Med ekstraordinære optisk girkasse å kvantifisere Cardiac Biomarkers i humant Serum

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette verket beskriver en nanoimprinting litografi metode å utvikle høy kvalitet sensing matriser som fungerer på prinsippet om ekstraordinære optisk overføring. Biosensor er rimelig, robust, lett å bruke, og kan oppdage cardiac troponin jeg i serum i klinisk relevante konsentrasjoner (99th persentil cutoff ∼10-400 pg/mL, avhengig av analysen).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Patra, A., Ding, T., Hong, M., Richards, A. M., Wong, T. I., Zhou, X., Drum, C. L. Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum. J. Vis. Exp. (130), e55597, doi:10.3791/55597 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

For en biosensing plattform for klinisk relevans i point-of-care (POC) innstillinger, er analysen følsomhet, reproduserbarhet og evne til å overvåke pålitelig analytter på bakgrunn av humant serum avgjørende.

Nanoimprinting litografi (null) ble brukt til å fabrikkere, koste, sensing områder opptil 1,5 x 1,5 mm. Sensing overflaten var laget av Hi-Fi-matriser av nanoholes, hver med et areal på ca 140 nm2. Den store reproduserbarhet av NIL gjort det mulig å ansette en én brikke, ett-måling strategi på 12 individuelt produsert overflater, med minimal chip til chip variasjon. Disse nanoimprinted lokalisert overflaten plasmon resonans (LSPR) chips var nøye testet på deres evne til å måle pålitelig en bioanalyte i konsentrasjonene varierer fra 2.5 til 75 ng/mL i bakgrunnen av en kompleks biofluid-i dette tilfellet, menneskelige serum. Hi-Fi av NIL aktiverer generering av store sensing områder, som i sin tur eliminerer behovet for et mikroskop, som denne biosensor kan være lett tilkobles med en vanlig laboratoriet lyskilde. Disse biosensors kan gjenkjenne hjertestans troponin i serum med en høy følsomhet, på en grense for påvisning (LOD) av 0.55 ng/mL, som er klinisk relevant. De viser også lav chip til chip varians (på grunn av den høye kvaliteten på fabrikasjon prosessen). Resultatene er commensurable med brukte enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)-baserte analyser, men teknikken beholder fordelene med en LSPR-basert sensing plattform (dvs. amenability miniatyrisering og multipleksing, gjør det mer gjennomførbart for Konseptgodkjenning programmer).

Introduction

Kjemisk sensor basert på nanohole matriser har vært gjenstand for mange undersøkelser siden den første rapporten om ekstraordinære optisk overføring (EOT) ble utgitt av Ebbesen et al. i 19981. Når lyset gjøre inngrep på periodiske matriser av nanohole strukturer av sub bølgelengde dimensjoner, oppstår forbedret overføring på bestemte bølgelengder. Dette skjer når hendelsen lyset par med Bloch-bølge overflate polariton (BW-SPP) og/eller lokaliserte overflate plasmons (LSP)2.

Det underliggende fysiske prinsippet utnyttes når biosensing med slike periodiske matriser er enkel. Adsorpsjon av molekyler på eller nær grensesnittet av metall endrer dielektrisk konstant av mediet i kontakt med metall, igjen skiftende plasseringen av overføring bandene i spekteret. Spekteret selv kan justeres av nano-engineering form, størrelse og separasjon avstand3,4,5. Ved design har sensor basert på EOT karakteristiske band i deres spektra som letter bestemte tildelinger6,7,8 under etterforskning av molekylær binding hendelser. Dette er en avgjørende fordel over kommersielt tilgjengelige overflaten plasmon resonans (SPR) plattformer.

Sensorer med EOT vanligvis innebære en lyskilde optisk justert slik at en collimated stråle hendelsen på sensing overflaten. Teknikker for å generere store nanohole overflater, som co polymer maler og forstyrrelser og nanosphere litografi, har dårlig reproduserbarhet9. På grunn av disse begrensningene i nøyaktig fabrikere store flater som viser EOT fenomenet, var en optisk mikroskop nødvendig å plassere riktig lyskilde og detektor. For å forenkle det teknikken, høykvalitets nanoimprinting litografi (null)10 var ansatt. Dette gjorde det stor sensor flater11 (mm-skala), fjerne behovet for et mikroskop for å se etter sensing overflaten på en brikke. I stedet kan denne sensoren være lett tilkobles med en standard fiberoptisk kabel.

Siden overføring toppene for denne nanohole matrise finnes i den synlige for nær-infrarøde området (NIR), er det perfekt til sensing bindende hendelser for biomolecules i vandig miljø. Den forventede optiske oppførselen til nanohole array var simulert. Resultatet ble deretter bekreftet gjennom studier med væsker standard refractive indekser (RI). Denne matrisen ble brukt til å måle konsentrasjonen av cardiac troponin jeg (cTnI) i humant serum komplekse bakgrunnen. cTnI er klinisk gullstandarden for diagnostisering av hjerteinfarkt.

Bruke denne sensoren, er det mulig å oppdage og kvantifisere cTnI i humant serum på en grense for påvisning (LOD) av 0.55 ng/mL, som er klinisk relevant. Gjenkjenning er mye raskere enn mest brukte teknologien i dette domenet, enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA). Videre sensing overflaten kan lett bli regenerert og derfor på nytt. Derfor viser dette arbeidet løfte om nanohole matriser som en levedyktig point-of-care (POC) teknologi for biosensing i komplekse biofluids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikasjon av sensoren og henting av Data

  1. Utarbeidelse av nikkel mold
    1. Lag en 220 nm-tykt lag av negative elektronstråle motstå på en 600 µm tykke 4 i silisium wafer. Skrive designet nanohole matrisen på denne wafer bruker et elektron strålen litografi system.
      1. For å akselerere e-strålen skrive, skrive mønstre med en lav dotmap (N) 20 k for hver 300 µm Feltstørrelse (A) (dvs. det er 0,4 milliarder prikker tilordnet hver 300 µm2 område og hvert punkt vil enten bli utsatt av e-strålen eller ikke avhengig av mønster design). Angi e-beam motstå eksponering dosen for resist til 110 µC cm2 og skrive på en strøm (jeg) av 800 pA.
        Merk: E-beam skriftlig, eksponering dose (D) er kontrollert av eksponeringstid for hvert punkt (Tdot), beregnet ved Equation 1 . For eksponering dose på 110 µC cm2er e-beam bolig tiden på hver synlig prikken 0,5 µs12. Siden matrisen dekker et område på 1,8 mm2, er det totalt 36 flekker av 300-µm2 feltet områder sydd sammen til skjemaet en stor, gold nanohole matrise.
    2. Utvikle resist ved immersing 4 tommers silisium kjeks i utvikler løsningen for 10 s og la kjeks tørr luft.
    3. Sette inn et frø laget av metall, som nikkel, kobber og aluminium, på silisium kjeks.
    4. Electroplate kjeks i et plating system i et nikkel sulfamate bad. Utføre electroplating i to trinn. I det første trinnet, varig 95 min, bruke en nåværende tetthet av 0,7 A dm2; Dette fyller helt nanopatterns med nikkel. I det andre trinnet, varig 125 min, bruke 12 A dm2 for å nå 300 µm som siste nikkel mold tykkelsen (20 nm). Sikre at pH-verdi er på 3,5-3,8 og at temperaturen er på 52-54 ° C.
    5. Skille nikkel mold fra silicon underlaget ved hjelp av mild mekanisk kraft. Suge nikkel mold i ca 100 mL av positiv photoresist fjerning reagens over natten å vaske bort rester fra e-beam motstå.
    6. Mate nikkel mold i en ovn og tørr det ved 100 ° C i 3 h. Rengjør det i en plasma etsing system med O2 gass på 10 sccm og 100 W for 3 min.
  2. Fabrikasjon av gull nanostructure
    1. Pels 150 µL av heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane (FDTS) på nikkel mold i en selvstendig montering monolayer (SAM) belegg machine på 80 ° C.
      Merk: Dette vil danne en anti-lim laget, som gjør separasjon av mold fra photoresist ("demolding") etter ferdigstillelse av det nanoimprinting trinnet. Fordampe tiden skal 180 s, og reaksjonstid skal 900 s.
    2. Forlaget nanopatterns på en 4 - i glass wafer som har vært belagt med en 300 nm-tykt lag av foto-helbredelig NIL motstå bruker en nano-trykkverktøy ved et trykk på 10 bar og en temperatur på 40 ° C for 10 min.
    3. Overføre mold, photoresist og glass kjeks til et UV lys herding system og photocure med 75 mW cm-2 UV eksponering for 30 s.
      Merk: Hvis alle trinnene er fulgt riktig nikkel mold bør lett være demolded fra photoresist.
    4. I en reaktiv ion etsing (RIE) system, utføre en tom etch av photoresist på glass underlaget, med en O2 gass flyt av 10 sccm, 50 M 2 s å avsløre glasset på innrykket områder.
    5. Sette inn et 5 nm tykke lag av krom (Cr) for metall vedheft og et 100-nm lag av gull (Au) for plasmonic sensoren på glass kjeks i en elektronstråle deponering maskin. Bruke en avsetning rate 1 Å s−1 for Cr og 2 Å s−1 for Au.
    6. Utføre lift-off av photoresist O2 plasma etsing for 3 min etterfulgt av et 15-s sonification skritt i aceton.
    7. Terninger prøven til 5 mm × 5 mm chips. Nanohole matrisen vil oppta den sentrale 2 mm × 2 mm av chip.
  3. Oppkjøpet av data
    1. Definere apparatet å foreta målinger er optisk slik at hvite lyset spennende gjennom slutten av senderen er collimated og er hendelsen på sensoren overflaten (nanohole matrise) ved 90°.
      Merk: Lys overføres gjennom hele nanohole array.
    2. Samle overført signalet med mottaker optisk fiber og ta det med en UV-synlig spectrometer opererer innen 300 til 1000 nm.
    3. Angi anskaffet for hver ramme på 20 ms. gjennomsnittlig 100 rammer å få siste spekteret lavere støy i målinger.
    4. Bruk inntegningsrekkefølgen programvare for å analysere data basert på tidligere identifisert overføring toppene (med en Lorentz-basert metode).

2. sensor Bulk følsomhet Test

  1. Sette inn standard RI væske på flytende cellen med RI varierer fra 1,31 til 1.39.
  2. Fordype sensor flis i standard RI væsken og justerer med hvit lysstråle. Få overføring spekteret.
  3. Rengjøre sensor flis etter hver måling med en overflateaktive rengjøring reagens og tørke den med nitrogen gass.

3. sensor overflaten modifikasjon

  1. Før noen kjemiske endringer, rengjøre sensor chips ved sekvensielle nedsenkning i isopropanol og aceton deionisert vann. Tørr ved romtemperatur i en strøm av tørr nitrogen gass.
  2. Inkuber sensor chips i en ethanolic av 0.4 mM 10-carboxy-1-decanethiol og 1,6 mM 1-octanethiol for 12 h ved romtemperatur.
    Merk: Dette vil danne et Amin-reaktive selvtillit forsamlingen monolayer (SAM).
  3. Bruk etanol skyll grundig og tørr ved romtemperatur.
  4. Gjør en blanding av 75 mM sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) og 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Fordype chips i denne blandingen i 15 min.
    Merk: Dette vil aktivere karbonoxylsyre gruppen av SAM.
  5. Spot 50 µL av 200 µg/mL anti-troponin antistoff løsning laget i en pH 4.5 acetate buffer på sensoren overflaten og ruge i 30 min.
  6. Deaktiver de Ureagert estere ved immersing sensor flis i 1 M ethanolamine-HCl løsning for 15 min.
  7. Skyll chip med deionisert vann og tørk den i en strøm av tørr nitrogen gass ved romtemperatur.

4. cTnI analysen

  1. Blokkere en uspesifisert binding av småblødninger 100 µL av 1% bovin serum albumin (BSA) løsning på overflaten.
Inkuber i 15 min.
  • Skyll sensor chips tre ganger i fosfat-bufret (PBS) saltvann. Sett inn chip i målet cellen å registrere overføring spekteret.
    Merk: Dette er referanse spekteret.
  • Spot 50 µL av cTnI standard på chip overflaten og ruge i et fuktig miljø i 30 min.
  • Skyll sensor chips tre ganger i PBS løsning og sett den inn i målet cellen å registrere overføring spekteret.
    Merk: Dette er etter bindende spekteret.
  • Senk chips i 50 mM glycine-HCl (pH 2) i 1 minutt og skyll i PBS løsning tre ganger for å regenerere chip overflaten. Måle overføring spekteret i PBS bekrefte suksessen av gjenfødelse trinnet.
  • 5. overflate Plasmon resonans (SPR) måling

    1. Kjøre multiplex SPR sensor chip på SPR systemet med PBS-T buffer.
      Merk: Sammensetningen av PBS-T buffer er 20 mM Na-fosfat og 150 mM NaCl 0,05% mellom 20. PH er 7.4.
    2. Bruk cTnI standard og antistoffer, som beskrevet i trinn 4.
    3. Aktivere 3 av 6 tilgjengelige kanaler med en blanding av EDC (0,2 M) og sulfo-NHS (0,05 M) i 5 min. utføre en 5 min injeksjon av 50 µg/mL antistoff 560 og en 5-min injeksjon av 1 M ethanolamine-HCl løsning.
    4. Roter 90° sensor flis og injisere cTnI standarder i ulike konsentrasjoner (75, 30, 7.5 og 2,5 ng/mL).
    5. Observere Bøyning til antistoffer på flekker av samhandling på chip i sanntid via SPR avlesning.
    6. Generere chip ved å injisere 50 mM glycine-HCl (pH 2) i 1 minutt.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Optisk oppsettet for å ta målinger vises i figur 1A. Et bilde av den faktiske nanohole matrisen er gitt i figur 1B. For å forstå fysikk kjøring sensing prosessen, ble COMSOL simuleringsprogram brukt til å simulere distribusjon av plasmonic feltet i vandig miljø. Simuleringen resultatene var så knyttet til den faktiske målingen. En tidligere publisert studie inneholder detaljer om forutsetningene gjort og parameterne som brukes i simuleringen11,13. De fysiske dimensjonene som brukes for å simulere plasmonic feltet for nanohole matrisen var som følger: p = 400 nm, D = 150 nm og T = 100 nm. Absorpsjon og spredning effekten er også tatt i kontoen14 ved overføring spekteret. Simulert spekteret sammenlignes eksperimentelt målt spekteret i figur 1 c. Både den simulerte og de målte spectra formidle eksistensen av fire band fra 450 til 850 nm. Bandet på 495 nm tilsvarer interband overgangen av gull. De tre påfølgende bandene, heretter kalt band I-III sortert etter bølgelengde, finnes på 560 nm, 645 nm og 712 nm, henholdsvis. Band I-III ble observert for å ha akseptabel justeringen til eksperimentelt målt band, på 558 nm, 638 nm og 724 nm. De ferdige nanoholes er nesten rund i formen, være disse bandene ikke følsomme for polarisering av det innfallende lyset. I tillegg kan COMSOL simuleringen direkte visualisering av nær-feltet fordelingen av disse bandene som de enhet celler i periodiske strukturen (figur 1 d). Enheten fargelinjen er optisk feltet fordelingen (V/m) i en logaritmisk skala. Høyeste intensiteten observert var rundt 4.7 (50,119 V/m). Denne størrelsen sammenlignet med intensiteten av forekomsten brukes i simuleringen (4,340 V/m), og representerer en utvidelse av 11.5-fold feltet. Elektromagnetiske felt for band I og III ble lokalisert på overflaten av glasset underlaget. Derimot bandet II ble hovedsakelig lokalisert på overkanten av nanohole og ble valgt for påvisning av bioanalyte. Figur 1E illustrerer overføring spektra av nanohole matrisen i væsker kjent refractive indekser, som varierte fra 1,31 til 1.39. Tre overføring bånd, tilsvarer band I, II og III, ble observert i spekteret størrelsesorden 400-900 nm. En rød Skift ble observert med en endring i RI. Omfanget av skiftet fulgte sekvens bandet II > band jeg > band III. Figur 1F er en konsolidering av observerte red skifter band I, II og III. Bulk følsomheten beregnet for bandet jeg var 322 nm/RIU bandet II var 345 nm/RIU og bandet II var 202 nm/RIU.

    Figur 2A inneholder skjematiske sensing fenomenet i aksjon. Figur 2B viser endringen i overføring spectra etter cardiac troponin molekylene binde til functionalized chip overflaten. I lave konsentrasjoner finnes en lineær forskyvning i bandet troponin nivået. Skiftet i bandet posisjon kan monteres godt til en bindende isotherm med R2 verdien 0.995. Ved nærmere observasjon synes 30 ng/mL å være konsentrasjonen som angir isotherm utbruddet av metning (figur 2C).

    Figur 3A viser sensorgram fra samspillet av serum med chip overflaten av en modifisert GLC chip i et XPR36 oppsett. Erobringen av cTnI er vist ved økningen i signalet. Deretter kan av cTnI i et PBST medium (1 x PBS, 0,05% mellom 20) observeres som signal fellingene fra 120-660 s. Injecting glysin (gjenfødelse løsningen) for 1 min redusert signalet til 0, indikerer fornyelse av sensing overflaten gjennom komplett oppløsning av cTnI. Sensorgram for påfølgende foreningen av cTnI til Spartments chip overflaten vises i rammemargen i figur 3A. Samme protokoll (dvs., leve i glysin løsning for 1 min) ble brukt til å generere nanohole matrise overflaten. Figur 3B viser at plasseringen av band 2 skifter tilbake til sin opprinnelige posisjon, dermed bekrefter suksessen av gjenfødelse trinnet.

    Figure 1
    Figur 1 : Karakterisering av nanohole array. (A) forenklet skjematisk av eksperimentelle. (B) Scanning elektron mikroskop bilde av nanohole array. (C) sammenligning mellom simulert spekteret og eksperimentelt målt overføring spekteret i vandig miljø. (D) feltet nær distribusjon som simulert i COMSOL for band I og III, sett i en tverrsnittvisningen. Rød representerer sterkere feltnære distribusjon. Enheten vises i fargesøylen er | E |, distribusjon av optisk feltet tatt i logaritmisk skala. (E) målt eksperimentelt overføring spektra av nanohole matrisen i miljøer med standard brytningsindeks væsker (1.31 til 1.39). (F) Bulk sensitiviteter tre overføring band (I-III) endringer i RI målt i de synlige NIR området. Svarte firkanten: bandet I rød sirkel: bandet II, blå trekant: bånd III. Figuren har blitt endret fra Ding et al. 14 under en kopi av lisens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2 : Nanohole array brukes som en biosensor. (A) skjematisk av nanohole array brukes som en biosensor for å oppdage cTnI. (B) endringen i overføring spekteret av biosensor på samspill med menneskelige cTnI på en 30 ng/mL konsentrasjonen i en bakgrunn av serum. Blå: før samhandling, red: etter interaksjon. Prikket sirkel angir bandet spores. (C) skifte i bølgelengde for bandet II i ulike konsentrasjoner av troponin (2,5 ng/mL, 7,5 ng/mL, 30 ng/mL og 75 ng/mL).De viser standardavviket blant n = 3 brikker for hver måling. Figuren har blitt endret fra Ding et al. 14 under en kopi av lisens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3 : Regenerering av sensoren overflaten. (A) en SPR sensorgram fra XPR36 viser injeksjon av analytt (cTnI) etterfulgt av injeksjon av glysin å regenerere sensor overflaten. Etterfølgende oppdagelsen målinger av ulike konsentrasjoner av cTnI på serum bakgrunn vises i innfelt. Den røde linjen representerer startverdien, mens den sorte linjen viser målingen etter fornyelse av overflaten med protokollen teksten. (B) skifte i bandet bølgelengdene observert etter fornyelse av en nanohole biosensor chip. Σ: standardavviket for endringer i bølgelengdeområdet av bandet plasseringen. Figuren har blitt endret fra Ding et al. 14 under en kopi av lisens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Simulere interaksjon mellom hendelsen lyset og nanostrukturer gjør det mulig å identifisere den aktuelle toppen (i overføring spekteret), som Skift kan registreres som en funksjon av konsentrasjonen av analytt. Det er viktig å merke seg at lokaliseringen av band med hensyn til strukturen av sensoren er avgjørende for valg av riktig bandet som Skift kan spores for å kjenne analytt. Effekten kan oppnås gjennom simuleringer. Dette er også avgjørende for utformingen av en optimal struktur som gjør at biosensing av analytter. Sett her I og III er lokalisert på glass-gull grensesnittet og dermed er ikke nyttig for biosensing. En fremtredende LSPR komponent kan observeres i bandet II. Det viser en kort forfall lengde og er lokalisert på kanten av nanoholes. Som sådan, egner dette seg godt til brukes for sensing analytt konsentrasjoner. Kvaliteten på det ferdige nanostrukturer over hele matrisen er også avgjørende for kvaliteten på spectra samlet. Non-uniform strukturer vil innføre gjenstander.

    Spredning og uunngåelig absorpsjon lage gjenstander i en vandig måling. Samlet signal-til-støy forholdet er også forstyrret av tilstedeværelsen av vandig medium. I tilfelle det er flere passende band som Skift kan overvåkes for biosensing, må følgende vurderes. På sub 600 nm bølgelengder, er observerte overføring spekteret kraftig påvirket av protein absorpsjon og partikkel spredning. På den annen side, bruker bølgelengder større enn 900 nm kan lage forvirring ved å skjule viktig underliggende signalene kommer fra binding hendelsene, som i denne regionen, absorpsjon av vann øker med bølgelengde. For sensing analytter i vandig miljø, derfor er bandet II optimalt plassert i bølgelengde. Et lite avvik i måling av bandet posisjon kunne observeres. Dette er forårsaket av stor sensor størrelsen. Mens det store sensoren etter hvert oversettes til kortere oppkjøpet ganger fordi hver av gjenkjenning bildepunktene nå se et større-enn-vanlig fluks av fotoner, påvirker det også negativt støy. Faktisk, hvis samlingen signalet ikke utføres riktig og data condition ikke optimalt utformet, kan mye støy observeres. Ved å beregne samlet signalet over 100 rammer15, støynivået kan senkes. Det finnes andre måter å produsere LSPR signaler, spesielt fra gull nanopartikler16, er nanohole matrisen mye mer mulig å implementere i et bærbart format med microfluidics. Hele enheten kan brukes for Konseptgodkjenning programmer på grunn av enkel automatisering av hele prosessen og muligheten til å regenerere sensing overflaten.

    Denne eksperimentelle protokollen er designet for å minimere eksperimentelle feil med overføringsmodus i stedet for refleksjon. Dette skjærer mulig gjenstander fra vinkel-av-forekomsten endringer. Det er også viktig å påpeke kritiske natur trinn 3.4, når antistoffer er krysskoblet til sensoren overflaten. Det er viktig å bevare reaktivitet sulfo-NHS og EDC. Det ble også funnet at bytte fra NHS til sulfo-NHS var avgjørende for forbedret stabilitet. Hvis prøvene skal gjenbrukes, anbefales lagringsplass under flytende nitrogen. Plattform-teknologi som vises her kan brukes til å overvåke andre kliniske biomarkers, med passende overflaten endring.

    Så langt, er penetrasjon av LSPR sensorer begrenset av begrensningene på muligheten til å lage forståelsesfull overflater over store områder med en reproduserbarhet ligner på semiconductor industry. Store sensing flater kan være lett tilkobles med standard og kostnadseffektiv optikk. Presisjon i fabrikasjon prosessen vil også redusere chip til chip avviket, en kritisk flaskehals i å forbedre påliteligheten av målinger, som er avgjørende i en klinisk setting. I sammenheng med en medisinsk enhet, hvor føljetong målinger er nødvendig, er reproduserbarhet av overflaten regenerasjon også avgjørende. Det har også vist at den optimale protokollen for regenererende sensing overflaten kan etablert i en kommersielt tilgjengelig SPR plattform og deretter ble oversatt til nanohole array. Effektiviteten av gjenfødelse lett kan beregnes for nanohole matrise og hensiktsmessigheten av gjenfødte overflaten for gjenta målinger kan vurderes. Ved å etablere robuste overflatekjemi endring og regeneration protokoller, kan LSPR sensorer være en følsom ennå enkel plattform for sanntids bioanalyte deteksjon. Det er lett å forutse sin betydelig innvirkning på pasientomsorgen. Det skal bemerkes at absolutt følsomheten til sensoren ikke samsvarer med de mest avanserte ELISA-baserte testene. Noen forsterkning strategier må være utformet for å øke følsomhet. Selv i sin nåværende form, denne teknologien representerer en betydelig forbedring i forhold til etablerte nanoimprinted LSPR protokoller, fordi den definerer en ny nedre grense for etikett uten påvisning av en hjerte biomarkør bruker en overføring optisk oppsett. Teknologien utvikler seg mot gjennomføringen av sanntids overvåking av flere klinisk viktige biomarkers. Ytterligere forbedringer i datainnsamling (f.eks detektorer med bedre oppløsning) og påfølgende signalbehandling kunne hjelpe LSPR-baserte sensorer oppnå dette.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

    Acknowledgments

    AP anerkjenner Prof T Venkatesan, direktør, NUS nanovitenskap og nanoteknologi initiativ og Office av nestformann (National University of Singapore) (R-398-000-084-646). CLD anerkjenner av Singapore departementet av helse National Medical Research Council under sin kliniker forsker finansiering ordningen, NMRC/CSA/035/2012 og National University of Singapore. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Electron Beam Lithography setup Elionix ELS 700
    o-Xylene Sigma Aldrich 95662
    EB resist Sumitomo NEB-22A2
    Developer reagent Shipley Company Microposit MF 321
    Electroplating machine Technotrans AG RD 50
    Photoresist stripper  Rohm and Haas Electronic Materials LLC Microposit Remover 1165
    Etching System Trion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl)trichlorosilane  Gelest (PA, USA) 78560-44-8
    SAM coater  Sorona Inc. AVC 150M
    Photo-curable NIL resist micro resist technology GmbH mr-UVCur21-300nm
    Light Curing System Dymax  Model 2000 Flood
    E-beam deposition machine Denton Explorer
    UV-visible spectrometer  Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Standard refractive index liquids  Cargill Inc (Cedar Grove, USA) 18032
    Plotting software Origin Origin Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol  Dojindo Laboratories (Japan) C385-10
    1-octanethiol  Sigma-Aldrich, MO, USA 471386
    Sulfo-N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  BioRad (CA, USA) 1762410
    Anti-troponin antibody 560 Hytest (Finland) 4T21
    Ethanolamine-HCl solution BioRad (CA, USA) 1762450
    Surface Plasmon Resonance setup BioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR chip BioRad GLC
    Human cTnI standard Phoenix Pharmaceuticals EK -311-05
    Glycine-HCl BioRad (CA, USA) 1762221

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391, (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200, (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10, (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89, (12), 121106 (2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452, (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4, (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5, (5), 818 (2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29, (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105, (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19, (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13, (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29, (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10, (3), 0120974 (2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84, (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85, (20), 9564-9571 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics