

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    Disclosures

    लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की नहीं है ।

    Acknowledgments

    एपी प्रो टी वेंकटेसन, निदेशक, नुस Nanoscience और नैनो पहल और उप राष्ट्रपति (राष्ट्रीय सिंगापुर विश्वविद्यालय) के कार्यालय (आर-398-000-084-646) का समर्थन स्वीकार करता है । CLD अपने चिकित्सक वैज्ञानिक धन योजना, NMRC/CSA/035/2012, और सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के अंतर्गत स्वास्थ्य राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद के सिंगापुर मंत्रालय के समर्थन को स्वीकार करता है । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Electron Beam Lithography setup Elionix ELS 700
    o-Xylene Sigma Aldrich 95662
    EB resist Sumitomo NEB-22A2
    Developer reagent Shipley Company Microposit MF 321
    Electroplating machine Technotrans AG RD 50
    Photoresist stripper  Rohm and Haas Electronic Materials LLC Microposit Remover 1165
    Etching System Trion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl)trichlorosilane  Gelest (PA, USA) 78560-44-8
    SAM coater  Sorona Inc. AVC 150M
    Photo-curable NIL resist micro resist technology GmbH mr-UVCur21-300nm
    Light Curing System Dymax  Model 2000 Flood
    E-beam deposition machine Denton Explorer
    UV-visible spectrometer  Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Standard refractive index liquids  Cargill Inc (Cedar Grove, USA) 18032
    Plotting software Origin Origin Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol  Dojindo Laboratories (Japan) C385-10
    1-octanethiol  Sigma-Aldrich, MO, USA 471386
    Sulfo-N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  BioRad (CA, USA) 1762410
    Anti-troponin antibody 560 Hytest (Finland) 4T21
    Ethanolamine-HCl solution BioRad (CA, USA) 1762450
    Surface Plasmon Resonance setup BioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR chip BioRad GLC
    Human cTnI standard Phoenix Pharmaceuticals EK -311-05
    Glycine-HCl BioRad (CA, USA) 1762221

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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