En all-on-chip metode for rask nøytrofilt kjemotaksisanalyse direkte fra en bloddråpe

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikkelen gir den detaljerte metoden for å utføre en rask nøytrofilt kjemotaksisanalyse ved å integrere on-chip nøytrofilisolasjon fra helblod og kjemotaksistesten på en enkelt mikrofluidisk chip.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrofile migreringer og kjemotaksier er kritiske for kroppens immunsystem. Mikrofluidiske enheter brukes i økende grad for å undersøke neutrofilmigrasjon og kjemotaks, på grunn av deres fordeler i sanntidsvisualisering, presis kontroll av kjemisk konsentrasjonsgradientgenerering, og redusert reagens og prøveforbruk. Nylig er det gjort en økende innsats av de mikrofluidiske forskerne mot utvikling av integrerte og lettstyrte mikrofluidiske kjemotaksanalysesystemer, direkte fra helblod. I denne retning ble den første all-on-chip-metoden utviklet for å integrere den magnetiske negative rensingen av nøytrofiler og kjemotaksanalysen fra små blodvolumprøver. Denne nye metoden tillater en rask prøve-til-resultat nøytrofil kjemotaksis test på 25 minutter. I dette papiret gir vi detaljert konstruksjon, drift og dataanalysemetode for denne all-on-chip chemotaxis-analysen med en diskusjon om feilsøkingsstrategier, limiTasjoner og fremtidige retninger. Representative resultater av nøytrofilt kjemotaksis-analysen som tester en definert kjemoattraktant, N- formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) og sputum fra en pasient med kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), ved bruk av denne all-on-chip-metoden, er vist. Denne metoden gjelder for mange celle-migrasjonsrelaterte undersøkelser og kliniske anvendelser.

Introduction

Chemotaxis, en prosess med rettet cellemigrasjon til oppløselig kjemisk konsentrasjonsgradient, er kritisk involvert i mange biologiske prosesser, inkludert immunrespons 1 , 2 , 3 , vevsutvikling 4 og kreftmetastase 5 . Neutrofiler er den mest vanlige hvite blodlegemundersatsen og spiller viktige roller for å muliggjøre kroppens medfødte vertsforsvarsfunksjoner, samt å formidle adaptive immunresponser 6 , 7 . Neutrofiler er utstyrt med høyregulert kjemotaktisk maskineri slik at disse motile immunceller kan reagere på både patogen-avledede kjemoattraksjonanter ( f.eks. FMLP) og vert-avledede kjemoattraktanter ( f.eks . Interleukin-8) gjennomkjemotaks 8 . Neutrofile migrering og kjemotaksis medierer ulike fysiologiske problemerOg sykdommer som betennelse og kreft 1 , 9 . Dermed gir den nøyaktige vurderingen av nøytrofil kjemotaksis en viktig funksjonell avlesning for å studere nøytrofilbiologien og de tilknyttede sykdommene.

Sammenlignet med de allment brukte konvensjonelle kjemotaksanalysene ( f.eks. Transwellanalyse 10 ), viser de mikrofluidiske innretninger godt løfte for kvantitativ evaluering av cellemigrasjon og kjemotaksis på grunn av den nøyaktig kontrollerte kjemiske gradientgenerering og miniaturisering 11 , 12 , 13 . I løpet av de siste to tiårene har ulike mikrofluidiske enheter blitt utviklet for å studere kjemotaksen av forskjellige biologiske celletyper, spesielt nøytrofile 11 . Betydende innsats var viet til å karakterisere neutrofilmigrasjon i spatiotemporalt kompleks che Mical gradienter som ble konfigurert i mikrofluidiske innretninger 14 , 15 . Interessante strategier ble også utviklet for å studere retningsbestemt avgjørelse ved nøytrofiler ved bruk av mikrofluidiske enheter 16. Ved siden av biologisk orientert forskning har applikasjonene av mikrofluidiske enheter blitt utvidet til testkliniske prøver for sykdomsevaluering 17 , 18 , 19 . Imidlertid er bruken av mange mikrofluidiske enheter begrenset til spesialiserte laboratorier og krever langvarig nøytrofilisolasjon fra store mengder blodprøver. Derfor har det vært en økende trend med å utvikle integrerte mikrofluidiske enheter for rask nøytrofilt kjemotaksanalyse direkte fra en dråpe fullblod 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Mot denne retningen ble det utviklet en all-on-chip-metode som integrerer den magnetiske negative nøytrofilrensningen og den påfølgende kjemotaksanalyse på en enkelt mikrofluidisk anordning 25 . Denne all-on-chip-metoden har følgende nye funksjoner: 1) I motsetning til tidligere on-chip-strategier som isolerer nøytrofiler fra blodet ved adhesjonsbasert cellefangst eller cellestørrelsesfiltrering 20 , 22 , tillater denne nye metoden høye Renhet, magnetisk separasjon på nøytropiler fra små volumer av helblod, samt kjemotaksemåling ved kjemoattraktantstimulering; 2) celledockingsstrukturen hjelper til med å justere startposisjonene til nøytrofilene nær den kjemiske gradientkanalen og tillater enkel kjemotaksanalyse uten enkeltcellesporing; 3) integrasjon av nøytrofilisolasjon og kjemotAkseanalysen på en enkelt mikrofluidisk enhet tillater rask analyse av kjemotaksanalyser i løpet av 25 minutter når det ikke er noen avbrudd mellom eksperimentelle trinn.

Dette papiret gir en detaljert protokoll for konstruksjon, drift og dataanalysemetode for denne all-on-chip chemotaxis-analysen. Papiret demonstrerer effektiv bruk av den utviklede metoden for å utføre nøytrofilt kjemotaks ved å teste en kjent rekombinant kjemoattraktant og komplekse kjemotaktiske prøver fra pasienter, etterfulgt av en diskusjon om feilsøkingsstrategier, begrensninger og fremtidige retninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle humane samlingsprotokoller ble godkjent av Fellesforskningsetikkstyret ved University of Manitoba, Winnipeg.

1. Microfluidic Device Fabrication ( Figur 1A )

  1. Design og skriv gjennomsiktighetsmaske.
    1. Design enheten som beskrevet tidligere 25 . Se figur 1A .
      MERK: Enheten inneholder to lag. Det første laget (4 μm høyt) definerer celledockingsbarriarkanalen for å fange cellene ved siden av gradientkanalen. Det andre laget (60 μm høyt) definerer gradientgenereringskanalen, porten og kanalen for cellebelastning, de kjemiske innløpsreservoarene og avløpsutløpet. Justeringsmerkene er utformet for de to lagene. For det andre laget er lengden og bredden av den oppstrøms serpentininngangskanal henholdsvis 60 mm og 200 pm; Lengden og bredden av nedstrømsSerpentin inngangskanal er henholdsvis 6 mm og 280 μm.
    2. Skriv ut første og andre lagsfunksjoner til en gjennomsiktig maske ved hjelp av en høyoppløselig skriver.
      MERK: Utskriftsoppløsningen avhenger av de minste funksjonene i designet. I dagens design ble 32.000 dpi valgt for 10 μm minste funksjon.
  2. Rengjør silisiumplaten.
    1. Plasser en 3 i silisiumskive i plasmarenseren. Påfør vakuum i 3 minutter.
    2. Slå på plasmakraften og sett nivået til HØY. Bruk oksygenplasmaet til å behandle silisiumskiven i 30 minutter.
    3. Slå av plasmaskjøteren og ta ut silisiumplaten; Silisiumplaten er klar til å produsere enhetsformen.
  3. Fremstille det første laget ved fotolithografi i et cleanroom-anlegg.
    MERK: De eksakte fabrikasjonsparametrene kan variere avhengig av fabrikasjonsanlegget.
    1. Fortynn 10 ml SU-8 2025 med 10 ml SU-8 2000 i en glassbryter for å forberede den designede fotoresisten. La blandingen stå i avtrekksviften i 10 minutter til boblene forsvinner.
    2. Plasser forsiktig den rengjorte silikonplaten på spinneren med passende chuck og bruk vakuumet for å immobilisere silisiumplaten.
    3. Helt forsiktig 3 ml fotoresistblandingen på midten av silisiumplaten. Spinn ved 500 rpm i 5 s. Spinn deretter ved 3000 rpm i 30 s for å oppnå et siste 4 μm tykkelse fotoresistbelegg på silisiumplaten.
    4. Fjern forsiktig silisiumplaten fra spinneren og bake silikonplaten på en kokeplate i 4 minutter ved 95 ° C.
    5. Legg forsiktig silisiumplaten på en maskeringsjuster og sett UV-eksponeringstiden til 6 s. Fest forsiktig masken på det første laget på en transparent glassplate ved hjelp av tape.
    6. Legg forsiktig glassplaten med den vedlagte masken til justeringsapparatet og juster masken med silisiumplaten. Utsett siLignonplaten til UV-mønsteret for celledockingstrukturen.
    7. Fjern forsiktig glassplaten og ta ut den synlige silisiumplaten. Bake silisiumskiven på en kokeplate i 4 minutter ved 95 ° C.
    8. Overfør silisiumplaten til en avtrekksvifte og plasser den i en glassplate som inneholder SU-8-utvikleren. Rist forsiktig dette i 30 s.
    9. Rengjør silisiumplaten med frisk SU-8-utvikler etterfulgt av isopropylalkohol (IPA) inne i avtrekksdekselet. Tørk silikonplaten med nitrogengass inne i avtrekksdekselet; Det første laget er klart.
  4. Lag det andre laget på det første laget.
    1. Bruk tape for å dekke justeringsmerkene på det første laget. Legg forsiktig silisiumplaten med det første laget på vakuumspaken på spinneren og påfør vakuum for å immobilisere silisiumplaten.
    2. Hell 3 ml SU-8 2025 fotoresist på silisiumplaten. Spinn silisiumplaten ved 500 rpm i 5 s. Spinn deretter ved 2000 rpm for 30S for å oppnå en endelig 60 μm tykkelse fotoresistbelegg på silisiumplaten.
    3. Fjern forsiktig silisiumplaten fra spinneren og overfør den til en kokeplate; Bake ved 65 ° C i 2 minutter.
    4. Fjern forsiktig tapeet for å vise justeringsmerkene på det første laget. Legg silisiumskiven på en kokeplate og bake ved 95 ° C i 6 minutter.
    5. Plasser silisiumplaten forsiktig på en maskeringsjuster og sett UV-eksponeringstiden til 18 s.
    6. Fest forsiktig masken på det andre laget på en gjennomsiktig glassplate ved hjelp av tape.
    7. Plasser glassplaten forsiktig med den tilkoblede masken til justeringsapparatet, og juster masken og det første laget på silikonplaten ved kryssingsjusteringsmerkene ved hjelp av inspeksjonsmikroskopet til justeringsapparatet.
    8. Utsett den fotoresistbelagte silisiumplaten til UV for å mønstre cellebelastnings- og gradientkanalene.
    9. Fjern forsiktig glassplaten og ta ut silisium wafer. Bake silisiumplaten på en kokeplate ved 65 ° C i 2 minutter, og overfør deretter silisiumplaten til en annen varmepanne på 95 ° C og bake i 6 minutter.
    10. Overfør silisiumplaten til avtrekksviften og plasser den i en glassplate som inneholder SU-8-utvikleren. Rist forsiktig dette i 6 min.
    11. Rengjør silisiumplaten med en ny SU-8-utvikler etterfulgt av IPA inne i avtrekksviften.
    12. Tørk silikonplaten med nitrogengass inne i avtrekksventilen. Plasser silisiumplaten på en kokeplate og hardkake støpeformen ved 150 ° C i 30 minutter; Det andre laget er klart.
  5. Master mold overflate modifikasjon.
    MERK: Et silaniseringsoverflate modifikasjonstrinn påføres SU-8-molden for å lette polydimetylsiloksan (PDMS) frigjøring fra formen i myk-litografi.
    1. Ta 10 μl tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl- (triklorosilan) løsning i en mikropipettespiss. Sett mikropipettespissen i en 15 ml plastrør aNd løsne lokket på røret.
    2. Plasser røret og SU-8 mønstret silisiumskive i en desikator og påfør vakuumet i 1 time; Maskeformen er klar til å produsere PDMS-enheten.
  6. Lag PDMS-enheten.
    1. Forbered PDMS-løsningen ved å blande 40 g PDMS base og 4 g herdemiddel i et plastbeholder. Plasser den tilberedte SU-8 mesterformen i en Petri-tallerken og hell forsiktig 44 g PDMS-løsning på formen.
    2. Plasser Petriskålen i en desiccator og påfør vakuum for å avgjøre PDMS-løsningen i 20 minutter. Legg deretter petriskålen i en ovn og hell PDMS ved 80 ° C i 2 timer.
    3. Etter baking, ta ut Petriskålen og legg den på en ren benk. Klipp forsiktig og fjern PDMS-platen fra SU-8-molden.
    4. Punch ut lasteporten med en 3 mm diameter puncher. Punch ut de kjemiske innløpsreservoarene og avløpsutløpet ved hjelp av en 6 mm diameter puncher.
    5. Fjern støvet påOverflaten av PDMS-platen med tape. Plasser PDMS-platen og en ren glassglass i plasmamaskinen. Påfør vakuumet i 3 minutter.
    6. Slå på plasmakraften og sett nivået til HØY. Juster luftventilen forsiktig og plasmér PDMS-platen og glassglasset i 3 minutter.
    7. Slå av plasmakraften og slipp av vakuumet. Ta forsiktig ut PDMS-platen og glassglasset med pincett.
    8. Plasser PDMS-platen umiddelbart (med kanalkonstruksjoner med forsiden ned) på toppen av glassruten; Trykk forsiktig på PDMS-platen for å binde den til glasset. Fyll mikrofluidkanalen med deionisert vann umiddelbart; Den mikrofluidiske anordningens fremstilling og montering er fullført.

2. Fremstilling av mikrofluidcellmigreringsassay

  1. Mikrofluidisk enhet forberedelse.
    1. Lag 50 μg / ml fibronektinoppløsning ved å fortynne 50 μl lager fibronektinoppløsning (1 mg / ml) til 95081; L Dulbeccos fosfatbuffede saltvann (DPBS) inne i et biosikkerhetsskap.
    2. Forbered migreringsmediet ved å blande 9 mL Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-1640) og 1 mL RPMI-1640 med 4% bovint serumalbumin (BSA).
    3. Fjern deionisert vann fra enheten.
    4. Tilsett 100 μL fibronektinoppløsning til enheten fra utløpet. Vent 3 min for å sikre at alle kanalene er fylt med fibronektinløsning. Plasser den mikrofluidiske enheten i en dekket petriskål i 1 time ved romtemperatur.
    5. Fjern fibronektinløsningen fra enheten. Tilsett 100 μL migrasjonsmedium fra utløpet. Vent 3 min for å sikre at alle kanalene er fylt med migrasjonsmedium.
    6. Inkubér enheten i ytterligere 1 time ved romtemperatur; Enheten er så klar for kjemotaksisforsøk.
  2. Chemoattractant løsning forberedelse for chemotaxis eksperiment.
    1. Forbered 100 nM fMLP løsning i tTotalt 1 ml migreringsmedium. Bland 5 μl lager FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) med fMLP-oppløsningen i et 1,5 ml rør.
      MERK: FITC-Dextran brukes til gradientmåling. Alternativt kan du bruke rhodamin som gradientindikator. FMLP kjemoattraktantoppløsningen er så klar for kjemotaksisforsøk.
  3. Sputumprøvepreparasjon.
    MERK: Neutrofile kjemotaksier indusert av en gradient av sputumprøve fra KOL-pasienter ble testet som en klinisk diagnostisk anvendelse av denne all-on-chip-metoden.
    1. Skaff en human etikkprotokoll for å samle sputumprøver fra COPD-pasienter.
      MERK: Vi har innhentet godkjenninger for å samle prøver på Seven Oaks General Hospital i Winnipeg (godkjent av University of Manitoba).
    2. Hent de informerte skriftlige samtykke skjemaene fra alle fag.
    3. Samle COPD pasienters spontane sputumprøver. Plasser 500 μL sputumprøve i et 1,5 ml rør.
    4. Tilsett 500 μL 0,1% diTiotreitol i 1,5 ml rør og bland forsiktig. Plasser røret i et vannbad ved 37 ° C i 15 minutter.
    5. Sentrifuger prøven ved 753 xg i 10 minutter og oppsamler deretter supernatanten. Sentrifuger supernatanten ved 865 xg i 5 minutter og deretter oppsamler den endelige supernatanten. Oppbevar den oppsamlede supernatanten i en -80 ° C fryser før bruk.
    6. Når du er klar for kjemotaksisforsøk, tine sputumløsningen; Overfør 900 μL migrasjonsmedium til et 1,5 ml rør og bland med 100 μL sputumløsning inne i et biosikkerhetsskap. Sputumoppløsningen er så klar for kjemotaksisforsøk.
  4. Blodprøveinnsamling.
    1. Skaff en human etikkprotokoll for å samle blodprøver fra sunne givere. Hent de informerte skriftlige samtykkeformene fra alle blodgivere.
      MERK: Her ble det hentet prøver på Victoria General Hospital i Winnipeg (godkjent av Fellesforskningsetikkstyret ved University of Manitoba).
    2. Samle blodprøven ved venepunktur og sett prøven i et EDTA-belagt rør. Hold røret i et biosikkerhetsskap før forsøket.

3. All-on-chip Chemotaxis Assay Operation

  1. On-chip celleisolasjon ( Figur 1B ).
    1. Plasser 10 μl helblod i et 1,5 ml rør i et biosikkerhetsskap.
      MERK: Nærmere informasjon om innsamling av blodprøver er i avsnitt 2.4.
    2. Tilsett 2 μL antistoffcocktail (Ab) og 2 μL magnetiske partikler (MP) fra nøytrofile isolasjonssettet (se tabell over materialer) i 1,5 ml rør og bland forsiktig. Dette vil merke celler i blodet bortsett fra nøytrofile.
    3. Inkubér blod-Ab-MP-blandingen i 5 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Dette vil magnetisk merke antistoff merkede celler i blod.
    4. Fest to små magnetskiver til de to sidene av cellebelastningen pOrt av enheten. Aspirere mediet fra alle porter på enheten.
    5. Piper langsomt 2 μl blod-Ab-MP i mikrofluidinnretningen fra cellebelastningsporten.
      MERK: De magnetisk merkede cellene er fanget til sideveggene til cellebelastningsporten mens nøytrofiler vil strømme inn i enheten og bli fanget ved celledockingstrukturen.
    6. Vent noen få minutter til nok nøytrofiler er fanget på cellebockområdet.
  2. Chemotaxis-analyse ( figur 1C ).
    1. Plasser den mikrofluidiske enheten på det temperaturstyrte mikroskopetrinnet ved 37 ° C.
    2. Tilsett 100 μL kjemoattraktantløsning (fMLP eller sputumløsning) og 100 μl migreringsmedium til de utpekte innløpsreservoarene ved bruk av to pipetter; Dette vil generere en kjemoattraktiv gradient i gradientkanalen ved kontinuerlig laminær flyt-basert kjemisk blanding assistert av et trykkE balanseringsstruktur.
      MERK: Detaljer om sputuminnsamlingen fra KOL-pasienter er i avsnitt 2.3.
      1. For medium kontroll eksperimentet, bare legge til migrasjonsmedium til begge innløpsreservoarene.
    3. Oppnå fluorescensbildet av FITC-Dextran i gradientkanalen.
    4. Importer bildet til ImageJ-programvaren ved å bruke kommandoen "File | Open".
    5. Mål fluorescensintensitetsprofilen over gradientkanalen ved hjelp av kommandoen "Analyze | Plot Profile".
    6. Eksporter måldataene til et regneark for videre planlegging.
    7. Inkuber enheten på det temperaturstyrte mikroskopetrinnet eller i en konvensjonell cellekultur-inkubator i 15 minutter.
    8. Bilde gradientkanalen ved hjelp av et 10X objektiv for å registrere cellens sluttposisjoner for dataanalyse.
    9. Hvis nødvendig, ta opp celleoverføringen i enheten ved hjelp av tidsforskjellmikroskopi.

4. Celleoverføring DAta-analyse ( figur 1C )

  1. Analyser kjemotaksanalysen ved å beregne cellemigrasjonsavstanden fra dockingstrukturen som beskrevet nedenfor. Se figur 1C .
  2. Importer bildet inn i NIH ImageJ-programvaren (ver. 1.45).
  3. Velg midten av hver celle som flyttet inn i gradientkanalen.
  4. Mål koordinatene til de valgte cellene for deres endelige posisjoner. Mål koordinatet til et punkt ved kanten av dockingstrukturen som den opprinnelige referanseposisjonen.
  5. Eksporter de målte koordinatdataene til en regnearkprogramvare ( f.eks. Excel). Beregn migreringsavstanden til cellene som forskjellen mellom en celles endelige posisjon og den opprinnelige referanseposisjonen langs gradientretningen.
  6. Kalibrere avstanden til en mikrometer. Beregn gjennomsnittet og avviket av migrasjonsavstanden for alle celler som et mål for kjemotaksier.
  7. Sammenlign megaRasjonsavstand i nærvær av en kjemoattraktantgradient til mediumkontrollforsøket ved bruk av Studentens t- test.
  8. Hvis tidsforskjellbildene av cellemigrasjonen blir registrert, kan celle-migrasjonen og kjemotaksen analyseres ytterligere ved hjelp av cellesporingsanalyse 15 .
    MERK: Materialene som kreves for å konstruere og utføre all-on-chip chemotaxis-analysen, er beskrevet i materialetabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neutrofiler er negativt valgt fra en dråpe helblod direkte i den mikrofluidiske enheten. Renheten av de isolerte neutrofiler ble verifisert ved on-chip Giemsa-farging, og resultatene viste de typiske ringformede og lobeformede kjernene til nøytrofiler ( figur 2A ) 25 . Dette indikerer en effektiv neutrofile isolasjon på chip med høy renhet fra et lite volum helblod. Videre kan dockningsstrukturen effektivt justere celler ved siden av gradientkanalen før påføring av kjemisk gradient ( figur 2B ) 25 .

Gradientgenerering er basert på kontinuerlig laminar flytende kjemisk blanding, og strømningene drives av trykkforskjellen fra de ulike nivåene av innløps- og utløpsløsninger. Ingen eksterne pumper er påkrevd. Den kjemiske gradienT er etablert innen noen få minutter i den mikrofluide enheten, som er preget av fluorescensintensitetsprofilen til FITC-Dextran over gradientkanalen. Gradienten er stabil i minst 1 time, noe som er nok tid for det nåværende nøytrofile kjemotaksisforsøk ( Figur 1C ).

For å demonstrere bruken av all-on-chip-metoden for celle-migrasjonsforskning, ble neutrofile kjemotaksier i medium alene eller i en fMLP-gradient sammenlignet. Testresultatene viste at få celler kravlet gjennom barrierkanalen i mediumkontrolleksperimentet. I motsetning til dette flyttet mange nøytrofiler raskt gjennom barriarkanalen og migrert mot 100 nM fMLP-gradienten ( figur 2B ) 25 . Cellemigrasjonstesten måles kvantitativt av migrasjonsavstanden, noe som er signifikant høyere for fMLP-gradienten enn mediumkontrollen ( 25 .

Videre ble all-on-chip-metoden demonstrert for potensielle kliniske anvendelser ved å sammenligne nøytrofilmigrering i medium alene til en gradient av sputumprøve fra KOL-pasienter. Resultatene viste sterk cellemigrasjon til COPD sputumgradienten, som er kvantitativt indikert av signifikant høyere migrasjonsavstand sammenlignet med mediumkontrollen ( Figur 2B - C ) 25 .

Figur 1
Figur 1: Illustrasjon av all-on-chip-metoden for nøytrofilt kjemotaksanalyse. ( A ) Illustrasjon av den mikrofluidiske enheten. Enheten inneholder to lag. Det første laget (4 μm høyt) definerer cellenL docking barriere kanal for å fange cellene ved siden av gradientkanalen. Det andre laget (60 μm høyt) definerer gradientgenereringskanalen, porten og kanalen for cellebelastning, de kjemiske innløpsreservoarene og avløpsutløpet. Justeringsmerker er laget for de to lagene. For det andre laget er lengden og bredden av den oppstrøms serpentininngangskanal henholdsvis 60 mm og 200 pm; Lengden og bredden av den nedstrøms serpentin-inngangskanalen er henholdsvis 6 mm og 280 um; ( B ) Illustrasjon av all-on-chip-cellisolasjonsmetoden; ( C ) Illustrasjon av kjemotaksistesten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Representative resultater avAll-on-chip nøytrofil kjemotaksanalyse 25 . ( A ) Giemsa-fargebilde (ved hjelp av et 60X-objektiv) av alle-på-chip-isolerte celler i mikrofluidkanalen; ( B ) Sammenligning av celledistribusjonen i mediumkontrollen, en 100 nM fMLP-gradient og en COPD-sputumgradient; ( C ) Den gjennomsnittlige celle-migrasjonsavstanden i gradientkanalen i mediumkontrollen, en fMLP-gradient og en COPD-sputumgradient. Feilbarene angir standardfeilen til gjennomsnittet (SEM). * Indikerer p <0,05 fra studentens t- test. Tallene ble tilpasset fra referanse 25 med tillatelse fra World Scientific Publishing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papiret ble det beskrevet en detaljert protokoll for direkte isolering av nøytrofiler fra helblod etterfulgt av kjemotaksis-testen, alt på en enkelt mikrofluidisk brikke. Denne metoden gir nyttige funksjoner i sin enkle operasjon, negativt utvalg av nøytrale filtre med høy renhet, rask prøve-til-resultat kjemotaksis-test, reduserte reagenser og prøveforbruk, og nøyaktig analyse av celleoverføringsdata. Som et grovt estimat, gikk minst 25% av nøytrofilene fra den inntatte helblodprøven effektivt inn i dokkestrukturen i enheten, og vi fant at nøytrofile renheten er høy ved on-chip Giemsa-farging.

Denne utviklede all-on-chip chemotaxis analysemetoden har stort potensial i ulike cellemigreringsforskning og kliniske applikasjoner. En forskningsapplikasjon av denne metoden ble demonstrert ved å sammenligne nøytrofilt kjemotaksis i medium alene til en fMLP-gradient. På samme måte kan denne metoden brukes til å teste neutrofile kjemotaksier i COPD spuTum som et eksempel på utvikling av en cellefunksjonell biomarkør for klinisk diagnose. Med denne metoden kan en forsker enkelt teste neutrofile kjemotaksier til forskjellige kjemoattraktanter enkeltvis eller i kombinasjoner. Forskere kan også teste nøytrofilt kjemotaks til komplekse kjemotaktiske faktorer fra pasienter eller testnutrofiler fra syke pasienter for potensielt endret kjemotaksrespons ved hjelp av denne metoden. Denne integrerte all-on-chip-metoden er spesielt nyttig for å utføre testen i forskning eller kliniske laboratorier som ikke har spesialisert cellekultur og levende cellebilder. Testen kan lett betjenes av forskere eller klinikere som følger denne protokollen. For mer avanserte forskningsapplikasjoner, tillater denne metoden tidsforskjell mikroskopi til å spore individuell cellebevegelse.

Generelt er denne all-on-chip-metoden enkel å betjene og resultatet er robust. Flere tekniske påminnelser vil videre sikre et vellykket eksperiment. Først, thE PDMS-kopi skal forsiktig presses på klassesubstratet under plasmabinding for å unngå å skade den meget tynne barrierekanalen. For det andre kan fordamping av mediet i cellebelastningsporten forstyrre kjemisk gradient. Det anbefales å dekke cellebelastningsporten med en tetningsflik under kjemotaksistesten. For det tredje skal blodprøven forsynes forsiktig på enheten for å unngå høyt trykk som kan presse cellene over barrierekanalen før kjemotaksisforsøket. For det fjerde, i den nåværende innstillingen, anbefaler vi at magnene festes til cellebelastningsporten under kjemotaksanalysen for å forhindre uønskede celler i å komme inn i kanalen. Alternativt kan et separat stykke PDMS med et gjennomgående hull og de magnetiske diskene som er festet, justeres til cellens lastport på enheten. I dette tilfellet kan den øverste PDMS-delen med magnetdiskene og de fangede cellene fjernes fra enheten etter celleisolasjon.

Dette all-on-chIp-metoden kan videreutvikles for å overvinne nåværende begrensninger og for å forbedre og utvide funksjonalitetene. For det første tillater den nåværende enheten bare en enkelt analyse om gangen og begrenser dermed gjennomstrømningen. Videreutvikling av enheten med flere parallelle testenheter vil forbedre kravet til eksperimentell gjennomstrømning. For det andre begrenser den nåværende flytbaserte kjemiske gradientgeneratoren gradientgenerering i 1D. Videreutvikling av 2D- eller 3D-strømningsfrie gradientgeneratorer vil bedre etterligne de fysiologiske gradientforholdene. For det tredje, i tillegg til nøytrofiler, kan denne all-on-chip-metoden i prinsippet brukes til å teste andre hvite blodlegemetyper, som T-celler, B-celler og NK-celler ved hjelp av lignende magnetiske isolasjonspakker. Det vil være viktig å studere om denne metoden effektivt kan brukes til å teste blodcellepopulasjoner ved lavere frekvens og de cellene som krever aktivering og kultivering på chip før kjemotaksistesten. Da er all-on-chip-cellisolasjonsmetoden ca.N forlenges ytterligere for noen andre applikasjoner. Ulike barrierekanaltykkelse ble testet, og resultatene viste at 3-4 um er mest egnet for nøytrofile migrasjonseksperimentet; Det vil si at den tilstrekkelig fanget de ikke-stimulerte cellene og tillot at cellene kryper gjennom barriarkanalen ved stimulering. Barriere kanal dimensjonen bør optimaliseres for ulike celletyper. Endelig vil denne integrerte og raske kjemotaksistesten tillate forskere å utforske relevante kliniske applikasjoner. For å muliggjøre praktisk testing i klinikker, er det utviklet et bærbart system som integrerer mikrofluidisk enhet, temperatur og scenekontroll, samt smarttelefonbasert optisk bildebehandling og dataanalysemoduler. I tillegg til den KOL-relaterte studien som vist i dette dokumentet, blir cellemigrasjonen for andre relevante sykdommer som kronisk nyresykdom testet ved hjelp av denne all-on-chip-metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det er ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet er delvis støttet av stipend fra Norges naturvitenskapelige og tekniske forskningsråd (NSERC) og de kanadiske instituttene for helseforskning (CIHR). Vi takker Klinisk Institutt for anvendt forskning og utdanning på Victoria General Hospital i Winnipeg og Seven Oaks General Hospital i Winnipeg for å administrere kliniske prøver fra mennesker. Vi takker Dr. Hagit Peretz-Soroka for nyttig diskusjon om analyseoperasjonsstrategiene. Vi takker professor Carolyn Ren og Dr. Xiaoming (Cody) Chen fra University of Waterloo for sin sjenerøse støtte i filmprosessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)
Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)
Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich
R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit
STEMCELL
Technologies Inc
19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6, (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43, (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3, (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11, (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210, (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139, (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23, (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13, (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2, (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6, (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33, (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2, (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9, (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5, (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10, (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8, (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100, (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111, (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04, (02), 104-109 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics