אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כתב היד הזה מפרט את ייצור של רקמות מיקרו- רקמות מהונדסות ברשתות עצביות: מבנים תלת-מימדיים בגודל מיקרון המורכבים משטחים אקסונליים ארוכי טווח המקיפים אוכלוסייה נוירונית מצטברת (s), המצופים בהידרוגול צינורי. אלה הפיגומים החיים יכולים לשמש ממסרים תפקודית לשחזר או לווסת מעגלים עצביים או כמו מיטות בדיקה ביופידלית מחקה נוירונטומי חומר אפור לבן.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התאוששות פונקציונלית לעיתים רחוקות מתרחשת בעקבות פציעה או ניוון מחלה המושרה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) בשל הסביבה מעכב ואת יכולת מוגבלת neurogenesis. אנו מפתחים אסטרטגיה בו זמנית כתובת נוירונים ואת הנתיב המסלול axonal בתוך CNS פגום. כתב יד זה מציג את פרוטוקול ייצור עבור מיקרו-רקמות מהונדסים רשתות עצביות (מיקרו- TENNs), בונה מושתל המורכב נוירונים ומסומנים axonal שטחים פורש לומן תאיים (ECM) לומן של צילינדרים הידרוג'ל preformed מאות מיקרון בקוטר שיכולים להרחיב סנטימטרים באורך. עצבים נוירונים הם תחומים לקיצוניות של תלת מימדי encasement ו הם מורחבת על ידי תחזיות axonal. Micro-TENNs מותאמים באופן ייחודי כאסטרטגיה לשיקום CNS, המדמה היבטים של cytoarchitecture במוח connectome ואפשרות לספק אמצעי להחלפת הרשת. הניאואגרגטים רונאליים עשויים סינפסה עם רקמות המארח ליצור ממסרים פונקציונליים חדשים כדי לשחזר ו / או לשנות את המעגל חסר או פגום. מבנים אלה עשויים לשמש גם "פרוגומים חיים" פרו - רגנרטיבית, המסוגלים לנצל מנגנוני התפתחות של נדידת תאים ומסלול דרכי אקונלי, המספקים רמזים מבניים ומסיסים סינרגיסטיים על בסיס מצב התחדשות. Micro-TENNs הם מפוברק על ידי שפוך נוזל הידרוג לתוך עובש גלילי המכיל מחט ממוקד longitudinally. לאחר הידרוג יש gelled, מחט מוסר, משאיר חלול מיקרו העמודה. פתרון ECM מתווסף לומן כדי לספק סביבה מתאימה להדבקה העצבית ואת תוצר axonal. נוירונים מנותקים הם מצטברים מכנית עבור זריעה מדויקת בתוך אחד או בשני הקצוות של המיקרו טור. מתודולוגיה זו מייצרת באופן אמין בונה מיניאטורי עצמאי עם ארוך הקרנת חלקים axonal שיכולים לשחזר תכונות של המוח neuroanatomy. סינפטיתUnlabeling ו מסומנת גנטית סידן מחוונים מצביעים על כך מיקרו- TENNs יש הפצה סינפטי נרחב ופעילות חשמל מהותי. כתוצאה מכך, Micro-TENNs מייצגים אסטרטגיה מבטיחה לשיקום נוירו-ניתוחי ממוקד של מסלולי מוח, ויכולים לשמש גם כמודלים ביופידליים כדי לחקור תופעות נוירוביולוגיות במבחנה .

Introduction

המאפיין השכיח של הפרעות ומחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כגון פגיעה מוחית טראומטית (TBI), פגיעה בחוט השדרה (SCI), שבץ, מחלת האלצהיימר ומחלת פרקינסון, הוא ניתוק מסלולי האקסון ותאי העצב הפסד 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . לדוגמה, כאשר שבץ איסכמי הולך untreated, ההערכה היא כי האקסונים הם איבדו בקצב של 7 קילומטרים של אקסונים לדקה 5 . במקרה של TBI, אשר כ -1.7 מיליון אנשים חווים מדי שנה בארצות הברית לבדה, ניוון axonal עשוי להמשיך להתרחש שנים לאחר טראומה, כמו הפגיעה הראשונית מזרז מצב נוירודגנרטיבי לטווח ארוך 4 . מחריף השפעות אלה מזיקים, CNS יש capa מוגבלת מאודעיר עבור התחדשות 1 , 7 , 8 , 9 . לאחר הפציעה, מתפתחת סביבה מעכבת המאופיינת בחוסר הדרכה מכוונת למטרה רחוקה, נוכחות של מעכבים הקשורים במיאלין, המעכבים את צמיחת הנוריטים, ויצירת צלקת גלייה על ידי אסטרוציטים תגובתיים 8 , 10 , 11 , 12 . צלקת גלייה משמש כמחסום ביוכימי ופיזי התחדשות, עם מולקולות כגון chondroitin sulfate proteoglycans חסימת תוצר האקסון 8 , 11 . יתר על כן, למרות תאי גזע עצביים נמצאו CNS מבוגר, הייצור של נוירונים חדשים מוגבל, כמו עדות עקבית של neurogenesis רק נמצא הנורה חוש הריח, ההיפוקמפוסאזור subgranular, אזור periventricular, ואת התעלה המרכזית של חוט השדרה 13 , 14 . מכשולים אלה מונעים התאוששות תפקודית של נוירונים אבודים ואדריכלות החומר הלבן בעקבות פגיעה או מחלה, וכתוצאה מכך את החיים לעתים קרובות שינוי מתמשך ההשפעות של תנאים אלה.

למרות חוסר יכולת התחדשות CNS הבוגר, הוכח כי התחדשות axonal אפשרי אם רמזים סביבתיים נאותים מוצגים לארח נוירונים 15 , 16 , 17 , 18 . החוקרים ניסו לספק ולטפל בגורמי גדילה ( למשל, גורם גדילה עצבי , גורם גדילה באפידרמיס, גורם גדילה תלוי-גליה וגורם נוירוטרופי -3) ומולקולות הדרכה אחרות כדי לעורר את הפלסטיות ואת התחדשות האקסון 14 ,/ Sup> 18 , 19 . למרות שמחקרים אלו אישרו כי אקסונים מבוגרים מסוגלים להגיב לגורמי גדילה, אסטרטגיות אלו מוגבלות על ידי החדירות הנמוכה של מחסום הדם והמוח והדרגות הספציפיות והזמניות הנדרשות לקידום התחדשות 14 , 18 , 19 . גישות אחרות הסתמכו על hyperactivation של גורמים שעתוק הקשורים שיקום נוירונים CNS. לדוגמה, overexpression של גורם שעתוק Stat3 עוררה התחדשות axonal העצב האופטי 20 . עם זאת, הן ביומולקולה משלוח overexpression של גורמי שעתוק לא מצליחים להחליף אוכלוסיות איבוד נוירונים. אסטרטגיות מבוססות תאים התמקדו בעיקר בהשתלת תאי גזע עצביים (NSC) לתוך מערכת העצבים המרכזית, תוך ניצול יכולתם להחליף נוירונים במערכת העצבים המרכזית,ולתמוך בניסיונות נוירוגנזה המתרחשים לאחר הפציעה. למרות זאת, ישנם עדיין אתגרים דוחקים בגישה זו, כולל היכולת הקשה של תאים עצביים המושתלים לשרוד, להשתלב עם המארח, ולהישאר מוגבל מרחבית לאזור הפגוע 6 , 14 , 17 , 21 . בנוסף, משלוח תאים לבד אינו מסוגל להחזיר את cytoarchitecture של מסלולים axonal פגום או אבוד. גישה חלופית המטפלת בבעיות העומדות בפני אסטרטגיות של תאים ותרופות / תרופות כימיות היא שילוב של גישות אלה עם השימוש ביומטריאליות 14 , 22 , 23 . Biomaterials כגון הידרוג מסוגלים לחקות את המאפיינים ביוכימיים ופיזיים של המטריצה ​​תאיים (ECM), המסייעים משלוח תאD החזקת באזור הפגוע, ומספק גורמי גדילה ומולקולות ביו אקטיביות אחרות עם שחרור מבוקר 22 . המאפיינים האטרקטיביים של אסטרטגיות אלו מבוססי ביו חומרים הובילו ראיות של התחדשות אקסונול vivo לאחר השתלת פיגומים לאזור lesioned 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . עם זאת, אסטרטגיות biomaterial ביולוגי לא להחליף אוכלוסיות איבוד נוירונים; כאשר משמשים כלי הלידה עבור תאי עצב נוירונים, גליה, או נוירונים, biomaterials אינם מסוגלים לבנות מחדש רשתות ארוכות טווח axonal. האתגר של פיתוח גישה המתמודדת הן ניוון המסלול אקסונל ואובדן עצבי הקשורים הפציעה CNS המחלה עדיין נשאר <Sup class = "xref"> 31.

קבוצת המחקר שלנו דיווחה בעבר על פיתוח של רקמת מיקרו-רקמה מושתלת מהונדסת רשתות עצביות (מיקרו-טנס), שהן סוג של "פיגום חי" המורכב מגופי תא עצביים המוגבלים לאחד או לשני הקצוות של מיקרו-אגרוזה , עם שטחים axonal מיושר המשתרעת על פני השטח של זה תלת מימדי (3D) encasement 1 , 10 , 31 , 32 . אחד ההבדלים העיקריים בין טכניקה זו לבין גישות קודמות היא כי cytoarchitecture של מיקרו- TENNs נוצרת לחלוטין במבחנה ו מושתלים לאחר מכן 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , <Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . ייצור במבחנה מציעה שליטה מרחבית וטמפורלית רחבה על הפנוטיפ והתכוונות הסלולר, תכונות מכניות / פיסיקליות, רמזים ביוכימיים וגורמים אקסוגניים, אשר מרוויח שילוב של פיגומים אלה עם המארח לאחר ההשתלה 41 , 42 . Micro-TENNs הם בהשראת אנטומית כי הם לחקות neuroanatomy המוח, הצגת דרכי axonal דומים לאלה לגשר אזורים תפקודיים שונים של המוח ( איור 1 א ) 1 . לכן, אסטרטגיה זו עשויה להיות מסוגל פיזית להחליף את החומר הלבן איבד שטחים נוירונים בעקבות ההשתלה לאזור lesioned. טכניקה זו מושפעת גם ממנגנונים התפתחותיים שבהם "פיגומי חיים טבעיים" שנוצרו על ידי תאי גלייה רדיאליים ו אקסונים חלוציים לשמש מדריכי pathfinding עבור התאהגירה מן האזור subventricular ו תוצר axonal, בהתאמה 43 . מנגנונים אלה הם recapitulated ב axonal שטחים של micro-TENNs, אשר יכולים להציג נתיבים חיים עבור הגירה תאים עצביים התחדשות axonal ידי תוצר אקסון בתיווך אקסונל ( איור 1 ג ) 43 . יתר על כן, אסטרטגיה זו מנצלת אינטגרציה סינפטי בין נוירונים מיקרו TENN ו מעגל הילידים, יצירת ממסרים חדשים שעשויים לתרום התאוששות תפקודית ( איור 1 ב ) 43 . היכולת להיווצרות סינפסה עשויה גם להעניק גישה זו את היכולת לווסת את CNS ולהגיב רקמות המארח על פי משוב ברשת. לדוגמה, נוירונים פעילים optogenetically של פיגומים חיים עשוי להיות מגורה כדי לווסת את הנוירונים המארח באמצעות אינטראקציות סינפטי ( איור 1D ).

בנוסף, קונסטרוקטור ביולוגי מבוסס ביומטריUction של מיקרו- TENNs מציעה סביבה נאותה עבור הידבקות התא, צמיחה, הרחבת neurite, איתות, בעוד מימדים מיניאטורי של מבנים עשוי לאפשר השתלה פולשנית מינימלית לספק microenvironment חלקית חלקית עבור אינטגרציה הדרגתית לתוך המוח. ואכן, הפרסומים האחרונים הוכיחו את הפוטנציאל של מיקרו- TENNs לחקות מסלולים עצביים לאחר ההשתלה לתוך המוח חולדה. בעקבות microinjection stereotaxic, אנחנו בעבר דיווחו עדויות של הישרדות עצביים מיקרו-TENN, תחזוקה של ארכיטקטורת דרכי axonal, ואת הרחבת neurite לתוך הקורטקס המארחת עד לפחות 1 חודש in vivo 10 , 31 . יתר על כן, תיוג עם סינאפסין סיפק ראיות היסטולוגית של אינטגרציה סינפטי עם רקמות יליד 10 , 31 . בסך הכל, Micro-TENNs עשוי להיות מתאים באופן ייחודי לשחזר ולפגוע פגוםCNS על ידי החלפת נוירונים אבודים, שילוב סינפטי עם המעגלים המארחת, שחזור אבודים cytoarchitecture axonal, ובמקרים מסוימים, מתן אקסונים התחדשות עם רמזים pathfinding המתאים.

איור 1
איור 1: עקרונות השראה מאחורי פיתוח של רקמות מיקרו מהונדסים רשתות עצביות (מיקרו- TENNs). ( A ) Micro-TENNs לחקות את cytoarchitecture של המוח connectome (סגול), שבו אזורים נפרדים מבחינה תפקודית מחוברים על ידי ארוך, מיושר axonal tracts ב חד כיווני (אדום, ירוק) או דו כיווני (כחול) באופן. לדוגמה, מיקרו- TENNs יכול לשחזר חיבורים אבודים במסלולים קורטיקוטלמיים ו nigrostriatal או במסלול perforant מן קליפת המוח אל ההיפוקמפוס (מותאם struzyna et al. , 2015) 1 . ( ב ) תרשים של חד-כיווניותL ו חד כיווני micro-TENN (אדום וכחול, בהתאמה) שילוב סינפטי עם המעגל המארח (סגול) לשמש כמסר פונקציונלי בין שני הקצוות של הנגע. ( C ) סכמטי של שטחי axonal של חד כיווני מיקרו TENN (ירוק) משמש כמדריך התחדשות מאופקת האקסון של האקסונים המארח (סגול) לעבר מטרה שבה micro-TENN אינטראקציה. ( D ) תרשים תפיסתי של השימוש מיקרו-TENNS פעיל optogenetically כמו neuromodulators, תוך ניצול אינטגרציה סינפטי עם נוירונים מעוררים או מעכבים (התחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

כתב היד הנוכחי מפרט את המתודולוגיה שנוצלה כדי לפברק מיקרו- TENNs באמצעות נוירונים קליפתיים מוחיים הנגזרים עובריים. יש לציין, מיקרו- TENNs יכול להיות מפוברק עם סוגים אחרים של תאים עצביים. לדוגמהבשפע, הדוחות הראשונים של מוצלח מיקרו פיתוח TENN מובלט גנגליון השורש הגבי (DRG) נוירונים 32 . הידרוג'ל מיקרו עמודות ניתן להפיק ( איור 2 א ) על ידי הוספת agarose נוזלי כדי אישית, לחתוך לייזר מערך ערוץ גלילי או צינורות נימי, שניהם המכילים מחטים אקופונקטורה מיושר. המחט יוצרת את לומן וקובעת את הקוטר הפנימי (ID) של המיקרו טור, ואילו מזהה צינור נימי ואת קוטר של צילינדרים ב לייזר לחתוך התקן להכתיב את הקוטר החיצוני (OD) של מבנים. OD ו ID ניתן לבחור על פי היישום הרצוי על ידי בחירת בקטרים ​​שונים עבור המכשיר / צינורות נימי ואת מחטי דיקור, בהתאמה. אורכו של עמודות המיקרו יכול גם להיות מגוונים; עד כה, יש לנו דיווחו על בניית מיקרו TENNs עד 20 מ"מ אורך 10 והם פעיל רודף אפילו אורכים ארוכים יותר. לאחר ג'ל agarose ואת דיקור nEedles מוסרים, פתרון ECM בדרך כלל המורכב סוג אני קולגן laminin מתווסף לומן של בונה ( איור 2 ג ). הליבה ECM מספק פיגום לתמוך הידבקות התא העצבית ותוצר axonal. בתחילה, ראשי נוירונים קליפת המוח עכברוש היו מצופה בעמודות מיקרו באמצעות השערות תא מנותקים 10 , 31 , 32 . עם זאת, גישה זו לא ייצרה את cytoarchitecture היעד בכל המקרים, אשר הוגדר כמו תא תאים עצביים מוגבל לקצוות של עמודות מיקרו, עם לומן מרכזי המורכב טהור מיסודות axonal. מאז, השימוש בשיטת צבירה נוירונים כפויה (המבוססת על פרוטוקולים המותאמים מ- Ungrin et al ) אפשרה ייצור אמין יותר ועקבי של מיקרו-טנס עם המבנה האידיאלי ( איור 2 ב ) 44 . בנוסף לתיאור הנוכחימתודולוגיה, מאמר זה יראה נציג בניגוד שלב ו confocal תמונות של מיקרו- TENNs המדגימים את היווצרות של שטחי axonal לאורך זמן, כמו גם את cytoarchitecture היעד הסופי. כתב היד הזה ירחיב גם על היבטים ראויים לציון של הפרוטוקול ואתגרים נותרו ואת הכיוונים העתידיים של הטכנולוגיה מיקרו- TENN.

איור 2
איור 2: דיאגרמה סכמטית של תהליך ייצור מיקרו-TENN תלת-שלבי. ( א ) פיתוח של hydroel agarose: (i) בתחילה, מחט אקופונקטורה קטנה ( למשל , 180-350 מיקרומטר קוטר) מוכנס לתוך ערוצי גלילי של מותאם אישית, לייזר לחתוך עובש או צינור נימי ( למשל , 380-700 מיקרומטר בקוטר). בשלב הבא, agarose נוזלי DPBS הוא הציג לתוך צינורות גליליים או צינורות נימי. (2) לאחר ג'ל agarose, המחט מוסרהתבנית מפורקת להניב את האגרוזה החלולה מיקרו-עמודות. (ג) מבנים אלה מעוקרים ומאוחסנים ב- DPBS. ( ב ) תרבות נוירון העיקרי בשיטה המצטברת: (i) צבירה העצבית מבוצעת מערכים פירמידליים מיקרו היטב, יצוק מ -3 מודפסים בקבוצה זו, שמתאימים בארות של צלחת 12 היטב תרבות. (II) מיקרו TENNs כוללים נוירונים עכברוש הראשי ניתק מ המוח העוברי של עובריים יום 18 חולדות. בעקבות דיסוציאציה רקמות עם טריפסין- EDTA ו DNase אני, פתרון התא עם צפיפות של 1.0-2.0 x 10 6 תאים / מ"ל ​​מוכן. (Iii) 12 μL של פתרון זה מועברים היטב כל במערך פירמידה מיקרו היטב. הצלחת המכילה אלה מיקרו בארות הוא centrifuged לייצר אגרגטים התא. (IV) אלה מודגרת אז לילה לפני ציפוי בעמודים מיקרו. ( C ) ייצור הליבה ECM ו זריעת תאים: (i) לפני זריעת תאים, פתרון ECM המכיל 1 מ"ג / מ"ל ​​סוג קולגן אני 1 מ"ג / מ"לLaminin מועבר הפנים של מיקרו- TENNs מותר לפלמר. (Ii) תלוי אם חד-כיווני או חד-כיווני מיקרו-טנס מפוברקים, צבירה ממוקמת באחד או בשני הקצוות של המיקרו-טור, בהתאמה. (ג) לאחר תקופה של הדגירה כדי לקדם הידבקות, מיקרו- TENNs מתורבת בצלחות פטרי מוצף בינוני בינוני העצבית הבסיסית העצבית. (Iv) לאחר 3-5 ימים בתרבות, מבנה המיקרו-טין הסופי אמור להפגין אגרגטים של תאים בקצוות המיקרו-טור, עם שטחי אקסונים המשתרעים לאורכו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות באוניברסיטת פנסילבניה ואת מייקל ג 'יי Crescenz ווטרנים לענייני המרכז הרפואי דבק הקווים המנחים שנקבעו במדיניות הבריאות הציבורית NIH מדיניות על טיפול הומאני ושימוש במעבדה בעלי חיים (2015).

1. פיתוח של הידרוגל Agarose (רכיב Acellular של מיקרו- TENNs)

  1. הכנת פתרון Agarose
    1. בתוך ארון biosafety, להכין מאגרים עבור מיקרו עמודות על ידי העברת 20 מ"ל של Dulbecco של פוספט שנאגרו מלוחים (DPBS) לכל אחד שני מנות 10 ס"מ פטרי. לעקר מלקחיים בסדר microscalpels עם מעקר חרוז חם.
    2. לשקול 3 גרם של agarose ולהעביר אותו כוס סטרילית בתוך ארון biosafety. הוסף 100 מ"ל של DPBS לריכוז סופי של משקל 3% / נפח (w / v). לכלול בר מגנטי נקי לכסות את כוס עם alumiמס 'נייר.
    3. עם צלחת / stirrer חם, חם את הכוס ב 100 מעלות צלזיוס ומערבבים בסל"ד 120-200 לחלוטין כדי להמיס את agarose (הפתרון יהפוך מעונן לבהיר). לשמור על חימום ערבוב לאחר מכן כדי למנוע gelation ולשנות את טמפרטורת החימום לפי הצורך כדי למנוע שריפת agarose.
      הערה: ייצור עם מכשיר חיתוך לייזר ו צינורות נימי מוצג להלן בסעיפים 1.2 ו 1.3, בהתאמה. המשך לסעיף 1.4 לאחר שסיים את השלבים המתוארים בסעיף משנה. עבור שתי שיטות ייצור מיקרו טור, להוסיף את agarose נוזלי במהירות, כמו agarose מתקשה במהירות כפי שהוא מתקרר. בעת עיקור עם החיטוי בכל אחד מהצעדים הבאים, השתמש בתנאים הרגילים החלים על כלי זכוכית.
  2. הכנה מיקרו טור באמצעות מכשיר לחתוך לייזר
    הערה: התקן לחתוך לייזר הוא לחתוך אקריליק שקוף באמצעות מסחרי CO2 לייזר חותך. הפבריקטיון של מבנים והתקנים באמצעות חיתוך לייזר מתועד היטב עבור מגוון של יישומים הנדסיים ומחקר 45 , 46 , 47 . עובש זה ( איור 3 ) מורכב מערך של חמישה ערוצים גליליים, כל אחד עם קוטר של 398 מיקרומטר אורך של 6.35 מ"מ. מערכים גליליים אלה נוצרים לאורך שני חלקים: חצי תחתון (אורך: 25.4 מ"מ, רוחב 6.35 מ"מ, גובה: 6.0 מ"מ) וחצי עליון (אורך: 31.5 מ"מ, רוחב: 6.35 מ"מ, גובה: 12.7 מ"מ ), כפי שמוצג באיורים 3 א ו 3 ב , בהתאמה. את שני החצאים ניתן להדק יחד בכפות הקדמיות והאחוריות שנצפו בתרשים 3C (אורך: 31.5 מ"מ, רוחב: 6.35 מ"מ, גובה: 12.7 מ"מ), המכיל ארבעה חורים יישוריים אשר חופפים עם שני חורים כל אחד על החלק העליון והתחתון חתיכות ומסייעים לאבטח את כל החלקים יחד כאשר דפוק. אלה גם כובעים incחמש חורים גסים, מרוכזים בערוצים הגליליים, שאליהם ניתן להכניס את מחטי האקופונקטורה כדי ליצור את לומן המיקרו-עמודות.
    1. לעקר את המכשיר שמוצג באיור 3 על ידי כיסוי זה עם רדיד אלומיניום ו החיטוי. להרכיב את המכשיר כפי שמוצג באיור 3D על ידי יישור הכובעים הקדמי ואת האחורי עם רק את החלק התחתון חצי חתיכת לאבטח את שלושת החלקים עם שני # 440 ברגים ואומים (קוטר חוט: 3.05 מ"מ) בחורים יישור התחתונה.
    2. מלא להציג מחט דיקור (קוטר: 180 מיקרומטר, אורך: 30 מ"מ) לתוך החורים מחט על הכובע הקדמי או האחורי של המכשיר ( איור 3D ). עם micropipette, לשפוך מספיק agarose נוזלי (~ 1 מ"ל עבור חמשת הערוצים) על החלק התחתון חצי חתיכת למלא לחלוטין כל אחד מחצי ערוץ גלילי.
    3. מניחים מיד את החלק העליון של המכשיר על החצי התחתון ומפעילים לחץ עד שהוא מחובר היטבבמקום כדי להשלים את הערוצים הגליליים (חיכוך בין הכובעים ואת החלק העליון ישמור את האחרון במקום). המתן ~ 5 דקות בטמפרטורת החדר לאחר agarose בנוסף לאפשר gelation שלה בתוך הערוצים של המכשיר.
    4. לחלופין לחלץ את המחט מכל אחד החורים על כובעי המכשיר. הסר את הברגים באופן ידני להפריד בין שתי כובעי ואת החצי העליון מחלק חצי התחתון, שבו האחרון יהיה מחזיק את העמודים מיקרו הידרוגל.
    5. השתמש מלקחיים בסדר בעדינות להסיר את העמודים מיקרו מן הערוצים על החלק התחתון חצי חתיכת ומניחים אותם לתוך צלחת פטרי שהוכנו בעבר המכיל DPBS (שלב 1.1.1). Reutilize את המכשיר לסיבוב נוסף של ייצור העמודה מיקרו. המשך לסעיף 1.4.
  3. מיקרו-עמודה ייצור באמצעות צינורות נימי
    1. העברת צינורות נימי זכוכית (קוטר: 398.78 מיקרומטר, אורך: 32 מ"מ) לתוך הפנימי של ארון biosafety. באופן ידני לשבור אתצינורות ארוכים לשברים 2.0-2.5 ס"מ ו מלא להכניס מחט אקופונקטורה אחת (קוטר: 180 מיקרומטר, אורך: 30 מ"מ) לתוך כל קטע ( איור 2 א ).
    2. העברת 1 מ"ל של agarose נוזלי מן כוס על פני השטח של צלחת פטרי ריק. החזקת הצינור נימי המחט הציג, מקום אחד קצה הצינור במגע עם הבריכה agarose נוזלי למלא אותו על ידי פעולה נימית. לעצב את הצינור כדי לקדם עלייה נימית.
      הערה: מלאו את צינורות נימי עם agarose נוזלי גבוה ככל היתרי פעולה נימי; לאחר מכן, אלה מיקרו עמודות ניתן לחתוך מבנים קטנים בהתאם אורך הרצוי. בריכה 1-מ"ל agarose משמש בדרך כלל רק צינור אחד, מאז agarose מתקרר וג 'לים במהירות, מניעת פעולה נימית נוספת.
    3. כאשר הנוזל מפסיק לעלות, להסיר את צינור נימי מן הבריכה ומניחים אותו אופקית על פני השטח של צלחת פטרי. המתן 5 דקות כדי לאפשר את agarose ג'ל בתוך הצינורות/ Li>
    4. הצב את האגודל והאצבע על צדי הצינור ולחץ עליו. השתמש ביד השנייה כדי למשוך במהירות את המחט החוצה תוך שימוש האגודל והאצבע כדי למנוע את המיקרו-טור עצמו מחליקה מתוך הצינור. הכנס מחט 30-מד לתוך צינור נימי לאט לדחוף את העמודה החוצה החוצה לתוך צלחת המכילה DPBS (שלב 1.1.1).
  4. מיקרו-טור זמירה ועיקור
    1. בעדינות להעביר עמודה אחת מיקרו מן DPBS כדי צלחת ריקה באמצעות מלקחיים בסדר. הוסף 10 μL של DBPS לחלק העליון של העמודה מיקרו עם micropipette כדי למנוע ייבוש. מניחים את המנה האחרונה מתחת stereoscope להכוונה חזותית.
      הערה: לאורך הפרוטוקול, ייבוש מיקרו עמודה או התייבשות מתייחס לרכישת מבנה מקומט כי הוא להבחין מבחינה ויזואלית מן המראה טיפוסי, hydrated של מבנים אלה. מיובש עמודות מיקרו בחוזקה לצרף את פני השטח של צלחות פטרי ו גAnnot ניתן להעביר בקלות, ואילו מבריק hydrated נוטים להחליק על פני השטח לאחר מניפולציה עם מלקחיים. תמונה שלב ניגודיות של מיקרו מיקרו לחלוטין יבשים מוצג בתרשים 8A .
    2. חתוך את העמודה מיקרו עם microscalpel לקצר אותו אורך הרצוי (כאן, 2-5 מ"מ). הובלה את trimmed מיקרו טור עם מלקחיים בסדר השני צלחת DPBS פטרי מוכן בשלב 1.1.1.
    3. חזור על שלבים 1.4.1 ו 1.4.2 עבור כל micro-column מפוברק.
    4. לעקר את עמודות מיקרו של DPBS המכיל צלחות פטרי תחת אור אולטרה סגול (UV) עבור 1 שעות. חנות צלחות פטרי ב 4 מעלות צלזיוס לפני תוספת ECM ציפוי התא.

2. ראשי נוירון תרבות צבירה התא הכפוי שיטה

  1. הכנת מערך פירמידלי מיקרו-היטב
    הערה: סעיף זה מעסיק תבנית מודפסת תלת-ממדית המורכבת מבסיס גלילי (קוטר: 2.2 ס"מ, גובה: 7.0 מ"מ)Nd 9 מרובע פירמידות על גבי (אורך בצד: 4.0 מ"מ, זווית זווית: 60 °), מאורגן במערך 3 x 3, כפי שמוצג בתרשים 3E . תהליך הייצור התוסף באמצעות מדפסות 3D זמין מסחרית מתועד היטב. בעזרת מחשב עיצוב תוכנה ניתן להשתמש כדי לעצב את התבנית. לאחר מכן ניתן להמיר את קובץ העיצוב שנוצר באופן דיגיטלי לנתיב כלים עבור מדפסת תלת-ממדית. לכל מדפסת יש מפרטים שונים, וההוראות להגדרה והפעלה של מדפסת תלת-ממדית משתנות בהתאם.
    1. השתמש במקדח 3/32 "כדי לנקב 16 חורים במערך 4 x 4 (אורך צד: 4 ס"מ, הפרדת חור: 1 ס"מ), מרוכז במכסה של צלחת פטרי 10 ס"מ, את החלק התחתון של צלחת פטרי לשקול 27 גרם של polydimethylsiloxane (PDMS) ו 3 גרם של סוכן ריפוי (עבור יחס 1:10) מערבבים עם מרית מיקרו להפיץ את הסוכן באופן שווה.
    2. לכסות את PDMS / סוכן ריפוי עם מכסה נקב. חבר קצה אחד של צינור אל הוואקומ 'של מכסה המנוע קטר ולהכניס את הקצה השני לתוך גזע של משפך (קוטר הפה: 10 ס"מ, אורך גזע: 3 ס"מ, קוטר גזע: 1.5 ס"מ).
    3. בצע פתיחה עם 3/32 "תרגיל קצת בחלק העליון של נורה 1 מ"ל פיפטה ולהכניס ומאובטח טיפ μrop 1000 μL לתוך הפתח (עם קצה מחודד כלפי מעלה). מניחים את הנורה ואת קצה לתוך הצינור ולמשוך את הצינור כלפי מעלה עד הנורה חותמת את הצינור לתוך גזע של המשפך.
    4. מניחים את המשפך על מכסה הצלחת הנקובה ומניחים את הצינור בתמיכת חסון זמינה. פתח את שסתום ואקום 5 דקות כדי שאיבה ולהביא את בועות אוויר אל פני השטח.
    5. סגור את השסתום, להסיר את המשפך, ופגע בצלחת פטרי על פני השטח של מכסה המנוע קטר ~ 3 פעמים כדי לפוצץ את כל בועות האוויר הנותרים.
    6. מניחים תבנית פירמידלית היטב 3D מודפס לתוך כל הבארות בצלחת 12 היטב תרבות, עם הפירמידות הצביע למעלה. יוצקים את PDMS / ריפוי סוכן על גבי התבניות עד כל טוב של לאהוא צלחת מלאה. מכסים את צלחת 12 היטב עם מכסה שלה ולהעביר אותו לתנור במשך 1 שעה ב 60 ° C לייבוש.
    7. בזהירות להסיר כל PDMS מיקרו היטב מערך ( איור 3F ) מהצלחת עם מיקרו מרית. לכסות את מערכי PDMS עם רדיד אלומיניום לעקר ידי מעוקר. בתוך ארון biosafety, להוסיף מערך אחד מיקרו היטב לתוך כל טוב של צלחת 12 גם ( איור 2 ב ).
  2. בידוד נוירונים קליפת המוח מעכברים חולדה
    1. הוסף ~ 20 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) לכל אחד מארבע עד שש 10 צלחות פטרי (אחד לכל רקמה גזור) בתוך ארון biosafety. מעבירים את הכלים האלה למכסה לנתיחה ומניחים אותם על הקרח. לעקר מכשירים לנתיחה, כגון microscalpels, מספריים, ו מלקחיים, עם מעקר חרוז חם.
    2. טרום חם עובריים בינוני נוירון הבסיס + 2% ללא תוסף חינם + 0.4 מ"מ L- גלוטמין (המכונה "בינוני תרבות" hereefteR) ו 0.25% טריפסין + 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ב 37 ° C. Thox deoxyribonuclease (DNase) אני על ידי הנחת אותו בטמפרטורת החדר. הכן 1.5 מ"ל של 0.15 מ"ג / מ"ל ​​DNAse אני פתרון ב HBSS ולשמור על הפתרון על הקרח.
    3. להרדים חולדה מתוזמן-יום-18 עובריים על ידי פחמן דו חמצני שאיפה ולאשר מוות על ידי עריפת ראש. מעבירים את הפגר למכסה לנתיחה סטרילי ולהניח אותו בצד הגחון למעלה. שוטפים את הבטן ביסודיות עם אתנול 70%.
    4. לפתוח את הרחם ולהסיר את העוברים (בדרך כלל ~ 11) מתוך שקיות מי השפיר עם מספריים ולהעביר אותם עם מלקחיים לצלחת פטרי המכיל HBSS קר, כמתואר 48 . מניחים קרני (-20 מעלות צלזיוס) גוש גרניט מתחת stereoscope. מניחים את צלחת פטרי על פני השטח של בלוק זה קר כדי לשמר את הטמפרטורה הנמוכה של HBSS לאורך הליך לנתיחה.
    5. שוטפים את הגורים על ידי swishing את HBSS סביב ולאחר מכן להעביר אותם לצלחת נקייה הבאההמכיל HBSS. בעזרת stereoscope ומכשירים לנתיחה, ברצף להסיר את הראש, המוח המוחיים, ואת הקורטקס של העוברים ולהעביר כל רקמה עם מלקחיים לצלחת חדשה HBSS מלא לאחר כל דיסקציה 48 .
    6. לשאוב רק את הקורטקס עם פיפטה פסטר ומניחים את הרקמה לתוך צינור סטרילי 15 צנטריפוגות סטרילי. מחק את רקמות גזור אחרים. שוטפים את הקורטקס שלוש פעמים על ידי הוספת ברצף והסרה ~ 5 מ"ל של HBSS עם פיפטה סרולוגית. מניחים את הצינור על הקרח כאשר אינו בשימוש.
    7. מעבירים את הקורטקס עם פיפטה פסטר לצינור 15 מ"ל המכיל מראש חימם טריפסין- EDTA (4-6 קליפות לכל 5 מ"ל של טריפסין- EDTA). באופן ידני לסחוט את הצינור פעם אחת ומניחים אותו על 37 מעלות צלזיוס. הפוך את הצינור כל 3 דקות כדי למנוע את הרקמה מ clumping.
    8. עצור את החשיפה טריפסין לאחר 10 דקות ~ על ידי הסרת הרקמה עם פיפטה פסטר והעברת אותו צנטריפוגה נקי 15 מ"לצינור. מוסיפים את 0.15 מ"ג / מ"ל ​​DNase אני פתרון (1.5 מ"ל) לצינור עם פיפטה.
    9. השתמש פיפטה פסטר לשבור באופן ידני גושים רקמות ואז מערבולת (~ 30 שניות) עד הפתרון נראה הומוגני ואין שברי רקמות הנותרים בנוזל. אם לא ניתן homogenize לחלוטין את הפתרון, לחלץ את שברי מסיסים ידי משיכת אותם לתוך קצה של פיפטה פסטר.
    10. צנטריפוגה פתרון התא הומוגנית שהושג בשלב 2.2.9 ב 200 xg במשך 3 דקות. הסר את supernatant עם פיפטה פסטר, נזהר לא להפריע לתאים pelleted. הוסף 2 מ"ל של המדיום תרבות עם פיפטה סרולוגית ו מערבולת resuspend התאים.
    11. ספירת מספר תאים בתמיסה מוכן בשלב 2.2.10 באמצעות hemocytometer; התשואה הצפויה היא 3.0-5.0 x 10 6 תאים / חצי כדור קליפת המוח. הכן 1 מ"ל או יותר ההשעיה התא במדיום התרבות, עם צפיפות של 1.0-2.0 x 10 6 תאים / מ"ל.
  3. גיבוש של אגרגטים תא עצבי
    1. עם micropipette, להוסיף 12 μL של 1.0-2.0 x 10 6 / mL ההשעיה תא לתוך כל מיקרו היטב של מערך PDMS (כי הונח בצלחת בשלב 2.1.7).
      הערה: ריכוז התא יכול להיות מותאם בהתאם מיקרו טור טור ואת גודל התא הרצוי התא, כמו ריכוזים גבוהים יותר תשואה אגרגטים גדולים יותר.
    2. צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 במשך 5 דקות לכפות את הצבירה של תאים בתחתית מיקרו בארות ( איור 2 ב ). בזהירות להוסיף ~ 2 מ"ל של המדיום תרבות לחלק העליון של כל מערך PDMS כדי לכסות את כל בארות מיקרו seeded, נזהר לא להפריע את התאים המצטברים.
    3. אם תאים לא יהיה transduced עם וקטור ויראלי, דגירה את הצלחת עבור 12-24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2 ולאחר מכן להמשיך סעיף 3. אם אגרגטים יהיה transduced, לדלג על הדגירה ולהמשיך סעיף 2.4 .
  4. טראןSuction עם וקטור ויראלי כדי לצפות איתות סידן
    הערה: צעדים אלה מבוצעים כדי transduce נוירונים עם וקטור ויראלי המכיל מחוון סידן מקודד גנטית (GECI). התוצאות המוצגות במאמר זה התקבלו באמצעות וירוס זמין ADNO הקשורים מסחרית (AAV) (סרוטיפ 1) עם GCaMP6f, GECI עם קינטיקה מהירה המורכבת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), calododulin (CaM), ואת פפטיד M13, מונע על ידי האדם Synapsin אני מקדם. פתרון וקטור ויראלי עשוי לדרוש דילול DPBS סטרילית לפני התמרה, בהתאם לריכוז של פתרון המניות. בריאות תאים / מורפולוגיה כוח GCaMP6f האות חייב להיות שנצפה לאורך זמן עבור מגוון של ריכוזים וקטוריים. הליך זה אופטימיזציה חייב להתבצע על ידי כל חוקר כדי לקבוע את titer המתאים לתרבויות התא שלהם. זמן הביטוי האופייני GCaMP6f הוא 7-8 ימים לאחר התמרה המתרחשת במהלך הדגירה נעשה ברחובEp 2.4.2.
    1. עם micropipette, להוסיף את נפח נדרש של פתרון וקטור ויראלי (עבור ריכוז סופי של ~ 3.0 x 10 9 עותקים גנומיים לכל צבירה) למדיום התרבות, המכסה את אגרגטים. לאט לאט פיפטה למעלה ולמטה כדי להבטיח כי פתרון וקטור מופץ הומוגנית ברחבי המדיום התרבות.
    2. דגירה את הצלחת עם זרע פירמידה מיקרו בארות עבור 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2 כדי לאפשר התמרה ויראלי של GCaMP6f.

3. פיתוח המרכיב הסלולרי של מיקרו-טנס

  1. ייצור ECM הליבה
    1. לאחר הדגירה המצטברת, להוסיף סוג אני קולגן laminin כדי המדיום תרבות (עבור ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ​​כל) בצינור microcentrifuge להכין את הפתרון ECM. בצע שלבים 3.1.2-3.1.4 בטמפרטורת החדר, אבל לשמור על הצינור עם ECM על הקרח כאשר לא בשימוש כדי למנוע gelation מוקדם.
    2. התאם את ה- pH של פתרון ECM על ידי העברת 1-2 μL נייר litmus כדי לאמת את ה- pH הראשונית, הוספת 1 μL של 1 N נתרן hydroxide (NaOH) ו / או 1 N חומצה הידרוכלורית (HCl) ל- ECM, לפי הצורך, וחוזר עד שה- pH הוא 7.2-7.4. להבטיח homogenization של פתרון ECM ידי pipetting למעלה ולמטה תוך הימנעות היווצרות בועות אוויר.
    3. מעבירים את העמודים מיקרו עם מלקחיים מעוקרים מן הכלים בשלב 1.4.3 לרוקן 35 או 60 מ"מ צלחות פטרי. עבודה על 4-5 מיקרו עמודות בכל פעם כדי למנוע התייבשות. צרף עצה 10 μL המצורפת טיפ 1,000-μL micropipette. באמצעות stereoscope עבור הדרכה חזותית, במקום קצה בקצה אחד של מיקרו עמודות יניקה לחלץ DPBS שיורית בועות אוויר מן לומן.
    4. מהר לצייר 4-5 μL של ECM ב micropipette. מתבונן תחת steראוסקופ, מניחים את קצה micropipette באחד הקצוות של מיקרו עמודות פריקה מספיק ECM למלא את לומן. לאשר את היעדר בועות אוויר לומן, כמו אלה עשויים לעכב תוצר axonal דרך ECM. אם בועות אוויר קיימות, הסר את ה- ECM, כפי שמוסבר בשלב 3.1.3, והוסף את ECM שוב.
    5. כדי למנוע התייבשות, להוסיף ~ 2 μL של ECM סביב כל עמודה מיקרו. דגירה hydrogel / ECM מיקרו עמודות בצלחות פטרי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 במשך 25 דקות. המשך זריעת תא מיד לאחר הדגירה.
      הערה: תקופת הדגירה בשלב 3.1.5 נועד לאפשר זמן פילמור של קולגן laminin בתוך מיקרו עמודות.
  2. זריעת תאים עצביים בעמודים מיקרו
    הערה: כדי לשנות את המדיום התרבות של אגרגטים transduced, להטות את הצלחת, להשתמש micropipette כדי להסיר את המדיום כי בריכות על הקיר של הבאר, ולאחר מכן לאט להוסיף ~ 1 מ"ל נגדקיר (כדי למנוע הפרעה אגרגטים של פירמידלי מיקרו בארות). חזור על שינוי בינוני זה בפעם השנייה.
    1. לאחר תקופת הדגירה בשלב 3.1.5, להעביר כ 10-20 μL של המדיום תרבות לשני אזורים ללא תשלום בצלחות פטרי מחזיק את העמודים מיקרו. השתמש micropipette בנפרד להעביר את אגרגטים לצלחת פטרי המכיל את המבנים ולהעביר אותם עם מלקחיים לאחד הבריכות קטנות של המדיום תרבות לשמור על בריאות התא.
    2. בעת התבוננות תחת stereoscope, הכנס צבירה בכל קצה של מיקרו עמודות עבור מיקרו-TENN דו כיוונית או בקצה אחד עבור ארכיטקטורה חד כיווני (לפי הצורך) באמצעות מלקחיים. לאשר את המיקום של אגרגטים בתוך מיקרו עמודות באמצעות stereoscope. השתמש במלקחיים כדי להזיז את מיקרו זרע זרעים לבריכה קטנה אחרים של המדיום תרבות כדי למנוע התייבשות כדי לשמר בריאות מצטבר.
    3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 למשך 45 דקות לLlow את אגרגטים לדבוק ECM. ודא כי אגרגטים להישאר בקצה של מיקרו עמודות באמצעות stereoscope; Reintroduce אגרגטים התא לחזור על שלב הדגירה לפי הצורך.
    4. בזהירות להציף את המאכלים פטרי המכילים את המיקרו TENNs עם המדיום תרבות (3 או 6 מ"ל על צלחת פטרי 35 או 60 מ"מ, בהתאמה) באמצעות פיפטה סרולוגית. מניחים את הכלים באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2 לתרבות לטווח ארוך.
    5. בצע חצי מדיה שינויים כל יומיים עם בינוני תרבות. בזהירות להסיר חצי המדיום הישן עם פיפטה ולהשתמש stereoscope להכוונה חזותית, כדי למנוע שאיבת מיקרו- TENNs. החלף על ידי הוספת לאט, טרום חימם בינוני עם פיפטה.
    6. כדי reutilize המערכים PDMS מיקרו היטב, להסיר את המדיום תרבות, להרתיח את מערכים במים deionized במשך 30 דקות, לעקר החיטוי לסיבוב נוסף של היווצרות המצרפי ואת התרבות.
      הערה: בנקודות הזמן הרצויות,Cytoarchitecture של מיקרו TENNs ניתן לאמת באמצעות מיקרוסקופית שלב לעומת. כאן, זמן חשיפה של 5-8 MS ו 10X (0.64 מיקרומטר / פיקסל) ו 20x (0.32 מיקרומטר / פיקסל) מטרות נוצלו כדי ללכוד את הפאזה בניגוד תמונות. הקרינה קשורה לשינויים בריכוז סידן ב- microduced TENNs transcial נלכד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי במהירות גבוהה עם 50 זמן חשיפה MS, מטרה 10X (0.64 מיקרומטר / פיקסל), ואור מצב מוצק עם מסננים bandpass של 480 ~ Nm ו ~ 510 ננומטר עבור עירור פליטה, בהתאמה, כדי לחזות את האות הקרינה GCaMP6f.

4. Immunocytochemistry עבור מחקרים במבחנה

הערה: עבור התמונות המוצגות כאן, נוגדנים העיקריים הבאים שימשו: עכבר נגד Tuj-1 / beta III Tubulin (1: 500) ו ארנב אנטי סינאפסין -1 (1: 500) עבור תיוג של אקסונים מראש - סינפטיק boutons, בהתאמה. הנוגדנים המשניים היו אנטי חמור-Mouse 568 (1: 500) ו חמור נגד ארנב 488 (1: 500). הכרכים הדרושים של פתרונות נוגדן ראשוניים ומוכנים משני, כמו גם כמויות של פורמלדהיד, סרום הסוס, ופתרונות דטרגנט, תלויים בנפח הנדרש כדי לכסות לחלוטין את המבנים. כרכים אלה עשויים להיות ממוזער באמצעות עט המכשול הידרופובי כדי להגביל את האזור המקיף כל עמודה מיקרו.

זהירות: סעיף זה מעסיק פורמלין ו Hoechst. פורמלדהיד הוא תרכובת רעילה הידועה כמסרטנת, ו- Hoechst הוא מוטאגן ידוע. לכן, יש לסלק את המרכיבים הללו במיכל פסולת מתאים. תמיד לטפל בהם ברדס כימיים כימיים תוך שימוש בציוד הגנה אישי מתאים, כגון מעבדה מעבדה, משקפי מגן, וכפפות.

  1. הכן נפח 4.0% / נפח (V / V) פתרון פורמלדהיד ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בתוך מכסה המנוע קטר כימי.
  2. הסר את המדיום תרבות מן מנות פטרי ContiNg micro-TENNs עם micropipette. הוסף נפח מספיק של פתרון פורמלדהיד על המנות כדי לכסות לחלוטין את מיקרו- TENNs. משרים את TENNs מיקרו בפתרון פורמלדהיד במשך 35 דקות ב 18-24 מעלות צלזיוס כדי לתקן את התאים בתוך מיקרו עמודות.
  3. הסר את הפתרון פורמלדהיד 4.0% מן הצלחות פטרי עם פיפטה וזורקים הבאים המתאים חומרים מסוכנים להשליך הנחיות.
  4. בצע שתי שטיפות מהירה על ידי הוספת מספיק PBS כדי לכסות לחלוטין את המיקרו TENNs קבוע ולאחר מכן להסיר את PBS עם פיפטה. בצע שטיפה ארוכה שלישית על ידי השריית מבנים ב PBS במשך 10 דקות.
    זהירות: מחק את PBS המשמש שטיפה ככל הנראה המכיל עקבות של פורמלדהיד.
  5. הכן 0.3% V / V פתרון של דטרגנט שאינם יוניים 4% V / V בסרום בסרום PBS. הסר את PBS מן הצלחות פטרי המכילים מיקרו זעירים- TENNs ולהוסיף נפח מספיק של פתרון הדטרגנט 0.3% כדי לכסות את המבנים. משרים 60 דקות ב 18-24 & #176; C כדי permeabilize התאים.
  6. הסר את הפתרון דטרגנט עם פיפטה. בצע שתי שטיפות מהירים על ידי הוספה ולאחר מכן הסרת PBS. לאחר מכן, לבצע שלושה שטיפות ארוכות יותר על ידי השריית מבנים ב PBS במשך 5 דקות במהלך כל שטיפה.
  7. מדולל נוגדנים ראשוניים בסרום 4% בסרום. הסר את PBS מן הצלחות פטרי המכיל את קבוע microeabilized מיקרו TENNs. הוסף מספיק פתרון נוגדן ראשוני לעמודות מיקרו כדי לכסות אותם לחלוטין. חותם את צלחות פטרי עם parafilm כדי למנוע אידוי ו דגירה לילה (12-16 שעות) ב 4 ° C.
  8. הסר את הפתרון נוגדן העיקרי מן הכלים ולשטוף כפי שהוסבר בשלב 4.6. בחושך, להכין את הפתרון נוגדנים משני בסרום 4.0% בסרום. הוסף מספיק פתרון נוגדנים משני כדי לכסות באופן מלא את המבנים, לכסות את המאכלים עם רדיד אלומיניום, דגירה עבור 2 שעות ב 18-24 ° C.
  9. הכן את הפתרון Hoechst (1: 10,000) ב PBS להכתים את הגרעינים.
  10. הערה: תמונות עבור מיקרו-TENN immunolabeled נלקחו עם מיקרוסקופ confocal לייזר עם רזולוציה של 2,048 (~ 8 s / מסגרת), מטרה 10X (0.64 מיקרומטר / פיקסל), 487 ננומטר עירור ~ ~ 525 ננומטר אורכי גל עבור ירוק הקרינה, עירור 561 ננומטר ~ 595 ננומטר אורכי גל פליטה עבור אדום הקרינה, ו ~ 3.22 מיקרומטר / פרוסה עם ~ 60 פרוסות בממוצע עבור z- ערימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Micro-TENNs היו במעקב באמצעות מיקרוסקופ שלב לעומת זאת להעריך cytoarchitecture שלהם תוצר axonal ( איור 4 ). בתוך חד-כיווני, מיקרו-טון של 2 מ"מ, צבירים נוירונים הוגבלו לקצה אחד של העמוד הקטן והציגו צרור של אקסונים דרך הליבה הפנימית. אקסונים משתרע על פני כל עמודה של 5 ימים במבחנה (DIV) ( איור 4 א ). היה גידול גדול יותר בשלב הראשוני של אקסונאל דו-כיווני בגודל 2 מ"מ - מיקרו-TENNs, כאשר האקסונים נמתחו על כל העמודים הקטנים ב -3 DIV ( איור 4 ב ' ). ב- 5 DIV, מיקרו-TENNs דו-כיווניים הציגו חלקים צפופים של אקסונלים שחיברו את המצברים שנשמרו בקצוות המיקרו-טור. זה cytoarchitecture נצפתה גם 5 מ"מ מיקרו- TENNs, עם אקסונים פורש את העמודה מיקרו על ידי 5 DIV ( איור 4 ג ). כפי שנצפה בכל המקרים, ECM לומן ואת restri גיאומטריCtion שהוצגו על ידי agarose סיפק את הכיווניות הנדרשת כדי ליצור שטחים axonal כי לחקות מבנית תכונות של neuroanatomy הילידים.

טכניקות Immunocytochemistry יושמו בפרוטוקול זה, ותמונות confocal נלקחו כדי לאמת את הרכיבים של הארכיטקטורה micro-TENN. גרעיני תאים מוכתמים עם Hoechst (כחול) היו מקומיים כמעט אך ורק בתוך אגרגטים בקצה הקצוות של חד כיווני ועמודות מיקרו דו כיווני, עם למעשה אין מכתים Hoechst בפנים ( איור 5 ). תצפית זו אישרה את מה שהוסבר מתמונות הפאזה-ניגודיות: אוכלוסיות עצביות היו מוגבלות לקצוות, ורק אקסונים (באדום) משתרעים על לומן המיקרו-טנס. עם זאת, לאחר אקסונים חצה את אגרגטים, הגירה תא נצפתה לאורך שטחי axonal לתוך לומן פנימי, כפי שנצפה על ידי נוכחות של גרעינים (כחול) בפנים ב 28 DIV עבור 2 מ"מ אורך bidireCtional Micro-TENN ( איור 6 ). יתר על כן, סינפסין I immunolabeling (ירוק) נמצאה בכל גופי התא ואת שטחי axonal ( איור 6 ). Synapsin אני חלבון מסוף מראש סינפטי מעורב בויסות שחרור נוירוטרנסמיטר והוא מעיד על נוכחות של מסופים מראש סינפטי כאשר נמצא בהפצה פיזור; זה כבר בעבר בקורלציה עם היווצרות של סינפסות פעיל על ידי תא שלם תיקון הקלטות 49 . מכתים הסינפלקס באזור המרכזי האקסון עשיר של מיקרו- TENN סביר שילוב של puncta כמו גם סינפסין להיות מועבר למטה אקסונים לקראת מסופים מראש סינפטי. עם זאת, נוכחות של synctin puncta בתוך אגרגטים micro-TENN עולה כי מבנים אלה יש את היכולת לתקשר באמצעות סינפסות, אם כי colocalization של סינאפסין עם חלבון פוסט סינפטית יהיה צורך ראיות מבניות נוספות של סינפסות פונקציונליות./ P>

Micro-TENNs היו גם מפוברק עם נוירונים מצטברים שהיו transduced עם AAV המכיל את מחוון סידן GCaMP6f לבחון מראש את המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים של מבנים אלה. מבנים אלה הביעו את מחוון הסידן לאורך כל אורכם, כפי שמוצג על ידי הקרינה הן אגרגטים העצבית ואת שטחי axonal ( איור 7 א ). שים לב כי בשל הגדרות מיקרוסקופ שמטרתן למקסם את העוצמה של אגרגטים, הקרינה של שטחי axonal נראה חלש יותר. אלה transduced מיקרו TENNs נותחו לאורך זמן עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי במהירות גבוהה (ללא גירוי חשמלי חיצוני), וכמה אזורים בגודל תא של עניין (ROIs) נבחרו באקראי מיקרו נציג- TENN לאפיין את יכולת איתות של אלה מבנים. התפרצויות סידן ריכוז נצפו כמעט בכל ההחזר על ההשקעה, כפי משתקף עם אסוציאציהIated תנודות עוצמות הקרינה לאורך זמן ( איור 7 ב ). באופן ספציפי, ROIs שונים נראה להראות מחזוריות כמעט קבוע של ריכוז סידן מגביר ( איור 7 ב ). שינויים אלה ריכוז סידן מוסקים להיות תוצאה של הפוטנציאל פעולה ספונטנית, הטבועה, איתות תא בתוך צבירה בודדים, ו / או איתות על פני אקסונים מן אגרגטים נפרדים. ניתוחים נוספים נדרשים כדי לאפיין באופן מלא את המאפיינים האלקטרופיזיים של נוירונים ושטחי axonal בתוך מיקרו- TENNs. אף על פי כן, תוצאות ראשוניות אלה מראות כי מיקרו-טנס מציגים פעילות חשמלית אנדוגנית / בסיסית.

איור 3
איור 3: Blueprints של לייזר לחתוך מיקרו-טור ייצור המכשיר ואת 3D מודפס פירמידה מיקרו עובש היטב עבור צבירה התא. ( א) - ( B ) Blueprint ותמונה של החצאים התחתונים והחלק העליון של מערך הערוץ הגלילי, בהתאמה, המשמשים לפברק את העמודים המיקרו-הידרוגליים. ( C ) Blueprint ותמונה של כובעים המשמשים להחזיק את המכשיר יחד. שני החלקים הקדמיים והאחרונים חולקים את אותם הממדים. ( ד ) תמונה של המכשיר התאספו נדרש לפברק את העמודים מיקרו. רק שתי כובעי ואת החצי התחתון הם הידק יחד עם ברגים בשני חורים יישור התחתון (משמאל). הקווים שבורים להראות את המיקום של מחטים אקופונקטורה דרך חמש חורים על כל כובע. Agarose נוזלי מתווסף למחצית התחתונה של צילינדרים, ולאחר מכן, את החצי העליון (מימין) ממוקם על המכשיר כדי לעצב agarose נוזלי לצורה. ( ה ) תכנית אב של תבניות 3D מודפס נעשה כדי להפוך PDMS מיקרו מערכי היטב. ( F ) תמונות של 3D מודפס עובש (משמאל) ואת PDMS מיקרו מערכים היטב (מימין). כל המאפיינים נמצאים במילי מטר (מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: תצפית של צמיחה axonal מיקרו- TENNS על ידי הדמיה בניגוד שלב של מבנים חד כיווניים דו כיווניים כפונקציה של ימים במבחנה . ( א ) חד כיווני 2 מ"מ ארוך מיקרו TENNs להראות שטחי axonal המשתרעת כמעט לכל אורכו של מיקרו עמודה על ידי 5 DIV. ( B ) לעומת מיקרו חד פעמי מיקרו, 2 כיווני מיקרו זעירים מיקרוסקופים להציג קצב צמיחה מהיר יותר axonal. ( C ) עבור 5 מ"מ חד כיווני מיקרו TENNs, שטחי axonal לאכלס את אורך המיקרו טור ב 5 DIV. ארכיטקטורה זו נשמרת לפחות עד 10 DIV. סולם ברים = 200 מיקרומטר./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: Micro-TENN cytoarchitecture שנצפתה עם תמונות confocal של חד-כיווני immunolabeled ו חד כיווני מיקרו TENNs. תאים הוכתמו עבור גרעיני תאים (Hoechst, כחול) ו אקסונים (Tuj1, אדום). ( A ) שלב ניגודיות התמונה של 5 מ"מ דו כיוונית מיקרו TENN (28 DIV). שינויי קונפוקליות ( D ) - ( F ) ו- ( I ) - ( K ) של 5 מ"מ דו-כיוונית (28 DIV) ו- micro-TENN חד-כיווני (25 DIV), בהתאמה, מציגים גרעיני תאים שכותרתם ( D ), ( I ) ואת האקסונים ( E ), ( J ), כמו גם את שכבת ( F ), ( K ). סולם ברים: 500 מיקרומטר. תוספות ב ( א F ), ( K ) מתייחסים אל בניגוד לעומת ( B ) - ( C ) ו confocal ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) זום- ins של אגרגטים נוירונים ושברי axonal . התמונות מראות את האגרגטים המוגבלים לקצות המיקרו-טן, בעוד שהלומן מתוחם על-ידי חלקיקים אקוסליים מיושרים. סולם ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: הביטוי של סינפטין מראש סינפטי חלבון synapsin אני נציג דו כיווני מיקרו TENN. המבנה היה מוכתם עבור גרעיני תאים (Hoechst, כחול), אקסונים (Tuj1, אדום), ו מראש סינפטית boutons (synapsin אני, ירוק). ( א ) שלב קונטרAst תמונה של 2 מ"מ דו כיוונית מיקרו TENN ב 28 DIV. ( D ) - ( G ) שחזור קונפוקאל המציג את גרעיני התא ( D ), אקסונים ( E ), boutons מראש סינפטית ( F ), וכן שכבת ( G ) של שלושת הערוצים. תיבות להראות זום ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) של הניגודיות שלב תמונות כיסוי עבור אגרגטים עצביים, בהתאמה. סולם ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: פעילות איתות ספונטנית ב micro-TENN דו כיוונית שנצפתה באמצעות ביטוי של מחוון סידן מקודד גנטית. ( א ) Fluorescencמיקרוסקופ אלקטרוני אישר את הביטוי של כתב GCaMP, כפי שנצפה על ידי הקרינה ברחבי אגרגטים ואקסונים. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( B ) שינויים הקרינה הקשורים וריאציות ריכוז סידן נמדדו ללא גירוי חיצוני בכמה אזורים של עניין (ROIs) כפונקציה של זמן. עיגולים צבעוניים ממוספרים ב ( א ) לייעד ROIs אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8: תמונות שלב ניגודיות של מצבים נפוצים של כישלון במתודולוגיה מיקרו-טן. ( א ) מיובש לחלוטין / יבשים אגרוז מיקרו בעמודה כתוצאה של הסרת ו / או אידוי של DPBS בשלבים הראשונים של ייצור. סרגל קנה מידה = 5081; ( ב ) הידרוג'ל מיקרו עמוד עם לומן בטנה הקיר החיצוני של המבנה בשל היעדר יישור קונצנטריים של מחט דיקור עם צינור נימי. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( ג ) זרעו מיקרו- TENN עם שני אגרגטים הנוכחי 1 DIV. ( ד ) אחד האגרגטים נפל מאותו עמוד מיקרו כמו ( C ) ב 3 DIV. ( E ) חד כיווני מיקרו TENN ב 4 DIV. ( F ) המצרפי ואת הצירים axonal נפל מן המיקרו טור ב ( E ) ונשאר צף במדיום התרבות ב 5 DIV. סולם בר עבור ( C ) - ( E ) = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פציעה ומחלה של מערכת העצבים המרכזית בדרך כלל גורמות לאובדן או לתפקוד לקוי של המסלולים האקסונליים למרחקים ארוכים שמרכיבים את המוח, עם או בלי התנוונות העצבית. זה מורכב על ידי יכולת מוגבלת של CNS לקדם neurogenesis והתחדשות. למרות המרדף אחר אסטרטגיות תיקון כגון גורם הגדילה, התא, ואת אספקת ביולוגי כמו גישות בודדות או קומבינטורית, טכניקות אלה נכשלים בו זמנית חשבון הן התנוונות של תאים עצביים ואובדן חיבורים axonal 14 , 22 . פערים אלה בטכנולוגיה מגבילים את היכולת לתקן, לשנות ולחקור רשתות עצביות בצורה מבוקרת ומתמשכת. בהתאם לכך, הטכנולוגיה מיקרו- TENN פותחה כדי לענות על הצורך באסטרטגיה לתיקון העצבים, בניגוד לשיטות הקיימות, מקל הן החלפת נוירונים השחזור של קשרים ארוכים axonal. מיקרופוןRo-TENNs הם להשתלות פיגומים חיים עם cytoarchitecture preformed כי גישות אבני הבניין ברמת המערכות של connectome המוח שתוכננו במיוחד עבור שחזור ממוקד, החלפת, ושינויים של מעגלים עצביים המארח. אלה פיגומים מורכבים של אוכלוסייה נפרדת (s) של נוירונים מחוברים על ידי שטחי axonal ארוכים בתוך לומן המכיל ECM של הידרוג גלילי מיניאטורי גלילי. מבנים אלה עשויים להיות מסוגלים לתפקד כממסר סינפטי להחליף מסלולים אבוד דינמי מווסת מעגלים ילידים. בנוסף, במקרים של ניוון אקסונלי בודד (עם נוירונים המקור נשאר שלם), מיקרו- TENNs עשוי לשמש מדריכים עבור התחדשות axonal מבוסס על מנגנון של התחדשות האקסון הקלה על האקסון. כתב היד הזה הציג את פרוטוקול ייצור כדי ליצור באופן אמין micro-TENNs, עם גיאומטריה מבוקרת, פנוטיפ, ומאפיינים פונקציונליים. שלב מיקרוסקופיה בניגוד, immunocytochemiStry, מיקרוסקופיה confocal הוכיח כי מיקרו TENNs המיוצר עם פרוטוקול התערוכה cytoarchitecture הנדרשת להביע את הסינפלקס מראש סינפטי חלבון סינפלקס. יתר על כן, הוכח כי micro-TENN יש פעילות איתות פנימי, אולי בשל הפוטנציאל פעולה, בהעדר סימולציה חיצונית. זה היה ידוע על ידי נוכחות של תנודות כמעט סינכרוני הקרינה הקשורים כתב סידן מקודד גנטית.

Micro-TENN פיתוח ניתן לסכם על ידי שלושה שלבים: (1) ייצור של צינור הידרוג חלול, (2) תוספת של פתרון ECM ל לומן של הצינור, ו (3) זריעת אגרגטים של נוירונים מבודדים לתוך קצות הצינור. מיקרו-עמודות יכול להיות מפוברק עם צינורות נימי זכוכית או עם מכשיר מפוברק מיקרו המכיל ערוצים גלילי. מכשיר זה ניתן ליצור עם כל דיוק גבוהה מיקרו בדיה שיטה זמינה לחוקר. נוזלAgarose הוא שפך לתוך הערוצים של המכשיר או לתוך צינורות נימי המכיל מחט אקופונקטורה מרוכז כדי ליצור את העמודים מיקרו הידרוג. לאחר agarose gelation, מחט אקופונקטורה מוסר לייצר את לומן חלול. מספר מכשולים נפוצים המתרחשים במהלך ייצור או צמיחה מודגשים באיור 8 . שים לב שחלק מהתמונות המוצגות באיור 4 ובמקרה קיצוני באיור 8 ב מציגות את החלק הלומינלי קרוב באופן הדוק לקיר הגליל. על מנת לייצר עובי דופן אפילו בעת שימוש בשיטה צינור נימי, הרכבה מחט צינור צריך להיות זקוף כאשר לשים במגע עם agarose, ואת המחט צריך להישמר במרכז הצינור. שמירה על הרכבת מחט צינור בזווית יחסית למשטח agarose מקדם ביזור של המחט. אף על פי כן, קשה לנקוט באמצעי הזהירות הללו, והמחט לעיתים קרובות יותר אינה נחה על אלוןאת הקירות של צינורות נימי. להיפך, הנכס העיקרי של המכשיר מפוברק מיקרו הוא כי הוא כולל חורים מחט מיושרים באופן קריטי עם ערוצי גלילי, קידום ריכוזיות נאותה של המחט ואת לומן יחסית לערוץ מיקרו טור, בהתאמה. בנוסף, המכשיר מגדיל את התפוקה על ידי להקל על ייצור של מספר מיקרו עמודות באותו זמן. למרות היתרון הניתן על ידי המכשיר, מחוץ לומן lumens עדיין ניתן ליצור באמצעות מחטים אקופונקטורה כפוף. טכניקות Micro-fabrication יש גם סובלנות הטמון המגביל את האפקטיביות שלהם. באופן כללי, התייבשות מיקרו טור, אשר במקרה קיצוני מוצג בתרשים 8A , לא צריך להיות מכשול אם ההמלצות הניתנים לאורך הפרוטוקול הם אחריו. שים לב כי התכונות הפיזיות של agarose המשמש עבור encasement החיצוני עשוי להזדקק אופטימיזציה עבור תת סוגים עצביים חלופיים, כמו משופרת נוירונים של קליפת המוח(4% -4%) לעומת ריכוז נמוך יותר (1-2%).

Micro-TENN פיתוח נמשך עם כניסתה של ECM לתוך לומן מיקרו טור, אשר משמש כדי לספק סביבה נאותה עבור הדבקה נוירונים, הישרדות, ותולדה. בנוסף, ECM, בשילוב עם ההגבלה הגיאומטרית נקבוביות נמוכה המסופקים על ידי hydroel agarose, מגבילה צמיחה axonal לכיוון האורך כדי לייצר את הארכיטקטורה הנדרשת. התוכן של הפתרון ECM יכול להיות מותאם עבור סוג של נוירון בשימוש. לדוגמה, קולגן לבד מקדם הישרדות ו אקסונלי תולדה ב DRG מיקרו- TENNs, ואילו שילוב של קולגן laminin נדרש נוירונים בקליפת המוח 10 . יתר על כן, פילמור ECM בתוך מיקרו טור הוא קריטי לפני ציפוי התא, כמו שיתוף משלוח של תאים עם ECM לא מנופח מוביל לירידה neurite outgrאוד ופסיכולוגיה 31 . שים לב כי למרות מיקרו עמודה מילא בתחילה עם פתרון ECM, התוכן שלה לפלמר לתוך ג'ל רך נוטים החוזה במהלך תקופת הדגירה, יצירת מרחב המאפשר את ההכנסה של אגרגטים התא. בנוסף, חשוב לוודא כי ECM נכנסו פנים מיקרו עמוד על ידי בדיקה תחת stereoscope; היעדר מוחלט ו / או כיסים של חסר ECM תוצאות חוסר מחסור axonal מן אגרגטים. ייצור מיקרו-טן מסתיים בזריעת נוירונים בקליפת המוח בקצוות הפיגום. נוירונים אלה גוזרו מעוברים חולדה באמצעות נהלים ידועים 48 . ניתן להסיק כי רוב התאים מבודדים נוירונים כי קליפת עכברוש עובריים בזמן ההריון המשמש לבידוד מורכב של 99% נוירונים, ואת המדיום התרבות מוגדר בשימוש בפרוטוקול הוא מגביל מטבולית עבור התפשטות גלייה 49 . כתוצאה מכך, לא צריך להיות זיהום glial מינימלי, אם כי מכתים עבור סמנים ספציפיים נדרש לאישור. בעוד שכתב היד הזה הציג יצור מיקרו-טן עם נוירונים בקליפת המוח, נוירונים מאזורי מוח שונים ( למשל, nigral, thalamic, and hippocampal) או עם פנוטיפים שונים ( למשל, מרגש, מעכבי, ודופאמינרגי) יכול להיות מנוצל על פי היישום הרצוי שטח ההשתלה. הקודם איטרציות של מיקרו-TENN פרוטוקול ייצור מעורב זריעת תאים ניתק 10 , 31 , 32 . למרות cytoarchitecture הרצוי הושג באמצעות שיטה ניתק, זה לא היה מושג בכל המקרים. במקרים רבים, תאים מנותקים הציפו את הפנים והובילו למספר אשכולות של תאי הגוף לאורך הלומן, עם תהליכים המחברים אותם לרשת תלת-ממדית נרחבת, 10 , 31. השיטה המצטברת, לעומת זאת, מבטיחה את ההכללה של גופי התא לקיצוניות, ולכן היא חלק בלתי נפרד מהצלחת טכנולוגיית המיקרו-טן ( איור 5 ). בתרשימים 4-6 היו מפוברקים עם אגרגטים גדולים שלא הוכנסו במלואם, והדבר עלול לגרום לאגרגטים ליפול מן המיקרו-עמודות בתרבות, כמו הדוגמאות שמופיעות בתרשים 8D ו- 8 E. כדי למנוע זאת, להיות מוכנס לחלוטין בתוך פנים עמודה מיקרו.אם מצב זה מציג את עצמו גם לאחר יישום האסטרטגיה הקודמת, תקופת הדגירה הראשונית ניתן להרחיב על מנת לספק מספיק זמן הדבקה מצטבר על ECM במהלך התרבות, טיפול עדין של מיקרו- TENNs הוא מומלץ לשמור על שלמות של hydrogel encasement ואת cytoarchitecture, בעיות במהלך מיקרו-Tמניפולציה ENN הם הגורם של העקמומיות המתקבלות במסלולים אקסונלי אחרת מיושר ( איור 5 ). עם זאת, בעקבות הפרוטוקול המוצג במאמר זה צריך לגרום ייצור עקבית של מיקרו- TENNs עם הארכיטקטורה העצבית / הצפונית הצפויה, הפצה bouton מראש סינפטי, ופעילות חשמל פנימי.

למרות ההבטחה כי מיקרו- TENN להחזיק, ישנם אתגרים שנותרו להגביל את היישומים של טכנולוגיה זו. הטכניקה הנוכחית מיקרו ייצור עמודה מוגבלת על ידי ביזור של לומן מיקרו טור, אשר עלול לגרום להצגה עקבית של רמזים מכניים לתאים ( למשל, נוקשות), קרע של קיר העמודה מיקרו החשיפה שלאחר מכן של שטחי axonal אל החוץ, ובעיות במהלך ההשתלה. למרות השימוש במכשיר מיקרו מפוברק שיפרה את התוצאה בהשוואה צינורות נימי, דיוק גבוהה מיקרו בדיוN טכניקות נדרשים כדי להגדיל את reproducibility ממדי של מבנים אלה. התוצאות בכתב היד הזה הראו כי מתודולוגיית המיקרו-טן יכולה לייצר באופן אמין פיגומים חיים המורכבים מנוירונים ומערכות אקסונאליות הדומות לנוירונטומיה ילידית, במיוחד באזורי האקסון המחברים בין אזורי מוח שונים. עם זאת, אורך מיקרו-TENN הוא משוכה, בהתאם לאורך של המסלול axonal המארח כי צריך להחליף. לדוגמה, רקמה מהונדסים עצבים מהונדסים (TENGs) הם אסטרטגיה נפרדת פיגום המגורים בשימוש על ידי קבוצת המחקר שלנו לתקן פציעות עצבים ארוכים מאוד. כדי להחליף אלה פערים ארוכים, האקסונים ב TENGs ניתן להאריך עד עשרות סנטימטרים על ידי הפעלת מתח מכני מתמשך מותאמים אישית מכאו bioreactors 1 , 23 , 50 . זו "צמיחה למתוח" טכניקה יש גם הוחל לתפעל אורך התהליך astrocytic כדי betteR לחקות את המבנה של מסלולי גלייה רדיאלי 51 . להיפך, הטכנולוגיה הנוכחית מיקרו- TENN עדיין לא מציעים מידה זו של שליטה; אורך מקסימלי שניתן להשיג כעת מוגבל על ידי כמה זמן את הצורות axonal יכול לגדול במבחנה מבוסס על הרחבה מסורתית קונוס בתיווך הרחבה. יתר על כן, למרות CNS יש יכולת מהותי עבור rewiring נוירופיזיולוגיים בתגובה לגירויים שונים, תאים מושתלים יש את היכולת של שילוב סינפטי עם מעגל הילידים, מגבלה נוספת של הטכנולוגיה הזו היא כי מיקרו- TENNs להסתמך על גמישות של המוח הילידים ואת היכולת של רשתות מארח לשלב פונקציונלית להשתלב עם לבנות מושתלים 52 , 53 , 54 , 55 . לבסוף, מחסור מולד בכל הגישות מבוססות השתל, כגון מיקרו-טנס, הוא הפולשנות שלהם. מאז נוירונים הםבדרך כלל בסמיכות נימים, כל סוג של הליך כירורגי יכול לגרום הפרעה במחסום הדם במוח, דליפה של גורמי דם לתוך parenchyma המוח, ותגובה חריפה (ואף כרונית) דלקתית 31 . תגובה זו עלולה להזיק נוירונים המארח מיקרו TENN, שולל את ההיבטים המועילים של טכניקה זו. עם זאת, Micro-TENNs מושתל לתוך מסלול corticothalamic של חולדה שרדו לפחות 1 חודש הראו עדויות של אינטגרציה מבנית עם קליפת המוח המארחת 10 , 31 . יתר על כן, פרסום קודם של קבוצת המחקר שלנו הציג מתודולוגיה המאפשרת להשתיל פחות מחט של מיקרו- TENN למוח חולדה 31 . בגישה זו, אסטרטגיה זו hydrogel encasement היה augmented לכלול דק (~ 20 מיקרומטר) ציפוי של carboxymethylcellulose, אשר, על התייבשות קלה, הציג נוקשות מספיק כדי לחדוראת המוח ללא צורך מחט או מדריך 31 . שיטה זו פחות מחטים השתלה, יחד עם חתך קטן של מיקרו עמודות, צריך למזער נזק למוח במהלך ואחרי ההליך השתלת stereotaxic.

למרות ההצלחה הראשונית של מיקרו- TENNs in vivo , מחקרים עתידיים יצטרכו לאשר כי מבנים אלה משתלבים באופן סינפטי עם רקמות יליד כדי לחקור אם ההתאוששות הפונקציונלית מתקבל במודלים של פציעה CNS ומחלות ניווניות 10 , 31 . לדוגמה, מותאמות מיקרו TENNs עשוי להיות מתוכנן עם פנוטיפים התא ספציפיים מושתלים לתוך המסלול מנוון המקביל לשחזר את הרשת ולשחזר את הפונקציה. כדי להקטין את התגובה הדלקתית החריפה לאחר ההשתלה, הקליפה של מיקרו-טן הידרוג'ל עשויה להיות מסוממת עם חומרים אנטי-דלקתיים ופרו-הישרדות. ייצור חלופיטכניקות ( למשל, הדפסה 3D) ניתן לפתח כדי ליצור את הידרוגר מיקרו עמודות בקלות רבה יותר עם תכונות מדויקות יותר, כולל ריכוזיות עקבית של לומן ו reproducibility של הממדים. אותה תוכנית ביומטרי המועסקים עם מיקרו TENNs עשוי להיות שונה כדי להתמודד עם פתולוגיות אופייניות אחרות של פציעה CNS ומחלה. לדוגמה, הקבוצה שלנו פיתחה בעבר מבנים המורכבים longitudinally מיושר חבילות astrocytic לאורך לומן מצופה קולגן של hydroel agarose כי מבנית לחקות מסלולי גלייה רדיאליים צינור גליה כדי להקל על התחדשות axonal והמעבר נוירונים 56 . בנוסף, תאי גזע, כגון תאי גזע עובריים אנושיים (HESCs), תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) ותאי גזע שמקורם בשומן (ASC) עשויים להיות משולבים כדי לפברק מיקרו-טנולוגים אוטולוגיים על בסיס מטופל ליותר דומים מאוד אבודים cytoarchitecture ו פנוטיפ התא. אלה futuשינויים מחדש יגדיל את היכולת של מיקרו- TENNs להחליף נתיבים מנוונים in vivo ויאפשר שחזור של ארכיטקטורות רקמות מתוחכמות יותר, המשלבים תמיכה astroglial ו myonination axonal, בין שאר התכונות. נוירונים מהונדסים גנטית יכול להיות גם seeded או להגדיל את פעולת משובי של מיקרו- TENNs באמצעות שחרור של גורמים trophic או לאפשר אפנון של CNS על ידי גירוי optogenetic של ערוצי יון אור מגודרת 43 . פיגומים אלה יכול להיות מפוברק עם נוירונים מעוררים או מעכבים כדי לסנפטציה מסונכרנים הקיימים חיבורים המארח הקיים בתנאים כגון אפילפסיה, דיכאון, התמכרות לסמים, או הפרעות כאב 1 . לדוגמה, Micro-TENNs המרכיבים בעיקר GABAergic או glutamatergic סינפסות עשוי להיות בנוי לדכא או לעורר, בהתאמה, למעלה או דה- regulated מסלולים באמצעות אינטגרציה סינפטי ו / או על ידי עצב בתפזורתשחרור. חשוב לציין, מבנים מבודדים עצמאיים כאלה יגיבו באופן תיאורטי על סמך משוב של רשת מארח 1 . באופן דומה, מיקרו- TENNs יכול להיות מיושם כמו ממשקי מחשב-מוח (BCI), עם מיקרו-TENN מהונדס optogenetically המשרתים ביניים בין המוח ו התקנים אורגניים מגרה או הקלטה. יישום זה יכול להיות חלופה BCIs microelectrode, אשר היעדר מיקוד תא ספציפי ויציבות מכנית גרמו תגובות דלקתיות, היווצרות צלקת גלייה, הגירה נוירונים או הפסד כאשר חדרו לתוך המוח 57 , 58 .

כמו במבחנה במבחנה , Micro-TENNs יכול לספק פלטפורמה חזקה עבור המחקר של נוירוביולוגיה electrophysiology, המשרתים מודלים biofidelic של מערכת העצבים. בנוסף, 3D בונה יכול לשמש מיטות בדיקה לאסטרטגיות טיפול כאשר נעשה שימוש פציעה עצביתמודלים ומודל מחלות 59 . כמו 3D בונה, מיקרו- TENNs מסוגלים לדמות את הסביבה in vivo , אשר מאופיין תא תאים מורכבים תא ECM אינטראקציות בכל הכיוונים המרחביים כי לא ניתן לייצג במדויק בתרבויות מישוריים 42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 . ואכן, חקירות רבות קבעו כי סוג הסביבה הוא קריטי עבור תאים להציג את המורפולוגיה, התפשטות, הגירה, ביטוי גנים, בידול, איתות שהוצג בסביבה יליד 60 . קווי הדמיון בין סביבת 3D של פיגומים אלה לבין המוח עצמו משלימים את מידת השליטה כי מבנים אלה מציעים מעל פיזית שלהם ביוכימי PRאופקים 42 . זה מאפשר את ההנדסה של מיקרו- TENNs עם קבוצות שונות של אותות מכניים, haptotaxic, ו chemotaxic כדי לחקור את ההשפעה של רמזים אלה, בנפרד או סינרגיסטי, על הישרדות העצבית, התבגרות, הרחבה axonal, synaptogenesis, ו mechanotransduction 32 , 42 , 63 . יתר על כן, גמישות העיצוב של טכניקה זו הנדסת מיקרו רקמות מאפשר בנייה של פיגומים חיים המחקים תכונות אחרות של רקמת המוח, כגון עמודה, מבנה של ספקטרום neocortex, המורחבת על ידי axonal שטחים של connectome, כדי להגדיל עוד יותר את כוח של מערכת זו כמו פלטפורמה במבחנה ללמוד את המוח 65 . כמו פלטפורמות חקירה, מיקרו- TENNs לנצל את הגדרת מבוקר של מודלים אופייניים במבחנה , זמינות רחב של פרמטרים עיצוב ב רקמות enגישות גנינג, והגדילה את הרלוונטיות הפיזיולוגית-פאתופיסיולוגית של פלטפורמות תלת-ממד כדי להפוך למבחן אידיאלי לבדיקת ידע נוירוביולוגי. מספר עצום של כיוונים עתידיים עבור טכנולוגיה זו מתמצת את הרבגוניות של מיקרו- TENNs. כתב היד הזה הוכיח כי פרוטוקול המיקרו-טן יכול לייצר באופן אמין מהימן פיגומים חיים מהונדסים, המחקים תכונות מכריעות של נוירואנטומיה במוח כדי לספק תובנות חדשות לתופעות נוירוביולוגיות, כולל תהליכי פיתוח, מחלות ותיקון. מבנים אלה עשויים גם לשלב באופן סינפטי עם רקמה מקומית לשחזר מחדש את החלקיקים פגום החומר הלבן, להחליף תאים עצביים איבדו, ו לווסת מסלולים dysregulated בעקבות הפציעה CNS ומחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

תמיכה כספית סופקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (האריס) ו- F31-NS090746 (Katiyar), קרן מייקל ג'יי. פוקס (תוכנית טיפולית מס '9998, Cullen) (Cullen), הקרן הלאומית למדע (DBA-1321851), המחלקה לענייני יוצאי צבא (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), האגודה האמריקאית של המנתחים הנוירולוגים והקונגרס של המנתחים הנוירולוגים (מלגה 2015) בקודמן (Neurotrauma and Care Care) (פטרוב)), והמחקר הרפואי של צבא ארצות הברית ומפקדת המטריאל (# W81XWH-13-207004 (Cullen) ו- W81XWH-15-1- 0466 (קאלן)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16, (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67, (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27, (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31, (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48, (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21, (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26, (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11, (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6, (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106, (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6, (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11, (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3, (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20, (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3, (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14, (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23, (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116, (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24, (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80, (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25, (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44, (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5, (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics