Extração e purificação de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado para o tratamento de células musculares lisas vasculares

Chemistry

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Summary

Este trabalho detalha um método passo a passo para preparar extratos ricos em polifenóis de pó de baga liofilizado. Além disso, fornece uma descrição completa de como usar esses extratos ricos em polifenóis em cultura celular na presença do hormônio peptídico angiotensina II (Ang II) usando células musculares lisas vasculares (VSMCs).

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Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

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Abstract

Estudos epidemiológicos indicam que o aumento da ingestão de flavonóides correlaciona-se com a diminuição da mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV) nos Estados Unidos (EUA) e na Europa. As bagas são amplamente consumidas nos EUA e têm um alto conteúdo polifenólico. Os polifenóis demonstraram interagir com muitos alvos moleculares e exercer numerosas funções biológicas positivas, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e cardioprotetores. Os polifenóis isolados do blackberry (BL), da framboesa (RB) e da framboesa preta (BRB) reduzem o estresse oxidativo e a senescência celular em resposta à angiotensina II (Ang II). Este trabalho fornece uma descrição detalhada do protocolo usado para preparar os extratos de polifenóis de bagas liofilizadas. As extracções de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado foram realizadas utilizando 80% de etanol aquoso e um método de extração assistida por ultra-som. O extracto em bruto foi ainda purificado e fraccionado utilizando clorofórmio e acetato de etilo,respectivamente. Os efeitos de extratos brutos e purificados foram testados em células musculares lisas vasculares (VSMCs) em cultura.

Introduction

Os polifenóis são compostos contendo pelo menos um anel fenólico em sua estrutura e estão abundantemente presentes no reino vegetal 1 . Os seres humanos têm consumido plantas por milênios para fins medicinais sem estar ciente da existência de tais compostos 2 . Muitas frutas e vegetais têm alguns compostos polifenólicos compartilhados, embora com diferentes quantidades, incluindo flavonóides, stilbenos e ácidos fenólicos 3 . Embora os polifenóis sejam freqüentemente associados a frutas e vegetais coloridos, isso não é estritamente verdadeiro. Por exemplo, a zeaxantina e a xantina estão presentes em vegetais que não são altamente coloridos, como cebolas e alho, que são da família de cebolas e estão associados a numerosos benefícios para a saúde 4 . Além de estar associado a vários benefícios para a saúde 5 , os polifenóis também servem as plantas, protegendo-os de insetos eD radiação ultravioleta 2 . Os polifenóis são comumente encontrados na dieta humana e são considerados poderosos antioxidantes, pois eles podem evitar as espécies reativas de oxigênio (ROS) 6 , 7 , 8 . Eles também têm propriedades antiinflamatórias 9 , antimicrobianas 10 , anti-hipertensivas 11 e antitranscinogênicas 12 , 13 .

Estudos epidemiológicos demonstram uma associação inversa entre o consumo de flavonóides e incidência de doença cardiovascular (DCV) 16 , 17 e mortalidade 14 , 15 . As bagas são amplamente consumidas nos EUA e possuem grandes quantidades de polifenóis, incluindo flavonóides. Por exemplo, o consumo de suco de amora (BL) (300 ML / d) durante oito semanas diminuiu significativamente a pressão arterial sistólica em pacientes dislipidêmicos 18 . Jeong et al. 19 relataram que homens e mulheres pré-hipertensos que consumiam 2,5 g de extrato de framboesa preta (BRB) por dia tiveram uma pressão arterial baixa de 24 horas e noite em comparação com aqueles que consumiam um placebo. As framboesas (RB) diminuíram a pressão sanguínea ao aumentar a expressão de superóxido dismutase (SOD) em ratos espontaneamente hipertensos 20 . Foi recentemente demonstrado que BL, RB e BRB reduzem os níveis de ROS e senescência induzidos pela angiotensina II (Ang II) em células musculares lisas vasculares (VSMCs) 21 . Além disso, a fração de antocianina do extracto de BL reduziu a expressão de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e inibiu a atividade do Fator Nuclear kappa B (NF-kB) e cinase regulada por sinal extracelular (ERK) em lipopolisacarídeos (LPS) estimulada Células J774Ass = "xref"> 22. Os extratos de BRB diminuíram a ativação de NF-κB e a expressão de ciclooxigenase 2 (COX-2) in vitro 23 , melhoraram o perfil lipídico e impediram a formação da lesão aterosclerose em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura 24 . As antocianinas, que são consideradas os flavonóides mais abundantes nas bagas, modulam a resposta inflamatória em macrófagos RAW 264.7 estimulados pelo LPS ao diminuir a produção 25 do Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e diminuir a proliferação e migração de VSMCs 26 .

Uma vez que tem crescido o interesse em compreender o papel dos polifenóis na saúde humana e na doença, é importante otimizar o método de extração. A extração de solvente é amplamente utilizada para esse propósito, pois é econômica e facilmente reprodutível. Neste estudo, utilizou-se uma extração solvente com etanol, juntamente com uma extração extraída por ultra-somN método, que foi adaptado de Kim e Lee 27 . A purificação e o fraccionamento de extratos brutos (CE) utilizando clorofórmio e acetato de etilo foram realizados para obter a fração de extrato purificado (PE) que foi adaptada de Queires et al 28 . Além disso, foram comparadas a eficácia de extratos de polifenóis em bruto contra purificado de BL na redução da fosforilação basal de ERK1 / 2 e foram apresentados exemplos representativos do efeito inibitório do extrato de polifenol BL purificado em reduções de sinalização induzidas por Ang II em VSMCs.

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Protocol

1. Preparação de Reagentes

  1. Prepare 80% de etanol (100 mL) misturando 80 mL de etanol absoluto (grau de biologia molecular) e 20 mL de água estéril de grau de cultura celular.
  2. Para preparar extrato de polifenol (10 mg / mL), pesa 10 mg de CE ou PE. Adicione 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sob uma capa de cultura de células. Vortex a solução. Alíquota em porções de 200 μL e armazene a -20 ° C.
  3. Prepare o tampão de lise.
    1. Adicionar 5 mL de solução de reserva de HEPES 1 M (pH 7,4, final de 50 mM), 1 mL de solução de reserva de NaCl 5 M (50 mM de final), 1 mL de solução de reserva de EDTA 0,5 M (final 5 mM), 2 mL de 0,5 Solução madre de NaF de M (10 mM final), 286 μL de solução de reserva de Na3 VO4 700 mM (final de 2 mM), 5 mL de solução de reserva de Na4P2O7 200 mM (10 mM de final) e 5 mL de Solução de reserva de Triton-X-100 a 20% preparada em água (1% final). Adicione água para atingir um volume de 100 mL. Mantenha-se a 4 ° C.
  4. Prepare o tampão de amostra Laemmli (4x).
    1. Adicionar 31,25 ml de solução de reserva de Tris 2 M (pH 6,8), 100 mL de glicerol, 50 mL de uma solução a 20% de Dodecyl Sulfate de Sódio (SDS) preparada em água e 50 mL de β-mercaptoetanol. Adicione água até 250 mL. Mantenha-se a 4 ° C.
  5. Para preparar o tampão salino tamponado com Tris (TBS), pesa 3 g de Tris (25 mM final), 0,18 g de KCl (2,5 mM final) e 8,76 g de NaCl (150 mM final). Ajuste o pH para 7,4 e adicione água até 1 L. Manter à temperatura ambiente.
  6. Para preparar TBS-T, adicione 997,5 mL de TBS e 2,5 mL de uma solução Triton-X-100 a 20% preparada em água. Mantenha-se à RT.

2. Preparação de extratos de Blackerry

  1. Preparação de extracto bruto de pó de baga liofilizado.
    1. Pesar 10 g de pó de amora liofilizada (ou 5 g de pó fresco). Se for usada fruta congelada, corte-aNto peças muito pequenas antes de iniciar a extração.
    2. Misture o pó de fruta com 100 mL de etanol aquoso a 80% num balão Erlenmeyer de 1 L de fundo redondo.
    3. Sonicate a mistura por 20 min a 42 kHz, 135 W usando um banho ultra-sônico a 25 ° C, sem intervalo de tempo entre eles. Execute a sonicação com purga contínua de nitrogênio em luz moderada. Para frutas congeladas, aumentar o tempo de incubação para 4 h.
    4. Filtre a mistura através de um papel de filtro # 2 usando um funil refrigerado Buchner com aspiração a vácuo.
      NOTA: No final desta etapa, os resíduos da amostra aparecem no papel de filtro; Isso é chamado de bolo de filtro.
    5. Lavar o bolo de filtração com 50 mL de etanol a 100%. Salve o filtrado e adicione o bolo de filtração a um frasco de fundo redondo de 1 L contendo 100 mL de etanol aquoso a 80%.
    6. Repita o processo de extração para o resíduo (etapas 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Combine os dois filtrados num balão de fundo redondo com 50 ml adicionaisDe etanol aquoso a 80%.
      NOTA: O volume final deve ser de aproximadamente 300 mL.
    8. Use um evaporador rotativo a 62 ° C e 50 rpm para evaporar o solvente. Continue este processo até que o etanol não se evapore mais.
      NOTA: Este processo leva aproximadamente 45 min.
    9. Transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mL. Evaporar o etanol por injetar gás nitrogênio na parte superior do tubo durante 10 min.
      NOTA: Esta etapa é necessária para assegurar a evaporação completa do etanol. O volume da amostra neste passo é de aproximadamente 20 mL.
    10. Congele a amostra a -80 ° C durante pelo menos 24 h.
      NOTA: Esta etapa é necessária para permitir um processo de liofilização mais eficiente.
    11. Congele a amostra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Armazene as amostras a -20 ° C.
      NOTA: O secador de gelo cria um vácuo poderoso a -50 ° C dentro da câmara para secar as amostras, mas preserva a maioria dos compostos, como polipaNols.
  2. Preparação de extratos purificados de polifenóis a partir de extratos brutos.
    1. Pesar as amostras extraídas liofilizadas.
      NOTA: O volume do extrato neste passo é de aproximadamente 10 mL.
    2. Adicione dois volumes (~ 20 mL) de clorofórmio ao extrato bruto e agite a solução por 5 minutos em uma placa de agitação.
    3. Despeje a mistura em um funil de separação. Deixe o extracto bruto decantar durante 1 h à TA para obter a fração purificada.
      NOTA: Nesta etapa, formará uma mistura de duas fases.
    4. Descarte a camada inferior (fase de clorofórmio) do funil de separação e cole a camada aquosa em um copo limpo.
    5. Adicionar dois volumes de acetato de etilo à fração aquosa e usar uma barra de agitação magnética para agitar a mistura durante 5 min à TA.
    6. Filtre a mistura através do papel de filtro # 2 usando um funil Buchner refrigerado com aspiração a vácuo.
    7. Coletar a amostra filtrada e transferi-la para um balão de fundo redondo para ser nósCom o evaporador rotativo.
    8. Colocar o evaporador rotativo a 62 ° C e 50 rpm e evaporar o acetato de etilo durante cerca de 30 min.
    9. Congele a amostra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mL e guarde-o a -20 ° C.

3. Tratamento de VSMCs com Extractos de Berry

  1. Cultura de VSMCs.
    1. Isolar VSMCs das aortas torácicas de ratos Sprague-Dawley realizando uma digestão enzimática, como descrito anteriormente 29 . Cultive os VSMCs como descrito 29 .
    2. Prepare o meio completo para a cultura de VSMCs usando DMEM contendo 1 g / L de glicose e suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS), 100 U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina. Armazene o meio completo a 4 ° C.
  2. Incubação de VSMCs com extratos de polifenóis.
    1. Para dividir os VSMCs, descarte o cultuRe médio e lave as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicionar 4 mL de PBS e 2 mL de tripsina EDTA 0,25%. Incubar as células durante 5 minutos a 37 ° C numa incubadora de CO 2 .
      1. Recolher as células, misturá-las com 2 mL de meio completo em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 1.100 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular com 1 mL de PBS. Contar as células usando um hemocitómetro.
      2. Semear 50,000 VSMCs por poço em placas de cultura de 6 poços e cultivá-las em meio completo contendo 10% de FBS até atingir 90% de confluência (cerca de 3 d). Manter os VSMCs a 37 ° C em uma incubadora humidificada a 5% CO 2 .
    2. Prepare o meio para o tratamento usando meio DMEM contendo 1 g / L de glicose, 100 U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 0,5% de FBS. Armazene o meio de tratamento a 4 ° C.
      NOTA: Os extratos de polifenóis e Ang II são adicionados diretamente às células usando este euDium.
    3. Prepare uma solução-mãe de 10 mg / mL de Extracto Bruto (CE) ou Extracto Purificado (PE) de polifenóis dissolvendo 10 mg de extrato em 1 mL de meio DMEM liso. Mantenha o estoque em alíquotas de 200 μL a -20 ° C.
    4. Incubar os VSMCs com 2 mL de meio de tratamento contendo 0,5% de FBS e adicionar extratos CE ou PE para atingir uma concentração de 50 a 500 μg / mL. Mude o meio a cada 24 h adicionando extratos de polifenóis frescos. Trate as células por 3 d.
    5. Para o tratamento com Ang II ou outros hormônios e fatores de crescimento, fome as células por pelo menos 24 h incubando as células com meio de tratamento contendo 0,5% de FBS antes da adição de Ang II (100 nM).
      NOTA: Incubação com e sem CE e PE em meio de tratamento com FBS a 0,5% antes da adição de Ang II.
      1. Após 24 h de fome, adicione 100 nM de Ang II. Substitua o meio de tratamento por CE, PE ou Ang II frescos a cada 24 h por 3 d.
  3. Preparação de amostras de células.
    1. Lavar as células tratadas duas vezes em PBS frio e lisá-las com 200 μL de tampão de lise em gelo.
    2. Coletar lisados ​​celulares usando raspadores de células e transferir os lisados ​​para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Incube os lisados ​​celulares totais durante 20 min no gelo e vortex a cada 5 min.
    3. Sonicate os extratos celulares com três rajadas em 125 W por 10 s cada, com uma pausa de 2 s no meio. Mantenha as amostras em gelo ao longo da sonicação.
    4. Medir a concentração de proteína usando um reagente de teste de proteína a 595 nm.
    5. Armazene as amostras a -20 ° C para análise por Western blot.
  4. Western blot.
    1. Misture quantidades iguais de proteína (cerca de 50 μg) a partir de amostras tratadas não tratadas e tratadas com polifenol ou Ang II com tampão de lise para obter um volume total máximo de 50 μL. Adicione 16 μL de um tampão de amostra 4x Laemmli. Aquecer as amostras por 5 minutos a 75 ° C.
    2. Separar a amostraEs em 10% de géis SDS-PAGE e transfira-os para membranas PDVF a 10 V durante 75 min em um sistema de transferência semi-seco para análise de Western blot com anticorpos específicos.
    3. Bloqueie a membrana com 2% de leite em TBS 0,05% de tampão Triton-X100 (TBS-T) durante 20 min.
    4. Retire o leite lavando a membrana pelo menos três vezes com TBS (5 min cada) e incuba com anticorpos primários durante 1 h à TA ou O / N a 4 ° C.
    5. Lave a membrana três vezes, 10 min cada, com TBS-T e incuba com um anticorpo secundário ligado a HRP durante 45 min.
    6. Lave a membrana três vezes, 10 min cada, com TBS-T e desenvolva-se por quimioluminiscência avançada (ECL).

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Representative Results

Foi demonstrado anteriormente que os extratos de polifenóis isolados de BL, RB e BRB reduziram a senescência de VSMCs em resposta a Ang II 21 . Verificou-se que estes extratos de polifenóis purificados modulam a sinalização de Ang II através da redução da fosforilação de Akt, p38 Mitrogen-activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL evita a senescência ao reduzir a expressão da NADPH oxidase (Nox) 1, uma enzima que produz aniões superóxido e está fortemente regulada por Ang II. Em contraste, RB e BRB impedem a senescência por um mecanismo independente de Nox1, pois aumentam a expressão das enzimas antioxidantes SOD1, SOD2 e glutationa peroxidase 1 (GPx-1). BL não consegue aumentar a expressão de SOD2, enquanto nenhum dos extratos atenua a regulação negativa da catalase por Ang II 21 . BL foi focado para determinar se a falta de efeito de BL sobre SOD2 e catalase expressão poderiaSer explicado por uma perda de compostos de polifenóis durante o processo de purificação ou por uma concentração inadequada de um determinado composto polifenólico no extrato. Os VSMCs foram incubados com 50-500 μg / mL de CE ( Figura 1A ) ou PE ( Figura 1B ) em meio contendo FBS a 0,5% durante três dias. Nem CE nem PE aumentaram os níveis de SOD2 ou catalase em nenhuma das concentrações testadas. Como controle positivo, mediu-se a fosforilação ERK1 / 2 e verificou-se que CE reduziu a fosforilação desta quinase em concentrações superiores a 300 μg / mL. Em contraste, o PE foi eficaz em cerca de 100 μg / mL ( Figura 1B ). Baixos níveis de fosforilação foram observados em concentrações de 200-500 μg / mL. Estes dados suportam a observação anterior mostrando que 200 μg / mL de PE BL é suficiente para reduzir a sinalização Ang II 21 . Estes resultados sugerem que maiores concentrações de polifenol cObras em PE, em comparação com CE, poderia explicar a maior eficiência deste extrato na redução da fosforilação ERK1 / 2. Para testar esta ideia, compararam-se as composições de polifenóis de ambos os extratos. A identificação e quantificação de compostos de polifenóis em CE foi realizada por HPLC, conforme descrito anteriormente 21 ( Tabela 1 ). O ácido 3- o- azoleoíquico e a quercetina estavam presentes em níveis mais elevados em PE em comparação com CE, enquanto o ácido ferúlico e a rutina foram encontrados apenas em CE. Em seguida, os VSMCs foram tratados com 200 μg / mL de BL PE por 24 h antes da adição de 100 nM de Ang II ( Figura 1C ). Como relatado anteriormente 21 , o extracto de polifenol BL reduziu a fosforilação ERK1 / 2 induzida por Ang II, mas não demonstrou nenhum efeito sobre a catalase e a expressão de SOD2.

figura 1
B ) ou 200 μg / mL de PE ( C ) em 0,5 % De meio FBS DMEM para 3 d. C ) Após 24 h de incubação com BL PE, adicionou-se Ang II (100 nM) e as células foram incubadas durante 3 d. O meio, com extratos frescos e Ang II, foi alterado todos os dias. As células foram então lavadas e lisadas, e os extratos celulares totais foram separados em 10% de gel PAGE-SDS. As transferências de Western foram testadas com anticorpos de coelho contra ERK1 / 2 fosforilado (Thr 202 / Tyr 204), ERK1 / 2, catalase e SOD2 e anticorpo de murganho contra β-actina. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Analitos (ppm) PE CE
Ácidos fenólicos
ácido gálico 243.5 321,9
Ácido p-coumarico 32,9 46,5
Ácido ferúlico - 236.5
Ácidos clorogênicos
Ácido 3-O-cafeoilquinico 235.3 170.5
Ácido 4-O-cafeoilquinico 13 76,9
Ácido 5-O-cafeoilquinico 14.1 49,9
FLAVONOIDES
Flavonóis
Quercetina 95 24,5
Flavanones
Rutina - 37,8

Tabela 1: Análise da Composição de Polifenóis de Blackberry em Extratos puros e polifenóis. Os ácidos fenólicos e flavonóides em Extracto Bruto (CE) e Extracto Purificado (PE) foram analisados ​​utilizando Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC). A concentração de analitos é expressa em ppm. A composição de polifenóis em BL PE foi recentemente publicada 21 e adicionada à mesa para ser comparada à CE.

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Discussion

Os polifenóis isolados das bagas contêm composições distintas. O protocolo de extração baseado em etanol descrito aqui permitiu a identificação de diferentes níveis de ácidos fenólicos e flavonóides presentes em extratos de polifenóis brutos e purificados de BL ( Tabela 1 ). CE foi enriquecido em ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquinico e ácido 5-O-cafeoilquinico. O processo de purificação não alterou significativamente os níveis de ácido gálico e ácido p-cumarico. No entanto, aumentou os níveis de ácido 3- O- cafeoquinílico de 170,5 - 235,3 ppm e de quercetina de 24,5 a 95 ppm. Em contraste, o ácido ferúlico e a rutina foram perdidos durante a purificação de CE.

O tratamento de VSMCs com 50 e 500 μg / mL CE e PE mostrou que ambos os extratos foram eficazes na redução da fosforilação basal de ERK1 / 2. No entanto, PE apresentou uma downregulation mais forte na atividade desta quinase em uma concentração mais baixa: 100 & #181; g / mL para PE em comparação com 400 - 500 μg / mL para CE. Estes resultados podem refletir a maior concentração de ácido óxido de 3- O- cafeoquinolina ou quercetina encontrada em PE. O uso de compostos fenólicos individuais em células em cultura é necessário para identificar o (s) composto (s) específico (s) responsável (is) pela downreguação da fosforilação ERK1 / 2.

A diminuição da atividade das cinases de sinalização, incluindo Akt, ERK1 / 2 e p38MAPK, causada por polifenóis purificados isolados de BL, RB e BRB 21 , bem como de ERK1 / 2 causada por BL CE, mostrada aqui, está de acordo com Relatórios anteriores. Por exemplo, os extratos de polifenóis isolados do mirtilo diminuíram o crescimento tumoral de células de câncer mamário, em parte reduzindo a atividade de Akt e ERK1 / 2 30 . Como mencionado anteriormente, essas cinases também estão envolvidas na indução de senescência celular por Ang II 21 , sugerindo que polifenóis de BL, RB e BRB shoulD reduzir o envelhecimento vascular e disfunção associada à DCV.

Como relatamos anteriormente 21 , a expressão de catalase e SOD2 não foi regulada positivamente pelo PE, mesmo em concentrações tão altas como 500 μg / mL. Como a CE também foi ineficaz no aumento da expressão de catalase e SOD2, esses dados sugerem que os compostos fenólicos perdidos durante o protocolo de purificação não estão envolvidos na regulação dessas enzimas antioxidantes. Estes dados também sugerem que o protocolo de purificação mostrado aqui efetivamente concentrou compostos fenólicos relevantes para a regulação da sinalização Ang II, estresse oxidativo e senescência celular. Por exemplo, os resultados representativos mostram que PE promoveu fortemente a fosforilação ERK1 / 2 induzida por Ang II. A avaliação da fosforilação desta quinase é relevante porque a inibição da atividade de ERK1 / 2 impediu a senescência celular induzida por Ang II 21 .

Em tErras de modificações aos protocolos anteriores, foi adicionada uma sonicação para aumentar o rendimento de extração para CE. Além disso, para a purificação de polifenóis, em vez de usar um Cartucho C18, conforme descrito por Kim e Lee 27 , um método mais tradicional de Queires et al . 28 foi adotado aqui. Um passo de filtração, usando papel de filtro para remover impurezas, foi adicionado à purificação da seção de polifenóis. Em termos de limitações, as etapas de sonicação e evaporação devem ser cuidadosamente monitoradas de acordo com o tipo de instrumento utilizado, uma vez que a duração e a temperatura da sonicação e evaporação são as etapas críticas deste protocolo. As modificações adicionadas a este método resultaram no maior rendimento de polifenóis quando comparados aos métodos anteriores 27 , 28 utilizados em nosso laboratório (dados não mostrados), provavelmente devido à adição de um passo de sonicação. Como mentiNa seção de protocolo, este protocolo pode ser usado para o pó liofilizado de várias bagas, bem como para frutas congeladas. Este método foi utilizado com sucesso para extrair e purificar polifenóis de framboesas e framboesas pretas 21 , bem como de mirtilos e morangos (dados não mostrados). Assim, este método também pode ser usado para extrair polifenóis de outros tipos de alimentos, incluindo vegetais.

Em conclusão, este trabalho detalha um método rápido, econômico e facilmente reproduzível para isolar polifenóis de bagas, o que permite a retenção e concentração de compostos que protegem contra o estresse oxidativo em VSMCs.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Associação Americana do Coração (14GRNT20180028) e pelo Conselho da Universidade Estadual da Flórida sobre Pesquisa e Criatividade (COFRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

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References

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