혈관 평활근 세포 치료를위한 동결 건조 베리 파우더에서 폴리 페놀 추출 및 정제

Chemistry

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Summary

이 작품은 동결 건조 베리 파우더에서 폴리 페놀이 풍부한 추출물을 준비하는 단계별 방법을 자세히 설명합니다. 또한 Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs)를 사용하여 펩타이드 호르몬 인 안지오텐신 II (Ang II)의 존재하에 세포 배양에서 이들 폴리 페놀이 풍부한 추출물을 사용하는 방법에 대한 철저한 설명을 제공합니다.

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Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

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Abstract

역학 조사에 따르면 플라보노이드 섭취가 증가하면 미국과 유럽에서 심혈관 질환 (CVD)으로 인한 사망률이 감소하는 것으로 나타났습니다. 딸기는 미국에서 광범위하게 소비되며 폴리 페놀 함량이 높습니다. 폴리 페놀은 많은 분자 표적과 상호 작용하고 항산화, 항염증제 및 심장 보호 효과를 비롯한 수많은 긍정적 인 생물학적 기능을 발휘하는 것으로 나타났습니다. 블랙 베리 (BL), 라즈베리 (RB) 및 블랙 라즈베리 (BRB)에서 분리 된 폴리 페놀은 안지오텐신 II (Ang II)에 대한 산화 스트레스와 세포 노화를 감소시킵니다. 이 작품은 동결 건조 딸기에서 폴리 페놀 추출물을 준비하는 데 사용되는 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 동결 건조 베리 분말로부터 폴리 페놀 추출을 80 % 수성 에탄올 및 초음파 보조 추출법을 사용하여 수행 하였다. 조 추출물을 추가로 정제하고 클로로포름 및 에틸 아세테이트를 사용하여 분획하고,각기. 원유 및 정제 추출물의 효과는 배양 된 혈관 평활근 세포 (VSMCs)에서 시험 하였다.

Introduction

폴리 페놀은 그 구조 중에 적어도 하나의 페놀 릭 고리를 함유하고 식물 왕국에 풍부하게 존재하는 화합물이다. 인간은 그러한 화합물의 존재를 의식하지 않고 약용 목적으로 수천 년 동안 식물을 먹고있다. 많은 과일과 채소에는 플라보노이드, 스틸 벤 (stilbenes), 페놀 릭산 (phenols acids) 3을 포함한 다양한 양의 폴리 페놀 화합물이 있습니다. 폴리 페놀은 다채로운 과일과 채소와 관련이 있지만 이는 사실이 아닙니다. 예를 들어, zeaxanthin과 xanthine은 양파와 마늘과 같이 매우 다채롭지 않은 채소에 존재하며, 이는 scallions 계열에서 비롯되며 수많은 건강상의 이점과 관련이 있습니다 4 . 폴리 페놀은 여러 가지 건강상의 효능과는 별도로 식물을 곤충에서 보호하여d 자외선 2 . 폴리 페놀은 일반적으로 인간의 식단에서 발견되며 반응성 산소 종 (ROS) 6 , 7 , 8을 제거 할 수 있기 때문에 강력한 항산화 물질로 간주됩니다. 그들은 또한 항염증제 9 , 항균제 10 , 항 고혈압제 11 및 항암제 12 , 13 성질이 있습니다.

역학 연구는 플라보노이드와 심혈관 질환 (CVD) 발병률 16 , 17 및 사망률 14 , 15 사이의 역 상관 관계를 보여줍니다. 딸기는 미국에서 널리 섭취되고 있으며 플라보노이드를 포함한 많은 양의 폴리 페놀을 함유하고 있습니다. 예를 들어, 블랙 베리 (BL) 주스 (300 mL / d)에서 8 주 동안 이상 지질 혈증 환자에서 수축기 혈압을 유의하게 감소시켰다. Jeong et al. 19 명은 하루에 2.5g의 블랙 라즈베리 (BRB) 추출물을 섭취 한 고혈압 남성과 여성이 위약을 복용 한 남성과 그렇지 않은 여성보다 하루 24 시간 낮고 혈압이 낮았다 고 전했다. 라스베리 (RB)는 혈압을 감소시키는 반면 자발적으로 고혈압 쥐에서 수퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD)의 발현을 증가시킨다. BL, RB 및 BRB가 혈관 평활근 세포 (VSMC)에서 안지오텐신 II (Ang II)에 의해 유도 된 ROS 및 노화의 수준을 감소 시킨다는 것이 최근에 밝혀졌습니다 21 . 또한 BL 추출물의 안토시아닌 분획물은 유도 성 질소 산화물 합성 효소 (iNOS)의 발현을 감소 시켰으며, LPS (lipopolysaccharide) 자극 된 핵 인자 Kappa B (NF-κB) 및 세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK)의 활성을 억제 하였다. J774 세포ass = "xref"> 22. BRB 추출물 은 시험 관내 에서 NF-κB 활성화 및 cyclooxygenase 2 (COX-2) 발현 을 감소 시켰고, 지질 프로필을 향상 시켰으며, 고지 방식을 먹인 쥐에서 죽상 경화증 병변 형성을 막았다. 열매에서 가장 풍부한 플라 보 노이드로 여겨지는 안토시아닌은 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 생성을 감소시키고 VSMCs 26 의 증식과 이동을 감소시킴으로써 LPS- 자극 RAW 264.7 대식 세포에서 염증 반응을 조절한다.

인체 건강 및 질병에서 폴리 페놀의 역할을 이해하는 데 관심이 커지면서 추출 방법을 최적화하는 것이 중요합니다. 솔벤트 추출은 비용 효율적이고 쉽게 재현 할 수 있기 때문에 널리 사용됩니다. 이 연구에서는 에탄올과 함께 용매 추출물을 사용하였고, 초음파 보조 추출물n 방법으로, Kim과 Lee로부터 적응시켰다. 퀸 즈 (Queires) 28) 이 채택한 정제 추출물 (PE) 분획을 얻기 위해 클로로포름 및 에틸 아세테이트를 사용하여 조 추출물 (CE)의 정제 및 분별을 실시 하였다. 또한, BL의 정제 된 폴리 페놀 추출물 대 ERK1 / 2의 기초 인산화를 감소시키는 효능을 비교하였고, 정제 된 BL 폴리 페놀 추출물이 Ang II- 유도 된 VSMCs 신호 감소 억제 효과의 대표적인 예가 제공되었다.

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Protocol

1. 시약의 준비

  1. 절대 에탄올 (분자 생물학 등급) 80 mL와 세포 배양 등급의 멸균 수 20 mL를 혼합하여 80 % 에탄올 (100 mL)을 준비한다.
  2. 폴리 페놀 추출물 (10mg / ml)을 준비하려면 CE 또는 PE 10mg을 취하십시오. 세포 배양 후드 아래에 일반 Dulbecco 수정 이글 매체 (DMEM) 1 ML을 추가합니다. 솔루션을 소용돌이 치게하십시오. 분주 량을 200 μL로 나누고 -20 ° C에서 보관하십시오.
  3. 용해 완충액을 준비하십시오.
    1. 1 M HEPES 원액 (pH 7.4, 최종 50 mM) 5 mL, 5 M NaCl 원액 1 mL (최종 50 mM), 0.5 M EDTA 원액 1 mL (최종 5 mM), 0.5 mL 2 mL M NaF 저장 용액 (최종 10 mM), 700 mM Na 3 VO 4 저장 용액 (최종 2 mM) 286 μL, 200 mM Na 4 P 2 O 7 스톡 용액 5 mL (최종 10 mM) 및 5 mL의 물 (최종 1 %)로 제조 된 20 % 트리톤 -X-100 스톡 용액. 물을 넣어 100 mL의 부피에 도달하십시오. 4 ° C에서 유지하십시오.
  4. Laemmli 샘플 버퍼를 준비하십시오 (4x).
    1. 2M Tris 저장 용액 (pH 6.8) 31.25 mL, 글리세롤 100 mL, 물로 만든 20 % SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 용액 50 mL 및 β- 머 캅토 에탄올 50 mL를 넣는다. 최대 250 mL의 물을 첨가하십시오. 4 ° C에서 유지하십시오.
  5. Tris-Buffered Saline (TBS) 버퍼를 준비하기 위해 Tris (최종 25 mM) 3 g, KCl 0.18 g (최종 2.5 mM) 및 NaCl 8.76 g (최종 150 mM)을 잰다. pH를 7.4로 조절하고 물을 1 L까지 넣으십시오. RT에서 보관하십시오.
  6. TBS-T를 준비하기 위해 99.7.5 mL의 TBS와 물에 준비된 20 % Triton-X-100 용액 2.5 mL를 넣는다. RT에 보관하십시오.

2. 블랙 베리 추출물의 제조

  1. 동결 건조 베리 분말로부터 조 추출물 제조.
    1. 동결 건조 된 검은 딸기 분말 (또는 5g의 신선한 분말) 10g을 칭량하십시오. 냉동 과일을 사용하는 경우, 그것을 잘라nto 아주 작은 조각 추출을 시작하기 전에.
    2. 1 L 둥근 바닥 삼각 플라스크에 100 mL의 80 % 에탄올 수용액과 과일 파우더를 섞는다.
    3. 혼합물을 25 kHz에서 초음파 욕조를 사용하여 42 kHz, 135 W에서 20 분간 초음파를 사이에두고 시간 간격없이 초음파 처리하십시오. 부드러운 질소로 연속 질소 퍼지로 초음파 처리를 수행하십시오. 냉동 과일의 경우 배양 시간을 4 시간으로 늘립니다.
    4. 냉각 된 Buchner 깔때기를 사용하여 # 2 여과지를 통해 혼합물을 진공 흡입으로 여과한다.
      참고 :이 단계가 끝나면 시료의 잔류 물이 여과지에 나타납니다. 이것을 필터 케이크라고합니다.
    5. 필터 케이크를 100 % 에탄올 50 mL로 헹구십시오. 여액을 저장하고 80 % 수성 에탄올 100 mL가 들어있는 1 L 둥근 바닥 플라스크에 필터 케이크를 넣는다.
    6. 찌꺼기에 대한 추출 과정을 반복하십시오 (2.1.2 - 2.1.4 단계).
    7. 두 개의 여과 액을 둥근 바닥 플라스크에 넣고 50 mL의 80 % 수성 에탄올을 첨가 하였다.
      참고 : 최종 부피는 약 300 mL 여야합니다.
    8. 62 ° C와 50 rpm에서 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. 에탄올이 더 이상 증발하지 않을 때까지이 과정을 계속하십시오.
      참고 :이 프로세스는 약 45 분이 소요됩니다.
    9. 샘플을 50 mL 원추형 튜브에 옮긴다. 튜브 상단에 질소 가스를 10 분간 주입하여 에탄올을 증발시킨다.
      참고 :이 단계는 에탄올의 완전한 증발을 보장하기 위해 필요합니다. 이 단계에서 시료의 부피는 약 20 mL입니다.
    10. 최소 24 시간 동안 -80 ° C에서 샘플을 고정 시키십시오.
      참고 :이 단계는보다 효율적인 동결 건조 프로세스를 허용하기 위해 필요합니다.
    11. -50 ° C에서 약 8 시간 동 안 건조시킵니다. -20 ° C에서 샘플을 보관하십시오.
      참고 : 동결 건조기는 시료를 건조시키기 위해 챔버 내부에 -50 ° C의 강력한 진공을 생성하지만 폴리 신소와 같은 대부분의 화합물을 보존합니다nols.
  2. 조 추출물로부터 정제 된 폴리 페놀 추출물의 제조.
    1. 동결 건조 샘플을 칭량하십시오.
      참고 :이 단계에서 추출물의 부피는 약 10 mL입니다.
    2. 조 추출물에 두 부피 (~ 20 mL)의 클로로포름을 첨가하고 교반 판에서 5 분 동안 용액을 진탕하십시오.
    3. 혼합물을 분액 깔대기에 붓는다. 조 추출물을 실온에서 1 시간 동안 가만히 따르고 정제 된 분획을 수득한다.
      참고 :이 단계에서 2 단계 혼합물이 형성됩니다.
    4. 분액 깔때기에서 바닥 층 (클로로포름 상)을 버리고 수성 층을 깨끗한 비이커에 수집한다.
    5. 수성 분획에 에틸 아세테이트 2 부피를 첨가하고 자기 교반 막대를 사용하여 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반한다.
    6. 냉장 된 Buchner 깔때기를 사용하여 # 2 여과지를 통해 혼합물을 진공 흡입으로 여과하십시오.
    7. 여과 된 시료를 모은 다음 둥근 바닥 플라스크에 옮겨 담아주십시오.회전식 증발기로 에드.
    8. 로터리 증발기를 62 ° C와 50 rpm으로 설정하고 에틸 아세테이트를 약 30 분 동안 증발시킨다.
    9. -50 ° C에서 약 8 시간 동 안 건조시킵니다. 샘플을 50 mL 원추형 튜브에 옮기고 -20 ° C에 보관하십시오.

3. 베리 엑기스로 VSMCs 치료

  1. VSMCs 문화.
    1. 이전에 29 설명한대로, 효소 소화를 수행하여 Sprague-Dawley 쥐의 흉부 대동맥에서 VSMC를 분리합니다. 29. 설명한대로 VSMCs를 배양하십시오.
    2. 1g / L 포도당을 함유하고 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 100U / mL 페니실린, 100㎎ / mL 스트렙토 마이신 및 2mM L- 글루타민으로 보충 된 DMEM을 사용하여 VSMC 배양을위한 완전한 배지를 준비한다. 4 ° C에서 완전한 배지를 보관하십시오.
  2. VSMCs와 폴리 페놀 추출물의 배양.
    1. VSMC를 분리하려면 cultu를 버립니다.인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻어. 4 mL의 PBS와 2 mL의 트립신 EDTA 0.25 %를 첨가한다. CO 2 배양기에서 37 ° C에서 5 분 동안 세포를 품어 라.
      1. 세포를 수집하고, 15 ML 원심 분리기 튜브에 완전한 매체 2 ML와 그들을 섞어 1,100 X에서 5 분 원심 분리기. 뜨는을 버리고 PBS 1 ML와 세포 펠렛을 resuspend. hemocytometer를 사용하여 세포를 계산합니다.
      2. 6 잘 배양 접시에 잘 50,000 VSMCs를 시드하고 그들이 90 % confluency (약 3 일)에 도달 할 때까지 10 % FBS를 포함하는 전체 매체에서 그들을 성장. 가습 된 5 % CO2 배양기에서 37 ° C로 VSMC를 유지하십시오.
    2. 1g / L 포도당, 100U / mL 페니실린, 100㎎ / mL 스트렙토 마이신, 2mM L- 글루타민 및 0.5 % FBS를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 처리를위한 배지를 준비한다. 4 ° C에서 처리 매체를 보관하십시오.
      참고 : 폴리 페놀 추출물과 Ang II는이 세포를 사용하여 세포에 직접 첨가됩니다.다이뮴.
    3. 일반 DMEM 배지 1 mL에 추출물 10 mg을 녹여 폴리 페놀 10 mg / ml 원액 추출물 (CE) 또는 정제 추출물 (PE)을 준비합니다. -20 ° C에서 200 μL 분량의 주식을 보관하십시오.
    4. 0.5 % FBS를 포함하는 치료 매체 2 ML와 VSMCs를 품어 50 또는 500 μg / ML의 농도를 달성하기 위해 CE 또는 체육 추출물을 추가합니다. 신선한 폴리 페놀 추출물을 첨가하여 매 24 시간마다 배지를 교환한다. 세포를 3 일 동안 취급하십시오.
    5. Ang II 또는 다른 호르몬 및 성장 인자로 처리하기 위해, Ang II (100nM) 첨가 전에 0.5 % FBS를 함유하는 처리 배지로 세포를 배양하여 적어도 24 시간 동안 세포를 굶어 서라.
      참고 : Ang II를 추가하기 전에 0.5 % FBS 처리 배지에서 CE 및 PE가 포함되거나 포함되지 않은 인큐베이션이 권장됩니다.
      1. 기아가 24 시간이 지난 후, 100 nM Ang II를 첨가한다. 3 일 동안 24 시간마다 새로운 CE, PE 또는 Ang II로 처리 매체를 교체하십시오.
  3. 세포 샘플 준비.
    1. 차가운 PBS에서 두 번 처리 세포를 씻어 얼음에서 용해 버퍼의 200 μL로 그들을 해 줘.
    2. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포 lysates를 수집하고 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 lysates를 전송합니다. 얼음과 소용돌이에 5 분마다 20 분 동안 총 세포 lysates를 품어.
    3. 세포 추출물을 125W에서 10 초 동안 3 회 파열시키고 그 사이에 2 초간 일시 중지합니다. 초음파를 통해 샘플을 얼음에 보관하십시오.
    4. 595 nm에서 단백질 분석 시약을 사용하여 단백질 농도를 측정하십시오.
    5. Western blot으로 분석하기 위해 -20 ℃에서 보관한다.
  4. 서양 얼룩.
    1. 대조군 비 처리 및 폴리 페놀 처리 또는 Ang II 처리 시료에서 같은 양의 단백질 (약 50 μg)을 용해 완충액과 혼합하여 최대 총 부피 50 μL을 얻습니다. 4x Laemmli 샘플 버퍼 16 μL를 첨가하십시오. 75 ° C에서 5 분 동안 시료를 가열합니다.
    2. 샘플 분리10 % SDS-PAGE 젤에 넣고 10- V에서 75 분 동안 PDVF 멤브레인으로 옮기고 특정 항체를 사용한 Western blot 분석을 위해 반 건식 전달 시스템으로 옮깁니다.
    3. 20 분 동안 TBS 0.05 % Triton - X100 버퍼 (TBS - T)에 2 % 우유 막을 차단.
    4. TBS (각각 5 분)로 적어도 세 번 멤브레인을 세척하여 우유를 제거하고 RT 또는 O / N 4 ° C에서 1 차 항체와 함께 품어.
    5. 멤브레인을 TBS-T로 10 분씩 세 번 씻고 45 분 동안 HRP가 결합 된 2 차 항체와 함께 배양합니다.
    6. 멤브레인을 TBS-T로 10 분씩 세 번 씻고 강화 된 화학 발광 (ECL)으로 현상하십시오.

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Representative Results

BL, RB 및 BRB로부터 분리 된 폴리 페놀 추출물이 Ang II 21 에 반응하여 VSMCs의 노화를 감소시키는 것이 이전에 입증되었다. 이러한 정제 된 폴리 페놀 추출물은 Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) 및 ERK1 / 2의 인산화를 감소시킴으로써 Ang II 신호 전달을 조절한다는 것이 밝혀졌습니다. BL은 슈퍼 옥사이드 음이온을 생산하는 효소 인 NADPH 산화 효소 (Nox) 1의 발현을 감소시킴으로써 노화를 방지하고 Ang II에 의해 강력하게 상향 조절됩니다. 대조적으로, RB와 BRB는 항산화 효소 인 SOD1, SOD2 및 글루타티온 퍼 옥시 다제 1 (GPx-1)의 발현을 증가 시킴에 따라 Nox1 독립적 인 메커니즘에 의한 노화를 예방합니다. BL은 SOD2 발현을 증가시키지 못하지만, 추출물 중 어느 것도 Ang II 21에 의한 카탈라아제의 하향 조절을 약화시키지 못한다. BL은 SOD2 및 카탈라아제 발현에 대한 BL의 효과의 결여가정제 과정에서 폴리 페놀 화합물이 손실되거나 추출물 중 특정 폴리 페놀 화합물이 부적절하게 농축되어 설명 될 수 있습니다. VSMC는 3 일 동안 0.5 % FBS를 함유하는 배지에서 50-500 μg / mL CE ( 도 1A ) 또는 PE ( 도 1B )로 항온 배양 하였다. CE 나 PE도 시험 된 농도에서 SOD2 나 카탈라아제 수치를 증가시키지 않았다. 양성 대조군으로서, ERK1 / 2 인산화가 측정되었고, CE는 300 ㎍ / mL보다 높은 농도에서이 키나아제의 인산화를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, PE는 약 100 μg / mL에서 효과적이었다 ( 그림 1B ). 낮은 인산화 수준은 200-500 μg / mL의 농도에서 관찰되었다. 이러한 데이터는 200 μg / mL BL PE가 Ang II 신호 전달을 줄이는데 충분하다는 것을 보여주는 이전 관찰을 뒷받침합니다 21 . 이러한 결과는보다 높은 농도의 폴리 페놀 cCE와 비교하여 PE의 화합물은 ERK1 / 2 인산화를 감소시킬 때이 추출물의보다 높은 효율을 설명 할 수있다. 이 아이디어를 시험하기 위해 두 추출물의 폴리 페놀 조성을 비교 하였다. CE에서 폴리 페놀 화합물의 동정과 정량은 이전에 설명한 21 ( 표 1 )과 같이 HPLC로 수행되었다. 3- O -caffeoylquinic acid와 quercetin은 CE에 비해 PE에서 더 높은 수준으로 나타 났으 나 ferulic acid와 rutin은 CE에서만 발견되었다. 다음으로, 100 nM Ang II 첨가 전에 24 시간 동안 VSMC를 200 μg / mL BL PE로 처리 하였다 ( 그림 1C ). 이전에보고 된 바와 같이, BL 폴리 페놀 추출물은 Ang II- 유도 된 ERK1 / 2 인산화를 감소 시켰지만, 카탈라아제 및 SOD2 발현에 아무런 영향을 미치지 않았다.

그림 1
B ) 또는 200 μg / mL PE 3 일 동안 % FBS DMEM 배지. C ) BL PE와 함께 24 시간 배양 한 후, Ang II (100nM)를 첨가하고 세포를 3 일 동안 배양 하였다. 신선한 추출물과 Ang II가 함유 된 배지는 매일 바뀌 었습니다. 이어서, 세포를 세척하고 용해시키고, 전체 세포 추출물을 10 % PAGE-SDS 겔에서 분리 하였다. Western blot은 인산화 된 ERK1 / 2 (Thr 202 / Tyr 204), ERK1 / 2, catalase, SOD2에 대한 토끼 항체와 β-actin에 대한 마우스 항체로 시험 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분석 물 (ppm) 체육 CE
페놀 산
갈산 243.5 321.9
p- 쿠마르산 32.9 46.5
페룰 린산 - 236.5
염소산
3-O-caffeoylquinic acid 235.3 170.5
4-O-caffeoylquinic acid 13 76.9
5-O-caffeoylquinic acid 14.1 49.9
FLAVONOIDS
플라 보놀
케르세틴 95 24.5
플라 바논
루틴 - 37.8

표 1 : 조잡한 폴리 페놀 정제 추출물에서 검은 딸기의 폴리 페놀 성분 분석. Crude Extract (CE) 및 Purified Extract (PE)의 페놀 산과 플라보노이드를 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 사용하여 분석했습니다. 분석 물의 농도는 ppm으로 표시됩니다. BL PE의 폴리 페놀 성분은 최근 출판되었으며 21 에 추가되어 CE와 비교되었습니다.

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Discussion

딸기에서 단리 된 폴리 페놀은 별개의 조성물을 함유하고있다. 여기에 기술 된 에탄올 기반의 추출 프로토콜은 BL의 조잡하고 정제 된 폴리 페놀 추출물에 존재하는 페놀 릭 산과 플라보노이드의 서로 다른 수준의 확인을 허용했다 ( 표 1 ). CE는 갈산, 훼 루릴 산, 4-O- 카페인 퀴 닉산 및 5-O- 카페인 퀴 닉산으로 농축되었다. 정제 공정은 갈산 및 p- 쿠마린 산의 수준을 크게 변화시키지 않았다. 그러나 3- O- 카페인 오일 퀸산의 농도는 170.5 - 235.3 ppm으로 증가하였고 케르세틴은 24.5 - 95 ppm으로 증가시켰다. 대조적으로, ferulic acid와 rutin은 CE 정제 과정에서 없어졌습니다.

50 - 500 μg / mL CE와 PE를 가진 VSMC의 처리는 두 추출물 모두 ERK1 / 2의 기초 인산화를 감소 시키는데 효과적이라는 것을 보여 주었다. 그러나, PE는 낮은 농도에서이 키나제의 활성에서 더 강한 하향 조절을 나타내었다 : 100 &CE의 경우 400 - 500 μg / mL와 비교하여 PE의 경우 181, g / mL이다. 이러한 결과는 PE에서 발견되는 3- O -caffeoylquinic acid 또는 quercetin의 높은 농도를 반영 할 수 있습니다. ERK1 / 2 인산화의 하향 조절을 담당하는 특정 화합물을 확인하기 위해서는 배양중인 세포에서 개별 페놀 릭 화합물을 사용해야한다.

BL, RB 및 BRB 21 뿐만 아니라 BL CE에 기인 한 ERK1 / 2에서 분리 된 정제 된 폴리 페놀에 의해 야기되는 Akt, ERK1 / 2 및 p38MAPK를 포함하는 신호 전달 키나아제의 활성 감소는 이전 보고서. 예를 들어, 블루 베리에서 분리 된 폴리 페놀 추출물은 Akt 및 ERK1 / 2의 활성을 부분적으로 감소시킴으로써 유방암 세포의 종양 성장을 감소시켰다. 앞서 언급했듯이, 이들 키나아제는 Ang II 21에 의한 세포 노화 유도에도 관여하며, BL, RB 및 BRB의 폴리 페놀d는 CVD와 관련된 혈관 노화 및 기능 장애를 감소시킵니다.

우리가 이전에보고 한 바와 같이, 카탈라아제와 SOD2 발현은 500㎍ / mL의 높은 농도에서도 PE에 의해 상향 조절되지 않았다. CE는 또한 카탈라아제와 SOD2 발현을 증가 시키는데 효과적이지 않았기 때문에, 이들 데이터는 정제 프로토콜 동안 손실 된 페놀 화합물이 이들 항산화 효소의 조절에 관여하지 않는다는 것을 시사한다. 이 데이터는 또한 여기에 제시된 정화 프로토콜이 Ang II 신호 조절, 산화 스트레스 및 세포 노화 조절에 관련된 페놀 화합물을 효과적으로 농축 시켰다고 제안합니다. 예를 들어, 대표 결과는 PE가 Ang II- 유도 된 ERK1 / 2 인산화를 강하게 하향 조절 함을 보여준다. 이 키나아제의 인산화 평가는 ERK1 / 2 활성의 억제가 Ang II- 유도 된 세포 노화를 방해하기 때문에 관련이있다 .21.

~에서이전의 프로토콜에 대한 수정 사항으로, CE의 추출 수율을 높이기 위해 여기에 초음파 처리가 추가되었습니다. 또한 폴리 페놀의 정제를 위해서는 Cole Cartridge를 사용하는 대신 Kim and Lee가 설명한 27 번 Queires et al . 28 이 여기에 채택되었다. 불순물을 제거하기 위해 여과지를 사용하는 여과 단계가 폴리 페놀 부분의 정제에 첨가되었다. 제한의 관점에서, sonication과 증발 단계는 사용 된기구의 유형에 따라주의 깊게 관찰되어야한다. 왜냐하면 초음파와 증발의 기간과 온도가이 프로토콜의 중요한 단계이기 때문이다. 이 방법에 추가 된 변형은 우리 실험실에서 사용 된 이전의 방법 27 , 28 (데이터는 표시되지 않음)과 비교했을 때 폴리 페놀의 가장 높은 수율을 나타냈다. 이는 대부분 초음파 처리 단계를 추가했기 때문일 가능성이 높다. 멘티로서프로토콜 섹션에 oned,이 프로토콜은 냉동 과일뿐만 아니라 다양한 열매에서 동결 건조 분말에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 라스베리와 블랙 라스베리 21 뿐만 아니라 블루 베리와 딸기 (데이터가 표시되지 않음)에서 폴리 페놀을 추출하고 정제하는데 성공적으로 사용되었습니다. 따라서이 방법은 야채를 포함한 다른 유형의 식품에서 폴리 페놀을 추출하는 데에도 사용될 수 있습니다.

결론적으로,이 연구는 VSMC의 산화 스트레스에 대해 보호하는 화합물의 유지 및 농축을 가능하게하는 열매에서 폴리 페놀을 단리하는 빠르고, 비용 효율적이며, 재현하기 쉬운 방법을 상세히 설명합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 미국 심장 협회 (14GRNT20180028)와 플로리다 주립 대학 연구 및 창의위원회 (COFRS)가 자금을 지원했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

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