Ekstraksjon og rensing av polyfenoler fra frysetørket bærpulver til behandling av vaskulære glatte muskelceller

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dette arbeidet beskriver en trinnvis metode for å fremstille polyphenolrike ekstrakter fra frysetørket bærpulver. I tillegg gir den en grundig beskrivelse av hvordan man bruker disse polyfenolrike ekstraktene i cellekultur i nærvær av peptidhormon angiotensin II (Ang II) ved bruk av vaskulære glatte muskelceller (VSMCs).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Epidemiologiske studier indikerer at økt flavonoidinntak korrelerer med redusert dødelighet på grunn av hjerte-og karsykdommer (CVD) i USA og Europa. Bærene er mye konsumert i USA og har et høyt polyphenolisk innhold. Polyfenoler har vist seg å interagere med mange molekylære mål og utøve mange positive biologiske funksjoner, inkludert antioksidanter, antiinflammatoriske og kardioprotektive effekter. Polyfenoler isolert fra brombær (BL), bringebær (RB) og svart bringebær (BRB) reduserer oksidativt stress og cellulær senescens som svar på angiotensin II (Ang II). Dette arbeidet gir en detaljert beskrivelse av protokollen som brukes til å fremstille polyphenol-ekstraktene fra frysetørkede bær. Polyfenol ekstraksjoner fra frysetørket bærpulver ble utført ved anvendelse av 80% vandig etanol og en ultralydassistert ekstraksjonsmetode. Råekstraktet ble ytterligere renset og fraksjonert ved anvendelse av kloroform og etylacetat,henholdsvis. Effektene av både rå og rensede ekstrakter ble testet på Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs) i kultur.

Introduction

Polyfenoler er forbindelser som inneholder minst en fenolisk ring i deres struktur og er rikelig tilstede i planterike 1 . Mennesker har spist planter i årtusener til medisinske formål uten å være klar over eksistensen av slike forbindelser 2 . Mange frukter og grønnsaker har noen delte polyphenoliske forbindelser, om enn med forskjellige mengder, inkludert flavonoider, stilbener og fenol syrer 3 . Selv om polyfenoler ofte er forbundet med fargerike frukter og grønnsaker, er dette ikke helt sant. For eksempel er zeaxanthin og xantin til stede i grønnsaker som ikke er svært fargerike, som løk og hvitløk, som er fra familien av scallions og er forbundet med mange helsemessige fordeler 4 . Bortsett fra å være assosiert med flere helsemessige fordeler, tjener polyfenoler også planter ved å beskytte dem mot insekter ogD ultrafiolett stråling 2 . Polyfenoler finnes ofte i det menneskelige kostholdet og betraktes som kraftige antioksidanter, da de kan scavenge Reactive Oxygen Species (ROS) 6 , 7 , 8 . De har også antiinflammatorisk 9 , antimikrobiell 10 , antihypertensiv 11 og anti-kreftfremkallende 12 , 13 egenskaper.

Epidemiologiske studier viser en invers forbindelse mellom forbruket av flavonoider og kardiovaskulær sykdom (CVD) incidens 16 , 17 og dødelighet 14 , 15 . Bær er mye konsumert i USA og har høye mengder polyfenoler, inkludert flavonoider. For eksempel forbruk av blackberry (BL) juice (300 ML / d) i åtte uker signifikant redusert systolisk blodtrykk hos dyslipidemiske pasienter 18 . Jeong et al. 19 rapporterte at prehypertensive menn og kvinner som bruker 2,5 g svart bringebær (BRB) ekstrakt per dag, hadde lavere 24-timers og nattt blodtrykk sammenlignet med de som brukte en placebo. Hindbær (RB) reduserte blodtrykket mens du økte ekspresjonen av superoksiddismutase (SOD) i spontant hypertensive rotter 20 . Det har nylig blitt vist at BL, RB og BRB reduserer nivåene av ROS og senescence indusert av angiotensin II (Ang II) i vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) 21 . I tillegg reduserte anthocyaninfraksjonen fra BL-ekstrakt ekspresjonen av inducerbar nitrogenoksydsyntase (iNOS) og hemmet aktiviteten av Nuclear Factor kappa B (NF-KB) og ekstracellulær signalregulert kinase (ERK) i lipopolysakkarid (LPS) -stimulert J774 cellerAss = "xref"> 22. BRB-ekstrakter reduserte NF-KB-aktiveringen og cyklooksygenase 2 (COX-2) -ekspresjonen in vitro 23 , forbedret lipidprofilen og forhindret ateroskleroselesjonsdannelse hos mus med et fettfattig kosthold 24 . Anthocyaniner, som betraktes som de mest omfattende flavonoider i bær, modulerer den inflammatoriske responsen i LPS-stimulerte RAW 264.7-makrofager ved å redusere Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-a) -produksjonen 25 og redusere proliferasjonen og migrasjonen av VSMCs 26 .

Siden det har vært økende interesse for å forstå rollen av polyfenoler i menneskers helse og sykdom, er det viktig å optimalisere ekstraksjonsmetoden. Løsningsmiddelekstraksjon er mye brukt til det formålet, da det er kostnadseffektivt og enkelt reproduserbart. I denne studien ble en løsningsmiddelekstraksjon brukt med etanol, sammen med et ultralydassistert ekstraktN-metode, som ble tilpasset fra Kim og Lee 27 . Rensingen og fraksjoneringen av råekstrakter (CE) ved anvendelse av kloroform og etylacetat ble utført for å oppnå den rensede ekstrakt (PE) fraksjon som ble tilpasset fra Queires et al., 28 . Videre ble effekten av rå versus rensede polyfenolekstrakter fra BL sammenlignet med å redusere basal fosforylering av ERK1 / 2, og representative eksempler på den hemmeffekten av renset BL-polyfenol-ekstrakt på Ang II-induserte signalreduksjoner i VSMCs ble tilveiebrakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av reagenser

  1. Tilbered 80% etanol (100 ml) ved å blande 80 ml absolutt etanol (molekylærbiologi-klasse) og 20 ml sterilt vann fra cellekulturer.
  2. For å forberede polyphenol ekstrakt (10 mg / ml) veier 10 mg CE eller PE. Tilsett 1 ml vanlig Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) under en cellekulturhette. Vortex løsningen. Aliquot i 200-l porsjoner og lagre ved -20 ° C.
  3. Forbered lysis buffer.
    1. Tilsett 5 ml 1 M HEPES stamløsning (pH 7,4; 50 mM slutt), 1 ml 5 M NaCl stamløsning (50 mM endelig), 1 ml 0,5 M EDTA stamløsning (5 mM slutt), 2 ml 0,5 M NaF stamløsning (10 mM endelig), 286 μl 700 mM Na 3 VO 4 stamløsning (2 mM slutt), 5 ml 200 mM Na4P207 stamløsning (10 mM endelig) og 5 ml 20% Triton-X-100 stamløsning opparbeidet i vann (1% endelig). Tilsett vann for å nå et volum på 100 ml. Oppbevares ved 4 ° C.
  4. Forbered Laemmli prøvebuffer (4x).
    1. Tilsett 31,25 ml 2 M Tris stamløsning (pH 6,8), 100 ml glycerol, 50 ml av en 20% natriumdodecylsulfat (SDS) oppløsning fremstilt i vann og 50 ml p-merkaptoetanol. Tilsett vann opptil 250 ml. Oppbevares ved 4 ° C.
  5. For å fremstille Tris-Buffered Saline (TBS) buffer veier 3 g Tris (25 mM endelig), 0,18 g KCl (2,5 mM endelig) og 8,76 g NaCl (150 mM endelig). Juster pH til 7,4 og tilsett vann opp til 1 L. Oppbevares ved romtemperatur.
  6. For å fremstille TBS-T tilsettes 997,5 ml TBS og 2,5 ml av en 20% Triton-X-100-løsning fremstilt i vann. Hold ved RT.

2. Fremstilling av Blackberry Extracts

  1. Fremstilling av rå ekstrakt fra frysetørket bærpulver.
    1. Vekt 10 g frysetørket brombærpudder (eller 5 g ferskt pulver). Hvis det brukes fryst frukt, klipp det iNto veldig små biter før du starter utvinningen.
    2. Bland fruktpulveret med 100 ml 80% vandig etanol i en 1 L rundbundet Erlenmeyer-kolbe.
    3. Sonikater blandingen i 20 minutter ved 42 kHz, 135 W ved bruk av et ultralydbad ved 25 ° C, uten tidsintervall i mellom. Utfør sonikering med kontinuerlig nitrogenrensing i nedsenket lys. For frossen frukt, øk inkubasjonstiden til 4 timer.
    4. Filtrer blandingen gjennom et filterpapir nr. 2 ved bruk av en kaldt Buchner-trakt med vakuumsuging.
      MERK: På slutten av dette trinnet vises rester av prøven på filterpapiret; Dette kalles filterkake.
    5. Skyll filterkaken med 50 ml 100% etanol. Lagre filtratet og tilsett filterkaken til en 1 L rundbundet kolbe inneholdende 100 ml 80% vandig etanol.
    6. Gjenta utvinningsprosessen for resten (trinn 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Kombiner de to filtratene i en rundkolbe med ytterligere 50 mlAv 80% vandig etanol.
      MERK: Det endelige volumet skal være ca. 300 ml.
    8. Bruk en rotasjonsfordamper ved 62 ° C og 50 rpm for å fordampe løsningsmidlet. Fortsett denne prosessen til etanolet ikke fordamper lenger.
      MERK: Denne prosessen tar ca 45 min.
    9. Overfør prøven til et 50 ml konisk rør. Fordamp etanolen ved å injisere nitrogengass på toppen av røret i 10 minutter.
      MERK: Dette trinnet er nødvendig for å sikre fullstendig fordamping av etanolen. Volumet av prøven ved dette trinnet er ca. 20 ml.
    10. Frys prøven ved -80 ° C i minst 24 timer.
      MERK: Dette trinnet er nødvendig for å muliggjøre en mer effektiv frysetørking.
    11. Frys-tørk prøven ved -50 ° C i ca. 8 timer. Oppbevar prøvene ved -20 ° C.
      MERK: Frosttørkeren oppretter et kraftig vakuum ved -50 ° C inne i kammeret for å tørke prøvene, men beholder de fleste av forbindelsene, slik som polypheNols.
  2. Fremstilling av rensede polyfenol ekstrakter fra rå ekstrakter.
    1. Veie de frysetørkede ekstraherte prøvene.
      MERK: Volumet av ekstraktet ved dette trinnet er ca. 10 ml.
    2. Tilsett to volumer (~ 20 ml) kloroform til rå ekstrakt og rist oppløsningen i 5 minutter i en omrøringsplate.
    3. Hell blandingen i en skilletratt. La råproduktet dekantere i 1 time ved RT for å oppnå den rensede fraksjon.
      MERK: Ved dette trinnet vil en tofaseblanding dannes.
    4. Kast bunnlaget (kloroformfasen) fra skilletrakten og oppsaml det vandige laget i en ren beger.
    5. Tilsett to volumer etylacetat til den vandige fraksjon og bruk en magnetisk omrøringsstang for å røre blandingen i 5 min ved RT.
    6. Filtrer blandingen gjennom filterpapir nr. 2 ved hjelp av en kjølt Buchner-trakt med vakuumsuging.
    7. Samle den filtrerte prøven og overfør den til en rundkolbe for å være ossEd med rotasjonsfordamperen.
    8. Sett rotasjonsfordamperen til 62 ° C og 50 rpm og fordamp etylacetatet i ca. 30 minutter.
    9. Frys-tørk prøven ved -50 ° C i ca. 8 timer. Overfør prøven til et 50 ml konisk rør og oppbevar det ved -20 ° C.

3. Behandling av VSMC med Berry Extracts

  1. VSMCs kultur.
    1. Isoler VSMCs fra thoracale aorta av Sprague-Dawley-rotter ved å utføre en enzymatisk fordøyelse, som tidligere beskrevet 29 . Kultur VSMCs som beskrevet 29 .
    2. Klargjør fullstendig medium for kulturen av VSMCs ved bruk av DMEM som inneholder 1 g / L glukose og suppleres med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin og 2 mM L-glutamin. Oppbevar hele mediet ved 4 ° C.
  2. Inkubasjon av VSMC med polyfenol ekstrakter.
    1. For å dele VSMCene, kast kultuRe medium og vask cellene to ganger med fosfatbuffert saltvann (PBS). Tilsett 4 ml PBS og 2 ml trypsin EDTA 0,25%. Inkubér cellene i 5 minutter ved 37 ° C i en CO 2- inkubator.
      1. Samle cellene, bland dem med 2 ml komplett medium i et 15 ml sentrifugerør, og sentrifuger ved 1.100 x g i 5 min. Kast supernatanten og resuspender cellepellet med 1 ml PBS. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer.
      2. Sæd 50 000 VSMCs per brønn i 6-brønds kulturplater og dyrk dem i komplett medium som inneholder 10% FBS til de når 90% konfluens (ca. 3 d). Oppretthold VSMCs ved 37 ° C i en fuktig 5% CO 2 inkubator.
    2. Forbered mediet til behandling ved bruk av DMEM-medium inneholdende 1 g / l glukose, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 0,5% FBS. Oppbevar behandlingsmediet ved 4 ° C.
      MERK: Polyfenol ekstrakter og Ang II legges direkte til celler som bruker dennedium.
    3. Forbered en stamløsning av 10 mg / ml rå ekstrakt (CE) eller renset ekstrakt (PE) av polyfenoler ved å oppløse 10 mg ekstrakt i 1 ml vanlig DMEM-medium. Hold aksjen i 200 μl alikvoter ved -20 ° C.
    4. Inkubér VSMCs med 2 ml behandlingsmedium som inneholder 0,5% FBS og tilsett CE eller PE ekstrakter for å oppnå en konsentrasjon på 50 - 500 μg / ml. Bytt mediet hver 24. time ved å legge til ferske polyfenol ekstrakter. Behandle cellene i 3 d.
    5. For behandling med Ang II eller andre hormoner og vekstfaktorer, sulter cellene i minst 24 timer ved å inkuberere cellene med behandlingsmedium som inneholder 0,5% FBS før tilsetning av Ang II (100 nM).
      MERK: Inkubasjon med og uten CE og PE i 0,5% FBS behandlingsmedium før tilsetning av Ang II anbefales.
      1. Etter 24 timer med sult, legg til 100 nM Ang II. Bytt behandlingsmediet med fersk CE, PE eller Ang II hver 24. time i 3 d.
  3. Fremstilling av celleprøver.
    1. Vask behandlede celler to ganger i kald PBS og lys dem med 200 μl lysisbuffer på is.
    2. Samle cellelysater ved hjelp av celleskraper og overfør lysatene til 1,5 ml mikrocentrifugerør. Inkubér de totale cellelysatene i 20 minutter på is og hvirvel hver 5 min.
    3. Sonikere celleekstrakter med tre sprekker ved 125 W i 10 s hver, med en 2 s pause i mellom. Hold prøvene på is gjennom sonikering.
    4. Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et proteinanalysereagens ved 595 nm.
    5. Oppbevar prøvene ved -20 ° C for analyse av Western blot.
  4. Western blot.
    1. Bland like mengder protein (ca. 50 μg) fra kontroll-ikke-behandlede og polyfenolbehandlede eller Ang II-behandlede prøver med lyseringsbuffer for å oppnå et maksimalt totalvolum på 50 μl. Tilsett 16 μl av en 4x Laemmli prøvebuffer. Varm prøvene i 5 minutter ved 75 ° C.
    2. Separat sampletEs i 10% SDS-PAGE geler og overfør dem til PDVF membraner ved 10 V i 75 min i et semi-tørt overføringssystem for Western blot-analyse med spesifikke antistoffer.
    3. Blokker membranen med 2% melk i TBS 0,05% Triton-X100 buffer (TBS-T) i 20 minutter.
    4. Fjern melken ved å vaske membranen minst tre ganger med TBS (5 min hver) og inkuber med primære antistoffer i 1 time ved RT eller O / N ved 4 ° C.
    5. Vask membranen tre ganger, 10 minutter hver, med TBS-T og inkuber med et HRP-koblet sekundært antistoff i 45 min.
    6. Vask membranen tre ganger, 10 min hver, med TBS-T og utvikle ved forbedret kjemiluminescens (ECL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det har tidligere blitt påvist at polyfenolekstrakter isolert fra BL, RB og BRB reduserte senescensen av VSMCs som svar på Ang II 21 . Det har blitt vist at disse rensede polyfenolekstrakter modulerer Ang II-signalering ved å redusere fosforyleringen av Akt, p38-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) og ERK1 / 2. BL forhindrer senescens ved å redusere ekspresjonen av NADPH-oksidasen (Nox) 1, et enzym som produserer superoksydanioner og er sterkt oppregulert av Ang II. I kontrast forhindrer RB og BRB senescens av en Nox1-uavhengig mekanisme, da de øker uttrykket av antioxidant-enzymer SOD1, SOD2 og glutationperoxidase 1 (GPx-1). BL unnlater å øke SOD2-uttrykket, mens ingen av ekstraktene demper nedreguleringen av katalase av Ang II 21 . BL var fokusert på å avgjøre om mangelen på effekt av BL på SOD2 og katalaseuttrykk kunneForklares ved tap av polyfenolforbindelser under renseprosessen eller ved en utilstrekkelig konsentrasjon av en viss polyfenolisk forbindelse i ekstraktet. VSMCs ble inkubert med 50-500 μg / mL CE ( figur 1A ) eller PE ( figur 1B ) i medium inneholdende 0,5% FBS i tre dager. Verken CE eller PE økte SOD2 eller katalasnivåer ved en hvilken som helst av de undersøkte konsentrasjoner. Som en positiv kontroll ble ERK1 / 2 fosforylering målt, og det ble funnet at CE reduserte fosforyleringen av denne kinasen ved konsentrasjoner høyere enn 300 ug / ml. I motsetning var PE effektiv ved ca. 100 ug / ml ( figur 1B ). Lavt fosforyleringsnivå ble observert ved konsentrasjoner på 200-500 μg / ml. Disse dataene støtter den forrige observasjonen som viser at 200 μg / mL BL PE er tilstrekkelig til å redusere Ang II-signalering 21 . Disse resultatene antyder at høyere konsentrasjoner av polyfenol cOmpounds i PE, sammenlignet med CE, kunne forklare høyere virkningsgrad av dette ekstraktet ved å redusere ERK1 / 2-fosforylering. For å teste denne ideen ble polyphenolsammensetningene fra begge ekstraktene sammenlignet. Identifikasjonen og kvantifiseringen av polyfenolforbindelser i CE ble utført ved HPLC, som tidligere beskrevet 21 ( tabell 1 ). 3- O- koeoylkininsyre og quercetin var tilstede ved høyere nivåer i PE sammenlignet med CE, mens ferulsyre og rutin ble funnet bare i CE. Deretter ble VSMCs behandlet med 200 μg / mL BL PE i 24 timer før tilsetningen av 100 nM Ang II ( figur 1C ). Som tidligere rapportert 21 reduserte BL-polyfenol-ekstraktet Ang II-indusert ERK1 / 2-fosforylering, men viste ingen virkning på katalase og SOD2-ekspresjon.

Figur 1
B ) eller 200 μg / ml PE ( C ) i 0,5 % FBS DMEM medium for 3 d. C ) Etter 24 timer inkubasjon med BL PE ble Ang II (100 nM) tilsatt og cellene ble inkubert i 3 d. Mediet, med friske ekstrakter og Ang II, ble forandret hver dag. Cellene ble deretter vasket og lysert, og de totale celleekstrakter ble separert i 10% PAGE-SDS geler. Western blott ble testet med kaninantistoffer mot fosforylert ERK1 / 2 (Thr 202 / Tyr 204), ERK1 / 2, katalase og SOD2 og musantistoff mot β-aktin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Analyter (ppm) PE CE
Fenol syrer
Gallinsyre 243,5 321,9
P-kumarinsyre 32.9 46.5
Ferulsyre - 236,5
Klorogen syrer
3-0-koffeokylsyre 235,3 170,5
4-0-koffeokylsyre 1. 3 76.9
5-0-koffeokylsyre 14.1 49.9
flavonoider
flavonols
quercetin 95 24.5
flavanones
Rutin - 37.8

Tabell 1: Analyse av polyphenolsammensetningen av Blackberry i rå og polyfenol-rensede ekstrakter. Fenoliske syrer og flavonoider i rå ekstrakt (CE) og renset ekstrakt (PE) ble analysert ved bruk av høyytelsesvæskekromatografi (HPLC). Konsentrasjonen av analyter er uttrykt som ppm. Sammensetningen av polyfenoler i BL PE ble nylig publisert 21 og lagt til bordet som skal sammenlignes med CE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Polyfenoler isolert fra bær inneholder forskjellige sammensetninger. Den etanolbaserte ekstraksjonsprotokollen beskrevet her er tillatt for identifisering av forskjellige nivåer av fenoliske syrer og flavonoider som finnes i rå og rensede polyfenol ekstrakter av BL ( tabell 1 ). CE ble anriket i gallinsyre, ferulinsyre, 4-0-koffeokylsyre og 5-0-koffeokylsyre. Rensingsprosessen endret ikke signifikant nivåene av gallinsyre og p-kumarinsyre. Det økte imidlertid nivåene av 3- O- koeoylkinsyre fra 170,5 - 235,3 ppm og av quercetin fra 24,5 - 95 ppm. I kontrast ble ferulsyre og rutin tapt under rensingen av CE.

Behandlingen av VSMC med 50 - 500 μg / mL CE og PE viste at begge ekstraktene var effektive for å redusere basal fosforylering av ERK1 / 2. PE viste imidlertid en sterkere downregulering i aktiviteten til denne kinasen ved en lavere konsentrasjon: 100 & #181; g / mL for PE sammenlignet med 400 - 500 μg / mL for CE. Disse resultatene kan gjenspeile den høyere konsentrasjonen av 3- O- koffeylsyre eller quercetin som finnes i PE. Bruk av individuelle fenolforbindelser i celler i kultur er nødvendig for å identifisere den eller de spesifikke forbindelsene som er ansvarlige for nedreguleringen av ERK1 / 2-fosforylering.

Den reduserte aktiviteten til signaleringskinaser, inkludert Akt, ERK1 / 2 og p38MAPK, forårsaket av rensede polyfenoler isolert fra BL, RB og BRB 21 , samt av ERK1 / 2 forårsaket av BL CE, vist her, er i samsvar med Tidligere rapporter. For eksempel reduserte polyfenolekstrakter isolert fra blåbær svulstveksten av brystkreftceller, delvis ved å redusere aktiviteten til Akt og ERK1 / 2 30 . Som nevnt tidligere er disse kinaser også involvert i induksjon av cellulær senescens av Ang II 21 , hvilket tyder på at polyfenoler fra BL, RB og BRB shoulD redusere vaskulær aldring og dysfunksjon assosiert med CVD.

Som vi rapporterte tidligere 21 , ble ikke katalase- og SOD2-uttrykket oppregulert av PE, selv ved konsentrasjoner så høye som 500 μg / ml. Siden CE også var ineffektivt ved å øke katalase- og SOD2-ekspresjonen, antyder disse dataene at fenolforbindelsene tapt under renseprotokollen ikke er involvert i reguleringen av disse antioksidant enzymer. Disse dataene antyder også at renseprotokollen vist her effektivt konsentrerte fenoliske forbindelser som er relevante for reguleringen av Ang II-signalering, oksidativt stress og cellulær senescens. For eksempel viser de representative resultatene at PE sterkt nedregulert Ang II-indusert ERK1 / 2 fosforylering. Vurderingen av fosforyleringen av denne kinasen er relevant fordi inhiberingen av ERK1 / 2-aktivitet forhindret Ang II-indusert cellulær senescens 21 .

I tErms av modifikasjoner til tidligere protokoller ble en sonikering tilsatt her for å øke utvinningsutbyttet for CE. I tillegg til rensing av polyfenoler, i stedet for å bruke en C18-kassett, som beskrevet av Kim og Lee 27 , er en mer tradisjonell metode fra Queires et al . 28 ble vedtatt her. Et filtreringstrinn, ved bruk av filterpapir for å fjerne urenheter, ble tilsatt til rensingen av polyfenolseksjonen. Når det gjelder begrensninger, bør sonikering og fordampningstrinnene overvåkes nøye etter type instrument som brukes, siden varighet og temperatur for sonikering og fordampning er de kritiske trinnene i denne protokollen. Modifikasjonene som ble lagt til denne metoden resulterte i det høyeste utbyttet av polyfenoler sammenlignet med tidligere metoder 27 , 28 som ble brukt i vårt laboratorium (data ikke vist), mest sannsynlig på grunn av tilsetning av et sonikeringstrinn. Som mentiDenne protokollen kan brukes i frysetørket pulver fra forskjellige bær, så vel som for frosne frukter. Denne metoden har blitt brukt til å ekstrahere og rense polyfenoler fra bringebær og svarte bringebær 21 , samt fra blåbær og jordbær (data ikke vist). Dermed kan denne metoden også brukes til å ekstrahere polyfenoler fra andre typer matvarer, inkludert grønnsaker.

Til slutt konkluderer dette arbeidet med en rask, kostnadseffektiv og lett reproduserbar metode for å isolere polyfenoler fra bær, noe som muliggjør oppbevaring og konsentrasjon av forbindelser som er beskyttende mot oksidativt stress i VSMCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av American Heart Association (14GRNT20180028) og Florida State University Council for forskning og kreativitet (COFRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27, (3), 152-159 (2000).
  2. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, (3), 859-904 (2010).
  3. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79, (5), 727-747 (2004).
  4. Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16, (7), 603-615 (2002).
  5. Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96, (2), 365-371 (2016).
  6. Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48, (11), 5677-5684 (2000).
  7. Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53, (2), 1214-1221 (2016).
  8. Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
  9. Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
  10. Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23, (2), 174-181 (2012).
  11. Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23, (2), 220-231 (2016).
  12. Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8, (9), E552 (2016).
  13. Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6, (2), 251-261 (2016).
  14. Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155, (4), 381-386 (1995).
  15. Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70, (9), 491-508 (2012).
  16. Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127, (2), 188-196 (2013).
  17. Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114, (9), 1496-1503 (2015).
  18. Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20, (7), 684-691 (2015).
  19. Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32, (4), 461-467 (2016).
  20. Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7, (25), 19-24 (2011).
  21. Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7, (10), 4175-4187 (2016).
  22. Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15, (1), 30-39 (2006).
  23. Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54, (1), 69-78 (2006).
  24. Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146, (2), 515-524 (2013).
  25. Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50, (15), 4183-4189 (2002).
  26. Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11, (4), 1679-1703 (2010).
  27. Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
  28. Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26, (1A), 379-387 (2006).
  29. Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266, (23), 15498-15504 (1991).
  30. Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics