Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

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Summary

Este manuscrito detalha a fabricação de redes neurais manipuladas com micro-tecidos: construções tridimensionais de tamanho micrométrico, constituídas por longos trilhos axonais alinhados que abrangem a (s) população (s) neuronal agregada (s) envolvida (s) em um hidrogel tubular. Esses andaimes vivos podem servir como relés funcionais para reconstruir ou modular circuitos neurais ou como bancas biofidais que imitam a neuroanatomia de matéria cinza-branca.

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Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

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Abstract

A recuperação funcional raramente ocorre após uma lesão ou degeneração induzida por doença no sistema nervoso central (SNC) devido ao ambiente inibitório e à capacidade limitada de neurogênese. Estamos desenvolvendo uma estratégia para abordar simultaneamente a perda de via neuronal e axonal no SNC danificado. Este manuscrito apresenta o protocolo de fabricação de redes neurais modificadas com micro-tecidos (micro-TENNs), construções implantáveis ​​constituídas por neurônios e traços axonais alinhados que abrangem o lúmen da matriz extracelular (ECM) de um cilindro de hidrogel pré-formado com centenas de microns de diâmetro que podem se estender centimetros em comprimento. Os agregados neuronais são delimitados aos extremos do encasamento tridimensional e são abrangidos por projeções axonais. Os MicroTENNs são unicamente posicionados como uma estratégia para a reconstrução do SNC, emulando aspectos da citoarquitetura de conexão do cérebro e potencialmente fornecendo meios para a substituição da rede. O neuOs agregados ronais podem sinapse com o tecido hospedeiro para formar novos relés funcionais para restaurar e / ou modular circuitos faltantes ou danificados. Essas construções também podem atuar como "andaimes vivos" pró-regenerativos capazes de explorar mecanismos de desenvolvimento para a migração celular e a localização do axonal, fornecendo pistas sinergísticas estruturais e solúveis com base no estado de regeneração. Micro-TENNs são fabricados por vazamento de hidrogel líquido em um molde cilíndrico contendo uma agulha centrada longitudinalmente. Uma vez que o hidrogel tenha gelado, a agulha é removida, deixando uma micro-coluna oca. Uma solução ECM é adicionada ao lúmen para fornecer um ambiente adequado para adesão neuronal e crescimento axonal. Os neurônios dissociados são agregados mecanicamente para semeadura precisa dentro de uma ou ambas as extremidades da micro-coluna. Esta metodologia produz de forma confiável construções em miniatura autônomas com traços axonais de longa projeção que podem recapitular características da neuroanatomia cerebral. Synaptic immIndicadores de cálcio não genéricos e codificados genômicamente sugerem que micro-TENNs possuem ampla distribuição sináptica e atividade elétrica intrínseca. Conseqüentemente, os microTENNs representam uma estratégia promissora para a reconstrução neurocirúrgica direta de caminhos cerebrais e também podem ser aplicados como modelos biofidelicos para estudar fenômenos neurobiológicos in vitro .

Introduction

Uma característica comum de distúrbios e doenças do sistema nervoso central (SNC), como lesão cerebral traumática (TCE), lesão da medula espinhal (AVC), acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer e doença de Parkinson é a desconexão das vias axonais e células neuronais Perda 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Por exemplo, quando um acidente vascular cerebral isquêmico não é tratado, estima-se que os axônios sejam perdidos a uma taxa de 7 milhas de axônios por minuto 5 . No caso do TBI, que aproximadamente 1,7 milhões de pessoas experimentam anualmente apenas nos EUA, a degeneração axonal pode continuar a ocorrer anos após o trauma, já que a lesão inicial precipita um estado neurodegenerativo de longo prazo 4 . Agravando esses efeitos deletérios, o SNC tem uma capa severamente limitadaCidade para regeneração 1 , 7 , 8 , 9 . Após a lesão, desenvolve-se um ambiente inibidor caracterizado pela falta de orientação dirigida para alvos distantes, a presença de inibidores associados à mielina que impedem a proliferação de neurites e a formação de uma cicatriz glial por astrocitos reativos 8 , 10 , 11 , 12 . A cicatriz glial serve como uma barreira bioquímica e física à regeneração, com moléculas como os proteoglicanos de sulfato de condroitina que obstruem o crescimento do axônio 8 , 11 . Além disso, mesmo que as células estaminais neurais tenham sido encontradas no SNC adulto, a produção de novos neurônios é limitada, uma vez que evidências consistentes de neurogênese só foram encontradas no bulbo olfativo, no hipocampoZona subgranular, área periventricular e canal central da medula espinhal 13 , 14 . Esses obstáculos impedem a recuperação funcional de neurônios perdidos e arquitetura de matéria branca após lesão ou doença, resultando em efeitos que muitas vezes mudam a vida e prolongam essas condições.

Apesar da falta de capacidade regenerativa no SNC adulto, demonstrou-se que a regeneração axonal é possível se houver sugestões ambientais adequadas para os neurônios hospedeiros 15 , 16 , 17 , 18 . Os pesquisadores tentaram entregar e manipular fatores de crescimento ( por exemplo, fator de crescimento nervoso, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento dependente da glia e fator neurotrófico 3) e outras moléculas de orientação para estimular a plasticidade e a regeneração do axônio 14 , </ Sup> 18 , 19 . Embora esses estudos tenham confirmado que os axônios adultos são capazes de responder a fatores de crescimento, essas estratégias são limitadas pela baixa permeabilidade da barreira hematoencefálica e pelos gradientes espaciais e temporais específicos necessários para promover a regeneração 14 , 18 , 19 . Outras abordagens basearam-se na hiperativação de fatores de transcrição relacionados à regeneração em neurônios do SNC. Por exemplo, a sobre-expressão do fator de transcrição Stat3 estimulou a regeneração axonal no nervo óptico 20 . No entanto, tanto a administração de biomoléculas como a sobreexpressão de fatores de transcrição não conseguem substituir as populações neuronais perdidas. As estratégias baseadas em células centraram-se principalmente no transplante de células-tronco neurais (NSCs) para o SNC, aproveitando sua capacidade para substituir os neurônios do SNC, liberar fatores tróficos,E apoiam as tentativas de neurogênese que ocorrem após a lesão 17 . Apesar disso, ainda há desafios urgentes que impedem essa abordagem, incluindo a habilidade dificultada das células neurais transplantadas para sobreviver, integrar-se ao hospedeiro e permanecer restrita espacialmente à área lesada 6 , 14 , 17 , 21 . Além disso, a administração de células sozinha é incapaz de restabelecer a citoarquitetura de percursos axonais danificados ou perdidos. Uma abordagem alternativa que aborda os problemas que enfrentam as estratégias de entrega de células e drogas / químicas é combinar essas abordagens com o uso de biomateriais 14 , 22 , 23 . Os biomateriais, como os hidrogéis, são capazes de emular as propriedades bioquímicas e físicas da matriz extracelular (ECM), auxiliando na administração celular eRetenção dentro da área lesada e fornecimento de fatores de crescimento e outras moléculas bioativas com liberação controlada 22 . As características atraentes dessas estratégias baseadas em biomateriais resultaram em evidências de regeneração axonal in vivo após o transplante de andaimes para a área lesada 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . No entanto, as estratégias biomateriais acelulares não substituem as populações neuronais perdidas; Quando utilizados como veículos de entrega para células precursoras neuronais, gliais ou neuronais, os biomateriais são incapazes de reconstituir redes axonais de longa distância. O desafio de desenvolver uma abordagem que aborda a degeneração da via axonal e a perda neuronal associada à lesão e à doença do SNC ainda permanecem <Sup class = "xref"> 31.

Nosso grupo de pesquisa relatou anteriormente o desenvolvimento de redes neurais implantáveis ​​de micro-tecido (micro-TENNs), que são um tipo de "andaime vivo" que consiste de corpos celulares neuronais restritos a uma ou ambas as extremidades de uma micro coluna de hidrogel-ECM de agarose , Com traços axonais alinhados que se estendem por todo o interior deste encasamento tridimensional (3D) 1 , 10 , 31 , 32 . Uma das principais diferenças entre essa técnica e as abordagens anteriores é que a citocantação de microTENNs é criada completamente in vitro e é transplantada posteriormente 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , <Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . A fabricação in vitro oferece um extenso controle espacial e temporal do fenótipo e orientação celular, propriedades mecânicas / físicas, sugestões bioquímicas e fatores exógenos, o que beneficia a integração desses andaimes com o hospedeiro após a implantação 41 , 42 . Micro-TENNs são anatomicamente inspirados porque imitam a neuroanatomia do cérebro, exibindo traços axonais semelhantes aos que fazem a ponte entre as distintas regiões funcionais do cérebro ( Figura 1A ) 1 . Portanto, esta estratégia pode ser capaz de substituir fisicamente os tratos de matéria branca perdidos e os neurônios após a implantação em uma região lesionada. Esta técnica também é inspirada por mecanismos de desenvolvimento em que "andaimes vivos naturais" formados por células gliais radiais e axônios pioneiros atuam como guias de encaminhamento para célulasMigração da zona subventricular e crescimento axonal, respectivamente 43 . Esses mecanismos são recapitulados nos tratos axonais alinhados dos microTENNs, que podem apresentar vias vivas para a migração de células neurais e regeneração axonal por crescimento axonal mediado por axônio ( Figura 1C ) 43 . Além disso, esta estratégia aproveita a integração sináptica entre os neurônios micro-TENN e os circuitos nativos, formando novos relés que podem contribuir para a recuperação funcional ( Figura 1B ) 43 . A capacidade de formação de sinapse também pode conceder a essa abordagem a capacidade de modular o SNC e responder ao tecido do hospedeiro de acordo com o feedback da rede. Por exemplo, neurônios optogeneticamente ativos nos andaimes vivos podem ser estimulados para modular os neurônios do hospedeiro através de interações sinápticas ( Figura 1D ).

Além disso, a construção tubular baseada em biomateriaisA criação de microTENNs oferece um ambiente adequado para adesão celular, crescimento, extensão de neurite e sinalização, enquanto as dimensões em miniatura das construções potencialmente permitem implantação minimamente invasiva e fornecem um microambiente parcialmente seqüestrado para integração gradual no cérebro. Na verdade, publicações recentes demonstraram o potencial dos micro-TENNs para imitar os caminhos neurais após a implantação no cérebro do rato. Após microinjeção estereotáxica, anteriormente relatamos evidências de sobrevivência neuronal micro-TENN, manutenção da arquitetura do traço axonal e extensão de neurite no córtex do hospedeiro até pelo menos 1 mês in vivo 10 , 31 . Além disso, a rotulagem com sinapsina forneceu evidência histológica de integração sináptica com tecido nativo 10 , 31 . Em geral, os microTENNs podem ser unicamente adequados para reconstruir e modularCNS, substituindo os neurônios perdidos, integrando sinapticamente os circuitos do host, restaurando a citoarquitetura axonal perdida e, em certos casos, fornecendo axônios regeneradores com os sinais de detecção de caminho adequados.

figura 1
Figura 1: Princípios e inspiração por trás do desenvolvimento de redes neurais modificadas por micro-tecidos (micro-TENNs). ( A ) Micro-TENNs imitam a citoarquitetura do cérebro connectome (roxo), em que regiões funcionalmente distintas são conectadas por trilhos axonais longos e alinhados de maneira unidirecional (vermelha, verde) ou bidirecional (azul). Por exemplo, os microTENNs poderiam reconstituir conexões perdidas nas vias corticotalâmicas e nigrostriatais ou na via perfurante do córtex entorrinal ao hipocampo (adaptado de Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagrama de uma unidirectionaL e micro-TENN bidirecional (vermelho e azul, respectivamente) integrando sinapticamente com o circuito do host (roxo) para servir como um relé funcional entre as duas extremidades de uma lesão. ( C ) Esquema dos traços axonais de um micro-TENN (verde) unidirecional que serve como guia para a regeneração facilitada por axônio de axônios hospedeiros (roxo) em direção a um alvo com o qual o micro-TENN interage. ( D ) Diagrama conceitual do uso de microTENNS ativos optogeneticamente como neuromoduladores, aproveitando a integração sináptica com neurônios excitatórios ou inibitórios (parte inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O manuscrito atual detalha a metodologia utilizada para fabricar micro-TENNs utilizando neurônios corticais cerebrais derivados de embriões. Notavelmente, os microTENNs podem ser fabricados com outros tipos de células neurais. Por exAmplo, os relatórios iniciais de desenvolvimento micro-TENN bem-sucedido apresentaram neurônios de gânglios de raízes dorsais (DRG) 32 . As microcolunas de hidrogel podem ser geradas ( Figura 2A ) pela adição de agarose líquida a uma disposição de canais cilíndricos personalizados ou cortados a laser ou a tubos capilares, ambos contendo agulhas de acupuntura alinhadas. A agulha forma o lúmen e determina o diâmetro interno (ID) da micro-coluna, enquanto a identificação do tubo capilar e o diâmetro dos cilindros no dispositivo de corte a laser determinam o diâmetro externo (OD) das construções. O OD e ID podem ser escolhidos de acordo com a aplicação desejada selecionando diâmetros diferentes para o dispositivo / tubos capilares e as agulhas de acupuntura, respectivamente. O comprimento das micro colunas também pode ser variado; Até à data, relatamos a construção de microTENNs de até 20 mm de comprimento 10 e seguimos ativamente até longos períodos. Após os géis de agarose e a acupuntura nOs eedles são removidos, uma solução ECM geralmente consistindo em colágeno tipo I e laminina é adicionada ao lúmen das construções ( Figura 2C ). O núcleo ECM fornece um andaime para suportar a adesão celular neuronal e a expansão axonal. Inicialmente, os neurônios corticais de ratos primários foram plaqueados nas micro-colunas usando suspensões de células dissociadas 10 , 31 , 32 . No entanto, essa abordagem não produziu a citoarquitetura alvo em todos os casos, que foi definida como os corpos celulares neuronais restritos às extremidades das micro colunas, com a luz central composta por trilhos axonais alinhados. Desde então, o uso de um método de agregação neuronal forçada (com base em protocolos adaptados de Ungrin et al .) Permitiu uma fabricação mais confiável e consistente de microTENNs com a estrutura ideal ( Figura 2B ) 44 . Além de descrever o atualMetodologia, este artigo mostrará imagens representativas de contraste de fase e confocal de microTENNs que demonstram a formação de trilhos axonais ao longo do tempo, bem como a cito-arquitetura de destino finalizada. Este manuscrito também expandirá os aspectos notáveis ​​do protocolo e os demais desafios e direções futuras da tecnologia micro-TENN.

Figura 2
Figura 2: Diagrama esquemático do processo de fabricação de três estágios micro-TENN. ( A ) Desenvolvimento do hidrogel de agarose: (i) Inicialmente, uma pequena agulha de acupuntura ( por exemplo , 180-350 μm de diâmetro) é inserida nos canais cilíndricos de um molde personalizado por corte a laser ou um tubo capilar ( por exemplo, , 380-700 um de diâmetro). No passo seguinte, a agarose líquida em DPBS é introduzida nos canais cilíndricos ou nos tubos capilares. (Ii) Após os géis de agarose, a agulha é removida eO molde é desmontado para produzir as microcolunas de agarose vazias. (Iii) Essas construções são então esterilizadas e armazenadas em DPBS. ( B ) Cultura do neurônio primário e o método agregado: (i) A agregação neuronal é realizada em arrays de micro-poços piramidais, moldados a partir de moldes impressos em 3D, que se encaixam nos poços de uma placa de cultura de 12 poços. (Ii) Micro-TENNs incluem neurônios de ratos primários dissociados de cérebros fetais de ratos embrionários dia 18. Após a dissociação do tecido com tripsina-EDTA e DNase I, prepara-se uma solução celular com uma densidade de 1,0-2,0 x 10 6 células / mL. (Iii) 12 μL desta solução são transferidos para cada poço na matriz de micro-poços piramidais. A placa que contém esses micro-poços é centrifugada para produzir agregados celulares. (Iv) Estes são então incubados durante a noite antes do chapeamento nas micro colunas. ( C ) Fabricação de núcleos de ECM e semeadura de células: (i) Antes da semeadura de células, uma solução de ECM contendo 1 mg / mL de colágeno de tipo I e 1 mg / mLA laminina é transferida para o interior dos microTENNs e é permitida a polimerização. (Ii) Dependendo se os micro-TENNs unidireccionais ou bidireccionais estão sendo fabricados, um agregado é colocado em um ou ambos os extremos da micro-coluna, respectivamente. (Iii) Após um período de incubação para promover a adesão, os microTENNs são cultivados em placas de Petri inundadas com meio basal neuronal embrionário suplementado. (Iv) Após 3-5 dias em cultura, a estrutura micro-TENN final deve demonstrar agregados celulares nos extremos da micro-coluna, com traços axonais abrangendo seu comprimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais na Universidade da Pensilvânia e no Centro Médico de Assuntos de Veteranos de Michael J. Crescenz e aderiram às diretrizes estabelecidas na Política do Serviço de Saúde Pública do NIH sobre Cuidados Humanos e Uso do Laboratório Animais (2015).

1. Desenvolvimento do hidrogel de agarose (componente acelular dos micro-TENNs)

  1. Preparação da solução de agarose
    1. Dentro de um gabinete de biossegurança, prepare reservatórios para as micro colunas transferindo 20 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) para cada uma das duas placas de Petri de 10 cm. Esterilize pinças finas e microscalpels com um esterilizador de talão quente.
    2. Pesar 3 g de agarose e transferi-lo para uma taça estéril dentro do gabinete de biossegurança. Adicione 100 mL de DPBS para uma concentração final de 3% de peso / volume (p / v). Inclua uma barra magnética limpa e cubra o copo com alumíNum folha de papel.
    3. Com uma placa quente / agitador, aquecer o copo a 100 ° C e agitar a 120-200 rpm para dissolver completamente a agarose (a solução irá passar de turvo para desobstruído). Manter o aquecimento e agitação depois para evitar a gelificação e alterar a temperatura de aquecimento, conforme necessário, para evitar a queima de agarose.
      NOTA: A fabricação com o dispositivo de corte a laser e tubos capilares é apresentada abaixo nas sub-seções 1.2 e 1.3, respectivamente. Proceda à subsecção 1.4 depois de concluir as etapas descritas em qualquer sub-seção. Para ambos os métodos de fabricação de micro colunas, adicione rapidamente a agarose líquida, pois a agarose solidifica rapidamente à medida que esfria. Ao esterilizar com uma autoclave em qualquer uma das seguintes etapas, use as condições padrão aplicadas ao vidro.
  2. Preparação de micro colunas usando um dispositivo cortado a laser
    NOTA: O dispositivo de corte a laser é cortado a partir de acrílico transparente usando um cortador de laser CO 2 comercial. O fabriO catião de estruturas e dispositivos através do corte a laser está bem documentado para uma série de aplicações de engenharia e pesquisa 45 , 46 , 47 . Este molde ( Figura 3 ) consiste em uma série de cinco canais cilíndricos, cada um com um diâmetro de 398 μm e um comprimento de 6,35 mm. Estas matrizes cilíndricas são formadas ao longo do seu comprimento por duas peças: uma metade inferior (comprimento: 25,4 mm, largura: 6,35 mm, altura: 6,0 mm) e uma metade superior (comprimento: 31,5 mm, largura: 6,35 mm, altura: 12,7 mm ), Como mostrado nas Figuras 3A e 3B , respectivamente. As duas metades podem ser apertadas juntas pelas tampas anterior e posterior observadas na Figura 3C (comprimento: 31,5 mm, largura: 6,35 mm, altura: 12,7 mm), que apresentam quatro furos de alinhamento que coincidem com dois orifícios cada um na parte superior e inferior Peças e que ajudam a proteger todas as peças juntas quando ferradas. Estas tampas também incluemCinco buracos, concêntricos aos canais cilíndricos, nos quais as agulhas de acupuntura podem ser inseridas para formar o lúmen das micro colunas.
    1. Esterilize o dispositivo mostrado na Figura 3 cobrindo-o com papel alumínio e autoclave. Montar o dispositivo como mostrado na Figura 3D alinhando as tampas anterior e posterior com apenas a parte inferior da metade e segurando as três partes com dois parafusos e porcas # 4-40 (diâmetro da rosca: 3,05 mm) nos orifícios de alinhamento inferiores.
    2. Introduza completamente uma agulha de acupuntura (diâmetro: 180 μm, comprimento: 30 mm) nos orifícios da agulha na tampa anterior ou posterior do dispositivo ( Figura 3D ). Com uma micropipeta, despeje suficiente agarose líquido (~ 1 mL para os cinco canais) na metade inferior para preencher completamente cada uma das metades do canal cilíndrico.
    3. Coloque imediatamente a metade superior do dispositivo sobre a metade inferior e aplique pressão até ficar firmemente emLugar para completar os canais cilíndricos (o atrito entre as tampas e a peça superior manterá o último no lugar). Aguarde ~ 5 min a temperatura ambiente após a adição de agarose para permitir a sua gelificação dentro dos canais do dispositivo.
    4. Extraia manualmente a agulha de cada um dos orifícios nas tampas do dispositivo. Remova os parafusos e separe manualmente as duas tampas e a metade superior da metade inferior, onde o último segura as microcolunas de hidrogel.
    5. Use pinças finas para remover suavemente as micro colunas dos canais na parte inferior da metade e coloque-as na placa de Petri previamente preparada contendo DPBS (etapa 1.1.1). Reutilize o dispositivo para outra rodada de fabricação de micro-colunas. Proceda à subsecção 1.4.
  3. Fabricação de micro-colunas usando tubos capilares
    1. Transfira os tubos capilares de vidro (diâmetro: 398,78 μm, comprimento: 32 mm) para o interior do gabinete de biossegurança. Romper manualmenteTubos longos em fragmentos de 2,0-2,5 cm e inserir completamente uma agulha de acupuntura (diâmetro: 180 μm, comprimento: 30 mm) em cada fragmento ( Figura 2A ).
    2. Transfira 1 mL de agarose líquida do copo para a superfície de uma placa de Petri vazia. Segurando o tubo capilar e a agulha introduzida, coloque uma extremidade do tubo em contato com a piscina de agarose líquida para preenchê-la por ação capilar. Agite o tubo para promover o aumento capilar.
      NOTA: Encha os tubos capilares com agarose líquido tão alto quanto as permissões de ação capilar; Posteriormente, essas micro-colunas podem ser cortadas em construções menores dependendo do comprimento desejado. O pool de agarose de 1 ml é tipicamente usado para apenas um tubo, uma vez que a agarose esfria e geles rapidamente, evitando a ação capilar adicional.
    3. Quando o líquido deixar de subir, remova o tubo capilar da piscina e coloque-o horizontalmente na superfície de uma placa de Petri. Aguarde 5 min para deixar o gel de agarose dentro dos tubos. </ Li>
    4. Coloque o polegar e o dedo indicador em cada lado do tubo e pressione-o. Use a outra mão para puxar rapidamente a agulha enquanto usa o polegar e o dedo indicador para evitar que a própria micro coluna deslize para fora do tubo. Insira uma agulha de calibre 30 no tubo capilar para empurrar lentamente a micro-coluna para fora em um prato contendo DPBS (etapa 1.1.1).
  4. Recorte e esterilização de micro colunas
    1. Transfira delicadamente uma micro-coluna de DPBS para um prato vazio usando fórceps finos. Adicione 10 μL de DBPS ao topo da micro-coluna com uma micropipeta para evitar a secagem. Coloque o último prato abaixo de um estereoscópio para orientação visual.
      NOTA: Ao longo do protocolo, a secagem ou a desidratação de micro-colunas referem-se à aquisição de uma estrutura amassada que se distingue visualmente da aparência típica e hidratada dessas construções. Micro-colunas desidratadas firmemente anexadas à superfície de placas de Petri e cNão se mova facilmente, enquanto as construções hidratadas tendem a deslizar pela superfície depois de serem manipuladas com fórceps. Uma imagem de contraste de fase de uma micro-coluna completamente seca é mostrada na Figura 8A .
    2. Corte a micro-coluna com um microscalpel para encurtar o comprimento desejado (aqui, 2-5 mm). Transportar a micro-coluna aparada com fórceps finos para a outra placa de Petri DPBS preparada no passo 1.1.1.
    3. Repita as etapas 1.4.1 e 1.4.2 para cada micro-coluna fabricada.
    4. Esterilize as micro colunas nas placas de Petri contendo DPBS sob luz ultravioleta (UV) por 1 h. Armazene as placas de Petri a 4 ° C antes da adição de ECM e revestimento de células.

2. Cultura primária do neurônio e método de agregação de células forçadas

  1. Preparação da matriz de micro-poços piramidais
    NOTA: Esta seção emprega um molde impresso em 3D consistindo de uma base cilíndrica (diâmetro: 2,2 cm, altura: 7,0 mm) aE nove pirâmides quadradas na parte superior (comprimento do lado: 4,0 mm, ângulo inclinado: 60 °), organizadas em uma matriz de 3 x 3, como mostrado na Figura 3E . O processo de fabricação de aditivos usando impressoras 3D comercialmente disponíveis está bem documentado. O software de design assistido por computador pode ser usado para projetar o molde. O arquivo de design resultante pode então ser convertido digitalmente em um caminho de ferramenta para uma impressora 3D. Cada impressora possui especificações diferentes, e as instruções para configurar e operar uma impressora 3D variam em conformidade.
    1. Use uma broca de 3/32 "para perfurar 16 furos em uma disposição de 4 x 4 (comprimento do lado: 4 cm, separação do furo: 1 cm), centrada na tampa de uma placa de Petri de 10 cm. Dentro de um exaustor químico, use A parte inferior da placa de Petri pesa 27 g de polidimetilsiloxano (PDMS) e 3 g de agente de cura (para uma proporção de 1:10). Mexa com uma micro-espátula para distribuir o agente uniformemente.
    2. Cubra o PDMS / agente de cura com a tampa perfurada. Conecte uma extremidade de uma mangueira ao vácuoM porta da exaustão e inserir a outra extremidade na haste de um funil (diâmetro da boca: 10 cm, comprimento do caule: 3 cm, diâmetro do caule: 1,5 cm).
    3. Faça uma abertura com uma broca de 3/32 "na parte superior de uma lâmpada de pipeta de 1 mL e insira e prenda uma ponta de micropipeta de 1.000 μL na abertura (com a extremidade pontiaguda para cima). Coloque a lâmpada e a ponta na mangueira e puxe A mangueira para cima até que a lâmpada feche a mangueira na haste do funil.
    4. Coloque o funil na tampa do prato perfurado e prenda a mangueira com um suporte resistente disponível. Abra a válvula de vácuo por 5 min para sucção e coloque as bolhas de ar na superfície.
    5. Feche a válvula, remova o funil e bata a prato de Petri contra a superfície da chaminé ~ 3 vezes para estourar as bolhas de ar restantes.
    6. Coloque um molde de impressão 3D piramidal em cada um dos poços em uma placa de cultura de 12 poços, com as pirâmides apontando para cima. Despeje o PDMS / agente de cura sobre os moldes até que cada poço de tEle está cheio. Cubra a placa de 12 poços com a tampa e transfira-a para um forno durante 1 h a 60 ° C para secar.
    7. Retire cuidadosamente cada matriz de micro-poço PDMS ( Figura 3F ) da placa com uma micro-espátula. Cubra as matrizes PDMS com papel alumínio e esterilize por autoclave. Dentro de um gabinete de biossegurança, insira uma matriz de micro-poços em cada poço de uma placa de 12 poços ( Figura 2B ).
  2. Isolamento do neurônio cortical de fetos de ratos
    1. Adicione ~ 20 mL de solução de sal equilibrada de Hank (HBSS) a cada uma das quatro a seis placas de Petri de 10 cm (uma para cada tecido dissecado) dentro de um gabinete de biossegurança. Transfira estes pratos para uma capa de dissecação e coloque-os sobre gelo. Esterilize os instrumentos de dissecção, como microscalpels, tesouras e fórceps, com esterilizador de contas quentes.
    2. Meio basal do neurônio embrionário pré-quente + 2% de suplemento isento de soro + L-glutamina 0,4 mM (referido como "meio de cultura" aquiR) e 0,25% de tripsina + 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) a 37 ° C. Destilar desoxirribonuclease (DNase) I, colocando-a à temperatura ambiente. Prepare 1,5 mL de uma solução de DNAse I 0,15 mg / mL em HBSS e mantenha a solução no gelo.
    3. Eutanizar um rato embrionário-dia-18 timed-pregnant por inalação de dióxido de carbono e confirmar a morte por decapitação. Transfira a carcaça para uma capa de dissecção estéril e coloque-a com o lado ventral para cima. Enxágüe o abdômen com 70% de etanol.
    4. Abra o útero e remova os fetos (geralmente ~ 11) dos sacos amnióticos com tesoura e transfira-os com fórceps para uma placa de Petri contendo HBSS frio, conforme descrito 48 . Coloque um bloco de granito gelado (-20 ° C) abaixo do estereoscópio. Coloque a placa de Petri na superfície deste bloco frio para conservar a baixa temperatura do HBSS ao longo do procedimento de dissecação.
    5. Enxágüe os filhotes usando o HBSS e depois transfira-os para o próximo prato limpoContendo HBSS. Com a ajuda do estereoscópio e dos instrumentos de dissecação, remova sequencialmente as cabeças, hemisférios cerebrais e córtices dos fetos e transfira cada tecido com fórceps para um novo prato cheio de HBSS após cada dissecação 48 .
    6. Aspirar apenas os cortices com uma pipeta Pasteur e colocar o tecido em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Descarte os outros tecidos dissecados. Enxágüe os córtices três vezes, adicionando e removendo seqüencialmente ~ 5 mL de HBSS com uma pipeta serológica. Coloque o tubo no gelo quando não estiver em uso.
    7. Transfira os cortices com uma pipeta Pasteur para um tubo de 15 mL contendo tripsina-EDTA pré-aquecida (4-6 cortices por 5 mL de tripsina-EDTA). Agite manualmente o tubo uma vez e coloque-o a 37 ° C. Inverta o tubo a cada 3 min para evitar que o tecido se aglomerasse.
    8. Pare a exposição à tripsina após ~ 10 min, removendo o tecido com uma pipeta Pasteur e transferindo-a para uma centrifugadora limpa de 15 mLtubo. Adicione a solução de 0,15 mg / mL de DNase I (1,5 mL) ao tubo com uma pipeta.
    9. Use uma pipeta Pasteur para separar manualmente os grumos de tecido e depois o vórtice (~ 30 s) até a solução parecer homogênea e não há fragmentos de tecido remanescentes no líquido. Se não for possível homogeneizar completamente a solução, extraia os fragmentos insolúveis puxando-os para dentro da ponta de uma pipeta Pasteur.
    10. Centrifugar a solução celular homogênea obtida no passo 2.2.9 a 200 xg durante 3 min. Remova o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar as células granuladas. Adicione 2 mL de meio de cultura com uma pipeta serológica e vórtice para ressuspender as células.
    11. Contar o número de células na solução preparada no passo 2.2.10 usando um hemocitômetro; O rendimento esperado é 3.0-5.0 x 10 6 células / hemisfério cortical. Prepare 1 mL ou mais de suspensão celular em meio de cultura, com uma densidade de 1,0-2,0 x 10 6 células / mL.
  3. Formação de agregados de células neuronais
    1. Com uma micropipeta, adicione 12 μL da suspensão celular 1,0-2,0 x 10 6 / mL em cada micro-poço da matriz PDMS (que foi colocado na placa no passo 2.1.7).
      NOTA: A concentração celular pode ser ajustada dependendo da ID da micro-coluna e do tamanho desejado do agregado celular, uma vez que as concentrações mais altas produzem agregados maiores.
    2. Centrifugue a placa a 200 xg durante 5 min para forçar a agregação de células no fundo dos micro-poços ( Figura 2B ). Adicione cuidadosamente ~ 2 mL de meio de cultura ao topo de cada matriz PDMS para cobrir todos os micro-poços semeados, tomando cuidado para não perturbar as células agregadas.
    3. Se as células não forem transduzidas com um vetor viral, incubar a placa durante 12-24 h a 37 ° C e 5% de CO 2 e depois prosseguir para a seção 3. Se os agregados forem transduzidos, pule a incubação e vá para a seção 2.4 .
  4. TranSuce com um vetor viral para observar sinalização de cálcio
    Nota: Estas etapas são realizadas para transduzir neurônios com um vetor viral contendo um indicador de cálcio codificado geneticamente (GECI). Os resultados apresentados neste artigo foram obtidos usando um vírus adeno-associado comercialmente disponível (AAV) (serotipo 1) com GCaMP6f, um GECI com cinética rápida consistindo de proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina (CaM) e péptido M13, Conduzido pelo promotor humano Synapsin I. A solução de vector viral pode requerer diluição em DPBS estéril antes da transdução, dependendo da concentração da solução de reserva. A saúde celular / morfologia e a força do sinal GCaMP6f devem ser observadas ao longo do tempo para uma variedade de concentrações vetoriais. Este procedimento de otimização deve ser realizado por cada investigador para determinar o título apropriado para suas próprias culturas celulares. O tempo típico de expressão de GCaMP6f é 7-8 dias após a transdução que ocorre durante a incubação feita em stEp 2.4.2.
    1. Com uma micropipeta, adicione o volume necessário de solução de vetor viral (para uma concentração final de ~ 3,0 x 10 9 cópias genômicas por agregado) ao meio de cultura, cobrindo os agregados. Lentamente, pipetar para cima e para baixo para garantir que a solução vetorial seja distribuída de forma homogênea ao longo do meio de cultura.
    2. Incubar a placa com os micro-poços piramidais semeados durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO 2 para permitir a transdução viral de GCaMP6f.

3. Desenvolvimento do Componente Celular de microTENNs

  1. Fabricação de núcleo ECM
    1. Após a incubação agregada, adicione colágeno e laminina de tipo I ao meio de cultura (para uma concentração de 1 mg / mL cada) em um tubo de microcentrífuga para preparar a solução ECM. Execute as etapas 3.1.2-3.1.4 à temperatura ambiente, mas mantenha o tubo com ECM no gelo quando não estiver em uso para evitar a gelificação prematura.
    2. Ajuste o pH da solução ECM transferindo 1-2 μL para papel tornsol para verificar o pH inicial, adicionando 1 μL de hidróxido de sódio 1 N (NaOH) e / ou ácido clorídrico 1 N (HCl) ao ECM, conforme necessário, E repetindo até o pH ser 7.2-7.4. Assegurar a homogeneização da solução ECM por pipetagem para cima e para baixo, evitando a formação de bolhas de ar.
    3. Transfira as micro colunas com fórceps esterilizados dos pratos no passo 1.4.3 para esvaziar as placas de Petri de 35 ou 60 mm. Trabalhe em 4-5 micro-colunas de cada vez para evitar a desidratação. Anexe uma ponta de 10 μL anexada a uma dica de 1000 μL para uma micropipeta. Usando o estereoscópio para orientação visual, coloque a ponta em uma extremidade das micro colunas e sucção para extrair DPBS residual e bolhas de ar do lúmen.
    4. Desenhe rapidamente 4-5 μL de ECM em uma micropipeta. Observando sob um steNovamente, coloque a ponta da micropipeta em uma das extremidades das micro colunas e descarregue bastante ECM para preencher o lúmen. Confirme a ausência de bolhas de ar no lúmen, pois estas podem inibir o crescimento axonal através do ECM. Se existirem bolhas de ar, remova o ECM, conforme explicado no passo 3.1.3, e adicione o ECM novamente.
    5. Para evitar a desidratação, adicione ~ 2 μL de ECM em torno de cada micro-coluna. Incubar as micro colunas de hidrogel / ECM nas placas de Petri a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 25 min. Proceda à semeadura celular imediatamente após a incubação.
      NOTA: O período de incubação no passo 3.1.5 destina-se a permitir tempo para a polimerização de colágeno e laminina dentro das micro colunas.
  2. Semeadura de células neuronais nas micro colunas
    NOTA: Para alterar o meio de cultura dos agregados transduzidos, incline a placa, use uma micropipeta para remover o meio que se alinha na parede do poço e, em seguida, adicione lentamente ~ 1 mL contra aParede (para evitar perturbar os agregados nos micro-poços piramidais). Repita esta mudança de média uma segunda vez.
    1. Após o período de incubação no passo 3.1.5, transfira aproximadamente 10-20 μL de meio de cultura para duas áreas livres nas placas de Petri que contém as micro colunas. Use uma micropipeta para transferir individualmente os agregados para a placa de Petri contendo as construções e movê-las com fórceps para um dos pequenos grupos de meio de cultura para preservar a saúde celular.
    2. Ao observar sob um estereoscópio, insira um agregado em cada extremidade das micro-colunas para micro-TENNs bidirecionais ou em uma extremidade para uma arquitetura unidirecional (conforme desejado) usando fórceps. Confirme a colocação dos agregados dentro das micro-colunas usando o estereoscópio. Use fórceps para mover as micro colunas semeadas para o outro pequeno conjunto de meio de cultura para evitar a desidratação e preservar a saúde agregada.
    3. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 45 minutos a umaOs agregados devem aderir ao ECM. Verifique se os agregados permanecem nas extremidades das micro-colunas usando o estereoscópio; Reintroduza os agregados celulares e repita o passo de incubação conforme necessário.
    4. Inundar cuidadosamente as placas de Petri contendo micro-TENNs com meio de cultura (3 ou 6 mL para uma placa de Petri de 35 ou 60 mm, respectivamente) usando uma pipeta serológica. Coloque os pratos numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 para cultura de longo prazo.
    5. Execute mudanças de meia-média a cada 2 dias com meio de cultura. Remova cuidadosamente a metade do meio antigo com uma pipeta e use o estereoscópio para orientação visual para evitar a sucção dos microTENNs. Substitua lentamente adicionando meio fresco e pré-aquecido com uma pipeta.
    6. Para reutilizar as matrizes de micro-poços do PDMS, remova o meio de cultura, ferva os arrays em água desionizada durante 30 min e esterilize em uma autoclave para outra rodada de formação e cultura de agregados.
      NOTA: Nos pontos de tempo desejados, oA citoarquitetura de microTENNs pode ser verificada usando microscopia de contraste de fase. Aqui, um tempo de exposição de 5-8 ms e 10X (0,64 μm / pixel) e 20X (0,32 μm / pixel) objetivos foram utilizados para capturar as imagens de contraste de fase. A fluorescência associada às alterações da concentração de cálcio nos micro-TENNs transduzidos viralmente foi capturada usando um microscópio de fluorescência de alta velocidade com um tempo de exposição de 50 ms, um objetivo de 10X (0,64 μm / pixel) e luz de estado sólido com filtros de passagem de banda de ~ 480 Nm e ~ 510 nm para excitação e emissão, respectivamente, para visualizar o sinal de fluorescência GCaMP6f.

4. Imunocitoquímica para Estudos In Vitro

Nota: Para as imagens mostradas aqui, utilizaram-se os seguintes anticorpos primários: tubulina anti-Tuj-1 / beta-III de rato (1: 500) e anti-sinapsina-1 de coelho (1: 500) para rotulagem de axônios e pré - boutons sinápticos, respectivamente. Os anticorpos secundários foram anti-burro anti-mouse 568 (1: 500) e burro anti-coelho 488 (1: 500). Os volumes necessários das soluções de anticorpos primários e secundários preparados, bem como os volumes do formaldeído, soro de cavalo e soluções de detergente, dependem do volume necessário para cobrir completamente as construções. Esses volumes podem ser minimizados usando uma barreira hidrofóbica para limitar a área que envolve cada micro-coluna.

CUIDADO: Esta seção emprega formaldeído e Hoechst. O formaldeído é um composto tóxico conhecido por ser cancerígeno e Hoechst é um mutagênico conhecido. Portanto, esses compostos devem ser descartados em um recipiente de lixo apropriado. Sempre manipule-os em um exaustor químico enquanto estiver usando equipamento de proteção pessoal apropriado, como bata de laboratório, óculos de segurança e luvas.

  1. Prepare uma solução de formaldeído de 4.0% volume / volume (v / v) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) dentro de um exaustor químico.
  2. Remova o meio de cultura das placas de Petri contendoCom os microTENNs com uma micropipeta. Adicione volume suficiente da solução de formaldeído aos pratos para cobrir completamente os microTENNs. Mergulhe os microTENNs na solução de formaldeído durante 35 min a 18-24 ° C para consertar as células dentro das micro colunas.
  3. Remova a solução de 4,0% de formaldeído das placas de Petri com uma pipeta e descarte de acordo com as diretrizes adequadas de disposição de materiais perigosos.
  4. Execute dois enxaguamentos rápidos adicionando PBS suficiente para cobrir completamente os micro-TENNs fixos e, em seguida, removendo o PBS com uma pipeta. Execute um terceiro enxaguamento longo embebendo as construções no PBS por 10 min.
    CUIDADO: Descarte o PBS usado para enxaguar, possivelmente contendo vestígios de formaldeído.
  5. Prepare uma solução a 0,3% v / v de detergente não iónico em soro de cavalo a 4% v / v em PBS. Remova o PBS das placas de Petri contendo os microTENNs fixos e adicione um volume suficiente da solução de detergente a 0,3% para cobrir as construções. Mergulhe por 60 min a 18-24 e #176; C para permeabilizar as células.
  6. Remova a solução de detergente com uma pipeta. Execute dois enxaguamentos rápidos adicionando e removendo o PBS. Em seguida, execute três enxaguamentos mais longos embebendo as construções em PBS durante 5 minutos durante cada enxágüe.
  7. Diluir anticorpos primários em 4% de soro de cavalo. Remova o PBS das placas de Petri contendo os micro-TENN fixos e permeabilizados. Adicione solução de anticorpos primária suficiente às micro colunas para cobri-las completamente. Selar as placas de Petri com parafilme para evitar a evaporação e incubar durante a noite (12-16 h) a 4 ° C.
  8. Remova a solução primária de anticorpos dos pratos e enxágue como explicado no passo 4.6. No escuro, prepare a solução de anticorpo secundário em 4,0% de soro de cavalo. Adicione solução de anticorpos secundária suficiente para cobrir completamente as construções, cobrir os pratos com papel alumínio e incubar durante 2 h a 18-24 ° C.
  9. Prepare a solução Hoechst (1: 10 000) em PBS para manchar os núcleos.
  10. NOTA: As imagens dos micro-TENN imunomarcados foram tomadas com um microscópio confocal a laser com uma resolução de 2.048 (~ 8 s / frame), um objetivo 10X (0.64 μm / pixel), excitação de 487 nm e comprimentos de onda de emissão de 525 nm para Fluorescência verde, excitação de 561 nm e comprimentos de onda de emissão de ~ 595 nm para fluorescência vermelha e ~ 3,22 μm / fatia com ~ 60 fatias em média para as pilhas z.

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Representative Results

Micro-TENNs foram monitorados usando microscopia de contraste de fase para avaliar sua citoarquitetura e crescimento axonal ( Figura 4 ). Dentro dos micro-TENNs unidireccionais de 2 mm de comprimento, os agregados neuronais estavam restritos a uma extremidade da micro-coluna e projetaram um feixe de axônios através do núcleo interno. Os axões abrangiam todo o comprimento da coluna por 5 dias in vitro (DIV) ( Figura 4A ). Houve uma maior taxa de crescimento axonal inicial em micro-TENN bidirecionais de 2 mm de comprimento, uma vez que os axônios abrangiam toda a micro-coluna por 3 DIV ( Figura 4B ). Por 5 DIV, micro-TENN bidirecionais apresentaram tramas axonais densas que ligavam os agregados mantidos nos extremos da micro-coluna. Esta citoarquitetura também foi observada em micro-TENNs de 5 mm, com axônios que abrangem a micro-coluna em 5 DIV ( Figura 4C ). Como observado em todos os casos, o ECM no lúmen e o resto geométricoA apresentação apresentada pela agarose proporcionou a direcionalidade necessária para formar traços axonais que imitam estruturalmente as características da neuroanatomia nativa.

As técnicas de imunocitoquímica foram aplicadas neste protocolo e as imagens confocais foram realizadas para verificar os componentes da arquitetura micro-TENN. Os núcleos celulares corados com Hoechst (azul) foram localizados quase que exclusivamente em agregados nos extremos das micro colunas unidirecionais e bidirecionais, com essencialmente nenhuma coloração Hoechst no interior ( Figura 5 ). Esta observação confirmou o que foi inferido das imagens de contraste de fase: as populações neuronais foram restritas aos fins, e apenas axônios (em vermelho) atravessaram o lúmen dos micro-TENNs. No entanto, após os axônios cruzados nos agregados, a migração celular foi observada ao longo dos trilhos axonais no interior do lúmen, conforme observado pela presença de núcleos (azul) no interior a 28 DIV para um bidireccional de 2 mm de comprimentoMicro-TENN ( Figura 6 ). Além disso, a imunomarcação de sinapsina I (verde) foi encontrada em todos os corpos celulares e trilhos axonais ( Figura 6 ). A sínapsina I é uma proteína terminal pré-sináptica implicada na regulação da liberação do neurotransmissor e é indicativa da presença de terminais pré-sinápticos quando encontrada em uma distribuição pontual; Tem sido anteriormente correlacionada com a formação de sinapses ativas por gravações de patch de células inteiras 49 . A coloração de sinapsina na zona central rica em axônios do micro-TENN é provavelmente uma combinação de puncta, bem como a sinapsina sendo transportada pelos axônios para os terminais pré-sinápticos. No entanto, a presença de punpas de sinapsina dentro dos agregados micro-TENN sugere que essas construções tenham a capacidade de se comunicar através de sinapses, embora a colocalização da sinapsina com uma proteína pós-sináptica seja necessária para novas evidências estruturais de sinapses funcionais. </ P>

Micro-TENNs também foram fabricados com neurônios agregados que foram transduzidos com um AAV contendo o indicador de cálcio GCaMP6f para testar preliminarmente as propriedades eletrofisiológicas dessas construções. Essas construções expressaram o indicador de cálcio ao longo de todo o seu comprimento, como mostrado pela fluorescência tanto nos agregados neuronais quanto nos trilhos axonais ( Figura 7A ). Note-se que devido a configurações de microscópio destinadas a maximizar a intensidade nos agregados, a fluorescência nos trilhos axonais pareceu mais fraca. Estes micro-TENNs transduzidos foram analisados ​​ao longo do tempo com microscopia de fluorescência de alta velocidade (sem estimulação elétrica externa) e várias regiões de interesse de tamanho celular (ROIs) foram selecionadas aleatoriamente em um micro-TENN representativo para caracterizar a capacidade de sinalização destes Construções. As explosões de concentração de cálcio foram observadas em quase todos os ROIs, como refletido com assocInfluenciou as intensidades de fluorescência ao longo do tempo ( Figura 7B ). Particularmente, vários ROIs pareciam mostrar uma periodicidade quase constante de aumento da concentração de cálcio ( Figura 7B ). Estas alterações da concentração de cálcio são inferidas como resultado de potencialidades de ação espontâneas e inerentes, sinalização celular em agregados individuais e / ou sinalização através de axônios de agregados distintos. São necessárias mais análises para caracterizar completamente as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios e dos tractos axonais dentro dos microTENNs. No entanto, esses resultados iniciais demonstram que os microTENNs apresentam atividade elétrica endógena / básica básica robusta.

Figura 3
Figura 3: Modelos do dispositivo de fabricação de micro-colunas com corte a laser e o molde de micro-poços piramidais 3D para agregação de células. ( A) - ( B ) Modelo e imagem das partes inferiores e superiores do conjunto de canais cilíndricos, respectivamente, utilizados para fabricar as micro-colunas de hidrogel. ( C ) Modelo e imagem das tampas utilizadas para manter o dispositivo em conjunto. As peças anteriores e posteriores compartilham as mesmas dimensões. ( D ) Imagem do dispositivo montado necessário para fabricar as micro colunas. Apenas as duas tampas e a metade inferior são apertadas juntamente com parafusos nos dois orifícios de alinhamento inferiores (esquerda). As linhas quebradas mostram a colocação das agulhas de acupuntura através dos cinco orifícios em cada tampa. A agarose líquida é adicionada à metade inferior dos cilindros e, em seguida, a metade superior (direita) é colocada no dispositivo para moldar a agarose líquida em forma. ( E ) Cópia dos moldes impressos em 3D utilizados para fazer matrizes de micro-poços PDMS. ( F ) Imagens do molde impresso em 3D (à esquerda) e as matrizes de micro-poços PDMS (à direita). Todas as dimensões estão em milhas Metros (mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Observação do crescimento axonal em micro-TENNS por imagem de contraste de fase de construções unidirecionais e bidirecionais em função de dias in vitro . ( A ) Os micro-TENNs unidireccionais de 2 mm de comprimento mostram traços axonais que se estendem quase todo o comprimento da micro-coluna por 5 DIV. ( B ) Comparado com micro-TENNs unidirecionais, micro-TENN bidirecionais de 2 mm exibem uma taxa de crescimento axonal mais rápida. ( C ) Para micro-TENN bidireccionais de 5 mm, os traços axonais povoam o comprimento da micro-coluna a 5 DIV. Essa arquitetura é mantida pelo menos até 10 DIV. Barras de escala = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Citoarquitetura Micro-TENN observada com imagens confocais de micro-TENN unidirecionais e bidireccionais imunomarcados. As células foram coradas para núcleos celulares (Hoechst; azul) e axônios (Tuj1; vermelho). ( A ) Imagem de contraste de fase de um micro-TENN bidirecional de 5 mm (28 DIV). As reconstruções confocais ( D ) - ( F ) e ( I ) - ( K ) de um micro-TENN bidirecional de 5 mm (28 DIV) e um micro-TENN unidirecional (25 DIV), respectivamente, mostram os núcleos celulares marcados ( D ), ( I ) E axônios ( E ), ( J ), bem como a sobreposição ( F ), ( K ). Barras de escala: 500 μm. Inspeções em ( A F ) e ( K ) referem-se aos amplificadores neuronais e aos terminais axonais de contraste de fase ( B ) - ( C ) e confocal ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) . As imagens mostram os agregados restritos às extremidades do micro-TENN, enquanto o lúmen é atravessado por trilhos axonais alinhados. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Expressão da proteína terminal pré-sináptica sinapsina I em um micro-TENN bidirecional representativo. A construção foi corada para núcleos celulares (Hoechst; azul), axônios (Tuj1; vermelho) e boutons pré-sinápticos (sinapsina I, verde). ( A ) Fase-contrImagem de um micro-TENN bidirecional de 2 mm a 28 DIV. ( D ) - ( G ) Reconstruções confocais que mostram núcleos celulares ( D ), axônios ( E ), boutons pré-sinápticos ( F ) e uma sobreposição ( G ) dos três canais. As caixas mostram zoom-ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) das imagens de contraste de fase e sobreposição para os agregados neuronais, respectivamente. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7: atividade de sinalização espontânea em um micro-TENN bidirecional observado através da expressão de um indicador de cálcio codificado geneticamente. ( A ) FluorescênciaE a microscopia confirmou a expressão do repórter GCaMP, como observado pela fluorescência em todos os agregados e axônios. Barra de escala = 100 μm. ( B ) As alterações de fluorescência associadas às variações de concentração de cálcio foram medidas sem estimulação externa em várias regiões de interesse (ROIs) em função do tempo. Os círculos coloridos numerados em ( A ) designam esses ROIs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8: Imagens de contraste de fase de modos comuns de falha na metodologia micro-TENN. ( A ) Uma micro-coluna de agarose completamente desidratada / seca como resultado da remoção e / ou evaporação de DPBS nas fases iniciais de fabricação. Barra de escala = 5081; m. ( B ) Micro-coluna de hidrogel com o lúmen que reveste a parede exterior da construção devido à falta de alinhamento concêntrico da agulha de acupuntura com o tubo capilar. Barra de escala = 100 μm. ( C ) Micro-TENN semeado com ambos os agregados presentes em 1 DIV. ( D ) Um dos agregados caiu da mesma micro-coluna que ( C ) em 3 DIV. ( E ) Micro-TENN unidirecional a 4 DIV. ( F ) Os tractos agregados e axonais caíram da micro-coluna em ( E ) e permaneceram flutuando no meio de cultura em 5 DIV. Barra de escala para ( C ) - ( E ) = 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A lesão e a doença do SNC geralmente resultam na perda ou disfunção das vias axonais de longa distância que compõem o conector do cérebro, com ou sem degeneração neuronal concomitante. Isso é agravado pela capacidade limitada do SNC para promover neurogênese e regeneração. Apesar da busca de estratégias de reparo, como o fator de crescimento, a célula e a entrega do biomaterial como abordagens individuais ou combinatoriais, essas técnicas não respondem simultaneamente tanto à degeneração das células neuronais quanto à perda das conexões axonais 14 , 22 . Essas lacunas na tecnologia limitam a capacidade de reparar, alterar e sondar redes neurais de forma controlada e sustentada. Consequentemente, a tecnologia micro-TENN foi desenvolvida para abordar a necessidade de uma estratégia de reparo neural que, em contraste com os métodos existentes, facilita a substituição neuronal e a reconstrução de conexões axonais longas. MicrofoneOs ro-TENNs são andaimes vivos implantáveis ​​com uma citoarquitetura pré-formada que se aproxima dos blocos de construção dos sistemas do conectador do cérebro que são especificamente projetados para a reconstrução, substituição e modificação específicas dos circuitos neurais do hospedeiro. Esses andaimes são constituídos por uma (s) população (s) discreta (s) de neurônios conectados por extensões axonais longas dentro do lúmen contendo ECM de hidrogênio em agarose cilíndrico em miniatura. Essas construções podem ser capazes de funcionar como relés sinápticos para substituir perdas perdidas e modulação dinâmica dos circuitos nativos. Além disso, nos casos de degeneração axonal isolada (com os neurônios fonte permanecendo intactos), os microTENNs podem servir como guias para a regeneração axonal com base no mecanismo de regeneração axônica facilitada por axônio. Este manuscrito apresentou o protocolo de fabricação para criar de forma confiável micro-TENNs, com geometria controlada, fenótipo e características funcionais. Microscopia de contraste de fase, imunocitoquemaStry e microscopia confocal demonstraram que os microTENNs produzidos com o protocolo exibem a citocanquitetura requerida e expressam a sinapsina da proteína terminal pré-sináptica. Além disso, mostrou-se que os microTENNs possuem atividade de sinalização intrínseca, possivelmente devido a potenciais de ação, na ausência de simulação externa. Isto foi verificado pela presença de flutuações quase síncronas na fluorescência associada a um repórter de cálcio codificado geneticamente.

O desenvolvimento de Micro-TENN pode ser resumido por três etapas: (1) fabricação do tubo de hidrogel oco, (2) a adição de solução de ECM ao lúmen do tubo, e (3) a semeadura de agregados de neurônios isolados no Extremidades do tubo. As micro colunas podem ser fabricadas com tubos capilares de vidro ou com um dispositivo microfabricado contendo canais cilíndricos. Este dispositivo pode ser criado com qualquer método de micro-fabricação de alta precisão disponível para o investigador. LíquidoA agarose é vertida nos canais do dispositivo ou em tubos capilares contendo uma agulha de acupuntura centrada para criar as microcolunas de hidrogel. Após a gelificação de agarose, a agulha de acupuntura é removida para produzir o lúmen oco. Várias armadilhas comuns que ocorrem durante a fabricação ou o crescimento são destacadas na Figura 8 . Observe que algumas das imagens exibidas na Figura 4 e um caso extremo na Figura 8B mostram a porção luminal precariamente perto da parede do cilindro. Para produzir uma espessura de parede uniforme ao usar o método do tubo capilar, o conjunto da agulha do tubo deve ser mantido ereto quando colocado em contato com agarose e a agulha deve ser mantida no centro do tubo. Manter a montagem da agulha de tubo em um ângulo em relação à superfície de agarose promove a descentralização da agulha. No entanto, essas precauções são difíceis de implementar, e a agulha é mais frequentemente do que não descansarAs paredes dos tubos capilares. Pelo contrário, o principal recurso do dispositivo microfabricado é que possui orifícios de agulha concentrados de forma alinhada com os canais cilíndricos, promovendo uma centralização adequada da agulha e do lúmen em relação ao canal e à micro coluna, respectivamente. Além disso, o dispositivo aumenta o rendimento, facilitando a fabricação de várias micro-colunas ao mesmo tempo. Apesar do benefício fornecido pelo dispositivo, os lumens fora do centro ainda podem ser criados usando agulhas de acupuntura curvadas. As técnicas de micro-fabricação também possuem uma tolerância inerente que limita sua eficácia. Em geral, a desidratação de micro-colunas, para o qual um caso extremo é mostrado na Figura 8A , não deve ser um obstáculo se as recomendações fornecidas ao longo do protocolo forem seguidas. Observe que as propriedades físicas da agarose utilizada para encasamento externo podem precisar de otimização para subtipos neuronais alternativos, como o neurônio cortical melhoradoFoi observado aumento de urve e neurite em concentrações de agarose maiores (3-4%) versus menor (1-2%) 10 .

O desenvolvimento do Micro-TENN continua com a introdução do ECM no lúmen da micro-coluna, que serve para proporcionar um ambiente adequado para adesão neuronal, sobrevivência e crescimento. Além disso, o ECM, em combinação com a restrição geométrica e baixa porosidade fornecida pelo hidrogel de agarose, restringe o crescimento axonal na direção longitudinal para produzir a arquitetura necessária. O conteúdo da solução ECM pode ser otimizado para o tipo de neurônio utilizado. Por exemplo, o colágeno sozinho promove a sobrevivência e a expansão axonal em DRG micro-TENNs, enquanto que uma combinação de colágeno e laminina é necessária para os neurônios corticais 10 . Além disso, a polimerização de ECM dentro da micro-coluna é crítica antes do revestimento celular, uma vez que a co-entrega de células com ECM não polimerizado conduz a diminuição do fenómeno de neuriteOwth e fasciculação 31 . Note-se que mesmo que a micro-coluna seja inicialmente preenchida com solução ECM, seus conteúdos polimerizam em um gel macio e tendem a se contrair durante o período de incubação, criando um espaço que permite a inserção dos agregados celulares. Além disso, é importante confirmar que o ECM entrou no interior da micro-coluna inspecionando-se sob o estereoscópio; A ausência completa e / ou bolsas de ECM ausentes resultam na falta de crescimento axonal dos agregados. A fabricação de Micro-TENN culmina na semeadura de agregados de neurônios corticais nos extremos do andaime. Esses neurônios foram dissecados a partir de fetos de ratos usando procedimentos conhecidos 48 . Pode-se inferir que a maioria das células isoladas são neurônios porque o córtex embrionário de ratos no tempo de gestação utilizado para o isolamento é composto por 99% de neurônios, e o meio de cultura definido utilizado no protocolo é metabicamente limitativo para a proliferação glial 49 . Por conseguinte, deve haver uma contaminação glial mínima, embora seja necessária a coloração para marcadores específicos para confirmação. Embora este manuscrito tenha apresentado a fabricação micro-TENN com neurônios corticais, os neurônios de diferentes regiões cerebrais ( por exemplo, nigral, talâmico e hipocampo) ou com diferentes fenótipos ( por exemplo, excitadores, inibitórios e dopaminérgicos) podem ser utilizados de acordo com a aplicação desejada e Área de implantação. As iterações anteriores do protocolo de fabricação micro-TENN envolveram a semeadura de células dissociadas 10 , 31 , 32 . Embora a citoarquitetura desejada tenha sido obtida usando o método dissociado, não foi alcançado em todos os casos. Em muitos casos, células dissociadas inundaram o interior e resultaram em vários clusters de células em todo o lúmen, com processos que os conectam em uma extensa rede 3DRef. "> 10 , 31. O método agregado, por outro lado, garante a contenção dos corpos celulares nos extremos e, portanto, é parte integrante do sucesso da tecnologia micro-TENN ( Figura 5 ). Os microTENNs representativos exibidos Nas Figuras 4-6 foram fabricadas com agregados maiores que não foram completamente inseridos, e isso ocasionalmente pode resultar em agregados que caem das micro colunas em cultura, como os exemplos mostrados na Figura 8D e 8E . Para evitar isso, os agregados podem Deve ser totalmente inserido dentro do interior da micro coluna. Se esta situação se apresentar mesmo após a aplicação da estratégia anterior, o período de incubação inicial pode ser ampliado para proporcionar tempo suficiente para a adesão agregada ao ECM. Durante a cultura, o manejo suave de microTENNs é Recomendado para preservar a integridade do encaixe de hidrogel e a cito-arquitetura; problemas durante a micro-TA manipulação ENN é a causa das curvaturas obtidas nos traços axonais alinhados de outra forma ( Figura 5 ). No entanto, o seguimento do protocolo apresentado neste artigo deve resultar na fabricação consistente de micro-TENNs com a arquitetura neuronal / axonal esperada, distribuição de botão pré-sináptica e atividade elétrica intrínseca.

Apesar da promessa de que os microTENNs possuem, existem desafios que podem limitar as aplicações desta tecnologia. A técnica atual de fabricação de micro-colunas é limitada pela descentralização do lúmen da micro-coluna, o que pode causar uma apresentação inconsistente de pistas mecânicas nas células ( por exemplo, rigidez), ruptura da parede da micro-coluna e posterior exposição dos tractos axonais Para o exterior, e problemas durante a implantação. Embora o uso de um dispositivo microfabricado tenha melhorado o resultado em comparação com os tubos capilares, a micro-fabricação de maior precisãoSão necessárias técnicas para aumentar a reprodutibilidade dimensional dessas construções. Os resultados neste manuscrito mostraram que a metodologia do micro-TENN pode produzir fator de vida consistente de caminhos neuronais e axonais que se assemelham a neuroanatomia nativa, em particular os traços axonais que conectam regiões distintas do cérebro. No entanto, o comprimento micro-TENN é um obstáculo, dependendo do comprimento da via axonal do hospedeiro que precisa ser substituído. Por exemplo, os enxertos de nervos modificados em tecidos (TENGs) são uma estratégia separada de andaimes vivos utilizada pelo nosso grupo de pesquisa para reparar lesões de nervos extremamente longas. Para substituir estas largas lacunas, os axônios em TENGs podem ser alongados a dezenas de centímetros aplicando tensão mecânica contínua em mechano-biorreatores personalizados 1 , 23 , 50 . Esta técnica de "alongamento do alongamento" também foi aplicada para manipular o comprimento do processo astrocítico para BetteRimite a estrutura das vias gliais radiais 51 . Pelo contrário, a tecnologia micro-TENN atual ainda não oferece essa extensão de controle; O comprimento máximo alcançável está atualmente limitado por quanto tempo os tractos axonais podem crescer in vitro com base na extensão tradicional de medição de cone de crescimento. Além disso, mesmo que o CNS tenha uma capacidade intrínseca para o re-câmbio neurofisiológico em resposta a vários estímulos, e as células transplantadas têm a capacidade de integrar sinteticamente com os circuitos nativos, outra limitação desta tecnologia é que os microTENNs dependem da plasticidade do cérebro nativo E a capacidade das redes hospedeiras de se integrar funcionalmente com a construção implantada 52 , 53 , 54 , 55 . Finalmente, uma deficiência inata de todas as abordagens baseadas em implantes, como micro-TENNs, é a sua invasividade. Como os neurônios sãoGeralmente em estreita proximidade com os capilares, qualquer tipo de procedimento cirúrgico pode causar ruptura na barreira hematoencefálica, vazamento de fatores sanguíneos no parênquima cerebral e resposta inflamatória aguda (e até mesmo crônica) 31 . Esta resposta pode prejudicar neurônios de hospedeiro e micro-TENN, negando os aspectos benéficos desta técnica. No entanto, os microTENNs implantados na via corticotalâmica de ratos sobreviveram pelo menos 1 mês e mostraram evidências de integração estrutural com o córtex cerebral do hospedeiro 10 , 31 . Além disso, uma publicação anterior de nosso grupo de pesquisa apresentou uma metodologia que permite a implantação sem agulhas de microTENNs em cérebros de ratos 31 . Nessa abordagem, esta estratégia de encapsulamento de hidrogel foi aumentada para incluir um revestimento fino (~ 20 μm) de carboximetilcelulose, que, após desidratação suave, apresentava rigidez suficiente para penetrarO cérebro sem necessidade de uma agulha ou guia 31 . Este método de implantação sem agulha, juntamente com a pequena seção transversal das micro colunas, deve minimizar o dano ao cérebro durante e após o procedimento de implantação estereotáxica.

Apesar do sucesso preliminar dos micro-TENNs in vivo , os estudos futuros precisarão confirmar que essas construções se integram de forma sináptica com tecido nativo e investigar se a recuperação funcional é obtida em modelos de lesão do SNC e doenças neurodegenerativas 10 , 31 . Por exemplo, micro-TENN adaptados podem ser projetados com fenótipos celulares específicos e implantados na correspondente via degenerada para reconstruir a rede e restaurar a função. Para reduzir a resposta inflamatória aguda após a implantação, o invólucro de hidrogel micro-TENN pode ser dopado com agentes anti-inflamatórios e pró-sobrevivência. Fabricação alternativaTécnicas ( por exemplo, impressão em 3D) podem ser desenvolvidas para gerar as microcolunas de hidrogel com maior facilidade e com características mais precisas, incluindo a centralização consistente do lúmen e a reprodutibilidade das dimensões. O mesmo esquema de biomateriais empregado com microTENNs pode ser modificado para enfrentar outras patologias características de lesões e doenças do SNC. Por exemplo, nosso grupo desenvolveu anteriormente construções constituídas por feixes astrocíticos alinhados longitudinalmente ao longo do lúmen revestido de colágeno de um hidrogel de agarose que imitam estruturalmente os caminhos gliais radiais e o tubo glial para facilitar a regeneração axonal e a migração neuronal 56 . Além disso, as células estaminais, tais como células estaminais embrionárias humanas (HESCs), células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e células estaminais derivadas de adipose (ASCs), podem ser incorporadas para fabricar micro-TENN autólogos por paciente para mais Se assemelham bastante à cito-arquitetura perdida e ao fenótipo celular. Estes futurosRe modificações aumentaria a capacidade dos microTENNs para substituir as vias degeneradas in vivo e permitiria a reconstrução de arquiteturas de tecido mais sofisticadas, incorporando suporte astroglial e mielinação axonal, entre outras características. Os neurônios de engenharia genética também podem ser semeados para aumentar a ação regenerativa dos micro-TENNs através da liberação de fatores tróficos ou permitir a modulação do SNC pela estimulação optogenética de canais de íons com luz 43 . Esses andaimes poderiam ser fabricados com neurônios excitatórios ou inibitórios para modular sinapticamente as conexões existentes do hospedeiro disfuncional em condições como epilepsia, depressão, dependência de drogas ou distúrbios da dor 1 . Por exemplo, os micro-TENNs que formam predominantemente sinapses GABAérgicas ou glutamatérgicas podem ser construídos para suprimir ou estimular, respectivamente, caminhos elevados ou desregulados através da integração sináptica e / ou do nexo de massaLançamento do otransmitter. Importante, tais construções moduladoras autônomas teoricamente seriam responsivas com base no feedback da rede hospedeira 1 . Da mesma forma, os microTENNs podem ser aplicados como interfaces cérebro-computador (BCIs), com micro-TENNs de engenharia genética optogeneticamente servindo como intermediários entre o cérebro e dispositivos de estimulação ou gravação inorgânicos. Esta aplicação pode ser uma alternativa aos BCI de microeletrodos, que não têm segmentação celular específica e estabilidade mecânica e causaram respostas inflamatórias, formação de cicatrizes gliais e migração ou perda neuronal quando penetrou no cérebro 57 , 58 .

Como bancos de teste in vitro , os microTENNs podem fornecer uma plataforma poderosa para o estudo de neurobiologia e eletrofisiologia, servindo como modelos biofidélicos do sistema nervoso. Além disso, as construções em 3D podem servir como bancos de teste para estratégias de tratamento quando usadas como injúcies neuraisUry e modelos de doenças 59 . Como construções em 3D, os microTENNs são capazes de simular o ambiente in vivo , caracterizado pelas complexas interações célula-célula e ECM em todas as direções espaciais que não podem ser representadas com precisão em culturas planas 42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 . De fato, numerosas investigações estabeleceram que o tipo de ambiente é fundamental para que as células apresentem a morfologia, a proliferação, a migração, a expressão gênica, a diferenciação e a sinalização exibida na configuração nativa 60 . As semelhanças entre o ambiente 3D desses andaimes e o próprio cérebro são complementadas pelo grau de controle que essas construções oferecem sobre seus produtos físicos e bioquímicosOperties 42 . Isso permite a engenharia de micro-TENNs com diferentes conjuntos de sinais mecânicos, haptotaxicos e chemotaxic para estudar o efeito dessas pistas, individualmente ou sinergicamente, sobre a sobrevivência neuronal, maturação, extensão axonal, sinaptogênese e mecanotransdução 32 , 42 , 63 . Além disso, a flexibilidade de design desta técnica de engenharia de micro-tecido permite a construção de andaimes vivos que imitam outras características do tecido cerebral, como a estrutura colunar e compartimentada do neocórtex, abrangida pelas extensões axonais do conectador, para aumentar ainda mais a Poder deste sistema como uma plataforma in vitro para estudar o cérebro 65 . Como plataformas de investigação, os microTENNs aproveitam a configuração controlada de modelos in vitro típicos, a disponibilidade expansiva de parâmetros de projeto em tecido enAbordagens de giro e aumento da relevância fisiológica e fisiopatológica das plataformas 3D para se tornar um teste ideal para avançar o conhecimento neurobiológico. A miríade de orientações futuras para esta tecnologia simboliza a versatilidade dos microTENNs. Este manuscrito demonstrou que o protocolo micro-TENN pode produzir fator de vida confiável, que imita características cruciais da neuroanatomia do cérebro para oferecer novos conhecimentos sobre fenômenos neurobiológicos, incluindo processos de desenvolvimento, doenças e reparos. Essas construções também podem se integrar de forma sináptica com tecido nativo para reconstruir traços de matéria branca danificados, substituir células neuronais perdidas e modular caminhos desregulados após lesão e doença do SNC.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O apoio financeiro foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) e F31-NS090746 (Katiyar)), a Fundação Michael J. Fox (Programa de Pipeline Terapêutico # 9998 (Cullen)), O Prêmio Piloto do Centro de Neurociências da Penn Medicine (Cullen), a National Science Foundation (Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação DGE-1321851 (Struzyna e Adeghtle)), o Departamento de Assuntos de Veteranos (Revisão do mérito de RR & D # B1097-I (Cullen)), a Associação Americana De Cirurgiões Neurológicos e Congresso de Cirurgiões Neurológicos (2015-2016 Codman Fellowship in Neurotrauma and Critical Care (Petrov)) e o US Army Medical Research and Materiel Command (# W81XWH-13-207004 (Cullen) e W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

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