Réseaux de neurones conçus par micro-tissus tridimensionnels inspirés anatomiquement pour la reconstruction, la modulation et la modélisation du système nerveux

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Neuroscience

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Summary

Ce manuscrit détaille la fabrication de réseaux de neurones fabriqués par micro-tissus: des constructions tridimensionnelles de taille de micromètre composées de trajets axonaux longs alignés couvrant une ou plusieurs populations neuronales agrégées enfermées dans un hydrogel tubulaire. Ces échafaudages vivants peuvent servir de relais fonctionnels pour reconstruire ou moduler les circuits neuronaux ou comme bancs biofidéliques imitant la neuroanatomie de la matière grise et blanche.

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Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

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Abstract

La récupération fonctionnelle se produit rarement après une dégénérescence due à une blessure ou à une dégénérescence induite par la maladie dans le système nerveux central (SNC) en raison de l'environnement inhibiteur et de la capacité limitée de neurogenèse. Nous développons une stratégie pour traiter simultanément la perte de voie neuronale et axonale dans le SNC endommagé. Ce manuscrit présente le protocole de fabrication pour les réseaux de neurones à micro tissage (micro-TENN), les constructions implantables constituées de neurones et de tracés axonaux alignés sur la lumière de la matrice extracellulaire (ECM) d'un cylindre d'hydrogel préformé de centaines de microns de diamètre pouvant s'étendre à des centimètres en longueur. Les agrégats neuronaux sont délimités aux extrêmes de l'encastrement tridimensionnel et sont recouverts de projections axonales. Les Micro-TENN sont uniquement conçus comme une stratégie pour la reconstruction du SNC, en imitant les aspects de la cytoarchitecture de connexion au cerveau et en fournissant potentiellement des moyens de remplacement du réseau. Le neuLes agrégats ronaux peuvent synapse avec le tissu hôte pour former de nouveaux relais fonctionnels pour restaurer et / ou moduler les circuits manquants ou endommagés. Ces constructions peuvent également constituer des «échafaudages vivants» pro-régénérables capables d'exploiter des mécanismes de développement pour la migration cellulaire et le suivi axonal, fournissant des indices synergiques structurels et solubles basés sur l'état de régénération. Les micro-TENN sont fabriqués en versant de l'hydrogel liquide dans un moule cylindrique contenant une aiguille centrée longitudinalement. Une fois que l'hydrogel a été gélifié, l'aiguille est retirée, laissant une micro-colonne creuse. Une solution ECM est ajoutée à la lumière pour fournir un environnement approprié pour l'adhérence neuronale et la croissance axonale. Les neurones dissociés sont agrégés mécaniquement pour l'ensemencement précis dans une ou les deux extrémités de la micro-colonne. Cette méthodologie produit de manière fiable des constructions miniatures autonome avec des tracés axonaux à longue projection qui peuvent récapituler les caractéristiques de la neuroanatomie du cerveau. Synaptic immLes indicateurs de calcium non colorés et codés génétiquement suggèrent que les micro-TENN possèdent une distribution synaptique étendue et une activité électrique intrinsèque. Par conséquent, les micro-TENN représentent une stratégie prometteuse pour la reconstruction neuro-chirurgicale ciblée des voies cérébrales et peuvent également être appliquées sous forme de modèles biofidéliques pour étudier les phénomènes neurobiologiques in vitro .

Introduction

Une caractéristique commune des troubles et des maladies du système nerveux central (SNC), comme une lésion cérébrale traumatique (TCE), une lésion de la moelle épinière (SCI), un accident vasculaire cérébral, une maladie d'Alzheimer et une maladie de Parkinson est la déconnexion des voies axonales et des cellules neuronales Perte 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Par exemple, lorsqu'un accident vasculaire ischémique n'est pas traité, on estime que les axones sont perdus à raison de 7 milles d'axones par minute 5 . Dans le cas de TBI, qui environ 1,7 million de personnes vivent chaque année aux États-Unis, la dégénérescence axonale peut continuer à se produire des années après un traumatisme, car la blessure initiale précipite un état neurodégénératif à long terme 4 . En aggravant ces effets délétères, le SNC a une capacité sévèrement limitéeVille pour la régénération 1 , 7 , 8 , 9 . Après une blessure, un environnement inhibiteur se développe qui se caractérise par un manque de guidage dirigé vers des cibles lointaines, la présence d'inhibiteurs associés à la myéline qui entravent la croissance des neurites et la formation d'une cicatrice gliale par astrocytes réactifs 8 , 10 , 11 , 12 . La cicatrice gliale sert de barrière biochimique et physique à la régénération, avec des molécules telles que les protéoglycans de sulfate de chondroïtine obstruant l'excès d'axone 8 , 11 . En outre, bien que des cellules souches neurales aient été trouvées dans le SNC adulte, la production de nouveaux neurones est limitée, car des signes constants de neurogenèse n'ont été trouvés que dans l'ampoule olfactive, l'hippocampeLa zone sous -granulaire, la zone périventriculaire et le canal central de la moelle épinière 13 , 14 . Ces obstacles empêchent la récupération fonctionnelle des neurones perdus et de l'architecture de la matière blanche suite à une blessure ou une maladie, ce qui entraîne des effets souvent changeants et prolongés de ces conditions.

Malgré le manque de capacité régénératrice dans le SNC adulte, il a été démontré que la régénération axonale est possible si des signaux environnementaux adéquats sont présentés aux neurones hôtes 15 , 16 , 17 , 18 . Les chercheurs ont essayé de fournir et de manipuler des facteurs de croissance ( p. Ex., Facteur de croissance nerveuse, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dépendant de la gliale et facteur neurotrophique 3) et d'autres molécules d'orientation pour stimuler la plasticité et la régénération des axones 14 , </ Sup> 18 , 19 . Bien que ces études aient confirmé que les axones adultes sont capables de répondre aux facteurs de croissance, ces stratégies sont limitées par la faible perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et les gradients spatiaux et temporels spécifiques requis pour favoriser la régénération 14 , 18 , 19 . D'autres approches se sont appuyées sur l'hyperactivation des facteurs de transcription liés à la régénération dans les neurones du SNC. Par exemple, la surexpression du facteur de transcription Stat3 a stimulé la régénération axonale dans le nerf optique 20 . Néanmoins, la délivrance de biomolécules et la surexpression des facteurs de transcription ne remplacent pas les populations neuronales perdues. Les stratégies basées sur les cellules ont principalement porté sur la transplantation de cellules souches neurales (NSC) dans le SNC, en profitant de leur capacité à remplacer les neurones du SNC, à libérer des facteurs trophiques,Et appuient les tentatives de neurogenèse qui surviennent après une blessure 17 . Malgré cela, il existe encore des défis pressants qui empêchent cette approche, y compris la capacité entravée des cellules névralgiques transplantées à survivre, à s'intégrer à l'hôte et à rester spatialement limité à la zone blessée 6 , 14 , 17 , 21 . En outre, la distribution cellulaire seule est incapable de rétablir la cytoarchitecture des voies axonales endommagées ou perdues. Une autre approche qui traite des problèmes auxquels sont confrontées les stratégies de distribution des cellules et des médicaments / produits chimiques combine ces approches avec l'utilisation des biomatériaux 14 , 22 , 23 . Les biomatériaux tels que les hydrogels sont capables d'émuler les propriétés biochimiques et physiques de la matrice extracellulaire (ECM), en facilitant la délivrance cellulaire etD rétention dans la zone lésée et délivrant des facteurs de croissance et d'autres molécules bioactives avec libération contrôlée 22 . Les caractéristiques attrayantes de ces stratégies basées sur le biomatériau ont donné lieu à des signes de régénération axonale in vivo après la transplantation d'échafaudages dans les zones lésées 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Cependant, les stratégies biomatériaux acellulaires ne remplacent pas les populations neuronales perdues; Lorsqu'ils sont utilisés comme véhicules de délivrance pour les cellules précurseurs neuronales, gliaires ou neuronales, les biomatériaux sont incapables de reconstituer les réseaux axonaux à longue distance. Le défi de développer une approche qui aborde à la fois la dégénérescence de la voie axonale et la perte neuronale associée à une lésion et une maladie du SNC reste encore <Sup class = "xref"> 31.

Notre groupe de recherche a précédemment rapporté le développement de réseaux de neurones implantables micro-tissulaires implantables (micro-TENN), qui sont un type d'échafaudage vivant constitué de corps de cellules neuronales restreints à une ou aux deux extrémités d'une micro-colonne ECM d'hydrogel d'agarose , Avec des tracés axiaux alignés s'étendant à travers l'intérieur de cette enceinte tridimensionnelle (3D) 1 , 10 , 31 , 32 . L'une des principales différences entre cette technique et les approches précédentes est que la cytoarchitecture des micro-TENN est créée complètement in vitro et est transplantée ensuite 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , <Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . La fabrication in vitro offre un vaste contrôle spatial et temporel du phénotype et de l'orientation cellulaire, des propriétés mécaniques / physiques, des indices biochimiques et des facteurs exogènes, ce qui profite à l'intégration de ces échafaudages avec l'hôte après l'implantation 41 , 42 . Les micro-TENN sont anatomiquement inspirés car ils imitent la neuroanatomie du cerveau, montrant des traces axonales semblables à celles qui relient les différentes régions fonctionnelles du cerveau ( figure 1A ) 1 . Par conséquent, cette stratégie peut être en mesure de remplacer physiquement les trajets de la substance blanche perdue et les neurones après l'implantation dans une région lésée. Cette technique s'inspire également des mécanismes de développement dans lesquels les «échafaudages naturels» formés par les cellules de gliale radiales et les axones pionniers agissent comme guides de guidage de cellulesMigration de la zone subventriculaire et croissance axonale, respectivement 43 . Ces mécanismes sont récapitulés dans les parcelles axonales alignées des micro-TENN, qui peuvent présenter des voies de vie pour la migration des cellules neuronales et la régénération axonale par croissance axonale médiée par l'axone ( Figure 1C ) 43 . En outre, cette stratégie bénéficie de l'intégration synaptique entre les neurones micro-TENN et les circuits natifs, formant de nouveaux relais pouvant contribuer à la récupération fonctionnelle ( Figure 1B ) 43 . La capacité de formation de synapses peut également accorder à cette approche la capacité de moduler le SNC et de répondre au tissu hôte en fonction des commentaires du réseau. Par exemple, les neurones optogénétiquement actifs dans les échafaudages vivants peuvent être stimulés pour moduler les neurones hôtes par des interactions synaptiques ( Figure 1D ).

En outre, la construction tubulaire à base de biomatériauL'utilisation de micro-TENN offre un environnement adéquat pour l'adhésion cellulaire, la croissance, l'extension des neurites et la signalisation, tandis que les dimensions miniatures des constructions permettent une implantation peu invasive et fournissent un micro-environnement partiellement séquestré pour une intégration progressive dans le cerveau. En effet, des publications récentes ont démontré le potentiel des micro-TENN à imiter les voies nerveuses après l'implantation dans le cerveau du rat. À la suite de la micro-injection stéréotaxique, nous avons précédemment signalé des signes de survie neuronale micro-TENN, le maintien de l'architecture des axaux et l'extension des neurites dans le cortex de l'hôte au moins 1 mois in vivo 10 , 31 . En outre, l'étiquetage avec la synapsine a fourni des preuves histologiques de l'intégration synaptique avec le tissu natif 10 , 31 . Dans l'ensemble, les micro-TENN peuvent être particulièrement adaptés pour reconstruire et moduler les dommagesCNS en remplaçant les neurones perdus, en intégrant de manière synaptique les circuits hôtes, en rétablissant la cytoarchitecture axonale perdue et, dans certains cas, en fournissant des axones régénérants avec les indices de détection appropriés.

Figure 1
Figure 1: Principes et inspiration liés au développement de réseaux de neurones à micro tissus (micro-TENN). ( A ) Les micro-TENN imitent la cytoarchitecture du connecteur du cerveau (violet), dans lequel les régions fonctionnellement distinctes sont connectées par des trajets axiaux longs et alignés d'une manière unidirectionnelle (rouge, verte) ou bidirectionnelle (bleue). À titre d'exemple, les micro-TENN pourraient reconstituer les connexions perdues dans les voies corticothalamique et nigrostriatale ou dans la voie perforante du cortex entorhinal à l'hippocampe (adapté de Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagramme d'une unidirectionaL et bidirectionnel micro-TENN (rouge et bleu, respectivement) intégrant de manière synaptique avec le circuit hôte (violet) pour servir de relais fonctionnel entre les deux extrémités d'une lésion. ( C ) Schéma des tracés axonaux d'un micro-TENN (vert) unidirectionnel servant de guide pour la régénération axiale des axones hôtes (violet) vers une cible avec laquelle le micro-TENN interagit. ( D ) Schéma conceptuel de l'utilisation de micro-TENNS optogénétiquement actifs en tant que néodomodulateurs, profitant de l'intégration synaptique avec des neurones excitateurs ou inhibiteurs (en bas). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Le manuscrit actuel détaille la méthodologie utilisée pour fabriquer des micro-TENN utilisant des neurones corticaux cérébraux dérivés d'embryons. Notamment, les micro-TENN pourraient être fabriqués avec d'autres types de cellules neurales. Pour l'exEn amont, les rapports initiaux du développement réussie de micro-TENN ont comporté des neurones de ganglion de racine dorsale (DRG) 32 . Les micro-colonnes d'hydrogel peuvent être générées ( Figure 2A ) en ajoutant de l'agarose liquide à un réseau de canaux cylindriques sur mesure, coupé au laser ou à des tubes capillaires, tous deux contenant des aiguilles d'acupuncture alignées. L'aiguille forme la lumière et détermine le diamètre intérieur (ID) de la micro-colonne, tandis que l'ID du tube capillaire et le diamètre des cylindres dans l'appareil de coupe au laser dictent le diamètre extérieur (OD) des constructions. Les OD et ID peuvent être choisis en fonction de l'application souhaitée en sélectionnant des diamètres différents pour les tubes périphériques / capillaires et les aiguilles d'acupuncture, respectivement. La longueur des micro colonnes peut également varier; À ce jour, nous avons signalé la construction de micro-TENN jusqu'à 20 mm de longueur 10 et recherchons activement des longueurs encore plus longues. Après les gels d'agarose et l'acupuncture nLes eedles sont éliminés, une solution ECM généralement constituée de collagène de type I et de laminine est ajoutée à la lumière des constructions ( Figure 2C ). Le noyau ECM fournit un échafaudage pour favoriser l'adhérence cellulaire neuronale et la croissance axonale. Au début, les neurones corticaux primaires du rat ont été plaqués dans les micro-colonnes en utilisant des suspensions de cellules dissociées 10 , 31 , 32 . Cependant, cette approche n'a pas produit la cytoarchitecture cible dans tous les cas, qui a été définie comme les corps de cellules neuronales restreints aux extrémités des micro-colonnes, avec la lumière centrale composée de traits axonaux alignés purs. Depuis lors, l'utilisation d'une méthode d'agrégation neuronale forcée (basée sur des protocoles adaptés de Ungrin et al .) A permis une fabrication plus fiable et cohérente de micro-TENN avec la structure idéale ( Figure 2B ) 44 . En plus de décrire le courantMéthodologie, cet article montrera des images représentatives de contraste de phase et confocales de micro-TENN qui démontrent la formation de parcelles axonales au fil du temps, ainsi que la cytoarchitecture ciblée finalisée. Ce manuscrit élargira également les aspects remarquables du protocole et les défis restants et les orientations futures de la technologie micro-TENN.

Figure 2
Figure 2: diagramme schématique du processus de fabrication micro-TENN en trois étapes. ( A ) Développement de l'hydrogel d'agarose: (i) Initialement, une petite aiguille d'acupuncture ( par exemple , 180-350 μm de diamètre) est insérée dans les canaux cylindriques d'un moule fabriqué sur mesure, coupé au laser ou un tube capillaire ( p. Ex. , 380-700 μm de diamètre). Dans l'étape suivante, l'agarose liquide dans le DPBS est introduit dans les canaux cylindriques ou les tubes capillaires. (Ii) Après les gels d'agarose, l'aiguille est enlevée etLe moule est démonté pour produire les micro colonnes creuses d'agarose. (Iii) Ces constructions sont ensuite stérilisées et stockées dans DPBS. ( B ) Culture de neurones primaires et méthode globale: (i) L'agrégation neuronale est réalisée dans des réseaux de micro-puits pyramidaux, issus de moules imprimés en 3D, qui s'ajustent dans les puits d'une plaque de culture à 12 puits. (Ii) Les micro-TENN incluent des neurones primaires de rat dissociés des cerveaux fœtaux des rats embryonnaires-jour-18. Après la dissociation tissulaire avec la trypsine-EDTA et la DNase I, on prépare une solution cellulaire avec une densité de 1,0-2,0 x 10 6 cellules / mL. (Iii) 12 μL de cette solution sont transférés à chaque puits dans le réseau de micro-puits pyramidale. La plaque contenant ces micro-puits est centrifugée pour produire des agrégats cellulaires. (Iv) Ils sont ensuite incubés toute la nuit avant le placage dans les micro-colonnes. ( C ) Fabrication de noyau d'ECM et semence cellulaire: (i) Avant l'ensemencement cellulaire, une solution ECM contenant 1 mg / mL de collagène de type I et 1 mg / mLLa laminine est transférée à l'intérieur des micro-TENN et autorisée à la polymériser. (Ii) Selon que des micro-TENN unidirectionnels ou bidirectionnels sont fabriqués, un agrégat est placé à l'un ou à l'autre des extrêmes de la micro-colonne, respectivement. (Iii) Après une période d'incubation pour favoriser l'adhérence, les micro-TENN sont cultivés dans des boîtes de Petri inondées de milieu basal neuronal embryonnaire complété. (Iv) Après 3-5 jours en culture, la structure micro-TENN finale devrait démontrer les agrégats cellulaires aux extrêmes de la micro-colonne, avec des tracés axonaux s'étendant sur sa longueur. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux à l'Université de Pennsylvanie et du Centre médical des affaires des anciens combattants de Michael J. Crescenz et ont adhéré aux lignes directrices énoncées dans la Politique du service de santé publique des NIH sur les soins et l'utilisation du laboratoire Animaux (2015).

1. Développement de l'hydrogel d'agarose (Composante acellulaire des micro-TENN)

  1. Préparation de la solution d'agarose
    1. Dans un cabinet de prévention des risques biotechnologiques, préparer des réservoirs pour les micro colonnes en transférant 20 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) dans chacune des deux boîtes de Pétri de 10 cm. Stérilisez les pinces fines et les microcalpes avec un stérilisateur à talons chaud.
    2. Peser 3 g d'agarose et le transférer dans un bécher stérile à l'intérieur de l'armoire de sécurité biologique. Ajouter 100 mL de DPBS pour une concentration finale de 3% poids / volume (p / v). Inclure une barre magnétique propre et couvrir le bécher avec alumiNum feuille.
    3. Avec une plaque chauffante / agitateur, réchauffer le bécher à 100 ° C et agiter à 120-200 tr / min pour dissoudre complètement l'agarose (la solution passera de nuageux à claire). Maintenir le chauffage et l'agitation ensuite pour éviter la gélification et changer la température de chauffage si nécessaire pour éviter de brûler l'agarose.
      REMARQUE: La fabrication avec le dispositif à coupe au laser et les tubes capillaires est présentée ci-dessous dans les sous-sections 1.2 et 1.3, respectivement. Passez à la sous-section 1.4 après avoir terminé les étapes décrites dans l'une ou l'autre des sous-sections. Pour les deux méthodes de fabrication de micro-colonnes, ajouter rapidement l'agarose liquide, car l'agarose se solidifie rapidement à mesure qu'elle se refroidit. Lors de la stérilisation avec un autoclave dans l'une des étapes suivantes, utilisez les conditions standard appliquées à la verrerie.
  2. Préparation de la micro-colonne à l'aide d'un dispositif coupe-laser
    REMARQUE: Le dispositif à coupe au laser est découpé en acrylique transparent à l'aide d'un coupeur laser à CO2 CO. Le fabriLe cation des structures et des dispositifs par découpe au laser est bien documenté pour une gamme d'applications d'ingénierie et de recherche 45 , 46 , 47 . Ce moule ( figure 3 ) se compose d'un réseau de cinq canaux cylindriques, chacun avec un diamètre de 398 μm et une longueur de 6,35 mm. Ces armoires cylindriques sont formées sur leur longueur de deux pièces: une moitié inférieure (longueur: 25,4 mm, largeur: 6,35 mm, hauteur: 6,0 mm) et une moitié supérieure (longueur: 31,5 mm, largeur: 6,35 mm, hauteur: 12,7 mm ), Comme représenté sur les figures 3A et 3B , respectivement. Les deux moitiés peuvent être serrées par les capuchons antérieurs et postérieurs observés à la figure 3C (longueur: 31,5 mm, largeur: 6,35 mm, hauteur: 12,7 mm), qui présentent quatre trous d'alignement qui coïncident avec deux trous chacun en haut et en bas Pièces et qui permettent de sécuriser toutes les pièces lorsqu'elles sont vissées. Ces plafonds incluent aussiCinq trous, concentriques aux canaux cylindriques, dans lesquels les aiguilles d'acupuncture peuvent être insérées pour former la lumière des micro colonnes.
    1. Stérilisez l'appareil illustré à la Figure 3 en le recouvrant d'aluminium et d'autoclavage. Assembler l'appareil comme indiqué sur la figure 3D en alignant les capsules antérieure et postérieure avec seulement la moitié inférieure et en fixant les trois parties avec deux vis et écrous n ° 4-40 (diamètre du fil: 3,05 mm) dans les trous d'alignement inférieurs.
    2. Introduire complètement une aiguille d'acupuncture (diamètre: 180 μm, longueur: 30 mm) dans les trous d'aiguille sur le capuchon antérieur ou postérieur de l'appareil ( Figure 3D ). Avec une micropipette, versez suffisamment d'agarose liquide (~ 1 mL pour les cinq canaux) sur la demi-partie inférieure pour remplir complètement chacune des moitiés de canal cylindrique.
    3. Placez immédiatement la moitié supérieure de l'appareil sur la moitié inférieure et appliquez la pression jusqu'à ce qu'elle soit fermement en placeLieu pour compléter les canaux cylindriques (le frottement entre les capuchons et la pièce supérieure maintiendra le dernier en place). Attendre ~ 5 min à température ambiante après addition d'agarose pour permettre sa gélification à l'intérieur des canaux de l'appareil.
    4. Extraire manuellement l'aiguille de chacun des trous sur les capuchons de l'appareil. Retirez les vis et séparez manuellement les deux capuchons et la moitié supérieure de la demi-partie inférieure, où celle-ci maintiendra les micro-colonnes d'hydrogel.
    5. Utilisez des pinces fines pour retirer doucement les micro colonnes des canaux sur la demi-partie inférieure et les placer dans la boîte de Petri préalablement préparée contenant du DPBS (étape 1.1.1). Réutilisez l'appareil pour une autre série de fabrication de micro-colonnes. Passez à la sous-section 1.4.
  3. Fabrication de micro-colonnes à l'aide de tubes capillaires
    1. Transférer les tubes capillaires en verre (diamètre: 398,78 μm, longueur: 32 mm) à l'intérieur de l'armoire de biosécurité. Cacher manuellementTubes longs dans des fragments de 2,0-2,5 cm et insérez complètement une aiguille d'acupuncture (diamètre: 180 μm, longueur: 30 mm) dans chaque fragment ( Figure 2A ).
    2. Transférer 1 mL d'agarose liquide du bécher à la surface d'une boîte de Petri vide. En tenant le tube capillaire et l'aiguille introduite, placez une extrémité du tube en contact avec le réservoir d'agarose liquide pour le remplir par une action capillaire. Agiter le tube pour favoriser l'élévation capillaire.
      REMARQUE: Remplissez les tubes capillaires avec de l'agarose liquide aussi élevé que le permis d'action capillaire; Ensuite, ces micro-colonnes peuvent être coupées en constructions plus petites en fonction de la longueur souhaitée. Le pool d'agarose de 1 ml est habituellement utilisé pour un seul tube, car l'agarose refroidit et gélifie rapidement, ce qui empêche toute action capillaire supplémentaire.
    3. Lorsque le liquide cesse d'augmenter, retirez le tube capillaire de la piscine et placez-le horizontalement sur la surface d'une boîte de Petri. Attendez pendant 5 minutes pour laisser le gel d'agarose dans les tubes. </ Li>
    4. Placez le pouce et l'index de chaque côté du tube et appuyez sur celui-ci. Utilisez l'autre main pour tirer rapidement l'aiguille pendant que vous utilisez le pouce et l'index pour empêcher la micro-colonne elle-même de glisser hors du tube. Insérez une aiguille de calibre 30 dans le tube capillaire pour pousser lentement la micro-colonne dans un plat contenant du DPBS (étape 1.1.1).
  4. Rectification et stérilisation des micro-colonnes
    1. Transférer délicatement une micro-colonne de DPBS à un plat vide en utilisant des pinces fines. Ajouter 10 μL de DBPS au sommet de la micro-colonne avec une micropipette pour éviter le séchage. Placez le dernier plat sous un stéréoscope pour le guidage visuel.
      NOTE: Tout au long du protocole, le séchage ou la déshydratation des micro-colonnes fait référence à l'acquisition d'une structure froissée qui se distingue visuellement de l'aspect typique hydraté de ces constructions. Les micro colonnes déshydratées s'attachent fermement à la surface des boîtes de Petri et cIl faut déplacer facilement, alors que les constructions hydratées ont tendance à glisser sur la surface après avoir été manipulées avec des pinces. Une image en contraste de phase d'une micro-colonne complètement séchée est représentée sur la figure 8A .
    2. Coupez la micro-colonne avec un microscalpel pour la raccourcir à la longueur désirée (ici 2-5 mm). Transporter la micro-colonne taillée avec des pinces fines à l'autre plaque de Petri DPBS préparée à l'étape 1.1.1.
    3. Répétez les étapes 1.4.1 et 1.4.2 pour chaque micro-colonne fabriquée.
    4. Stérilisez les micro colonnes dans les boîtes de Petri contenant du DPBS sous une lumière ultraviolette (UV) pendant 1 h. Rangez les boîtes de Petri à 4 ° C avant l'addition ECM et le placage cellulaire.

2. Culture primaire de neurone et méthode d'agrégation de cellules forcées

  1. Préparation du réseau de micro-puits pyramidale
    REMARQUE: Cette section utilise un moule imprimé en 3D constitué d'une base cylindrique (diamètre: 2,2 cm, hauteur: 7,0 mm) aNd neuf pyramides carrés sur le dessus (longueur latérale: 4,0 mm, angle oblique: 60 °), organisés dans un tableau 3 x 3, comme le montre la figure 3E . Le processus de fabrication d'additifs utilisant des imprimantes 3D disponibles dans le commerce est bien documenté. Le logiciel de conception assisté par ordinateur peut être utilisé pour concevoir le moule. Le fichier de conception résultant peut ensuite être converti numériquement en un chemin d'outil pour une imprimante 3D. Chaque imprimante possède des spécifications différentes et les instructions pour configurer et utiliser une imprimante 3D varient en conséquence.
    1. Utilisez un foret de 3/32 po pour percer 16 trous dans un réseau 4 x 4 (longueur latérale: 4 cm, séparation des trous: 1 cm), centré dans le couvercle d'une boîte à pétri de 10 cm. À l'intérieur d'une hotte chimique, utilisez La partie inférieure de la boîte de Petri pèse 27 g de polydiméthylsiloxane (PDMS) et 3 g d'agent de durcissement (pour un rapport de 1:10). Incorporer une micro-spatule pour distribuer l'agent uniformément.
    2. Couvrir le PDMS / agent de durcissement avec le couvercle perforé. Raccorder une extrémité d'un tuyau au videM port de la hotte et insérer l'autre extrémité dans la tige d'un entonnoir (diamètre de la bouche: 10 cm, longueur de la tige: 3 cm, diamètre de la tige: 1,5 cm).
    3. Faites une ouverture avec un foret de 3/32 "au sommet d'une ampoule à pipette de 1 mL et insérez et fixez une pointe de micropipette de 1000 μL dans l'ouverture (avec l'extrémité pointue vers le haut). Placez l'ampoule et la pointe dans le tuyau et tirez Le tuyau vers le haut jusqu'à ce que l'ampoule scelle le tuyau dans la tige de l'entonnoir.
    4. Placez l'entonnoir sur le couvercle du récipient perforé et fixez le flexible avec un support robuste disponible. Ouvrir la soupape de vide pendant 5 min à l'aspiration et amener les bulles d'air à la surface.
    5. Fermez la vanne, retirez l'entonnoir et frappez la boîte de Petri contre la surface de la hotte de fumée ~ 3 fois pour éclater les bulles d'air restantes.
    6. Placez un moule imprimé 3D pyramidal-poil dans chacun des puits dans une plaque de culture à 12 puits, les pyramides pointant vers le haut. Verser le PDMS / agent de durcissement sur les moules jusqu'à chaque puits de tIl est rempli. Couvrir la plaque à 12 puits avec son couvercle et la transférer dans un four pendant 1 heure à 60 ° C pour sécher.
    7. Retirez avec précaution chaque ensemble de micro-puits PDMS ( Figure 3F ) de la plaque avec une micro-spatule. Couvrir les tableaux PDMS avec du papier d'aluminium et stériliser en autoclave. À l'intérieur d'un coffret de sécurité biologique, insérez un réseau de micro-puits dans chaque puits d'une plaque à 12 puits ( Figure 2B ).
  2. L'isolement des neurones corticaux des fœtus de rat
    1. Ajouter ~ 20 ml de la solution salée équilibrée de Hank (HBSS) à chacune de quatre à six boîtes de Petri de 10 cm (un pour chaque tissu disséqué) à l'intérieur d'un coffret de sécurité biologique. Transférez ces plats dans un capuchon de dissection et placez-les sur de la glace. Stériliser les instruments de dissection, tels que des microscalpes, des ciseaux et des pinces, avec un stérilisateur à perles chaudes.
    2. Matière basale du neurone embryonnaire pré-chaud + 2% de supplément sans sérum + L-glutamine 0,4 mM (appelée "milieu de culture" iciR) et 0,25% de trypsine + 1 mM d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) à 37 ° C. Décongeler la désoxyribonucléase (DNase) I en la plaçant à température ambiante. Préparer 1,5 ml d'une solution de DNAse I 0,15 mg / mL dans du HBSS et maintenir la solution sur la glace.
    3. Éuthaniser un rat embryonnaire à durée de vie enceinte-18 par inhalation de dioxyde de carbone et confirmer la mort par décapitation. Transférez la carcasse sur un capuchon de dissection stérile et posez-le vers le ventral vers le haut. Rincer soigneusement l'abdomen avec de l'éthanol à 70%.
    4. Ouvrez l'utérus et retirez les fœtus (habituellement ~ 11) des sacs amniotiques avec des ciseaux et transférez-les avec des pinces dans une boîte de Petri contenant HBSS froid, comme décrit 48 . Placez un bloc de granite refroidi (-20 ° C) sous le stéréoscope. Placez la boîte de Petri à la surface de ce bloc froid pour conserver la basse température du HBSS tout au long de la procédure de dissection.
    5. Rincez les chiots en bousculant le HBSS et ensuite transférez-les au prochain plat propreContenant HBSS. À l'aide du stéréoscope et des instruments de dissection, retirez séquentiellement les têtes, les hémisphères cérébraux et les cortices des fœtus et transférez chaque tissu avec une pince à un nouveau plat rempli de HBSS après chaque dissection 48 .
    6. Aspirer uniquement les cortices avec une pipette Pasteur et placer le tissu dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL. Jeter les autres tissus disséqués. Rincez les cortices trois fois en ajoutant séquentiellement et en enlevant 5 ml de HBSS avec une pipette sérologique. Placez le tube sur de la glace lorsqu'il n'est pas utilisé.
    7. Transférer les corticaux avec une pipette Pasteur dans un tube de 15 ml contenant de la trypsine préchauffée-EDTA (4-6 cortises par 5 ml de trypsine-EDTA). Agiter manuellement le tube une fois et le placer à 37 ° C. Inverser le tube toutes les 3 minutes pour éviter que le tissu ne s'agglutine.
    8. Arrêtez l'exposition à la trypsine après ~ 10 min en enlevant le tissu avec une pipette Pasteur et en le transférant dans une centrifugeuse propre de 15 mLtube. Ajouter la solution de 0,15 mg / ml de DNase I (1,5 ml) au tube avec une pipette.
    9. Utilisez une pipette Pasteur pour séparer manuellement les touffes de tissu et ensuite tourbillonner (~ 30 s) jusqu'à ce que la solution semble homogène et qu'il n'y a pas de fragments de tissu restants dans le liquide. S'il n'est pas possible d'homogénéiser complètement la solution, extraire les fragments insolubles en les tirant dans la pointe d'une pipette Pasteur.
    10. Centrifuger la solution cellulaire homogène obtenue à l'étape 2.2.9 à 200 xg pendant 3 min. Retirer le surnageant avec une pipette Pasteur, en prenant soin de ne pas déranger les cellules granulées. Ajouter 2 ml de milieu de culture avec une pipette sérologique et un vortex pour réinstaller les cellules.
    11. Compter le nombre de cellules dans la solution préparée à l'étape 2.2.10 en utilisant un hémocytomètre; Le rendement prévu est de 3,0-5,0 x 10 6 cellules / l'hémisphère cortical. Préparer 1 ml ou plus de suspension cellulaire dans un milieu de culture, avec une densité de 1,0 à 2,0 x 10 6 cellules / ml.
  3. Formation d'agrégats de cellules neuronales
    1. Avec une micropipette, ajouter 12 μL de la suspension cellulaire 1.0-2.0 x 10 6 / mL dans chaque micro-puits du réseau PDMS (qui a été placé dans la plaque à l'étape 2.1.7).
      NOTE: La concentration de la cellule peut être ajustée en fonction de l'ID de micro-colonne et de la taille d'agrégat cellulaire souhaitée, car les concentrations plus élevées donnent des agrégats plus importants.
    2. Centrifuger la plaque à 200 xg pendant 5 min pour forcer l'agrégation des cellules au bas des micro-puits ( Figure 2B ). Ajoutez soigneusement ~ 2 mL de milieu de culture au sommet de chaque réseau PDMS pour couvrir tous les micro-puits ensemencés, en prenant soin de ne pas déranger les cellules agrégées.
    3. Si les cellules ne sont pas transduites avec un vecteur viral, incuber la plaque pendant 12-24 h à 37 ° C et 5% de CO 2 , puis passer à la section 3. Si les agrégats sont transduits, ignorer l'incubation et passer à la section 2.4 .
  4. TranSduction avec un vecteur viral pour observer la signalisation du calcium
    Note: Ces étapes sont effectuées pour transduire les neurones avec un vecteur viral contenant un indicateur de calcium génétiquement codé (GECI). Les résultats présentés dans cet article ont été obtenus en utilisant un virus adéno-associé commercialisé (AAV) (sérotype 1) avec GCaMP6f, un GECI avec une cinétique rapide consistant en protéines fluorescentes vertes (GFP), calmoduline (CaM) et le peptide M13, Conduit par le promoteur humain Synapsin I. La solution de vecteur viral peut nécessiter une dilution dans un DPBS stérile avant la transduction, en fonction de la concentration de la solution mère. La santé des cellules / la morphologie et la puissance du signal GCaMP6f doivent être observées dans le temps pour une gamme de concentrations vectorielles. Cette procédure d'optimisation doit être effectuée par chaque enquêteur pour déterminer le titre approprié pour ses propres cultures cellulaires. Le temps d'expression GCaMP6f typique est de 7 à 8 jours suivant la transduction qui se produit pendant l'incubation effectuée en stEp 2.4.2.
    1. Avec une micropipette, ajoutez le volume requis de la solution vecteur viral (pour une concentration finale de ~ 3,0 x 10 9 copies génomiques par agrégat) au milieu de culture, couvrant les agrégats. Poussez lentement les pipettes vers le haut et vers le bas pour vous assurer que la solution vectorielle est répartie de manière homogène dans tout le milieu de culture.
    2. Incuber la plaque avec les micro-puits pyramidaux ensemencés pendant 24 h à 37 ° C et 5% de CO 2 pour permettre la transduction virale de GCaMP6f.

3. Développement de la composante cellulaire des micro-TENN

  1. Fabrication du noyau ECM
    1. Après incubation globale, ajouter du collagène et de la laminine de type I au milieu de culture (pour une concentration de 1 mg / ml chacun) dans un tube de microcentrifugeuse pour préparer la solution ECM. Effectuez les étapes 3.1.2-3.1.4 à température ambiante, mais maintenez le tube avec ECM sur de la glace lorsqu'il n'est pas utilisé pour éviter une gélification prématurée.
    2. Ajuster le pH de la solution ECM en transférant 1-2 μL au papier de tournesol pour vérifier le pH initial, en ajoutant 1 μL d'hydroxyde de sodium 1 N (NaOH) et / ou d'acide chlorhydrique 1 N (HCl) à l'ECM, au besoin, Et répéter jusqu'à ce que le pH soit de 7,2 à 7,4. Assurer l'homogénéisation de la solution ECM en pipetant vers le haut et vers le bas tout en évitant la formation de bulles d'air.
    3. Transférer les micro colonnes avec des pinces stérilisées à partir de la vaisselle à l'étape 1.4.3 pour vider des boîtes de Petri de 35 ou 60 mm. Travailler sur 4-5 micro-colonnes à la fois pour éviter la déshydratation. Fixez une pointe de 10 μL à une pointe de 1000 μL à une micropipette. En utilisant le stéréoscope pour le guidage visuel, placez la pointe à une extrémité des micro colonnes et aspiratez pour extraire les DPBS résiduels et les bulles d'air de la lumière.
    4. Dessinez rapidement 4-5 μL d'ECM dans une micropipette. Observer sous un steEnrouler, placer la pointe de la micropipette à l'une des extrémités des micro colonnes et décharger suffisamment d'ECM pour remplir la lumière. Confirmer l'absence de bulles d'air dans la lumière, car cela peut entraver la croissance axonale à travers l'ECM. Si des bulles d'air existent, retirez l'ECM, comme expliqué à l'étape 3.1.3, et ajoutez l'ECM à nouveau.
    5. Pour éviter la déshydratation, ajoutez ~ 2 μL d'ECM autour de chaque micro-colonne. Incuber les micro colonnes hydrogel / ECM dans les boîtes de Petri à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 25 min. Procéder à l'ensemencement cellulaire immédiatement après l'incubation.
      NOTE: La période d'incubation à l'étape 3.1.5 est destinée à donner du temps à la polymérisation du collagène et de la laminine dans les micro-colonnes.
  2. L'ensemencement de cellules neuronales dans les micro-colonnes
    REMARQUE: Pour changer le milieu de culture des agrégats transduits, inclinez la plaque, utilisez une micropipette pour enlever le milieu qui se couche sur la paroi du puits, puis ajoutez lentement ~ 1 mL contre leMur (pour éviter de perturber les agrégats dans les micro-puits pyramidaux). Répétez cette modification moyenne une deuxième fois.
    1. Après la période d'incubation à l'étape 3.1.5, transférez environ 10-20 μL de milieu de culture à deux zones libres dans les boîtes de Petri contenant les micro colonnes. Utilisez une micropipette pour transférer individuellement les agrégats dans la boîte de Petri contenant les constructions et les déplacer avec une pince à l'un des petits pools de milieu de culture pour préserver la santé des cellules.
    2. En observant sous un stéréoscope, insérez un agrégat à chaque extrémité des micro-colonnes pour les micro-TENN bidirectionnels ou à une extrémité pour une architecture unidirectionnelle (comme vous le souhaitez) à l'aide de pinces. Confirmez le placement des agrégats dans les micro-colonnes à l'aide du stéréoscope. Utilisez une pince pour déplacer les micro-colonnes ensemencées vers l'autre petit bassin de milieu de culture pour éviter la déshydratation et pour préserver la santé globale.
    3. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 45 minutes à unLes agrégats doivent adhérer à l'ECM. Vérifiez que les agrégats restent aux extrémités des micro-colonnes à l'aide du stéréoscope; Réintroduire les agrégats cellulaires et répéter l'étape d'incubation au besoin.
    4. Involez soigneusement les boîtes de Petri contenant les micro-TENN avec un milieu de culture (3 ou 6 mL pour une boîte de Petri 35 ou 60 mm, respectivement) à l'aide d'une pipette sérologique. Placer la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2 pour une culture à long terme.
    5. Effectuer des changements à mi-média tous les 2 jours avec un milieu de culture. Retirez soigneusement la moitié du vieux support avec une pipette et utilisez le stéréoscope pour obtenir un guidage visuel pour éviter d'aspirer les micro-TENN. Remplacer en ajoutant lentement du milieu frais et préchauffé avec une pipette.
    6. Pour réutiliser les réseaux de micro-puits PDMS, enlever le milieu de culture, faire bouillir les tableaux dans de l'eau désionisée pendant 30 min et stériliser dans un autoclave pour un autre cycle de formation et de culture d'agrégats.
      REMARQUE: aux horaires souhaités, leLa cytoarchitecture des micro-TENN peut être vérifiée à l'aide d'une microscopie à contraste de phase. Ici, un temps d'exposition de 5-8 ms et 10X (0,64 μm / pixel) et 20X (0,32 μm / pixel) ont été utilisés pour capturer les images en contraste de phase. La fluorescence associée aux changements de concentration de calcium dans les micro-TENN transduits par voie virale a été capturée à l'aide d'un microscope à fluorescence à grande vitesse avec un temps d'exposition de 50 ms, un objectif 10X (0,64 μm / pixel) et une lumière à semi-conducteurs avec des filtres passe-bande de ~ 480 Nm et ~ 510 nm pour l'excitation et l'émission, respectivement, pour visualiser le signal de fluorescence GCaMP6f.

4. Immunocytochimie pour études in vitro

Remarque: Pour les images présentées ici, on a utilisé les anticorps primaires suivants: tubuline anti-Tuj-1 / beta-III de souris (1: 500) et anti-synapsine-1 de lapin (1: 500) pour l'étiquetage des axones et pré -synaptiques boutons, respectivement. Les anticorps secondaires étaient anti--mouse 568 (1: 500) et âne anti-lapin 488 (1: 500). Les volumes requis des solutions d'anticorps primaires et secondaires préparés, ainsi que les volumes du formaldéhyde, du sérum du cheval et des solutions détergentes dépendent du volume nécessaire pour couvrir entièrement les constructions. Ces volumes peuvent être minimisés en utilisant un stylo barrière hydrophobe pour limiter la zone entourant chaque micro-colonne.

ATTENTION: Cette section utilise du formaldéhyde et Hoechst. Le formaldéhyde est un composé toxique connu pour être cancérogène, et Hoechst est un mutagène connu. Par conséquent, ces composés doivent être éliminés dans un récipient de déchets approprié. Toujours les manipuler dans une hotte chimique lors de l'utilisation d'un équipement de protection individuelle approprié, comme une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants.

  1. Préparez une solution de formaldehyde de 4,0% volume / volume (v / v) dans 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS) à l'intérieur d'une hotte chimique.
  2. Retirer le milieu de culture des boîtes de Petri contenuesNg les micro-TENN avec une micropipette. Ajouter suffisamment de volume de la solution de formaldéhyde à la vaisselle pour couvrir complètement les micro-TENN. Faire tremper les micro-TENN dans la solution de formaldéhyde pendant 35 min à 18-24 ° C pour réparer les cellules dans les micro-colonnes.
  3. Retirez la solution de formaldehyde 4,0% des boîtes de Petri avec une pipette et laissez-les conformément aux directives appropriées en matière d'élimination des matières dangereuses.
  4. Effectuez deux rinçages rapides en ajoutant suffisamment de PBS pour couvrir entièrement les micro-TENN fixes, puis en retirant le PBS avec une pipette. Effectuer un troisième long rinçage en trempant les constructions dans le PBS pendant 10 min.
    ATTENTION: Jeter le PBS utilisé pour le rinçage contenant éventuellement des traces de formaldéhyde.
  5. Préparer une solution à 0,3% v / v de détergent non ionique dans du sérum de cheval à 4% v / v dans du PBS. Retirez le PBS des boîtes de Petri contenant les micro-TENN fixes et ajoutez un volume suffisant de la solution détergente à 0,3% pour couvrir les constructions. Tremper pendant 60 min à 18-24 et176; C pour perméabiliser les cellules.
  6. Retirez la solution de détergent avec une pipette. Effectuez deux rinçages rapides en ajoutant et en enlevant ensuite le PBS. Ensuite, effectuez trois rinçages plus longs en trempant les constructions dans PBS pendant 5 minutes pendant chaque rinçage.
  7. Diluer les anticorps primaires dans 4% de sérum de cheval. Retirez le PBS des boîtes de Petri contenant les micro-TENN fixes et perméabilisées. Ajoutez suffisamment de solution d'anticorps primaire aux micro-colonnes pour les couvrir complètement. Sceller les boîtes de Petri avec du parafilm pour éviter l'évaporation et incuber pendant une nuit (12-16 h) à 4 ° C.
  8. Retirez la solution d'anticorps primaire de la vaisselle et rincez comme expliqué à l'étape 4.6. Dans le noir, préparer la solution d'anticorps secondaire dans 4,0% de sérum de cheval. Ajoutez suffisamment de solution d'anticorps secondaire pour couvrir complètement les constructions, recouvrir la vaisselle avec du papier d'aluminium et incuber pendant 2 h à 18-24 ° C.
  9. Préparez la solution Hoechst (1: 10 000) dans PBS pour tacher les noyaux.
  10. NOTE: Les images pour les micro-TENN immunomarqués ont été prises avec un microscope confocal laser avec une résolution de 2,048 (~ 8 s / trame), un objectif 10X (0,64 μm / pixel), une excitation de 487 nm et des longueurs d'onde d'émission de 525 nm pour La fluorescence verte, l'excitation de 561 nm et les longueurs d'onde d'émission de 595 nm pour la fluorescence rouge et ~ 3,22 μm / tranche avec ~ 60 tranches en moyenne pour les piles z.

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Representative Results

Les micro-TENN ont été surveillés à l'aide d'une microscopie à contraste de phase pour évaluer leur cytoarchitecture et leur croissance axonale ( Figure 4 ). Au sein de micro-TENNs unidirectionnels de 2 mm de long, les agrégats neuronaux étaient limités à une extrémité de la micro-colonne et prévoyaient un faisceau d'axones à travers le noyau interne. Les axones ont parcouru toute la longueur de la colonne pendant 5 jours in vitro (DIV) ( Figure 4A ). Il y a eu un taux de croissance axonale initiale plus élevé dans les micro-TENN bidirectionnels de 2 mm de long, car les axones ont parcouru la micro-colonne entière par 3 DIV ( Figure 4B ). Par 5 DIV, les micro-TENN bidirectionnels présentaient des parcelles axonales denses qui reliaient les agrégats maintenus aux extrêmes de la micro-colonne. Cette cytoarchitecture a également été observée dans des micro-TENN de 5 mm, avec des axones couvrant la micro-colonne par 5 DIV ( Figure 4C ). Comme cela a été observé dans tous les cas, l'ECM dans la lumière et le reste géométriqueCtion présentée par l'agarose a fourni la directionnalité requise pour former des parcelles axonales qui imitent de façon structurelle les caractéristiques de la neuroanatomie native.

Des techniques d'immunocitochimie ont été appliquées dans ce protocole et des images confocales ont été prises pour vérifier les composants de l'architecture micro-TENN. Les noyaux cellulaires colorés avec Hoechst (bleu) ont été localisés presque exclusivement dans des agrégats aux extrêmes des micro-colonnes unidirectionnelles et bidirectionnelles, avec essentiellement une coloration Hoechst à l'intérieur ( figure 5 ). Cette observation a confirmé ce qui a été déduit des images de contraste de phase: les populations neuronales étaient limitées aux extrémités, et seuls les axones (en rouge) s'étendaient sur la lumière des micro-TENN. Cependant, après que les axones ont traversé les agrégats, la migration cellulaire a été observée le long des parcelles axonales dans la lumière intérieure, observée par la présence de noyaux (bleu) à l'intérieur à 28 DIV pour un bidire de 2 mm de longMicro-TENN ( Figure 6 ). En outre, l'immunolabellation de synapsine I (vert) a été retrouvée dans les corps cellulaires et les tronçons axonaux ( figure 6 ). La synapsine I est une protéine terminale pré-synaptique impliquée dans la régulation de la libération de neurotransmetteurs et indique la présence de terminaux pré-synaptiques lorsqu'ils sont trouvés dans une distribution ponctuée; Il a déjà été corrélé avec la formation de synapses actives par des enregistrements de patch de cellules entières 49 . La coloration de la synapsine dans la zone centrale riche en axone du micro-TENN est probablement une combinaison de puncta ainsi que de la synapsine transportée vers le bas des axones vers les terminaux pré-synaptiques. Néanmoins, la présence de synapsine puncta dans les agrégats micro-TENN suggère que ces constructeurs ont la capacité de communiquer par des synapses, bien que la colocalisation de la synapsine avec une protéine post-synaptique soit nécessaire pour d'autres signes structurels de synapses fonctionnelles. </ P>

Les micro-TENN ont également été fabriqués avec des neurones agrégés qui ont été transduits avec un AAV contenant l'indicateur de calcium GCaMP6f afin de détecter préalablement les propriétés électrophysiologiques de ces constructions. Ces constructions ont exprimé l'indicateur de calcium sur toute leur longueur, comme en témoigne la fluorescence dans les agrégats neuronaux et les tronçons axonaux ( figure 7A ). Notons qu'en raison des paramètres du microscope visant à maximiser l'intensité dans les agrégats, la fluorescence dans les parcelles axonales était plus faible. Ces micro-TENN transduits ont été analysés au fil du temps avec une microscopie à fluorescence à grande vitesse (sans stimulation électrique externe) et plusieurs régions d'intérêt de taille cellulaire (ROI) ont été sélectionnées au hasard dans un micro-TENN représentatif pour caractériser la capacité de signalisation de ces Constructions. Des rafales de concentration de calcium ont été observées dans presque tous les ROI, comme en témoignent les assocOnt influencé les intensités de fluorescence fluctuantes tout au long du temps ( figure 7B ). Particulièrement, divers ROI semblent montrer une périodicité presque constante de la concentration de calcium augmente ( figure 7B ). Ces changements de concentration de calcium sont supposés être le résultat de potentiels d'action spontanés et inhérents, la signalisation cellulaire dans des agrégats individuels et / ou la signalisation à travers des axones à partir d'agrégats distincts. D'autres analyses sont nécessaires pour caractériser pleinement les propriétés électrophysiologiques des neurones et des parcelles axonales au sein des micro-TENN. Néanmoins, ces résultats initiaux démontrent que les micro-TENN présentent une activité électrique endogène / basique robuste.

figure 3
Figure 3: Plans de l'appareil de fabrication de micro-colonnes à coupe laser et du moule pyramidal à micro-puits 3D pour l'agrégation cellulaire. ( A) - ( B ) Modèle et image des moitiés inférieure et supérieure du réseau de canaux cylindriques, respectivement, utilisés pour fabriquer les micro colonnes d'hydrogel. ( C ) Modèle et image des capuchons utilisés pour maintenir l'appareil ensemble. Les pièces antérieures et postérieures partagent les mêmes dimensions. ( D ) Image de l'appareil assemblé requis pour fabriquer les micro-colonnes. Seuls les deux capuchons et la moitié inférieure sont serrés avec des vis dans les deux trous d'alignement inférieurs (gauche). Les lignes interrompues montrent le placement des aiguilles d'acupuncture à travers les cinq trous de chaque capuchon. L'agarose liquide est ajouté à la moitié inférieure des cylindres et, ensuite, la moitié supérieure (droite) est placée sur le dispositif pour mouler l'agarose liquide en forme. ( E ) Modèle des moules imprimés en 3D utilisés pour créer des tableaux micro-puits PDMS. ( F ) Images du moule imprimé 3D (à gauche) et des tableaux micro-puits PDMS (à droite). Toutes les dimensions sont en milli Mètres (mm). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Observation de la croissance axonale dans le micro-TENNS par imagerie à contraste de phase des constructions unidirectionnelles et bidirectionnelles en fonction des jours in vitro . ( A ) Les micro-TENN unidirectionnels de 2 mm de long montrent des tracés axiaux s'étendant sur presque toute la longueur de la micro-colonne par 5 DIV. ( B ) Comparé aux micro-TENN unidirectionnels, les micro-TENN bidirectionnels de 2 mm affichent un taux de croissance axonal plus rapide. ( C ) Pour les micro-TENN bidirectionnels de 5 mm, les parcelles axonales peuplent la longueur de la micro-colonne à 5 DIV. Cette architecture est maintenue au moins jusqu'à 10 DIV. Barres d'échelle = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: cytoarchitecture Micro-TENN observée avec des images confocales de micro-TENN unidirectionnels et bidirectionnels immunomarqués. Les cellules ont été colorées pour les noyaux cellulaires (Hoechst, bleu) et les axones (Tuj1, rouge). ( A ) Image à contraste de phase d'un micro-TENN bidirectionnel de 5 mm (28 DIV). Les reconstitutions confocales ( D ) - ( F ) et ( I ) - ( K ) d'un micro-TENN bidirectionnel à 5 ​​mm (28 DIV) et un micro-TENN unidirectionnel (25 DIV), respectivement, montrent les noyaux cellulaires marqués ( D ), ( I ) Et les axones ( E ), ( J ), ainsi que la superposition ( F ), ( K ). Barres d'échelle: 500 μm. Inserts dans ( A F ) et ( K ) se réfèrent aux agrégats de contraste de phase ( B ) - ( C ) et confocal ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) des agrégats neuronaux et des parcelles axonales . Les images montrent les agrégats restreints aux extrémités du micro-TENN, tandis que la lumière est parcourue par des tronçons axiaux alignés. Barres d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6: Expression de la protéine terminale pré-synaptique synapsine I dans un micro-TENN bidirectionnel représentatif. La construction a été colorée pour les noyaux cellulaires (Hoechst, bleu), les axones (Tuj1; rouge) et les boutons pré-synaptiques (synapsine I, vert). ( A ) Phase-contrAst image d'un micro-TENN bidirectionnel de 2 mm à 28 DIV. ( D ) - ( G ) Des reconstructions confocales montrant les noyaux cellulaires ( D ), les axones ( E ), les boutons pré-synaptiques ( F ) et une superposition ( G ) des trois canaux. Les boîtes montrent les zoom-ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) des images de contraste de phase et de superposition pour les agrégats neuronaux, respectivement. Barres d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7: Activité de signalisation spontanée dans un micro-TENN bidirectionnel observé par l'expression d'un indicateur de calcium génétiquement codé. ( A ) FluorescentsLa microscopie a confirmé l'expression du reporter GCaMP, observée par fluorescence dans les agrégats et les axones. Barre d'échelle = 100 μm. ( B ) Les changements de fluorescence associés aux variations de la concentration de calcium ont été mesurés sans stimulation externe à plusieurs régions d'intérêt (ROI) en fonction du temps. Les cercles de couleur numérotés dans ( A ) désignent ces ROI. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8: images à contraste de phase de modes d'échec commun dans la méthodologie micro-TENN. ( A ) Une micro-colonne d'agarose complètement déshydratée / séchée résultant de l'élimination et / ou de l'évaporation du DPBS dans les étapes initiales de fabrication. Barre d'échelle = 5081; m. ( B ) Micro-colonne Hydrogel avec la lumière qui recouvre la paroi extérieure de la construction en raison du manque d'alignement concentrique de l'aiguille d'acupuncture avec le tube capillaire. Barre d'échelle = 100 μm. ( C ) Micro-TENN semé avec les deux agrégats présents à 1 DIV. ( D ) L'un des agrégats est tombé de la même micro-colonne que ( C ) à 3 DIV. ( E ) Micro-TENN unidirectionnel à 4 DIV. ( F ) Les parcelles globales et axonales sont tombées de la micro-colonne dans ( E ) et restent flottantes dans le milieu de culture à 5 DIV. Barre d'échelle pour ( C ) - ( E ) = 300 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La lésion et la maladie du SNC entraînent généralement la perte ou le dysfonctionnement des voies axonales à longue distance qui comprennent le connecteur du cerveau, avec ou sans dégénérescence neuronale concomitante. Ceci est aggravé par la capacité limitée du SNC à favoriser la neurogénèse et la régénération. Malgré la poursuite de stratégies de réparation telles que le facteur de croissance, la cellule et la délivrance de biomatériaux comme approches individuelles ou combinatoires, ces techniques ne permettent pas simultanément de tenir compte à la fois de la dégénérescence des cellules neuronales et de la perte des connexions axonales 14,22. Ces lacunes dans la technologie limitent la capacité de réparer, de modifier et de sondage des réseaux de neurones de manière contrôlée et soutenue. En conséquence, la technologie micro-TENN a été développée pour répondre à la nécessité d'une stratégie de réparation neuronale qui, contrairement aux méthodes existantes, facilite à la fois le remplacement neuronal et la reconstruction de longues connexions axonales. MicLes ro-TENN sont des échafaudages vivants implantables avec une cytoarchitecture préformée qui s'approche des blocs de construction au niveau des systèmes du connecteur du cerveau qui sont spécifiquement conçus pour la reconstruction ciblée, le remplacement et la modification des circuits neuronaux hôtes. Ces échafaudages sont constitués de population (s) discrète (s) de neurones connectés par de longs axonaux à l'intérieur de la lumière contenant l'ECM des hydrogels cylindriques d'agarose miniatures. Ces constructions peuvent être capables de fonctionner comme des relais synaptiques pour remplacer les voies perdues et la modulation dynamique des circuits natifs. De plus, dans les cas de dégénérescence axonale isolée (avec les neurones sources restant intactes), les micro-TENN peuvent éventuellement servir de guides pour la régénération axonale basée sur le mécanisme de régénération de l'axone facilité par l'axone. Ce manuscrit a présenté le protocole de fabrication pour créer de manière fiable des micro-TENN, avec une géométrie contrôlée, un phénotype et des caractéristiques fonctionnelles. Microscopie à contraste de phase, immunocytochemiStry et la microscopie confocale ont démontré que les micro-TENN produites avec le protocole présentent la cytoarchitecture requise et expriment la synapsine de la protéine terminale pré-synaptique. En outre, il a été montré que les micro-TENN possèdent une activité de signalisation intrinsèque, éventuellement en raison de potentiels d'action, en l'absence de simulation externe. Ceci a été déterminé par la présence de fluctuations presque synchrones dans la fluorescence associée à un journaliste de calcium génétiquement codé.

Le développement de Micro-TENN peut se résumer en trois étapes: (1) la fabrication du tube d'hydrogel creux, (2) l'addition de la solution ECM à la lumière du tube, et (3) l'ensemencement des agrégats de neurones isolés dans le Extrémités du tube. Les micro colonnes peuvent être fabriquées avec des tubes capillaires en verre ou avec un dispositif micro-fabriqué contenant des canaux cylindriques. Cet appareil peut être créé avec n'importe quelle méthode de micro-fabrication de haute précision à la disposition de l'enquêteur. LiquideL'agarose est versé dans les canaux du dispositif ou dans des tubes capillaires contenant une aiguille d'acupuncture centrée pour créer les micro-colonnes d'hydrogel. Après la gélification à l'agarose, l'aiguille d'acupuncture est retirée pour produire la lumière creuse. Plusieurs traits communs se produisant pendant la fabrication ou la croissance sont mis en évidence à la figure 8 . Notez que certaines des images affichées sur la figure 4 et un cas extrême de la figure 8B montrent la partie lumineuse précaremment proche de la paroi du cylindre. Afin de produire une épaisseur de paroi uniforme lors de l'utilisation de la méthode du tube capillaire, l'assemblage de l'aiguille-tube doit être maintenu verticalement lorsqu'il est mis en contact avec de l'agarose et l'aiguille doit être maintenue au centre du tube. Garder l'ensemble tube-aiguille dans un angle par rapport à la surface d'agarose favorise la décentralisation de l'aiguille. Néanmoins, ces précautions sont difficiles à mettre en œuvre, et l'aiguille est le plus souvent au reposG des parois des tubes capillaires. Au contraire, le principal atout de l'appareil micro-fabriqué est qu'il présente des trous d'aiguille concentrés de manière alignée avec les canaux cylindriques, favorisant une centralisation adéquate de l'aiguille et de la lumière par rapport au canal et à la micro-colonne, respectivement. En outre, l'appareil augmente le débit en facilitant la fabrication de plusieurs micro-colonnes en même temps. En dépit de l'avantage fourni par l'appareil, des lumens décentrés peuvent encore être créés en utilisant des aiguilles d'acupuncture courbées. Les techniques de micro-fabrication ont également une tolérance inhérente qui limite leur efficacité. En général, la déshydratation des micro-colonnes, pour laquelle un cas extrême est représenté sur la figure 8A , ne doit pas être un obstacle si les recommandations fournies tout au long du protocole sont suivies. Notez que les propriétés physiques de l'agarose utilisé pour l'encasement extérieur peuvent nécessiter une optimisation pour les sous-types neuronaux alternatifs, car les neurones corticaux améliorésLa croissance urbaine et neuritique à des concentrations d'agarose supérieures (3-4%) par rapport aux concentrations inférieures (1-2%) d'agarose a été observée 10 .

Le développement de Micro-TENN se poursuit avec l'introduction de l'ECM dans la lumière de la micro-colonne, ce qui permet de fournir un environnement adéquat pour l'adhésion neuronale, la survie et la croissance. En outre, l'ECM, en combinaison avec la restriction géométrique et la faible porosité fournie par l'hydrogel d'agarose, limite la croissance axonale à la direction longitudinale pour produire l'architecture requise. Le contenu de la solution ECM peut être optimisé pour le type de neurone utilisé. Par exemple, le collagène seul favorise la survie et l'expansion axonale dans les micro-TENN DRG, alors qu'une combinaison de collagène et de laminine est requise pour les neurones corticaux 10 . En outre, la polymérisation ECM à l'intérieur de la micro-colonne est critique avant le dépôt cellulaire, car la distribution simultanée de cellules avec ECM non polymérisé conduit à une diminution des neuritesOthme et fasciculation 31 . Notez que même si la micro-colonne est initialement remplie d'une solution ECM, son contenu polymérise dans un gel doux et tend à se contracter pendant la période d'incubation, créant un espace qui permet l'insertion des agrégats cellulaires. De plus, il est important de confirmer que l'ECM est entré dans l'intérieur de la micro-colonne en inspectant sous le stéréoscope; L'absence complète et / ou les poches d'ECM manquants entraînent un manque de croissance axonale des agrégats. La fabrication de Micro-TENN culmine dans l'ensemencement des agrégats de neurones corticaux aux extrémités de l'échafaudage. Ces neurones ont été disséqués à partir de fœtus de rat en utilisant des procédures connues 48 . On peut déduire que la majorité des cellules isolées sont des neurones car le cortex embryonnaire du rat au moment de la gestation utilisé pour l'isolement est constitué de 99% de neurones et le milieu de culture défini utilisé dans le protocole limitant le métabolisme pour la prolifération de la gliale 49 . Par conséquent, il devrait y avoir une contamination gliale minimale, bien que la coloration des marqueurs spécifiques soit requise pour la confirmation. Bien que ce manuscrit ait présenté une fabrication de micro-TENN avec des neurones corticaux, des neurones de différentes régions du cerveau ( p. Ex ., Nigral, thalamique et hippocampique) ou avec des phénotypes différents ( p. Ex. Excitateur, inhibiteur et dopaminergique) pourraient être utilisés selon l'application souhaitée et Zone d'implantation. Les itérations antérieures du protocole de fabrication micro-TENN impliquaient l'ensemencement de cellules dissociées 10 , 31 , 32 . Bien que la cytoarchitecture souhaitée ait été obtenue en utilisant la méthode dissociée, elle n'a pas été réalisée dans tous les cas. Dans de nombreux cas, les cellules dissociées ont inondé l'intérieur et ont abouti à plusieurs grappes de corps cellulaires dans toute la lumière, avec des processus qui les relient dans un vaste réseau 3DRef "> 10 , 31. La méthode globale, d'autre part, assure le confinement des corps cellulaires aux extrêmes, et est donc partie intégrante du succès de la technologie micro-TENN ( figure 5 ). Les micro-TENN représentatifs ont montré Dans les figures 4-6 ont été fabriqués avec des agrégats plus grands qui n'ont pas été complètement insérés, ce qui peut occasionnellement entraîner l'apparition de granulats dans les micro colonnes en culture, comme les exemples illustrés à la figure 8D et 8E . Pour éviter cela, les agrégats peuvent Être complètement inséré dans l'intérieur de la micro-colonne. Si cette situation se présente même après l'application de la stratégie précédente, la période d'incubation initiale peut être prolongée pour donner suffisamment de temps pour l'adhésion agrégée à l'ECM. Pendant la culture, une manipulation douce des micro-TENNs est Recommandé de préserver l'intégrité de l'enveloppe d'hydrogel et de la cytoarchitecture; des problèmes de micro-TLa manipulation ENN est à l'origine des courbures obtenues dans les parcelles axonales autrement alignées ( figure 5 ). Néanmoins, suivre le protocole présenté dans cet article devrait aboutir à la fabrication cohérente de micro-TENN avec l'architecture neuronale / axonale attendue, la distribution de bouton pré-synaptique et l'activité électrique intrinsèque.

En dépit de la promesse que les micro-TENN tiennent, il reste des défis qui peuvent limiter les applications de cette technologie. La technique actuelle de fabrication des micro-colonnes est limitée par la décentralisation de la lumière de la micro-colonne, ce qui peut provoquer une présentation incohérente des indices mécaniques des cellules ( p. Ex., La rigidité), la rupture de la paroi de la micro-colonne et l'exposition subséquente des voies axonales À l'extérieur, et des problèmes lors de l'implantation. Même si l'utilisation d'un dispositif micro-fabriqué a amélioré le résultat par rapport aux tubes capillaires, une micro-fabricatio de plus haute précisionN techniques sont nécessaires pour augmenter la reproductibilité dimensionnelle de ces constructions. Les résultats de ce manuscrit ont montré que la méthodologie micro-TENN peut produire de manière fiable des échafaudages vivants composés de neurones et de trajets axonaux qui ressemblent à la neuroanatomie native, en particulier les voies axonales qui relient des régions distinctes du cerveau. Néanmoins, la longueur micro-TENN est un obstacle, en fonction de la longueur de la voie axonale hôte qui doit être remplacée. Par exemple, les greffes de nerf de génie tissulaire (TENG) sont une stratégie d'échafaudage séparée utilisée par notre groupe de recherche pour réparer des blessures nerveuses extrêmement longues. Pour remplacer ces longues lacunes, les axones dans les TENG peuvent être allongés à des dizaines de centimètres en appliquant une tension mécanique continue dans les mécano-bioréacteurs personnalisés 1 , 23 , 50 . Cette technique de «stretching stretch» ​​a également été appliquée pour manipuler la longueur de processus astrocytaire à betteImiter la structure des voies radiales de gliale 51 . Au contraire, la technologie micro-TENN actuelle n'offre pas encore cette mesure de contrôle; La longueur maximale atteignable est actuellement limitée par la durée de croissance des parcelles axonales sur la base de l'extension traditionnelle à médiation par cône de croissance. En outre, même si le SNC a une capacité intrinsèque pour le câblage neurophysiologique en réponse à divers stimuli, et les cellules transplantées ont la capacité d'intégrer synaptiquement avec les circuits natifs, une autre limitation de cette technologie est que les micro-TENN s'appuient sur la plasticité du cerveau indigène Et la capacité des réseaux hôtes à s'intègrer fonctionnellement avec la construction implantée 52 , 53 , 54 , 55 . Enfin, une carence innée de toutes les approches implantation, telles que les micro-TENN, est leur invasivité. Puisque les neurones sontGénéralement à proximité des capillaires, tout type de procédure chirurgicale peut entraîner une perturbation de la barrière hémato-encéphalique, une fuite de facteurs sanguins dans le parenchyme du cerveau et une réponse inflammatoire aiguë (voire chronique) 31 . Cette réponse peut endommager les neurones hôte et micro-TENN, en annulant les aspects bénéfiques de cette technique. Néanmoins, les micro-TENN implantés dans la voie corticothalamique des rats ont survécu pendant au moins 1 mois et ont montré des signes d'intégration structurelle avec le cortex cérébral de l'hôte 10 , 31 . En outre, une publication antérieure de notre groupe de recherche a présenté une méthodologie permettant l'implantation sans aiguille de micro-TENN dans les cerveaux de rat 31 . Dans cette approche, cette stratégie d'encapsulation d'hydrogel a été augmentée pour inclure un revêtement mince (~ 20 μm) de carboxyméthylcellulose qui, après une déshydratation légère, présente une rigidité suffisante pour pénétrerLe cerveau sans nécessiter une aiguille ou un guide 31 . Cette méthode d'implantation sans aiguille, couplée à la petite section transversale des micro-colonnes, devrait minimiser les dommages au cerveau pendant et après la procédure d'implantation stéréotaxique.

Malgré le succès préliminaire des micro-TENN in vivo , les études futures devront confirmer que ces constructions s'intègrent de manière synaptique avec le tissu indigène et pour déterminer si la récupération fonctionnelle est obtenue dans les modèles de lésions du SNC et de maladies neurodégénératives 10 , 31 . Par exemple, les micro-TENN sur mesure peuvent être conçus avec des phénotypes cellulaires spécifiques et implémentés dans la voie dégénérée correspondante pour reconstruire le réseau et restaurer la fonction. Pour réduire la réponse inflammatoire aiguë après l'implantation, l'enveloppe d'hydrogel micro-TENN peut être dopée avec des agents anti-inflammatoires et pro-survie. Fabrication alternativeDes techniques ( par exemple, une impression 3D) peuvent être développées pour générer les micro colonnes hydrogel avec plus de facilité et avec des caractéristiques plus précises, y compris une centralisation cohérente de la lumière et la reproductibilité des dimensions. Le même système de biomatériaux utilisé avec les micro-TENN peut être modifié pour s'attaquer à d'autres pathologies caractéristiques des lésions et des maladies du SNC. Par exemple, notre groupe a précédemment développé des constructions constituées de faisceaux astrocytaires alignés longitudinalement le long de la lumière liée au collagène d'un hydrogel d'agarose qui imite structurellement les voies radiales de gliale et le tube glial pour faciliter la régénération axonale et la migration neuronale 56 . De plus, les cellules souches, telles que les cellules souches embryonnaires humaines (HESC), les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules souches dérivées d'adipose (ASC), peuvent être incorporées pour fabriquer des micro-TENN autologues de façon patiente à plus Ressemblent étroitement à la cytoarchitecture perdue et au phénotype cellulaire. Ce futuLes modifications apportées augmenteraient la capacité des micro-TENN à remplacer les voies dégénérées in vivo et permettraient la reconstruction d'architectures tissulaires plus sophistiquées, en incorporant un support astroglial et une myélinisation axonale, entre autres caractéristiques. Les neurones génétiquement modifiés pourraient également être ensemencés pour augmenter l'action régénératrice des micro-TENN par la libération de facteurs trophiques ou permettre la modulation du SNC par la stimulation optogénétique des canaux ioniques à lumière 43 . Ces échafaudages pourraient être fabriqués avec des neurones excitateurs ou inhibiteurs pour moduler de manière synaptique les connexions existantes de l'hôte dysfonctionnel dans des conditions telles que l'épilepsie, la dépression, la toxicomanie ou les troubles de la douleur 1 . Par exemple, les micro-TENN formant principalement des synapses GABAergiques ou glutamatérgiques peuvent être construits pour supprimer ou stimuler, respectivement, des voies ascendantes ou dédisciplinées par intégration synaptique et / ou par néant en vracSortie de l'émetteur. Il est important de noter que ces constructions modulatrices autonomes seraient théoriquement sensibles en fonction du retour 1 du réseau hôte. De même, les micro-TENN peuvent être appliqués comme interfaces cerveau-ordinateur (BCI), avec des micro-TENN fabriqués par optogenetically servant d'intermédiaires entre le cerveau et des dispositifs de stimulation ou d'enregistrement inorganiques. Cette application peut être une alternative aux micro-électrodes de microélectrode, qui n'ont pas de ciblage cellulaire spécifique et de stabilité mécanique et ont causé des réponses inflammatoires, une formation de cicatrices gliales et une migration ou une perte neuronale lorsqu'elles sont pénétrées dans le cerveau 57 , 58 .

En tant que bancs d'essai in vitro , les micro-TENN peuvent constituer une plate-forme puissante pour l'étude de la neurobiologie et de l'électrophysiologie, qui servent de modèles biofidéliques du système nerveux. En outre, les constructions 3D peuvent servir de banc d'essai pour les stratégies de traitement lorsqu'elles sont utilisées comme injuresUry et les modèles de maladie 59 . En tant que constructions en 3D, les micro-TENN sont capables de simuler l'environnement in vivo , qui se caractérise par des interactions cellulaires et cellulaires complexes dans toutes les directions spatiales qui ne peuvent être représentées avec précision dans les cultures planes 42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 . En effet, de nombreuses recherches ont établi que le type d'environnement est essentiel pour que les cellules présentent la morphologie, la prolifération, la migration, l'expression des gènes, la différenciation et la signalisation dans le cadre natif 60 . Les similitudes entre l'environnement 3D de ces échafaudages et le cerveau lui-même sont complétées par le degré de contrôle que ces constructions offrent sur leurs produits physiques et biochimiquesOpéras 42 . Cela permet l'ingénierie de micro-TENN avec différents ensembles de signaux mécaniques, haptotaxiques et chimiotaxiques pour étudier l'effet de ces indices, individuellement ou en synergie, sur la survie neuronale, la maturation, l'extension axonale, la synaptogenèse et la mécanotransduction 32 , 42 , 63 . En outre, la flexibilité de conception de cette technique d'ingénierie de micro-tissus permet la construction d'échafaudages vivants qui imitent d'autres caractéristiques du tissu cérébral, telles que la structure en forme de colonne, compartimentée du néocortex, traversée par les tronçons axonaux du connecteur, pour augmenter encore la Le pouvoir de ce système en tant que plate-forme in vitro pour étudier le cerveau 65 . En tant que plates-formes expérimentales, les micro-TENN profitent du réglage contrôlé des modèles in vitro typiques, de la disponibilité étendue des paramètres de conception dans les tissus enLes approches gineuses et la pertinence physiologique et pathophysiologique accrue des plateformes 3D pour devenir un test idéal pour faire progresser les connaissances neurobiologiques. La myriade d'orientations futures pour cette technologie incarne la polyvalence des micro-TENN. Ce manuscrit a démontré que le protocole micro-TENN peut produire de manière fiable des échafaudages vivants modifiés par des tissus qui imitent les caractéristiques cruciales de la neuroanatomie du cerveau pour offrir de nouvelles idées sur les phénomènes neurobiologiques, y compris les processus de développement, de maladie et de réparation. Ces constructions peuvent également s'intégrer de manière synaptique avec le tissu indigène pour reconstituer les voies de la matière blanche endommagées, remplacer les cellules neuronales perdues et moduler les voies dérégulières après une lésion et une maladie du SNC.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Le soutien financier a été fourni par les National Institutes of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) et F31-NS090746 (Katiyar)), la Fondation Michael J. Fox (Programme thérapeutique sur les pipelines n ° 9998 (Cullen)), Le Prix pilote Penn Medicine Neuroscience Center (Cullen), la Fondation nationale pour la science (bourses de recherche pour les diplômés DGE-1321851 (Struzyna et Adewole)), le ministère des Anciens Combattants (RR et D Merit Review # B1097-I (Cullen)), l'American Association Des chirurgiens neurologiques et du Congrès des chirurgiens neurologiques (2015-2016 Codman Fellowship in Neurotrauma and Critical Care (Petrov)) et le Commandement de la recherche médicale et du matériel de l'armée américaine (# W81XWH-13-207004 (Cullen) et W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

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References

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16, (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67, (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27, (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31, (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48, (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21, (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26, (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11, (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6, (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106, (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6, (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11, (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3, (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20, (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3, (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14, (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23, (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116, (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24, (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80, (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25, (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44, (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5, (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).

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