Kas Dokular doğrudan sıvı azot içine girdikleri zaman Artifacts Donma bir çoklu-delikli dondurarak saklamaya uygun vialler ortadan kaldırır

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol, doğrudan sıvı azot içine sokulup çıkartılarak kas dokuları dondurarak için bir prosedür tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, azot gazı "battaniye etkisi" önlemek yeni cryovial vurguladığında sıvı azot temas bir numunenin doku yüzeyi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

iskelet kası fizyolojisi üzerinde çalışmalar uygun şekilde açıkça görünür sitoplazmik bölmelerle bölümleri elde etmek için numuneler işleme teknik sorunuyla karşı karşıya. Başka engel çevreleyen dokulara miyofiberlerindeki sıkı appozisyon olduğunu. doku fiksasyon ve parafine işlemidir kas lifleri büzülme yol açtığı için, donma kesit için kas dokusu sertleştirme optimal bir araçtır. Bununla birlikte, sık karşılaşılan bir sorun, buz kristallerinin oluşumu nedeniyle kas yüksek su içeriği Dondurulmuş kesitlerin hazırlanması sırasında meydana gelir. Burada sunulan protokol önce sıvı azot içine daldırılarak, kas dokuları dondurulması için basit ve etkili bir yöntem tarif etmektedir. tek başına sıvı azot kullanılarak sorun, aşağıdaki bir yalıtıcı olarak hareket eder ve dokuların soğutma inhibe doku, bir nitrojen gaz bariyeri oluşumuna neden olmasıdır. Bir NE bu "buğu örtüsü" etkisini önlemek içinw dondurarak saklamaya uygun vialler doku yüzeyi çevresinde, sıvı akış hızını arttırmak için tasarlanmıştır. Bu şişe duvarında 14 giriş deliklerinin toplam delme ile elde edilmiştir. Kabarcık dinamiklerine göre, küçük kabarcıklar ve daha az şansa sıvı akış sonuçlarının daha yüksek bir oranı, bir gaz bariyeri oluşturulur. Sıvı azot giriş deliklerinden dondurarak saklama viali içine aktığında, doku etrafında akış hızlı gaz bariyeri ortadan kaldırmak için yeterince hızlıdır. Önceden soğutulmuş izopentan kullanılarak, kas dokuları dondurma yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu protokol daha basit ve daha etkili ve bir verimli bir şekilde kas dondurmak için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem oda sıcaklığında son derece yanıcı olan izopentan, erişimi yok kurumlar için en uygunudur.

Introduction

İskelet kası bakış beslenme ve işleme noktasından bir et üreten hayvan en değerli bileşenidir. kas büyümesi verimliliği ve ortaya çıkan etin kalitesi: Et endüstrisinde, iki özellikle kritik yönleri vardır. Kas ana bileşen olarak, kas lifleri büyüme performansı ve hayvanlarda 1 taze et kalitesini doğrudan ilişkilidir. Örneğin, Liflerin toplam sayısı (TNF) ve Liflerin çapraz kesit alanı (ÇSAF) daha çok kas kitlesi ve et kalitesini belirler; Ayrıca, Elyaf Tipi Kompozisyon (FTC) kuvvetle taze et kalitesini 2. etkiler. Bu nedenle, hayvanlarda kas lifi özelliklerinin manipülasyon çekirdek karlılık ve çiftliklerin 1 rekabet gücünü artırmak için son derece etkili bir yöntemdir.

Bugüne kadar birçok içsel ve dışsal faktörler kas lifi characterist manipüle etmek tespit edilmiştirICS 1. Bu manipülasyon, domuzlar 5 sığırlarda 3 Miyostatin gen, koyun 4 Callipyge geni ve RyR1'in ve IGF2 genleri gibi spesifik genleri, hayvanların hedef seçimi ile elde edilebilir. Ayrıca, diyet kontrolü ve spesifik hormonlarla tedaviler kas lifi özelliklerine 6 önemli rol oynamaktadır. Böylece, genetik ve beslenme faktörleri birleştiren bir yaklaşım yağsız et içeriğini ve et kalitesini arttırmak mümkün olabilir. kas liflerinin yapısının aydınlatılması hala bir sorun olduğundan, ancak kas liflerinde çalışmalar et endüstrisinde sınırlıdır.

Kas lifi özellikleri, bu miyozin adenosin trifosfat (ATP) deneyi gibi histokimyasal yöntemler kullanılarak tespit edilir. Bu yöntem, dondurulmuş (6-8 um) ince bölümleri içinde yer enzimler gerçeğine dayanırkas lifleri kimyasal bazı ürünleri ile reaksiyona sokulabilir. Bununla birlikte, kas su içeriği ne olursa olsun, bir konumda (yani, sırt, karın veya arka bacak) 7, domuzlar, tavşanlar, fareler ve insanlarda% 75'den daha büyük olduğunu. Daha önce 8, 9 tarif edildiği gibi, cryosections hazırlanması sırasında - eserler dondurma - kas içinde bu ölçüde yüksek nem içeriği, sık görülen bir sorun neden olur. Çoğu durumda, uygun deneyimlerimizi göre, bir mezbaha üretim hattında kas dokularını dondurmak için neredeyse imkansızdır.

Burada sunulan protokol, yüksek verimli bir şekilde cryosectioning için kas dokularını dondurmak için laboratuvarda kullanılan basit ve etkili bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntemin vurgulamak sıvı azot içinde hızlı dondurma kas dokuları için tasarlanmış yeni bir gelmekteydi olup. mevcut iş akışı eşzamanlı olarak doku kolaylaştırabiliraçıkça görülebilir bir sitoplazmik bölüm ve çevredeki dokuya kas liflerine sıkı appozisyon ile mükemmel bir kas cryosection donma ve işlenmesi. Sıvı azot dokularıyla karışmaz Buna ek olarak, bu protokol, doku analizi için geniş bir seçenek dizisine uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Geçerli yöntem kurulmuş ve hasat ve laboratuvarımızda histolojik boyama için 1.000 'den fazla kas örnekleri saklamak için valide edilmiştir. Hayvan bakım ve kullanımını içeren tüm uygulamalar Çin Tarım Bakanlığı tarafından kurulan yönergelere izledi.

Örnek Toplama 1. Ekipmanları

  1. Her bir kriyojenik şişe ile ilgili örnek bir kimlik etiketleyin.
    Not: Derin dondurucudaki şişe özel cryosection prosedür (Şekil 1A) taze doku numuneleri dondurma için tasarlanmıştır. Deney şişeleri, bir kalıp fabrikası (Şekil 1C) polipropilen imal edilmektedir.
  2. uygun bir sıvı azot tankında sıvı azot, gözlükler veya bir yüz kalkanı, derin dondurucu eldiven, 10 cm forseps, 25 cm cımbız, plastik bir soğutucu (iç boyutları: 20 cm uzunluk x 12 cm genişlik x 13.5 cm yüksekliğinde, aşağıdaki malzemelerin temin ; dış boyutları: genişlik x 15 cm yükseklik, 24 cm uzunluk x 16 cm), bir plastik filmin (genişlik x 0.1 mm kalınlığında 2.5 cm uzunluğunda x 0.8 cm),bir bisturi ve A4 PVC bağlayıcı kapaklar (21 cm x 29.5 cm) (Şekil 1B).

Kas Örneklerinde 2. Hazırlık

  1. önde numune ile birlikte, sıvı azot, 5 dakika ile köpük soğutucu doldurun.
    Not: sıvı azot parçası edn ve yeni hazırlanmış numunelerin, dokunma zaman gaz haline geçer, çünkü sıvı azotun büyük bir kolon gerekmektedir. kaybını önlemek için sıvı azot devri sıklığını azaltmak için, uygun boyutta bir köpük soğutucu numune sayısına göre önceden kazanılmış olması gerekir.
  2. Bir örnek alındığında, nazikçe A4 PVC bağlayıcı kapağın bir parçasına koyun ve kas liflerinin yönüne dikkat.
    NOT: Burada, domuzlarda son bel omur birinciden longissimus Doris kasının kesiti kullanılır. Numuneler yaklaşık 12 cm uzunluğunda, 8 cm genişliğinde ve 5 cm yüksekliğinde bulunmaktadır.
  3. numune i ile iki paralel kesiler yapmak için bir neşter kullanınn, kas liflerinin doğrultusu, uzunluk olarak yaklaşık 3 cm, birbirinden 0.6 cm. Yaklaşık 0.6 cm genişliğinde x 0.6 cm x 1.5 x yükseklik cm uzunluğunda bir dikdörtgen kazınmış kas kesin.
    Not: kas liflerinin enine kesit alanı ölçülerek güvenilirliği çok kazıma kas lif oryantasyonuna bağlıdır.
  4. Yavaşça film (Şekil 2A) uzun kenarına kazıma kas paralel uzunlamasına ekseni ile, plastik film bir parça örneği koymak için, 10 cm forseps kullanın.
    Not: kas liflerinin yönelim ve nedeniyle hızlı dondurma numunedeki çatlaklar engelleyen bir yapışma işlevi sabitleme yardımcı olan bir tutma işlevi: plastik film iki işlevi vardır.
  5. Forseps kullanarak, sadece giriş delikleri arasında, etiketlenmiş bir kriyojenik şişe alt ortasına kas dokusunu yerleştirin ve ampul sıkıca (Şekil 2B) kap.

3. Dondurma ve Depolama kas Örneks

  1. 25 cm cımbız kullanarak, hızlı bir şekilde sıvı azot (yaklaşık 10-20 s) kaynatın etmez bekleyerek, önceden soğutulmuş köpük soğutucu sıvı azot içinde bütün kriyojenik şişe daldırın.
    Not: sıvı azot kaynama zaman dondurarak saklamaya uygun vialler dikkatli bir şekilde 10-20 saniye kaynatılarak sıvı azot içinde şişe sokmak, yüzer.
  2. bir sıvı azot depolama tankı ya da uzun süreli depolama için bir -80 ° C dondurucu kas örnekleri aktarın.

4. Slayt Hazırlama

  1. -20 ° C ve -22 ° C arasında bir kriyostat ön soğutma.
  2. Çıkarın ve eski mikrotom bıçak atmak kriyostat bıçak tutucusu ve devrilme önleyici levha aşağı silin, kriyostat, yeni bir mikrotom bıçağı yükleme ve 8 um kesme kalınlığını ayarlamak.
  3. Sıvı azot depolama tankı kriyojenik şişede kas örnek aktarın veya -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya kriostada, sıvı azot içinde veya kuru buz üzerinde taşınması. örnek kriyostatının sıcaklığına dengelenmeye için 30 dakika bekleyin.
    NOT: Bir yüksek sıcaklık numunede buz kristallerinin oluşmasını neden olabilir çünkü örnek dokunmatik olabilecek herhangi ekipman, önceden soğutulması gerekir.
  4. suda çözünür glikoller ve reçineler (OCT) optimum kesme ısısı formülasyon altında numune tutucu örnek monte edin. 8-mikron bölümleri kesilir.
    Not: ÇSAF kas liflerinin kesit alanı olduğu için, kas liflerinin yönelimine dik bir kesme açısı ayarlayın.
  5. Bir oda sıcaklık mikroslayd merkezine doğru bölümlerini monte edin. Derhal bir -80 ° C dondurucu içinde bir slayt kutusu içine slayt yerleştirin. slayt RT'de kurumasına izin vermeyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dondurarak saklamaya uygun vialler örnekleme ve dondurulmuş bölümleri hazırlanması sırasında kas dondurma için ortak laboratuar ekipmanları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. cryovials bir kalıp fabrikasında polipropilenden yapılmıştır. Her şişe, 14, giriş delikleri toplam vardır: bir açık olduğunu göstermektedir; Başka bir alt olduğu; ve geri kalan 12 formu, dört paralel hat, birbirine 90 ° 'de dört delik her biri. Bu giriş delikleri zaman "buhar battaniye" etkisi, sıvı azot temas doku engellemek için bir sonraki doku sıvı nitrojen akış hızını hızlandırabilir. Sonuç olarak, çok az buz kristalleri donmuş örneklerdeki mevcut oluşturur. Önemli olarak, izopentan, 28 ° C'de bir kaynama noktası ile son derece uçucu ve yanıcı sıvı, bu prosedürde gerekli değildir.

Ayrıca bu yöntemin avantajı vurgulamak için, longissimus dorsi kası donduDomuzlar beş dondurma yöntemler kullanılarak ve daha sonra boyama özellikleri ve bir Hematoksilin / Eosin (HE) boya (Şekil 3) kullanan histolojik ayrıntıları görülmektedir. Yaygın olarak karşılaşılan sorun Cryosection için kasların hazırlanması sırasında buz kristallerinin oluşması oldu. Numune -80 ° C dondurucu (Şekil 3A) doğrudan yerleştirildi zaman, büyük buz kristalleri oluşturulur ve daha sonra, kas cryosection içinde iyi bilinen bir "İsviçre peyniri" etkisi neden oldu. Kas dokusu, sıvı azot (Şekil 3B) doğrudan batırıldı Bundan başka, buz kristalleri de oluşturulur. Sıvı azot çok soğuk sıvı (-190 ° C) bile, bunun ısı sabit son derece düşüktür. Herhangi bir numune temas sıvı azot, buhar battaniye sonraki doku oluşturmak ve doku içine soğuk penetrasyonu izole zaman. Ayrıca, patoloji laboratuvarlarında numune dondurma için rutin bir işlem kas dokusu henüz geçerli değildir. birŞekil 3C'de gösterilen s, kas dokusu doğru yönelimde OCT montaj orta içine daldırılır ve daha sonra hızlı bir izopentan bir bulamaç içinde donduruldu sonra kas liflerine sitoplazmik bölmesinde oluşturulan çok sayıda iğneye benzer buz kristalleri (-160 ° C). Sonuç olarak, kas dokuları için uygun bir donma oranı kesinlikle işleminde karşılanmalıdır.

Geçerli protokol açıkça görülebilir bir sitoplazmik bölüm ve çevreleyen doku (Şekil 3D), miyofiberlere sıkı appozisyon ile mükemmel numune bütünlüğü elde edilir. Bu miyozin ATPase deneyi (Şekil 3E) kullanılarak kas liflerinin metabolik özelliklerinin mükemmel olarak gösterebilir. Bu tahlil için, miyozin ATPase aktivitesi hızlı sözleşme kas lifleri (memeli türü 2A ve 2B) daha hızlı yavaş sözleşme lifler (memeli tip 1) daha ATP hidrolize gerçeğine göre analiz edilmiştir. na denk verildiğindeödünç kez hızlı sözleşme lifler iki serbestlik derecesine sahip, ışık görünür ve yavaş sözleşme lifler siyah görünür. Bunu gerçekleştirmek için kolaydır ve zaman (Şekil 4), çünkü kaydeder Önemli olarak, bu yöntem, yüksek verimli bir ortamda etkin bir şekilde kullanılabilir. Daha önce 8, 9 (Şekil 3F) tarif edildiği gibi Günümüzde, iyi kurulmuş bir dondurma yöntemi OCT montaj ortamı ile temas etmeden izopentan bir bulamacında kas dokuları daldırın etmektir. Bu prosedürde, sıvı azot içinde izopentan ön soğutma ve küçük beyaz çökeltiler taban (Şekil 4) görünür kadar karıştırılarak elde edilecek izopentan 240 mL bir katı madde-sıvı bulamaç halinde için yaklaşık 30 dakika sürer. önceden soğutulmuş izopentan içinde kas dokuları dondurarak çalışılırken araştırmacılar tarafından karşılaşılan üç uygulama zorlukları vardır: (1) isopantane bir katı-sıvı bulamaç durum ne zaman muhafaza edilmesi zordurzaman örnekleme fazla 1 saattir. Bizim Geçmişteki girişimlerde, donma eserler genellikle kas dokularının onlarca kez toplandı sürecin, orta ve geç evrelerinde yapıldı örneklerinde meydana geldi. (2) tehlikeli bir sıvı olarak, toplu taşıma üzerinde herhangi bir yere isopantane izin verilmez. (3) İzopentan laboratuarlarında dışında kullanılamaz. Birçok et bilimi araştırmacıları genellikle uzak bir laboratuardan ve bu izopentan olmasına izin verilmeyen bir mezbahada kas dokularını dondurun. Buna ek olarak, tanı kas biyopsileri nedeniyle tıbbi tesislerde izopentan eksikliği genellikle alt optimal işlenmiş bulunmaktadır. Böylece, bizim protokol İzopentanın kullanılamaz durumlarda kas örneklerinin dondurma için önemli bir gelişmedir.

Şekil 1
Şekil 1: kas Dondurmaya cihaz. (A), çizimlerBu çalışmada kullanılan cryovial arasında. 14 giriş delikleri boru duvarında açılmış: bir açık olduğunu göstermektedir; Başka bir alt olduğu; ve geri kalan 12 formu, dört paralel hat, birbirine 90 ° 'de dört delik her biri. (B), dondurma cihazının bir fotoğrafıdır. sıvı nitrojen içinde kasları dondurma güvenli ve etkili bir araç meydana gelmekteydi, plastik film, gözlük, derin dondurucu eldiven, 10 cm forseps, 25 cm cımbız, plastik bir soğutucu, bir neşter ve A4 PVC bağlayıcı kapağın kullanılmasını içerir. (C) kalıp fabrikada mühendis, Yonghua Wang tarafından sağlanan dondurarak saklamaya uygun vialler kalıp çizimler. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2: Kas Numunelerin Hazırlanması. (A (B), kas dokusu kriyojenik şişe içinde, giriş delikleri arasında yerleştirilmelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3: Onlar Beş Farklı Yöntemler kullanılarak Dondurulmuş sonra Domuz Longissimus dorsi kasları histolojik Değerlendirilmesi Temsilcisi Görüntüler.
Buz kristalleri HE (AC) 'de gösterildiği gibi kaslar, uygunsuz yöntemlerle histolojik analiz için dondurulmuşken boyama ile görüntülendi kas cryosections okunabilirliği yok. Kas örnekleri, doğrudan 80 ° C dondurucu (A) içine ya da sıvı batırıldığında dikkate değer dondurma eserler oluştuAzot (B). Kas dokusu OCT içine daldırılır ve daha sonra doğrudan izopentan bulamacına (C) konulmuştur sonra birçok iğne benzeri buz kristalleri tek tek kas hücreleri içinde oluşturulan. Kas dokusu, sadece sıvı azot (D) sokulduğu zaman bu çalışmada sunulan protokol buz kristallerinin oluşmasını ortadan kaldırabilir. Bu protokol, miyozin ATPase deneyinde (E) dayalı olarak dondurulmuş kasında da enzimin faaliyeti analizleri için de geçerlidir. daha gerçekleştirmez kas için standart dondurma yöntemi; kas dokusu Ekim montaj ortamına (F) ile doğrudan temas olmadan izopentan bir bulamaç içinde daldırılır. Tüm görüntüler siyah kenarları (20X) olanlar hariç, bir 10X objektif altındadır. Ölçek çubukları: 100 um. Şekil 3C'de ok ucu küçük, iğneye benzer buz kristalleri göstermektedir. Şekil 3E'de ok ucu ve metin kas liflerinin türünü göstermektedir: tip 1 yavaş miyozin ağır zincir lifleri, Type 2A ara miyozin ağır zincir elyafı ifade eder, ve 2B hızlı miyozin ağır zincir lifleri belirtir yazın. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4: Sıvı azot bazlı ve İzopentan bazlı dondurma Usuller akışları karşılaştırılması. Sıvı nitrojen bazlı protokolde, yeni cryovial kas dokusu, sıvı azot içine batırılır. izopentan tabanlı protokol, izopentan bir bulamaç halinde sıvı azot içinde izopentan soğutulduktan ve küçük beyaz çökeltiler altta görünen kadar karıştırılarak önceden elde edilmelidir. Sonra, kas dokusu önceden soğutulmuş izopentan daldırılır. Şekil 3F'de açıklandığı gibi izopentan tabanlı bir prosedür 35 dakika ile karşılaştırıldığında, bu sadece 5 dakika t alır o Bu protokol sunulan dondurma prosedürü tamamlamak. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Şekil 5: bir keskin kenarlı bir delik içinden sıvı azot akımı. 14 giriş deliklerinden tüpe sıvı azot atmosfer basınç kuvvetleri, sıvı azot içinde bütün çoklu delikli cryovial daldırılması zaman. deliklerin varlığı akışı böylece hızı artırır içlerinden hızlandırmak yapar. (Mavi) bir yeniden dolaşım akışı (turuncu) deliğinin hemen aşağı geliştirir. D1 tüpünün duvan üzerindeki deliğinin çapını belirtir ve D2 deliği ve (kırmızı), kas numune arasındaki mesafeyi temsil eder.= "_ Blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, dondurma ve kas fonksiyonunun histolojik ölçümler yapmak kas dokuları depolamak için yeni, çok delikli cryovial tarif eder. Bu protokol kritik modifiye bir çok delikli cryovial örnek, doğrudan sıvı azot içine daldırılmış olmasıdır. Bildiğimiz kadarıyla, bu mevcut dondurma yöntemleri arasında kas cryosectioning mükemmel donmuş örnekleri (temsili sonuçları görmek) elde etmek için en basit ve rapidest yoludur.

kas araştırmacılar karşılaştığı teknik zorluk buz kristalleri kesit alma kas dokusu sertleşmesine aracı olarak donma kullanırken oluşturmak üzere büyük olasılıkla olmasıdır. temsili sonuçlarda belirtildiği gibi, üç faktör, uygun bir soğuk kaynak seçme numunenin nem asgariye indirilmesi, ve soğuk kaynağıyla temas halinde toplam yüzeyinin yüzde artırmak gibi patolojik çalışmalar için uygun kas dondurma belirlenmesinde önemli bir rol oynar. İlk,donma oranı kesit için dondurulmuş doku hazırlanması sırasında hasarı önlemek için önemlidir. Donma yavaş olduğu zaman büyük buz kristalleri hücre dışında oluşturulur için, dondurulmuş kaslar, iyi bilinen "İsviçre peyniri" etkisini göstermektedir. donma yeterince hızlı hızlı değil ise, küçük, iğneye benzer buz kristallerinin çok sayıda tek tek kas hücreleri içinde oluşturulmaktadır. Bu iğneye benzer buz kristalleri küçük tespit yapısal hasara neden olabilir, ama bunlar aşağıdaki etkileri getirmek: mitokondri 10 hasar görmüş, kas liflerinin boyutu yapay 11 artar ve elyaflı yapıların bütünlüğünün 11 yok edilir. Bu nedenle, yeterli bir soğuk sıcaklıkta bir soğutma kaynağı ve yeterli bir donma hızı, kas cryosections buz kristallerinin oluşumunu önlemek için gereklidir.

İdeal olarak, soğuk kaynak çok düşük sıcaklıklarda ve t düzenlenirO tüm yüzeylere temas. Bir katı-sıvı karışım halinde her ikisi de sıvı azot (-190 ° C) ve izopentan (-160 ° C), bu koşulu karşılayan. Ancak, iki donma medya kendi dezavantajları vardır. Sıvı azot son derece düşük bir özgül ısı sabitine sahiptir. Sonuç, sıvı azot ve doku arasındaki temas yanındaki dokuya ve büyük ölçüde kurar doku 12 içine soğuk penetrasyonu yavaşlatan bir buhar bariyeri neden olmasıdır. Bu durumda, önemli dondurma eserler dondurulmuş kas içi ortaya çıkmaktadır. izopentan bulamaç durum buhar bariyerleri oluşturmayan bir yere dondurma ortamı, ama ana problem, izopentan, 160 ° C'lik bir sıvı banyo sıcaklığı elde etmek için, sıvı nitrojen ile birlikte kullanılmalıdır zorunluluktur. Buna ek olarak, izopentan, oda sıcaklığında aşırı uçucu ve yanıcı bir sıvıdır. İkinci olarak, kas fazla su (> 75%), bu numunenin ekzojen içinde nem için herhangi bir yolu içerir eserler donmasına neden olur. Buz kristalleri Ekim montaj orta olmadan olanlarla karşılaştırıldığında çok daha belirgin olan kas donuk kesitlerinde böylece Örneğin, Ekim montaj orta, kas için ekstra su ekler. Son olarak, kas dokusu kalınlığının donma oranı kısmen soğuk kaynak (genellikle, kalınlık <0.5 cm) ile temas eden toplam yüzeyinin yüzde bağlıdır, çünkü uygun bir şekilde dondurmak için de önemlidir. Buna uygun olarak, doku dondurma yalnızca varolan bir şekilde, daha önce tarif edildiği gibi 8 önceden soğutulmuş izopentan (160 ° C) içine en az 0.5 cm kalınlığa sahip kas dokusu daldırmaktır.

Bu protokol, önce düzgün bir şekilde sıvı azot içinde doğrudan daldırılarak kas dokuları dondurarak açıklamaktadır. tek başına sıvı azot kullanılarak sorun doku soğutma bir yalıtkan olarak hareket eden ve inhibe doku yüzeyi boyunca azot gazı oluşumuf "> 13. kabarcıkların birleşmesi azot gazı sıvı azot doku ayrı böylece hızlı olması durumunda, bir buhar battaniye kabarcık dinamiklerine göre. yalnızca oluşturabilen, daha hızlı bir sıvı akışı, bunun gibi daha küçük kabarcıklar neden olur 14 birleştirme için daha az şansı vardır. Bu nedenle, doku etrafında sıvı akış hızını arttırmak için ve "buhar battaniye" etkisi önlemek için dondurarak saklamaya uygun vialler duvarına 14 delik delinmiş zaman sıvı azot temas doku.

Deneysel başarı belirleyen bir faktör doku etrafında sıvı akışının hızı olduğu göz önüne alındığında, dondurarak saklamaya uygun viallerin üç parametre konumu ve delik sayısı, giriş deliklerinin çapı ve delik arasındaki mesafe de dahil olmak üzere, çok önemlidir örnek. Sıvı dinamikleri bir delik boyunca akış hızı deliklerin çapı ile tespit edildiğini göstermektedir ve bir yeniden dolaşım akışı hemen aşağı geliştiğideliğinin akım (Şekil 5), 15, 16. Şekil 5 'de gösterildiği gibi, Buna uygun olarak, delik ve örnek arasındaki mesafe en çok, yüksek hızlı sıvı akışı ve örnek arasındaki temas alanını belirler. Sonuç olarak, Şekil 1A çok delikli dondurarak saklamaya uygun vialler 1.5 cm uzunluk x genişlik x 0.6 cm yüksekliğinde 0.6 cm olan bir kas numunesi için uygundur. Daha büyük kas parçaları için, daha büyük bir tüp ve daha fazla sayıda delik bu yöntemi denemeye değer. giriş delikleri daha küçük örnekler için çok büyük olabilir Ancak, bu protokol, örneğin bir murin modelinde olduğu gibi küçük hayvanların, kas numuneleri dondurma için uygun değildir.

Buna ek olarak, üç kritik adımlar kesinlikle protokolde uyulmalıdır. İlk olarak, sıvı azot bütün cryovial sokmak için yeterli olmalıdır, ve kriyojenik şişe tamamen sıvı seviyesinin altında olması gerekir. İkincisi, gereklidirDondurulmuş kas ve oda sıcaklığı kaplar ya da araçlar arasında boşluk kazara temas. Örneğin, dikkatli bir taşıma olmaksızın yeni bir buz kristalleri, sıvı azot depolama tankı donmuş numune transfer veya -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya bir kriyostat ile oluşturabilir. Üçüncü olarak, numuneler nedeniyle donmuş kas ve OCT arasındaki temas alanı çevresinde buz kristali oluşumu olasılığı yüksek olduğundan tutucu üzerine monte edildiğinde Ekim kullanılan çok fazla olmamalıdır.

formalin sabitleme ve parafine işlemidir TNF ve CSAF gibi bazı kas özellikleri, değerlendirilmesini bozar kas lifleri içinde büzülmesine neden olur, çünkü et endüstrisinde, bir kas cryosection prosedürü vazgeçilmezdir. Buna ek olarak, dondurulmuş kas miyozin ATPaz tahlili kullanılarak FTC değerlendirirken gereklidir. Şekil 3E'de gösterildiği üzere, bu protokol kaslarda ve patolojik analiz şartları ve histokimyasal lekeleri karşılayabilir. HazırlıkBir Cryosection klinik kas patoloji laboratuvarlarında rutin bir işlemdir. Meng ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi. 8, kas dokuları dondurma için standart bir çalışma prosedürü önceden soğutulmuş izopentan içinde otopsi örnekler bekletmektir. Ancak, izopentan klinik kas patoloji laboratuvarlarında olmadan kurumlarda otopsi örnekleri dondurmak için kullanılamaz. Sonuç olarak, tanı kas biyopsileri genellikle vasatın altında birçok tıbbi tesislerde işlenmektedir. Böylece, bizim protokol ölçüde yeterli kalitede tanısal kas biyopsi küçük hastaneler veya laboratuarlar için yeteneğini artırabilir. yüksek verimlilik ve bu protokolün basit operasyon düşünüldüğünde şimdiki izopentan tabanlı dondurma yöntemine umut verici bir alternatif olabilir ve yaygın gelecekte histolojik çalışmalara uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması, mali veya başka türlü, yazarlar tarafından bildirilmiştir.

Acknowledgments

Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (NSFC) tarafından desteklenmiştir: 31301950 ve 31671288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95, (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84, (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2, (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38, (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57, (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69, (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8, (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12, (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53, (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71, (9), 300-309 (2012).

Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics