Met behulp van buitengewone optische transmissie te kwantificeren cardiale Biomarkers in menselijk Serum

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit werk beschrijft een nanoimprinting lithografie methode om kwalitatief hoogwaardige sensing matrices die op het principe van buitengewone optische transmissie werken. De biosensor is lage kosten, robuust, makkelijk te gebruiken, en kan detecteren cardiale troponine ik in serum op klinisch relevante concentraties (99th percentiel cutoff ∼10-400 pg/mL, afhankelijk van de test).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Patra, A., Ding, T., Hong, M., Richards, A. M., Wong, T. I., Zhou, X., Drum, C. L. Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum. J. Vis. Exp. (130), e55597, doi:10.3791/55597 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Voor een biosensing platform dat klinische relevantie in point-of-care (POC) instellingen, zijn assay gevoeligheid, reproduceerbaarheid, en het vermogen om te controleren op een betrouwbare manier analyten tegen de achtergrond van menselijk serum cruciaal.

Nanoimprinting lithografie (nihil) werd gebruikt voor het fabriceren, tegen een lage prijs, sensing gebieden zo groot als 1.5 x 1.5 mm. Het sensing oppervlak werd gemaakt van HiFi-arrays van nanoholes, elk met een oppervlakte van ongeveer 140 nm2. De grote reproduceerbaarheid van nihil maakte het mogelijk een strategie van het één-chip, een-meting op 12 individueel vervaardigde oppervlakken, met minimale chip-op-Spaander variatie in dienst. Deze nanoimprinted gelokaliseerd oppervlakte plasmon resonantie (LSPR) chips waren uitgebreid getest op hun vermogen om op een betrouwbare manier meten een bioanalyte in concentraties variërend van 2,5 tot 75 ng/mL in het midden van de achtergrond van een complex biofluid-in dit geval, menselijk serum. De hifi van nihil stelt de generatie van grote sensing gebieden, die op zijn beurt de noodzaak van een Microscoop, elimineert zoals deze biosensor kan gemakkelijk worden geïnterfacet met een lichtbron van algemeen beschikbare laboratorium. Deze biosensoren kunnen cardiale troponine detecteren in serum met een hoge gevoeligheid, bij een limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor 0.55 ng/mL, die klinisch relevant is. Ze tonen ook lage chip-op-Spaander afwijking (als gevolg van de hoge kwaliteit van de productie-procédé). De resultaten zijn commensurabele met gebruikte enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-gebaseerd testen, maar de techniek behoudt de voordelen van een LSPR gebaseerde sensing platform (dat wil zeggen, inschikkelijkheid miniaturisatie en multiplexing, waardoor het meer haalbaar voor POC toepassingen).

Introduction

Chemische sensoren op basis van nanohole matrices zijn een onderwerp van talloze onderzoeken sinds het eerste verslag over buitengewone optische transmissie (EOT) werd gepubliceerd door Ebbesen et al. in 19981. Wanneer licht inbreuk op periodieke arrays van nanohole structuren van sub golflengte dimensies maakt, verbeterde transmissie gebeurt bij specifieke golflengten. Dit gebeurt wanneer het incident lichte met Bloch-Golf oppervlakte polariton (BW-SPP) en/of gelokaliseerde oppervlakte plasmons (LSP)2 paren.

De onderliggende fysieke principe misbruikt wanneer biosensing met dergelijke periodieke arrays eenvoudig is. Adsorptie van moleculen op of in de buurt van de interface van metaal verandert de diëlektrische constante van het medium in contact met het metaal, op zijn beurt het verschuiven van de locatie van de transmissie-bands in het spectrum. Het spectrum zelf kan worden aangepast door de vorm, de grootte en scheiding afstand3,4,5nano-engineering. Inherent aan het ontwerp hebben sensoren op basis van EOT karakteristiek bands in hun spectra die specifieke toewijzingen6,7,8 te gedurende de behandeling van moleculaire binding gebeurtenissen vergemakkelijken. Dit is een cruciaal voordeel ten opzichte van commercieel beschikbare oppervlakte plasmon resonantie (SPR) platformen.

Sensoren met behulp van EOT meestal betrekken een lichtbron optisch uitgelijnd zodanig zijn dat een collimated balk incident op het sensing oppervlak. Technieken voor het genereren van grote nanohole oppervlakken, zoals co-polymeer sjablonen en interferentie en nanosphere lithografie, hebben arme reproduceerbaarheid9. Vanwege deze beperkingen in het nauwkeurig het fabriceren van grote oppervlakken die aantonen dat het verschijnsel van EOT, moest een optische Microscoop correct positie van de lichtbron en detector. Ter vereenvoudiging van de techniek, de hoge kwaliteit nanoimprinting lithografie (nihil)10 werkte. Hierdoor is de productie van grote sensor oppervlakten11 (mm-schaal), het verwijderen van de noodzaak van een microscoop om te zoeken naar het sensing oppervlak op een chip. In plaats daarvan, deze sensor gemakkelijk kon worden geïnterfacet met een standaard optische glasvezelkabel.

Aangezien de pieken van de overdracht voor deze nanohole array zijn vervat in het zichtbare gebied nabij-infrarood (NIR), is het perfect geschikt voor sensing bindende gebeurtenissen voor biomoleculen in een waterige omgeving. De verwachte optische werking van de nanohole matrix werd gesimuleerd. Het resultaat werd vervolgens gecontroleerd door middel van studies met vloeistoffen van standaard refractieve indexen (RI). Deze matrix werd vervolgens gebruikt voor het meten van de concentratie van cardiale troponine ik (cTnI) in de complexe achtergrond van menselijk serum. cTnI is de klinische gouden standaard voor de diagnose van acuut myocardinfarct.

Met behulp van deze sensor, is het mogelijk om te detecteren en kwantificeren van cTnI in menselijk serum tegen een limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor 0.55 ng/mL, die klinisch relevant is. De detectie is veel sneller dan de meest technologie in dit domein, de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA gebruikte). Anderzijds het sensing oppervlak kan gemakkelijk worden opnieuw gegenereerd en daarom hergebruikt. Vandaar, dit werk toont de belofte van nanohole arrays als een levensvatbare point-of-care (POC) technologie voor biosensing binnen complexe biofluids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabricage van de Sensor en de verwerving van de gegevens

  1. Voorbereiding van de nikkel-schimmel
    1. Jas een 220 nm-dikke laag van negatieve elektronenbundel weerstaan op een 600 µm dik 4-in silicium wafer. Schrijf de ontworpen nanohole array op deze wafer met behulp van een electron beam lithografie systeem.
      1. Om te versnellen van de e-balk schrijven, schrijven de patronen met een laag dotmap (N) van 20k voor elke veldlengte 300 µm (A) (dat wil zeggen, er zijn 0,4 miljard dots toegewezen op elk gebied van de2 300 µm en elke stip zal ofwel worden blootgesteld door de e-bundel of niet afhankelijk van het ontwerp van het patroon). De e-bundel weerstaan blootstelling dosis voor het weerstaan ingesteld op 110 µC cm−2 en schrijven op een stroom (I) van 800 pA.
        Opmerking: E-bundel schriftelijk, de blootstelling dosis (D) wordt gecontroleerd door de belichtingstijd voor elke stip (Tstip), berekend door Equation 1 . Voor de blootstelling dosis op 110 µC cm−2is de e-bundel woning tijd op elke blootgestelde stip 0,5 µs12. Omdat de matrix een oppervlakte van 1,8 mm2 vangt, zijn er een totaal van 36 patches van 300-µm2 veld gebieden elkaar gestikt aan vorm één grote, gouden nanohole array.
    2. Ontwikkelen van de weerstaan door het onderdompelen van de 4 inch silicium wafer in de oplossing van de ontwikkelaar voor 10 s en laten de wafer drogen in de lucht.
    3. Een laag van zaad van een metaal, zoals aluminium, nikkel en koper op het silicium wafer storten.
    4. Electroplate de wafer in een beplating systeem in een bad van nikkel sulfamate. Verrichten de galvaniseren in twee stappen. In de eerste stap, duurzame 95 min, gebruikt een stroomdichtheid van 0,7 A dm−2; Dit wordt de nanopatterns volledig gevuld met nikkel. In de tweede stap, duurzame 125 min, 12 A dm−2 gebruiken tot 300 µm als de laatste nikkel schimmel dikte (20 nm). Zorgen dat de pH-waarde op 3.5-3.8 is en dat de temperatuur bij 52-54 ° C.
    5. De nikkel-mal van het silicium substraat scheiden door zachte mechanische kracht toe te passen. Geniet van de nikkel-schimmel in ongeveer 100 mL positieve fotoresist verwijdering reagens 's nachts weg te wassen het residu van de e-bundel weerstaan.
    6. Voeden de schimmel van nikkel in een oven en droog het bij 100 ° C gedurende 3 h. schoon te maken in een plasma etsen systeem met O2 gas bij 10 sccm en 100 W gedurende 3 minuten.
  2. Fabricage van de gouden nanostructuur
    1. Jas van 150 µL van heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane (FDTS) op de mal van nikkel in een zelf-assemblage enkelgelaagde (SAM) coating machine bij 80 ° C.
      Opmerking: Dit zal een anti-lijm laag, waardoor de scheiding van de mal van de fotoresist ("demolding") zal na de voltooiingvan de nanoimprinting stap vormen. Het verdampen tijd moet 180 s, en de reactietijd moet 900 s.
    2. Colofon van de nanopatterns op een 4 - in glas wafer die heeft zijn bekleed met een 300 nm-dikke laag van foto-drogende nihil weerstaan met behulp van een nano-imprinter een druk van 10 bar en een temperatuur van 40 ° C gedurende 10 minuten.
    3. De mal, de fotoresist en de glas-wafer overbrengen met een UV-licht uithardende systeem en photocure met 75 mW cm-2 van UV blootstelling voor 30 s.
      Opmerking: Als alle stappen correct gevolgd, de nikkel-schimmel moet gemakkelijk worden demolded uit de fotoresist.
    4. Een reactive ion etching (RIE) systeem, Voer in een lege etsen van de fotoresist op het glas-substraat, met een O-2 gasstroom van 10 sccm, op 50 W voor 2 s om het glas op de ingesprongen gebieden bloot te stellen.
    5. Storten een 5 nm-dikke laag van chroom (Cr) voor metalen hechting en een 100 nm van goud (Au) voor de Enterprise sensor op de wafer glas in een elektronenbundel afzetting machine. Gebruik een afzetting tarief van 1 Å s−1 voor Cr en 2 Å s−1 voor Au.
    6. Astronauten van de fotoresist uitvoeren door O2 plasma etsen gedurende 3 minuten gevolgd door een 15-s sonification stap in aceton.
    7. Dobbelstenen het monster in 5 mm × 5 mm chips. De nanohole matrix zal bezetten de centrale 2 mm × 2 mm van de chip.
  3. Overname van de gegevens
    1. Het apparaat instellen om de optische metingen zodanig dat een witte lichtstraal verlaten tot het einde van de zender optische vezel is collimated en incident op het sensoroppervlak (nanohole array) op 90 is °.
      Opmerking: Licht wordt overgedragen via de hele nanohole array.
    2. Het verzonden signaal met de ontvanger optische vezel verzamelen en opnemen met een UV-zichtbaar spectrometer die binnen het bereik van 300 tot 1000 nm.
    3. De Acquisitietijd instellen voor elk frame 20 ms. gemiddelde 100 frames te verkrijgen van de laatste spectrum te verlagen van het lawaai in de metingen.
    4. Plotten software gebruiken voor het analyseren van de gegevens op basis van de pieken van de eerder geïdentificeerde transmissie (met een Lorentz-gebaseerde methode).

2. sensor Bulk gevoeligheidstest

  1. Stort de standaard RI-vloeistof op de vloeibare cel, met de RI, variërend van 1.31 tot 1.39.
  2. Dompel de sensor-chip in de standaard RI-vloeistof en lijnen met de straal wit licht. Het spectrum van de transmissie te verkrijgen.
  3. Reinigen van de sensor-chip na elke meting met een tensioactieve schoonmaak reagens en droog het met stikstofgas.

3. sensor oppervlakte modificatie

  1. Voorafgaand aan chemische wijzigingen, reinig de sensor chips door sequentiële onderdompeling in isopropanol, aceton en gedeïoniseerd water. Droog, bij kamertemperatuur in een stroom van droog stikstofgas.
  2. Incubeer de sensor chips in een ethanolische oplossing van 0,4 mM 10-carboxy-1-decanethiol en 1.6 mM 1-octanethiol voor 12u bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Dit zal vormen een amine-reactieve zelf-assemblage enkelgelaagde (SAM).
  3. Ethanol gebruik goed naspoelen en drogen bij kamertemperatuur.
  4. Maak een mengsel van 75 mM sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) en 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Dompel de chips in dit mengsel gedurende 15 minuten.
    Opmerking: Dit zal activeren de carboxylic groep van de SAM.
  5. Ter plaatse 50 µL van 200 µg/mL anti-troponine antilichaam oplossing gemaakt in een pH 4.5 acetaat buffer op het sensoroppervlak en incubeer gedurende 30 min.
  6. De spoorverontreiniging esters deactiveren door de sensor chip in 1 M ethanolamine-HCl-oplossing gedurende 15 minuten onder te dompelen.
  7. Spoel de chip met gedeïoniseerd water en droog het in een stroom van droog stikstofgas bij kamertemperatuur.

4. cTnI Assay

  1. Het blokkeren van alle niet-specifieke binding door spotten 100 µL van 1% bovien serumalbumine (BSA)-oplossing op het oppervlak.
Incubeer gedurende 15 minuten.
  • Spoel de sensor chips driemaal in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing. De chip invoegen in de cel van de meting om vast te leggen van de transmissie-spectrum.
    Opmerking: Dit is het referentiespectrum.
  • Ter plaatse 50 µL van cTnI standaard op het oppervlak van de chip en broeden in een vochtige omgeving voor 30 min.
  • Spoel de sensor chips drie keer in PBS oplossing en plaatst u deze in de cel van de meting om vast te leggen van de transmissie-spectrum.
    Opmerking: Dit is het na bindende spectrum.
  • Onderdompelen van de chips in 50 mM glycine-HCl (pH 2) voor 1 min en dan afspoelen in PBS oplossing driemaal voor de regeneratie van het oppervlak van de chip. Meet het spectrum van de transmissie in PBS om te controleren of het succes van de regeneratie-stap.
  • 5. oppervlakte Plasmon resonantie (SPR) meting

    1. Voer de multiplexed SPR sensor chip op het SPR-systeem met PBS-T buffer.
      Opmerking: De samenstelling van de PBS-T buffer is 20 mM nb-fosfaat, 150 mM NaCl en 0,05% Tween-20. De pH is 7.4.
    2. Gebruik cTnI-standaard en het antilichaam, zoals beschreven in stap 4.
    3. Het activeren van 3 van de 6 beschikbare kanalen met een mengsel van EDC (0,2 M) en sulfo-NHS (0,05 M) voor 5 min. uitvoeren een 5 min injectie van 50 µg Mo/mL antilichaam 560 en een 5-min-injectie van 1 M ethanolamine-HCl-oplossing.
    4. De sensor-chip met 90° draaien en het injecteren van de cTnI-normen in verschillende concentraties (75, 30, 7.5 en 2.5 ng/mL).
    5. Observeer de vervoeging aan het antilichaam bij vlekken van interactie op de chip in real time via de SPR uitlezing.
    6. Het regenereren van de chip door het injecteren van 50 mM glycine-HCl (pH 2) voor 1 min.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    De optische setup voor metingen wordt weergegeven in figuur 1A. Een beeld van de werkelijke nanohole matrix wordt gegeven in figuur 1B. Om te begrijpen van de fysica rijden de sensing proces, was de software van de simulatie COMSOL gewend de verdeling van het Enterprise veld in een waterige omgeving simuleren. De resultaten van de simulatie werden vervolgens gerelateerd aan de werkelijke meting. Een eerder gepubliceerde studie bevat details van de hypothesen en de parameters die worden gebruikt in de simulatie11,13. De fysieke afmetingen gebruikt voor het simuleren van de Enterprise veld voor de nanohole matrix als volgt was: p = 400 nm, D = 150 nm, en T = 100 nm. Absorptie en verstrooiing effecten zijn ook in rekening14 genomen bij de berekening van de transmissie-spectrum. De gesimuleerde spectrum wordt vergeleken met het experimenteel gemeten spectrum in Figuur 1 c. De gesimuleerde zowel de gemeten spectra brengen het bestaan van vier bands uit 450 tot 850 nm. De band op 495 nm komt overeen met de interband overgang van goud. De drie daaropvolgende bands, voortaan genaamd bands ik-III in oplopende volgorde van de golflengte, bevinden zich op 560 nm, 645 nm, en 712 nm, respectievelijk. Bands III werden waargenomen dat aanvaardbaar aanpassing aan de experimenteel gemeten bands, attractiepark 558 nm, 638 nm en 724 nm. Als de gefabriceerde nanoholes bijna cirkelvormige in vorm zijn, mag deze banden niet gevoelig voor polarisatie van de invallende licht. Daarnaast maakt de COMSOL simulatie de directe visualisatie van de verdeling van de in de buurt van-veld van deze bands zoals die in een eenheidscel van de periodieke structuur (Figuur 1 d) zou plaatsvinden. De eenheid op de kleurenbalk is de optische veld verdeling (V/m) uitgedrukt in een logschaal. De hoogste intensiteit waargenomen was ongeveer 4,7 (50,119 V/m). Vergeleken met de intensiteit van de incidentie in de simulatie (4,340 V/m) gebruikt, vertegenwoordigt deze omvang een verhoging van de 11.5-fold veld. De elektromagnetische velden voor bands die i en III waren gelokaliseerd op het oppervlak van het glas-substraat. In tegenstelling, band II was voornamelijk gelokaliseerd op de bovenste rand van de nanohole en werd gekozen voor de detectie van de bioanalyte. Figuur 1E illustreert de spectra van de transmissie van de nanohole matrix in vloeistoffen van bekende refractieve indexen, die van 1.31 tot 1.39 varieerden. Drie bands van de transmissie, overeenkomt met de bands I, II en III, werden waargenomen in het spectrum bereik van 400-900 nm. Een rode de verschuiving werd waargenomen met een verandering in RI. De omvang van de werktijd gevolgd de reeks band II > band ik > band III. Figuur 1F is een samenvoeging van de waargenomen rode verschuivingen van bands I, II en III. De gevoeligheid van de bulk berekend voor band ik was 322 nm/RIU, voor band II was 345 nm/RIU en voor band II was 202 nm/RIU.

    Figuur 2A bevat het schema van het sensing fenomeen in actie. Figuur 2B wordt de wijziging in de transmissie spectra nadat de cardiale troponine moleculen aan het oppervlak matiemaatschappij chip binden. Bij lage concentraties is er een lineaire verschuiving in de band met het troponine-niveau. De verschuiving van het standpunt van de band kan ook een bindende Thermo met een R2 waarde van 0.995 worden gemonteerd. Op nauwere observatie lijkt 30 ng/mL te zijn de concentratie op die de Thermo geeft aan het begin van verzadiging (figuur 2C).

    Figuur 3A geeft de sensorgram van de interactie van serum met het oppervlak van de chip van een gemodificeerde GLC-chip in een XPR36 opstelling. Het vastleggen van de cTnI wordt weergegeven door de stijging van het signaal. Daarna kan de dissociatie van cTnI in een medium PBST (1 x PBS, 0,05% Tween-20) worden waargenomen, zoals de signaal daalt van 120-660 s. injecterend glycine (de regeneratie-oplossing) voor 1 min verminderd het signaal op 0, wat betekent de regeneratie van het sensing oppervlak door de volledige terugtrekking van de cTnI. De sensorgram voor de latere vereniging van cTnI aan de oppervlakte van geregenereerde chip wordt weergegeven in de inzet van figuur 3A. Hetzelfde protocol (dat wil zeggen, onder te dompelen in glycine oplossing voor 1 min) werd gebruikt voor het regenereren van het oppervlak van de matrix nanohole. Figuur 3B toont dat de positie van band 2 verschuift terug naar de oorspronkelijke positie, waardoor de bevestiging van het succes van de regeneratie-stap.

    Figure 1
    Figuur 1 : Karakterisering van de matrix nanohole. (A) vereenvoudigd schema van de experimentele opstelling. (B) Scannende Elektronen Microscoop afbeelding voor de matrix nanohole. (C) vergelijking tussen de gesimuleerde spectrum en het experimenteel gemeten transmissie spectrum in een waterige omgeving. (D) het in de omgeving van veld distributie zoals gesimuleerd in COMSOL voor bands I en III, gezien in een transversale weergave. Rood staat sterker in de buurt van-veld distributie. De eenheid wordt weergegeven in de kleurenbalk is | E |, de verdeling van de optische veld, genomen in de logschaal. (E) experimenteel gemeten transmissie spectra van de nanohole matrix in omgevingen met standaard brekingsindex vloeistoffen (1.31-1.39). (F) Bulk gevoeligheden van de drie transmissie bands (I-III) te wijzigingen in RI gemeten in het zichtbare bereik van NIR. Zwart vierkant: band I, rode cirkel: band II, blauwe driehoek: band III. De figuur is gewijzigd van Ding et al. 14 onder een licentie CC door. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 2
    Figuur 2 : De nanohole array gebruikt als een biosensor. (A) schema van de nanohole matrix wordt gebruikt als een biosensor voor het opsporen van cTnI. (B) de wijziging in de transmissie spectrum van de biosensor op interactie met menselijke cTnI bij een concentratie van de 30 ng/mL in een achtergrond van serum. Blauw: voor interactie, rood: na interactie. De gestippelde cirkel geeft aan de band wordt bijgehouden. (C) de verschuiving van de golflengte voor band II in verschillende concentraties van troponine (2,5 ng/mL, 7.5 ng/mL, 30 ng/mL en 75 ng/mL).De foutbalken Toon de standaarddeviatie onder de n = 3 chips gebruikt voor elke meting. De figuur is gewijzigd van Ding et al. 14 onder een licentie CC door. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 3
    Figuur 3 : Regeneratie van het sensoroppervlak. (A) een SPR-sensorgram van XPR36 de injectie van de analyt (cTnI) gevolgd door de injectie van glycine tonen om te regenereren het sensoroppervlak. De detectie van de latere metingen van verschillende concentraties van cTnI tegen de achtergrond van het serum worden weergegeven in de inzet. De rode balk geeft de beginwaarde, terwijl de zwarte balk de meting na de regeneratie van het oppervlak met het protocol beschreven in de tekst toont. (B) de verschuiving in de band golflengten waargenomen na de regeneratie van een nanohole biosensor chip. Σ: standaarddeviatie van verschuivingen in de golflengte van het standpunt van de band. De figuur is gewijzigd van Ding et al. 14 onder een licentie CC door. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Simuleren van de interactie tussen incident licht en de nanostructuren maakt het mogelijk om te identificeren van de juiste piek (in het spectrum transmissie), wiens shift kan worden opgenomen als een functie van de concentratie van de analyt. Het is belangrijk op te merken dat de lokalisatie van de bands met betrekking tot de structuur van de sensor cruciaal voor de keuze van de juiste band, waarvan verschuiving is te voelen van de analyt kan worden bijgehouden. De visualisatie kan worden bereikt door middel van simulaties. Dit is ook cruciaal voor het ontwerp van een optimale structuur waarmee de biosensing van de analyten. Zoals gezien hier, bands I en III zijn gelokaliseerd op de glas-goud-interface en vandaar niet nuttig voor biosensing zijn. Een prominent onderdeel van de LSPR kan worden waargenomen in de band II. Het toont een korte verval lengte en is gelokaliseerd op de rand van de nanoholes. Zo, leent dit zich goed voor wordt gebruikt voor de detectie van de analyt concentraties. De kwaliteit van de gefabriceerde nanostructuren over de hele matrix is ook essentieel voor de kwaliteit van spectra verzameld. Niet-uniforme structuren zal introduceren artefacten.

    Verstrooiing en onvermijdelijke absorptie maken artefacten in een waterige meting. De totale signaal-/ ruisverhouding wordt ook verstoord door de aanwezigheid van het waterig medium. In het geval er meerdere geschikte banden waarvan verschuivingen voor biosensing kunnen worden gecontroleerd, moeten de volgende punten worden beschouwd. Bij sub 600 nm golflengten, is het spectrum van de waargenomen transmissie aanzienlijk beïnvloed door absorptie van eiwitten en deeltje verstrooiing. Aan de andere kant, met behulp van golflengtes groter is dan 900 nm kan verwarring door het verhullen van de belangrijke onderliggende signalen afkomstig van de bindende gebeurtenissen, zoals in deze regio, de absorptie door water toeneemt met de golflengte. Voor sensing analyten in een waterige omgeving, daarom, ligt band II optimaal in termen van de golflengte. Een kleine afwijking bij het meten van de band standpunt kon worden waargenomen. Dit wordt veroorzaakt door de grote sensor grootte. Terwijl de grote sensor vertaalt zich uiteindelijk in kortere overname keer omdat elk van de detectie-pixels zien nu een groter-dan-gebruikelijke stroom van fotonen, is het ook een negatief effect van lawaai. In feite, als de signaal-collectie wordt niet goed uitgevoerd en de gegevens conditionering niet optimaal ontworpen, kan een heleboel lawaai worden waargenomen. Gemiddelde van de verzamelde signaal meer dan 10015frames, het geluidsniveau kan worden verlaagd. Hoewel er andere manieren om te produceren LSPR signalen, met name uit gouden nanodeeltjes16, is de nanohole array veel meer haalbaar om uit te voeren in een draagbaar formaat met microfluidics. Het hele apparaat kan worden gebruikt voor POC toepassingen vanwege het gemak van de automatisering van het hele proces en de mogelijkheid van het regenereren van de sensing oppervlak.

    Deze experimentele protocol is ontworpen om te minimaliseren van experimentele fout met behulp van transmissie mode in plaats van reflectie. Dit snijdt mogelijk artefacten uit hoek-van-incidentie veranderingen. Het is ook belangrijk erop te wijzen de kritieke aard van stap 3.4, wanneer het antilichaam kruisverwijzende op het sensoroppervlak is. Het is essentieel voor het behoud van de reactiviteit van zowel sulfo-NHS en EDC. Ook bleek dat overschakelen van NHS naar sulfo-NHS cruciaal voor verbeterde stabiliteit. Als de monsters worden hergebruikt, wordt opslag onder vloeibare stikstof aanbevolen. De platformtechnologie die hier wordt weergegeven kan worden gebruikt om te controleren van andere klinische biomarkers, met passende oppervlakte modificatie.

    Tot dusver heeft de penetratie van LSPR sensoren zijn beperkt door de beperkingen van de mogelijkheid om te maken responsieve oppervlakken over grote gebieden met een reproduceerbaarheid vergelijkbaar met die van de halfgeleiderindustrie. Grote sensing oppervlakken kunnen gemakkelijk worden geïnterfacet met standaard en kosteneffectieve optica. Precisie in het fabricageproces zou ook het verminderen van de afwijking van de chip-op-chip, een kritische knelpunt bij het verbeteren van de betrouwbaarheid van metingen, die is van cruciaal belang in een klinische setting. In het kader van een medisch hulpmiddel, waar seriële metingen nodig zijn, is de reproduceerbaarheid van oppervlakte regeneratie ook cruciaal. Ook is gebleken dat het optimale protocol voor het regenereren van de sensing oppervlak kan worden vastgesteld in een commercieel beschikbare SPR-platform en vervolgens met succes vertaald naar de nanohole array. De efficiëntie van de regeneratie kan gemakkelijk worden berekend voor de nanohole array en de geschiktheid van de geregenereerde oppervlakte voor herhaalde metingen kan worden beoordeeld. Bij de vaststelling van de robuuste Oppervlaktechemie wijziging en regeneratie protocollen, kunnen LSPR sensoren een gevoelige toch eenvoudig platform voor real-time bioanalyte detectie. Het is gemakkelijk te voorspellen de aanzienlijke gevolgen daarvan voor patiëntenzorg. Het dient te worden opgemerkt dat de absolute gevoeligheid van de sensor kan niet overeenkomen met de meest geavanceerde ELISA gebaseerde tests. Sommige amplificatie strategieën moeten worden ontworpen om te verhogen van de gevoeligheid. Zelfs in zijn huidige vorm, vertegenwoordigt deze technologie een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de gevestigde nanoimprinted LSPR protocollen, zoals het omschrijft een nieuwe ondergrens voor het opsporen van label-vrij van een cardiovasculaire biomarker met behulp van een transmissie-gebaseerde optische Setup. Technologie evolueert naar de uitvoering van real-time bewaking van meerdere klinisch belangrijk biomarkers. Verdere verbeteringen in de data-acquisitie (bijvoorbeeld detectoren met een betere resolutie) en latere signaalverwerking kunnen helpen LSPR gebaseerde sensoren bereiken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

    Acknowledgments

    AP erkent de steun van Prof T Venkatesan, directeur, NUS Nanoscience Nanotechnology Initiative en Bureau van de ondervoorzitter (National University of Singapore) (R-398-000-084-646). CLD erkent de steun van de Singapore ministerie van gezondheid nationale Medical Research Council onder haar behandelaar wetenschapper financieringssysteem, NMRC/CSA/035/2012, en de National University of Singapore. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Electron Beam Lithography setup Elionix ELS 700
    o-Xylene Sigma Aldrich 95662
    EB resist Sumitomo NEB-22A2
    Developer reagent Shipley Company Microposit MF 321
    Electroplating machine Technotrans AG RD 50
    Photoresist stripper  Rohm and Haas Electronic Materials LLC Microposit Remover 1165
    Etching System Trion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl)trichlorosilane  Gelest (PA, USA) 78560-44-8
    SAM coater  Sorona Inc. AVC 150M
    Photo-curable NIL resist micro resist technology GmbH mr-UVCur21-300nm
    Light Curing System Dymax  Model 2000 Flood
    E-beam deposition machine Denton Explorer
    UV-visible spectrometer  Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Standard refractive index liquids  Cargill Inc (Cedar Grove, USA) 18032
    Plotting software Origin Origin Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol  Dojindo Laboratories (Japan) C385-10
    1-octanethiol  Sigma-Aldrich, MO, USA 471386
    Sulfo-N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  BioRad (CA, USA) 1762410
    Anti-troponin antibody 560 Hytest (Finland) 4T21
    Ethanolamine-HCl solution BioRad (CA, USA) 1762450
    Surface Plasmon Resonance setup BioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR chip BioRad GLC
    Human cTnI standard Phoenix Pharmaceuticals EK -311-05
    Glycine-HCl BioRad (CA, USA) 1762221

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391, (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200, (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10, (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89, (12), 121106 (2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452, (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4, (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5, (5), 818 (2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29, (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105, (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19, (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13, (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29, (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10, (3), 0120974 (2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84, (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85, (20), 9564-9571 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics