Un metodo per testare l'efficacia della lavata a mano per la rimozione di nuovi patogeni infettivi

Immunology and Infection

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Summary

La lavata a mano è ampiamente raccomandata per prevenire la trasmissione delle malattie infettive. Tuttavia, non vi è alcuna prova su cui i metodi di lavaggio della mano sono più efficaci nella rimozione di patogeni delle malattie infettive. Abbiamo sviluppato un metodo per valutare l'efficacia dei metodi di lavaggio a mano alla rimozione dei microrganismi.

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Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).

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Abstract

La lavata a mano è ampiamente raccomandata per prevenire la trasmissione delle malattie infettive. Tuttavia, esistono scarse prove comparabili sull'efficacia dei metodi di lavaggio a mano in generale. Inoltre, esistono poche prove che consentono di confrontare i metodi di lavaggio a mano per determinare quali sono i più efficaci per la rimozione di patogeni infettivi. È necessaria la ricerca per fornire prove sui diversi approcci di lavaggio a mano che possono essere utilizzati durante i focolai di malattie infettive. Qui viene descritto un metodo di laboratorio per valutare l'efficacia dei metodi di lavaggio a mano per rimuovere i microrganismi dalle mani e la loro persistenza nell'acqua di risciacquo. Le mani dei volontari sono dapprima forate con l'organismo di prova e poi lavate con ogni metodo di lavaggio a mano d'interesse. In generale, i microrganismi surrogati vengono utilizzati per proteggere i soggetti umani dalla malattia. Il numero di organismi che rimangono sulle mani dei volontari dopo il lavaggio viene testato utilizzando un metodo "succo di guanti" modificato: le mani vengono collocate in guanti con un eluE vengono sciacquati per sospendere i microrganismi e renderli disponibili per l'analisi mediante filtrazione a membrana (batteri) o test di placca (virus / batteriofagi). L'acqua di risciacquo prodotta dalla lavata a mano viene direttamente raccolta per l'analisi. L'efficacia del lavaggio manuale viene quantificata confrontando il valore di riduzione del log tra i campioni prelevati dopo lavaggio a campioni senza lavaggio a mano. La persistenza della risciacquatura dell'acqua è quantificata confrontando i campioni di acqua di risciacquo da vari metodi di lavaggio a mano a campioni prelevati dopo lavaggio a mano con acqua sufficiente. Mentre questo metodo è limitato dalla necessità di utilizzare organismi surrogati per preservare la sicurezza dei volontari umani, raccoglie aspetti di lavaggio a mano che sono difficili da replicare in uno studio in vitro e riempie le lacune di ricerca sull'efficacia della lavaggio e la persistenza degli organismi infettivi in ​​risciacquo acqua.

Introduction

La lavata a mano è ampiamente raccomandata per prevenire la diffusione delle malattie, in particolare quelle trasmesse dalla via fecale-orale o aerea, comprese le malattie diarrea e respiratoria 1 . Sorprendentemente, non vi è alcuna prova comparabile sull'efficacia dei metodi di lavaggio a mano, come la lavaggio a mano con sapone e acqua (HWWS) e con il liquido sanitario a base di alcol (ABHS), sulla rimozione di organismi dalle mani. La ricerca iniziale ha scoperto che l'azione meccanica della lavaggio a mano, al contrario del metodo di lavaggio a mano, può rappresentare la maggior parte delle rimozioni dell'organismo 2 , 3 . Inoltre, non vi è alcuna prova comparativa su quale metodo di lavaggio a mano è più efficace. In una revisione informale della letteratura, sono stati identificati 14 studi che hanno confrontato l'efficacia del sapone e del sanitizzatore delle mani sulla rimozione degli organismi. Di questi studi, cinque hanno trovato ABHS per essere più efficaci 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , sette trovarono HWWS per essere più efficaci 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 e due non trovarono alcuna differenza significativa tra i metodi 16 , 17 . Questi risultati sono incoerenti e non affrontano il rischio continuo di malattia dalla persistenza degli organismi nell'acqua di risciacquo dopo la lavata a mano. Nel complesso, l'evidenza sull'efficacia comparata dei metodi di lavaggio a mano per la rimozione di patogeni causanti malattie infettive è limitata.

Questa prova limitata ha portato all'incertezza circa quali metodi sono più appropriati nelle impostazioni dell'epidemia. Per esempio, Durante l'epidemia di virus di Ebola (EVD) in Africa occidentale dal 2013 al 2016, numerosi intervistati internazionali hanno fornito raccomandazioni contraddittorie per HWWS, ABHS o soluzioni di cloro da 0,05%. Médecins Sans Frontières (MSF) raccomanda l'uso di una soluzione di cloro da 0,05% per la lavata a mano, mentre l'Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) raccomanda HWWS o ABHS (se le mani non sono visibilmente sporche). L'OMS va addirittura affermando che il cloro non deve essere utilizzato a meno che non siano disponibili altre opzioni, perché è meno efficace di altri metodi a causa della domanda di cloro esercitata dalla pelle 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Inoltre, le soluzioni di cloro vengono comunemente prodotte da quattro diversi composti di cloro, tra cui l'ipoclorito ad alta test (HTH), l'ipoclorito di sodio localizzato e stabilizzato (NaOCl) e la sodioIodicloroisocianurato (NaDCC). Una revisione sistematica commissionata dall'OMS in risposta all'epidemia di EVD in Africa occidentale ha recentemente trovato solo quattro studi che indagano sull'efficacia comparativa della lavaggio a mano con cloro 23 . Questi studi hanno inoltre prodotto risultati conflittuali e nessuno di questi studi ha utilizzato la concentrazione raccomandata di cloro dello 0,05% per la lavata a mano o studiati microorganismi simili al virus Ebola 10 , 24 , 25 , 26 , 27 . Pertanto, le raccomandazioni non sono state ritenute basate su prove e non era chiaro quali raccomandazioni erano più efficaci.

Sono necessarie ulteriori ricerche per confrontare gli approcci di lavaggio a mano per prevenire la diffusione degli agenti patogeni, poiché gli interventi di lavaggio a mano sono uno strumento importante per prevenire la trasmissione di malattie epidemiche. Questi hLe raccomandazioni di lavaggio devono essere basate su prove. Pertanto, è stato sviluppato un metodo per testare l'efficacia della lavaggio e la persistenza dell'acqua di risciacquo, eseguita con surrogati o agenti patogeni non infettivi, 2 , 28 e 29 . I risultati del campione, utilizzando Phi6 come surrogato per il virus Ebola e utilizzando Escherichia coli come un comune indicatore organismo, sono qui presentati. In questo protocollo viene presentata l'efficacia della lavaggio e il risciacquo delle prove di persistenza dell'acqua.

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Protocol

Dichiarazione di etica: Lo studio qui descritto (su Phi6 ed E. coli come surrogati per Ebola) è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale presso Tufts Medical Center e Tufts University Health Sciences Campus (# 12018); L'Università di Harvard ha ceduto la revisione al consiglio di revisione istituzionale di Tufts.

NOTA: Prima di iniziare questo protocollo, è necessario completare due passaggi. In primo luogo, deve essere identificata e selezionata una versione surrogata o non infettiva del livello 1 di biosicurezza (BSL-1) del patogeno da studiare e sicuro da usare sui soggetti umani. Per questo protocollo è necessario un surrogato BSL-1 o un agente patogeno non infettivo, in quanto l'organismo verrà utilizzato per inoculare le mani nude dei volontari umani. In secondo luogo, l'approvazione del consiglio di revisione istituzionale locale per condurre ricerche con soggetti umani deve essere ottenuta prima di assumere volontari o iniziare l'esperimento. Molti aspetti di questo protocollo possono essere regolati per soddisfare la tSpecifiche esigenze delle questioni di interesse.

1. Assunzione di soggetti umani ammissibili

  1. Reclutare i volontari inviando volantini di carta su schede pubbliche e inviando e-mail a gruppi con membri che potrebbero essere interessati a partecipare. Questi annunci dovrebbero includere lo scopo dello studio, le informazioni di contatto ei criteri di ammissibilità.
  2. Incontra i volontari per valutare l'idoneità. Confermare che i volontari sono sani, tra i 18 ei 65 anni, e non sono attualmente in gravidanza o prendono antibiotici e che non hanno danni / disturbi della pelle, allergie conosciute agli agenti lavaggio a mano o storia di problemi di salute mentale legati all'igiene.
  3. Avere i volontari idonei leggere i moduli di consenso. Rispondi a tutte le domande che fanno e fai che il volontario e l'investigatore firmano due copie del modulo. Conservare una forma e fornire uno al volontario.
  4. Amministrare un sondaggio di base, incluse le domande sulle informazioni demografiche, sulla personaLa storia delle condizioni della pelle e le informazioni sul comportamento recente lavaggio. Esaminare le mani per segni di dermatite, lesioni cutanee o anomalie della pelle di base 31 .
  5. Pianificare i volontari per due sessioni di test per ogni organismo di interesse (uno per test con carico del suolo e uno per test senza). Indica ai volontari di evitare i prodotti antimicrobici per un periodo di lavaggio di sette giorni prima di eseguire test per evitare confusione dall'uso personale del prodotto.
    1. Fornire volontari con prodotti antimicrobici (shampoo, condizionatore e sapone) da usare al posto dei loro prodotti abituali. Fornire guanti in vinile pesanti e istruire i soggetti a indossarli quando si utilizzano prodotti come i prodotti per la pulizia della casa.

2. Preparare le soluzioni di lavaggio delle mani comunemente usate in risposta di emergenza (sapone, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC e NaOCl Solutions)

NOTA: Le soluzioni di cloro possono essere preparate Fino a 12 ore prima dell'esperimento, ma degraderà se conservato> 12 h.

  1. Scegliere e acquistare un sapone rilevante per il contesto per cui vengono eseguiti i test.
    NOTA: nella maggior parte dei casi, per le emergenze delle malattie infettive nel mondo in via di sviluppo, questa sarà una barra di sapone.
  2. Scegliere e acquistare una soluzione ABHS pertinente per il contesto per cui vengono eseguiti i test.
    NOTA: L'ABHS scelto dovrebbe avere un contesto di alcool etilico superiore o pari al 70% per garantire l'efficacia.
  3. Preparare una soluzione di ipoclorito di calcio (Ca (ClO) 2 ) del 0,05% con l'aggiunta di granulare Ca (ClO) 2 per l'ultrapurazione dell'acqua. Determinare la quantità di soluzione necessaria in base al numero di soggetti da testare.
    1. Utilizzando la seguente equazione, determinare la quantità di polvere necessaria per preparare la quantità desiderata di soluzione in un determinato volume di acqua utilizzando un dato percentuale di cloro disponibile:
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      NOTA: La polvere di Ca (ClO) 2 presenta in genere il cloro disponibile al 60-80%.
  4. Preparare una soluzione 0,05% di sodio dicloroisocyanurate (NaDCC) aggiungendo una polvere NaDCC granulare per ultrapure l'acqua.
    1. Utilizzando la seguente equazione, determinare la quantità di polvere necessaria per preparare la quantità desiderata di soluzione in un determinato volume di acqua utilizzando un dato percentuale di cloro disponibile:
      Equazione
      NOTA: la polvere di NaDCC in genere ha circa il 50% di cloro disponibile.
  5. Preparare la soluzione stabile di 0,05% di NaOCl aggiungendo la soluzione di ipoclorito di sodio di riserva ad acqua ultrapure.
    1. Confermare la concentrazione della soluzione di zucchero NaOCl (probabilmente 5-8%) utilizzando un metodo di test di titolazione secondo le istruzioni del produttore ( ad esempio, titolazione iodometrica; vedere l'elenco dei materiali per il suKit ggested).
    2. Utilizzando i risultati del metodo di prova, calcolare la quantità di soluzione da aggiungere all'acqua utilizzando la seguente equazione:
      Equazione
  6. Preparare la soluzione stabile di 0,05% NaOCl aggiungendo la soluzione di ipoclorito di sodio prodotta utilizzando un elettrochlorinator, acqua ultrapure e un cloruro di sodio di laboratorio (NaCl) all'acqua ultrapure.
    1. Preparare una soluzione al cloro di 1% con acqua e NaCl ultrapure, utilizzando un elettrochinatore secondo le istruzioni del produttore.
    2. Utilizzare un metodo di test di titolazione ( ad esempio, titolazione iodometrica) per confermare la concentrazione della soluzione di scorta di NaOCl 32 .
    3. Utilizzando i risultati del test, calcolare la quantità di soluzione da aggiungere all'acqua utilizzando la seguente equazione:
      Equazione
  7. Confermare la cLa concentrazione di ciascuna delle soluzioni di lavaggio a mano del cloro usando un metodo di titolazione ( ad esempio, titolazione iodometrica) e regolare le soluzioni aggiungendo polvere / soluzione di origine clorosa o cloro fino a che non rientrino entro un errore del 10% della concentrazione di riferimento (0,045-0,055%).

3. Preparare gli organismi e il carico del suolo e combinare per produrre l'inoculo

NOTA: Nelle sottosezioni seguenti, E. coli e Phi6 sono utilizzati come organismi batterici e virali per la descrizione dei metodi.

  1. Preparare l'organismo ad essere utilizzato per il test a una concentrazione superiore a 10 x 10 8 CFU / mL per i batteri e superiore a 10 x 10 7 PFU / mL per i virus.
    1. Per preparare E. coli , strizza un ceppo non-patogeno di E. coli sulle piastre agar Luria-Bertani (LB) e incubare a 37 ° C per 24 ore per ottenere singole colonie. Conservare a 4 ° C.
      NOTA: questo può essere fatto severGiorni prima della sperimentazione.
      1. Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, raccogliere una singola colonia dalla piastra e inoculare 10 ml di brodo LB utilizzando un ciclo sterile. Incubare per una notte a 37 ° C con agitazione.
      2. Nella mattinata dell'esperimento, iniziare una nuova cultura aggiungendo 1 ml della coltura durante la notte a 20 ml di brodo fresco di LB. Incubare per circa 2,5 ore per ottenere una densità cellulare superiore a 10 8 CFU / mL.
      3. Utilizzare uno spettrofotometro per stimare la concentrazione della cultura.
        NOTA: Utilizzare un fattore di conversione stabilito in precedenza da una curva di standard per il ceppo E. coli utilizzato, assicurando una concentrazione superiore a 10 8 CFU / mL 33 . Se la densità delle cellule non è abbastanza alta, riportare la cultura all'incubatore e riprovare di nuovo fino a quando non sarà pronto.
    2. Confermare la concentrazione utilizzando la filtrazione a membrana 34 .
      NOTA: eseguire le diluizioni seriali oLa coltura in soluzione salina fosfatizzata (PBS) in modo che la soluzione filtrata produrrà un numero contabile di colonie sulla lastra (il numero esatto dipenderà dal mezzo utilizzato).
      1. Impostare una fiamma e un collettore di filtrazione con imbuti filtranti sterili e un collegamento a vuoto. Sterilizzare la pinza fendendo con etanolo. Usalo per posizionare un filtro da 0,45 μm sul collettore di filtrazione, con la griglia rivolta verso l'alto. Bagnare il filtro con una piccola quantità di PBS sterile.
      2. Posizionare l'imbuto sulla base e aggiungere la soluzione di campione da lavorare pipettando o versando direttamente sul filtro. Impegnare il vuoto fino a quando l'intero campione è passato attraverso la membrana. Sciacquare i lati dell'imbuto con PBS sterile e impegnare nuovamente il vuoto.
        NOTA: i campioni devono essere di almeno 100 μL e fino a 100 ml. Se un campione è inferiore a 10 ml, aggiungere circa 20 ml di PBS all'imbuto filtrante prima del filtraggio per assicurare la filtrazione uniforme del campionele.
      3. Rimuovere l'imbuto, sterilizzare a fuoco la pinza e sollevare il filtro dalla base. Posizionare il filtro delicatamente sull'agar LB in un piatto di Petri, con la griglia rivolta verso l'alto, assicurandosi che il filtro si trovi in ​​filo contro la superficie. Invertire le piastre e incubare per 24 h a 37 ° C.
      4. Dopo 24 h, rimuovere le piastre dall'incubatore e contare le colonie E. coli . Utilizzare questi dati e il fattore di diluizione noto e il volume della soluzione per calcolare la concentrazione della soluzione filtrata in CFU / mL.
    3. Propagare Phi6 nell'ospite di Pseudomonas syringae utilizzando il metodo di overlay del doppio agar 35 .
      1. Aggiungere 100 μL di sospensione di stock di Phi6 e 100 μl di P. syringae coltura per overnight direttamente a 6 ml di agar farmaco morbido dietetico (NBY) (0.3%). Versarlo su piastre con agar duro NBY (1,5%) e incubare per una notte a 26 ° C. Preparare piastre sufficienti per produrre inoculo sufficiente per l'esperimentoStimando una resa di circa 4 ml di sospensione virale per piastra.
      2. Il giorno dopo, aggiungere 5 ml di PBS sopra lo strato morbido agar. Lasciarlo a temperatura ambiente per 4 ore, recuperarlo con una pipetta e filtrarlo usando un filtro da 0,45 μm. Conservare a 4 ° C.
        NOTA: Questa soluzione servirà come inoculazione virale.
    4. Utilizzare un dosaggio a placca per confermare che la concentrazione è superiore a 10 7 PFU / mL 35 . Eseguire diluizioni seriali della sospensione virale in PBS in modo che 100 μL produca un numero contabile di placche sulla piastra.
      1. Pipettare 100 μl di un opportuno campione diluito e 100 μl di coltura host host overnight direttamente in un tubo contenente 6 ml di agar agile NBY. Versare agar agar su agar duro NBY e incubare a 26 ° C per 24 h.
      2. Il giorno dopo, togliere le piastre dagli incubatori e contare il numero di placche per piastra. Utilizzare questi dati e la nota diluizione faCtor e volume della soluzione per calcolare la concentrazione della soluzione filtrata in PFU / mL.
  2. Preparare il carico del terreno tripartito, destinato a simulare il siero umano.
    1. Combinare 7,80 mg / mL di albumina bovina del siero, 10,92 mg / mL di tryptone e 2,52 mg / mL di mucina bovina per produrre il volume richiesto di carico del suolo. Dopo aver mescolato il carico del suolo, filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm per sterilizzare. Conservarlo a 4 ° C fino all'uso. Non scaldare sterilizzare, come le proteine ​​denatureranno.
  3. Preparare una soluzione NaCl da 0,9% per miscelare l'inoculato per condizioni senza carico del terreno.
  4. Immediatamente prima del test, preparare un inoculo composto da sospensione batterica o virale del 68% e carico del terreno del 32%. Ad esempio, utilizzare 1,02 ml di sospensione batterica o virale da punti 3.1.1.2 o 3.1.3.2 e 0,48 ml di carico del terreno (fase 3.2.1) o soluzione di NaCl dello 0,9% (fase 3.3). Girare o vortex delicatamente per mescolare.
    NOTA: 1,5 ml di questoL'inoculo verrà utilizzato per ogni volontario in ogni condizione, in modo da assicurare che il volume totale dell'inoculo preparato sia sufficiente per il numero di prove previsto.

4. Preparare i volontari per l'esperimento

NOTA: Determinare l'organismo e la condizione di carico del suolo da testare in quel giorno. Gli stessi volontari possono essere usati per testare molteplici condizioni, ma ogni volontario deve essere sottoposto ad un solo ciclo di test entro un periodo di 48 ore.

  1. Prima di iniziare i test, confermare che i volontari rimangono idonei verbalmente verificando che essi hanno aderito al periodo di lavaggio antimicrobico a 7 giorni e confermando visivamente che non hanno sviluppato alcuna interruzione o anomalie sulla loro pelle.
  2. Utilizzando un generatore di numeri casuali, assegnare a ciascun volontario di utilizzare la loro mano destra o sinistra per il campionamento in questo giorno di test. Assegnare un ordine in cui vengono eseguite le condizioni di lavaggio della mano.
    NOTA: perAd esempio, ABHS può essere assegnato # 3 e verrà eseguito terzo.
  3. Eseguire un "lavaggio di pulizia" una volta all'inizio della prova per togliere la pelle di sporco e oli in modo che ogni test successivo sia condotto in condizioni equivalenti.
    1. Per eseguire un lavaggio di pulizia, eseguire ogni passaggio dell'esperimento (sezione 5), utilizzando un inoculato vuoto (solo brodo LB o PBS) e prelevando un campione senza lavaggio a mano.

5. Procedura sperimentale

  1. Per testare il pH della pelle di ogni volontario (per controllare la variazione), posizionare una sonda pH della pelle a punta piatta sulla superficie della superficie palmare e lo spazio tra il puntatore e le dita medie. Assicurarsi che l'elettrodo sia piatto contro la pelle. Registrare la lettura del pH.
  2. Spike le mani.
    1. Avere i volontari tazza entrambe le mani insieme. Spingere le mani con 1,5 ml dell'inoculo accuratamente pipettando 750 μL lentamente in ogni palmo.
    2. I volontari devono strofinare delicatamente le mani insieme fino a quando tutte le superfici della mano sono rivestite con l'inoculazione sottoponendo le mani a un minimo di attrito possibile.
    3. Avere i volontari tenere le mani ancora e lontano dal loro corpo per altri 30 secondi per consentire l'inoculazione ad asciugare. L'inoculato non può asciugare completamente.
  3. Lavare le mani.
    1. Per tutti i seguenti passi di lavaggio, catturare l'acqua di risciacquo dalle mani in una grande borsa di raccolta del campione. Aggiungere 4,5 ml di una soluzione di tiosolfato di sodio al 12% alla sacca per neutralizzare il cloro in contatto e procedere entro 2 ore.
      NOTA: il tiosolfato di sodio dovrebbe essere aggiunto a tutti i campioni (anche quelli senza cloro) per controllare qualsiasi impatto che possa avere sull'organismo.
    2. Dopo l'inoculazione (sezione 5.2), lavare le mani con il metodo successivo nell'ordine indicato.
      1. Per il controllo A, non eseguire un passaggio lavaggio manuale e passare direttamente al passaggio5.5.
      2. Per il controllo B, lavare le mani con solo acqua ultrapure a temperatura ambiente (circa 21 ° C) attraverso un imbuto con una portata nota.
        NOTA: Qui è stata utilizzata una portata di 1,5 L / m e 500 mL di acqua.
      3. Per la lavata a mano con sapone bagnare le mani con 10 ml di acqua ultrapure. Avere i volontari schiuma le mani con sapone e poi strofinare le mani per altri 20 secondi. Sciacquare le mani versando 500 ml di acqua ultrapure a temperatura ambiente attraverso un imbuto a una portata di 1,5 L / m.
      4. Per tutte le soluzioni di cloro ( ad es. ABHS, HTH, NaDCC e NaOCl) versate 200 ml di soluzione di cloro attraverso un imbuto a una portata di 1,5 L / m e lasciare che il volontario strofinasse le mani.
  4. Lavare a mano utilizzando una procedura succo di guanti modificato.
    1. Dopo la lavata a mano, mettere immediatamente la mano di ciascun volontario ( cioè la mano (destra o sinistra) selezionata per il testNel punto 4.2) in un sacchetto di campione contenente 75 mL di eluente ( ad esempio, PBS) fino al polso. Tenere la parte superiore della borsa stretto intorno al polso.
      NOTA: utilizzare un eluente per il campionamento che contiene sufficiente tiosolfato di sodio per neutralizzare qualsiasi cloro usato per la lavata a mano. PBS è un eluente comunemente usato per molti organismi.
    2. I volontari devono strofinare delicatamente la loro mano nella soluzione per 30 s, facendo attenzione a raggiungere tra le dita e sotto le unghie. Massaggiare la mano dall'esterno della borsa dolcemente per 30 secondi per assicurare che tutta la mano venga sciacquata completamente nell'elurante, fino al polso.
    3. Sigillare il sacchetto e lavorarlo secondo il dosaggio appropriato, descritto nella sezione 6, entro 2 ore.
  5. Decontaminazione.
    1. Prima di ripetere il processo con ogni metodo di lavaggio a mano, i volontari devono lavare le mani in un lavandino con sapone e acqua calda. Spruzzare il volontarioRs con il 70% di etanolo finché non sono rivestiti su entrambi i lati. Lasciarli asciugare.
    2. Ripetere tutti i passaggi della sezione 5 per ogni condizione di lavaggio della mano, solo utilizzando la mano selezionata a caso nella fase 4.2 ( Figura 1 ).

6. Quantificazione

  1. Eseguire saggi appropriati per l'organismo scelta ( ad es., Filtrazione a membrana per batteri o analisi delle placche per i virus, descritta in precedenza nelle sezioni 3.1.2 e 3.1.4).
  2. Dopo aver contato le piastre, registrare la stimata CFU / mL o PFU / mL per ogni prova delle analisi (sezioni 3.1.2 e 3.1.4).

7. Analisi

  1. Utilizzando i risultati della fase 6.2, calcolare il valore di riduzione del log degli organismi sulle mani, per ogni organismo e lo stato di carico del suolo e per ogni soggetto e metodo di lavaggio a mano.
    1. Per l'efficacia del lavaggio a mano, confrontare la concentrazione di batteri / virus in ciascuno Il lavaggio del lavaggio del campione per controllare A (nessun lavaggio a mano). Per la persistenza dell'acqua di risciacquo, confrontare ogni campione dell'acqua di risciacquo per controllare B (lavaggio solo con acqua). Utilizza la seguente formula standard:
      Riduzione del registro (lavaggio a mano ) = EquazioneEquazione
      Riduzione registro (acqua risciacquata ) = EquazioneEquazione
      NOTA: la riduzione del registro può anche essere espressa come log 10 (senza lavaggio a mano) - log 10 (con lavaggio a mano)
  2. Utilizzare un'analisi di varianza ripetuta in una sola misura (ANOVA) per valutare le differenze significative nei valori di riduzione del log calcolati tra i metodi di lavaggio e un test HSD di Tukey post-hoc per modelli significativi per valutare in coppia le differenze significative (p <0.05)Ef "> 36.
    1. Prima di eseguire l'ANOVA, valutare ogni set di dati per la sfericità ( ad esempio, utilizzando il test di Bartlett). Applicare una correzione ( ad esempio, la correzione di Greenhouse-Geisser) quando il test indica che la sfericità è stata violata 37 .

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Representative Results

Qui, il protocollo ( Figura 1 ) è stato completato con 18 volontari, che sono stati testati sia con E. coli che Phi6. Differenze significative sono state riscontrate tra i risultati di lavaggio a mano con E. coli sia con e senza carico del suolo e Phi6 con carico del suolo ( Figura 2 e Figura 3 ). Per E. coli senza carico del suolo, la lavata a mano con HTH, NaDCC e NaOCl stabilizzata ha portato ad una riduzione significativa di log rispetto alla lavaggio a mano solo con acqua (F (6,102) = 2,72, p = 0,034). Con il carico del suolo, HTH ha portato ad una riduzione significativa di log di E. coli rispetto all'acqua solo, HWWS e ABHS (F (6,102) = 3,94, p <0,001). Non esisteva alcuna differenza significativa tra i metodi per Phi6 senza carico del suolo (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). Tuttavia, per Phi6 con carico del suolo (F (6,102) = 7,01, p <0,001), l'acqua da sola ha prodotto un greRiduzione del log di ABHS o stabilizzato NaOCl e HWWS in una riduzione più grande di log di ABHS, stabilizzato NaOCl e generato NaOCl. HTH aveva anche una riduzione più grande di log rispetto a ABHS e stabilizzato NaOCl, e NaDCC ha portato ad una riduzione maggiore del log rispetto a NaOCl e ABHS stabilizzati. Mentre HTH è stato eseguito in modo più coerente nelle condizioni, avremmo cautela nei confronti dell'eccessiva interpretazione di risultati significativi, in quanto molti intervalli di confidenza sono stati grandi, che vanno da meno di 0,5 log a più di 1,5 log reduction in molti casi.

Nell'acqua di risciacquo, il cloro ha determinato una riduzione significativa di log di E. coli persistente nell'acqua di risciacquo rispetto a HWWS (senza carico del suolo, F (4,68) = 331,7, p <0,001; con carico del terreno, F (4,68 ) = 162,44, p <0,001) ( Figura 4 ). Questo stesso modello è stato trovato in Phi6 senza carico del suolo ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), con tutte le soluzioni di cloro con conseguenteUna riduzione nettamente maggiore di Phi6 nell'acqua di risciacquo che HWWS. Non esistono differenze significative nella persistenza nell'acqua di risciacquo con Phi6 e carico del terreno ((F (4,67) = 3,35, p = 0,071) ( Figura 5 ).

Figura 1
Figura 1: Panoramica sull'esperimento. Le cinque fasi intraprese per ciascun ciclo di lavaggio a mano comprendono: 1) test di pH, 2) inoculazione delle mani, 3) lavaggio a mano, 4) lavaggio delle mani e 5) decontaminazione delle mani per ognuna delle otto condizioni esaminate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: lavaggio a mano di E. coli ULT. Rispetto a nessun lavaggio a mano, i metodi di lavaggio a mano hanno provocato una riduzione media di log in E. coli di 1,94-3,01 senza carico del suolo e 2,18-3,34 con carico del suolo. La lavata a mano con acqua ha dimostrato la minima riduzione di E. coli in entrambe le condizioni (1,94 e 2,18 log). La lavata a mano con NaDCC ha determinato la massima riduzione senza carico del terreno (3,01) e HTH ha portato la più grande riduzione con carico del terreno (3,34). Nei grafici, la riga rappresenta la riduzione percentuale degli organismi e le barre di errore rappresentano l'errore standard della riduzione del registro. Ctrl B, controllo B; HWWS, lavaggio a mano con sapone; ABHS, sanitizzatore manuale a base di alcool; HTH, ipoclorito ad alta prova; NaDCC, sodio dicloroisocianurato; St NaOCl, ipoclorito sodico stabilizzato; Gen NaOCl, generò ipoclorito di sodio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ve_content "per: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 3
Figura 3: risultati di lavaggio a mano di Phi6. Rispetto a nessun lavaggio a mano, i metodi di lavaggio a mano hanno provocato una riduzione media di log in Phi6 di 2,44-3,06 senza carico del suolo e 2,71-3,69 con carico del suolo. La lavata a mano con sapone ha dimostrato la minima riduzione di Phi6 senza carico del suolo (2,44) e lavaggio a mano con NaOCl stabilizzato ha portato alla riduzione minima con carico del terreno (2,71). La lavaggio a mano con NaOCl generato ha portato alla riduzione massima senza carico del terreno (3,06) e la lavaggio a mano con sapone ha portato alla riduzione più grande con carico del terreno (3,69). Nei grafici, la riga rappresenta la riduzione percentuale degli organismi e le barre di errore rappresentano l'errore standard della riduzione del registro. Ctrl B, controllo B; HWWS, lavaggio a mano con sapone; ABHS, sanitizzatore manuale a base di alcool; HTH, ipoclorito ad alta prova; NaDCC, sodio dicloroisocianurato;St NaOCl, ipoclorito sodico stabilizzato; Gen NaOCl, generò ipoclorito di sodio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: risultati di risciacquo a mano di E. coli . Rispetto al lavaggio a mano solo con acqua, la riduzione media del tronco di E. coli rimanente nell'acqua di risciacquo è stata di 0,28-4,77 senza carico del suolo e 0,21-4,49 con carico del terreno. Sia con e senza carico del suolo, la più piccola riduzione è stata trovata nella lavaggio a mano con sapone (0,28 e 0,21). Le maggiori riduzioni sono state osservate con NaOCl stabilizzato e generato senza carico del suolo (entrambi 4.77) e con HTH e generato NaOCl con carico del terreno. Nei grafici, la riga rappresenta la percentuale di riduzione degli organismi e le barre di errore rappresentano le sErrore tandard della riduzione del registro. HWWS, lavaggio a mano con sapone; ABHS, sanitizzatore manuale a base di alcool; HTH, ipoclorito ad alta prova; NaDCC, sodio dicloroisocianurato; St NaOCl, ipoclorito sodico stabilizzato; Gen NaOCl, generò ipoclorito di sodio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: risultati di risciacquo a mano di Phi6. Rispetto al lavaggio a mano solo con acqua, la riduzione media di log del Phi6 rimanente nell'acqua di risciacquo è stata di 1,26-2,02 senza carico del suolo e 1,30-2,20 con carico del terreno. Con il carico del suolo, la riduzione minima è stata trovata nella lavaggio a mano con sapone (1,26). Senza carico del terreno, HTH ha portato alla riduzione minima (2,02). Le maggiori riduzioni sono state osservate con e senza carico del suolo con NaDCC(2,02 e 2,20). Nei grafici, la riga rappresenta la riduzione percentuale degli organismi e le barre di errore rappresentano l'errore standard della riduzione del registro. HWWS, lavaggio a mano con sapone; ABHS, sanitizzatore manuale a base di alcool; HTH, ipoclorito ad alta prova; NaDCC, sodio dicloroisocianurato; St NaOCl, ipoclorito sodico stabilizzato; Gen NaOCl, generò ipoclorito di sodio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia degli Stati Uniti per lo Sviluppo Internazionale, Ufficio di Assistenza Estera Del Disastro (AID-OFDA-A-15-00026). Marlene Wolfe è stata sostenuta dalla National Science Foundation (sovvenzione 0966093).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soap bar Dove White Beauty Bar soap
Alcohol-based hand sanitizer Purell Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol
HTH Powder Acros Organics 300340010
NaDCC Powder Medentech Klorsept granules
NaOCl Solution Acros Organics 419550010
Electrochlorinator AquaChlor
Iodometric titrator Hach 1690001
Bovine serum albumin MP Biomedicals NC0117242
Tryptone Fisher BP1421-100
Bovine Mucin EMD Milipore 49-964-3500MG
0.22 µm Filter EMD Milipore GVWP04700
NaCl Fisher BP358-1
Skin pH probe Hanna Instruments H199181
Large Whirlpak Sample Bag Nasco B01447WA
Small Whirlpak Sample Bag Nasco B01323WA
Funnel bottle Thermo Scientific 3120850001 You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate
Ethanol ThermoScientific 615090010 Mix with water to produce 70% ethanol
Spray bottle Qorpak PLC06934
E. coli ATCC 25922
LB Broth Fisher BioReagents BP1426-2
LB Agar Fisher BioReagents BP1425-500
Sterile loop Globe Scientific 22-170-204
Phi6 HER 102
Nutrient broth BD Difco BD 247110
GeneQuant 100 Spectrophotometer General Electric 28-9182-04
Sodium thiosulfate Fisher Chemical S445-3
Membrane filter (47 mm, 0.45 µm) EMD Millipore HAWP04700
m-ColiBlue24 broth media EMD Millipore M00PMCB24
Petri dish with pad (47 mm) Fisherbrand 09-720-500
Vacuum Manifold Thermo Scientific/Nalgene 09-752-5
Filter funnels Thermo Scientific/Nalgene 09-747
Pseudomonas syringae HER 1102
Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific 10010031 Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe

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References

  1. Kampf, G., Kramer, A. Epidemiologic Background of Hand Hygiene and Evaluation of the Most Important Agents for Scrubs and Rubs. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 863-893 (2004).
  2. Miller, T., Patrick, D., Ormrod, D. Hand decontamination: influence of common variables on hand-washing efficiency. Healthc Infect. 16, (1), 18 (2013).
  3. Jensen, D. A., Danyluk, M. D., Harris, L. J., Schaffner, D. W. Quantifying the effect of hand wash duration, soap use, ground beef debris, and drying methods on the removal of Enterobacter aerogenes on hands. J Food Prot. 78, (4), 685-690 (2015).
  4. Girou, E., Loyeau, S., Legrand, P., Oppein, F., Brun-Buisson, C. Efficacy of handrubbing with alcohol based solution versus standard handwashing with antiseptic soap: randomised clinical trial. BMJ. 325, (7360), 362 (2002).
  5. Kac, G., Podglajen, I., Gueneret, M., Vaupré, S., Bissery, A., Meyer, G. Microbiological evaluation of two hand hygiene procedures achieved by healthcare workers during routine patient care: a randomized study. J Hosp Infect. 60, (1), 32-39 (2005).
  6. Lages, S. L. S., Ramakrishnan, M. A., Goyal, S. M. In-vivo efficacy of hand sanitisers against feline calicivirus: a surrogate for norovirus. J Hosp Infect. 68, (2), 159-163 (2008).
  7. Holton, R. H., Huber, M. A., Terezhalmy, G. T. Antimicrobial efficacy of soap and water hand washing versus an alcohol-based hand cleanser. Tex Dent J. 126, (12), Retrieved from: http://www.tda.org/Publications/Texas-Dental-Journal 1175-1180 (2009).
  8. Salmon, S., Truong, A. T., Nguyen, V. H., Pittet, D., McLaws, M. -L. Health care workers' hand contamination levels and antibacterial efficacy of different hand hygiene methods used in a Vietnamese hospital. Am J Infect Control. 42, (2), 178-181 (2014).
  9. Steinmann, J., Nehrkorn, R., Meyer, A., Becker, K. Two in-vivo protocols for testing virucidal efficacy of handwashing and hand disinfection. Int J Hyg Environ Health. 196, (5), Retrieved from: https://www.journals.elsevier.com/international-journal-of-hygiene-and-environmental-health 425-436 (1995).
  10. Weber, D. J., Sickbert-Bennett, E., Gergen, M. F., Rutala, W. A. Efficacy of selected hand hygiene agents used to remove Bacillus atrophaeus (a surrogate of Bacillus anthracis) from contaminated hands. JAMA. 289, (10), 1274-1277 (2003).
  11. Grayson, M. L., Melvani, S., et al. Efficacy of Soap and Water and Alcohol-Based Hand-Rub Preparations against Live H1N1 Influenza Virus on the Hands of Human Volunteers. Clin Infect Dis. 48, (3), 285-291 (2009).
  12. Oughton, M. T., Loo, V. G., Dendukuri, N., Fenn, S., Libman, M. D. Hand hygiene with soap and water is superior to alcohol rub and antiseptic wipes for removal of Clostridium difficile. Infect Control Hosp Epidemiol. 30, (10), 939-944 (2009).
  13. Liu, P., Yuen, Y., Hsiao, H. -M., Jaykus, L. -A., Moe, C. Effectiveness of liquid soap and hand sanitizer against Norwalk virus on contaminated hands. Appl Environ Micro. 76, (2), 394-399 (2010).
  14. Savolainen-Kopra, C., Korpela, T., et al. Single treatment with ethanol hand rub is ineffective against human rhinovirus--hand washing with soap and water removes the virus efficiently. J Med Virol. 84, (3), 543-547 (2012).
  15. Tuladhar, E., Hazeleger, W. C., Koopmans, M., Zwietering, M. H., Duizer, E., Beumer, R. R. Reducing viral contamination from finger pads: handwashing is more effective than alcohol-based hand disinfectants. J Hosp Infect. 90, (3), 226-234 (2015).
  16. Steinmann, J., Paulmann, D., Becker, B., Bischoff, B., Steinmann, E., Steinmann, J. Comparison of virucidal activity of alcohol-based hand sanitizers versus antimicrobial hand soaps in vitro and in vivo. J Hosp Infect. 82, (4), 277-280 (2012).
  17. de Aceituno, A. F., Bartz, F. E., et al. Ability of Hand Hygiene Interventions Using Alcohol-Based Hand Sanitizers and Soap To Reduce Microbial Load on Farmworker Hands Soiled during Harvest. J Food Protect. 78, (11), 2024-2032 (2015).
  18. Sterk, E. Médecins Sans Frontières - Filovirus Haemorrhagic Fever Guideline. Available from: http://jid.oxfordjournals.org/content/204/suppl_3/S791.full (2008).
  19. World Health Organization. WHO Report. Ebola Virus Disease ( EVD ) Key questions and answers concerning water, sanitation and hygiene. Available from: http://www.who.int/water_sanitation_health/WASH_and_Ebola.pdf 1-5 (2014).
  20. World Health Organization. Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. First Global Patient Safety Challenge, Clean Care is Safer Care. Available from: http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241597906_eng.pdf (2009).
  21. Boyce, J. M., Pittet, D. Guideline for Hand Hygiene in Health-Care Settings Recommendations of the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee and the HICPAC/SHEA/APIC/IDSA Hand Hygiene Task Force. Infect Control Hosp Epidemiol. 23, (12 Suppl), Society for Healthcare Epidemiology of America. S3-S40 (2002).
  22. Emmanuel, J., Ndoye, B. UNDP Medical Waste Experts Assessment and Recommendations Regarding Management of Ebola-Contaminated Waste. United Nations Development Programme. Available from: https://noharm-global.org/sites/default/files/documents-files/3127/Report%20to%20WHO%20WASH%20and%20Geneva%20on%20Ebola%20final.pdf (2015).
  23. Hopman, J., Kubilay, Z., Allen, T., Edrees, H., Pittet, D., Allegranzi, B. Efficacy of chlorine solutions used for hand hygiene and gloves disinfection in Ebola settings: a systematic review. Antimicrob Resist Infect Control. 4, (1), 1 (2015).
  24. Lowbury, E. J. L., Lilly, H. A., Bull, J. P. Disinfection of hands: removal of transient organisms. BMJ. 2, (5403), 230-233 (1964).
  25. Edmonds, S. L., Zapka, C., et al. Effectiveness of Hand Hygiene for Removal of Clostridium difficile Spores from Hands. Infect Control Hosp Epidemiol. 34, (3), 302-305 (2013).
  26. Rotter, M. L. 150 years of hand disinfection-Semmelweis' heritage. Hyg Med. (22), 332-339 (1997).
  27. Hitomi, S., Baba, S., Yano, H., Morisawa, Y., Kimura, S. Antimicrobial effects of electrolytic products of sodium chloride--comparative evaluation with sodium hypochlorite solution and efficacy in handwashing. Kansenshōgaku Zasshi. 72, (11), 1176-1181 (1998).
  28. ASTM International. Standard E1174-13. Standard Test Method for Evaluation of the Effectiveness of Health Care Personnel Handwash Formulations. Available from: https://www.astm.org/ (2013).
  29. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Evaluation of eluents for the recovery of an enveloped virus from hands by whole-hand sampling. J Appl Microbiol. 118, (5), 1210-1216 (2015).
  30. Sinclair, R. G., Rose, J. B., Hashsham, S. A., Gerba, C. P., Haas, C. N. Criteria for Selection of Surrogates Used To Study the Fate and Control of Pathogens in the Environment. Appl Environ Microbiol. 78, (6), 1969-1977 (2012).
  31. Held, E., Skoet, R., Johansen, J. D., Agner, T. The hand eczema severity index (HECSI): A scoring system for clinical assessment of hand eczema. A study of inter- and intraobserver reliability. Br J Dermatol. 152, (2), 302-307 (2005).
  32. Chlorine Total, Iodometric Method Using Sodium Thiosulfate, Method 8209 Digital Titrator. Available from: http://www.hach.com/asset-get.download-en.jsa?id=7639983937 (2016).
  33. GeneQuant 100 User Manual. Available from: http://biochromspectros.com/media/wysiwyg/support_page/support-genequant-100/Genequant-100-UM.pdf (2016).
  34. United States Environmental Protection Agency. Method 1604: Total Coliforms and Escherichia coli in Water by Membrane Filtration Using a Simultaneous Detection Technique (MI Medium). Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/method_1604_2002.pdf (2002).
  35. Adams, M. H., Anderson, E. S. Bacteriophages. Interscience Publishers. New York. (1959).
  36. Kao, L. S., Green, C. E. Analysis of Variance: Is There a Difference in Means and What Does It Mean? The Journal of surgical research. 144, (1), 158-170 (2008).
  37. Schutz, R. W., Gessaroli, M. E. The Analysis of Repeated Measures Designs Involving Multiple Dependent Variables. Research Quarterly for Exercise and Sport. 58, (2), 132-149 (1987).
  38. Woolwine, J. D., Gerberding, J. L. Effect of testing method on apparent activities of antiviral disinfectants and antiseptics. Antimicrob Agents Chemother. 39, (4), 921-923 (1995).

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