Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido

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Biology

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Summary

Este protocolo descreve um processo para congelar os tecidos musculares, mergulhando-os directamente em azoto líquido. Este protocolo também realça um novo frasco de congelação que pode evitar o "efeito manta" de gás de azoto quando os contactos de azoto líquido da superfície do tecido de um espécime.

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Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

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Abstract

Estudos sobre a fisiologia do músculo esquelético enfrentar o desafio técnico de processar adequadamente as amostras para obtenção de cortes com compartimentos citoplasmáticos claramente visíveis. Outro obstáculo é a aposição apertada de miofibras para os tecidos circundantes. Uma vez que o processo de fixação do tecido e parafina leva ao encolhimento das fibras musculares, congelamento é um meio óptimas de endurecimento tecido muscular para seccionamento. No entanto, um problema vulgarmente encontrado, a formação de cristais de gelo, ocorre durante a preparação de secções congeladas por causa do elevado teor de água de músculo. O protocolo aqui apresentado descreve um primeiro método simples e eficiente para a congelação de tecidos musculares adequadamente por imersão em azoto líquido. O problema com o uso de azoto líquido sozinho é que ele provoca a formação de uma barreira de gás de azoto ao lado do tecido, que actua como um isolador e inibe o arrefecimento dos tecidos. Para evitar este efeito "cobertor de vapor", a new criotubo foi concebido para aumentar a velocidade do fluxo de líquido em torno da superfície do tecido. Isto foi conseguido por perfuração de um total de 14 orifícios de entrada na parede do frasco. De acordo com a dinâmica de bolha, uma taxa mais elevada de resultados de escoamento de líquido em bolhas mais pequenas e menos possibilidades de formar uma barreira ao gás. Quando azoto líquido flui para dentro do frasco de congelação através dos orifícios de entrada de ar, a velocidade do fluxo em torno do tecido é suficientemente rápido para eliminar a barreira de gás. Em comparação com o método de congelação dos tecidos musculares usando isopentano pré-arrefecido, este protocolo é mais simples e mais eficiente e pode ser usada para congelar músculo de um modo de transferência. Além disso, este método é ideal para instituições que não têm acesso a isopentano, que é extremamente inflamável à temperatura ambiente.

Introduction

O músculo esquelético é o componente mais valioso de um animal produtor de carne a partir do ponto de vista nutricional e processamento. Na indústria da carne, há dois aspectos especialmente críticos: a eficiência de crescimento muscular e a qualidade da carne resultante. Como um componente principal do músculo, as fibras musculares estão directamente relacionadas com o desempenho do crescimento e qualidade da carne fresca em animais 1. Por exemplo, o número total de fibras (TNF) e a área da secção transversal das fibras (CSAF) principalmente determinar a massa muscular e a qualidade da carne; Também, Tipo de fibra Composição (FTC) afeta fortemente a qualidade da carne fresca 2. Portanto, a manipulação de características da fibra muscular em animais é um método altamente eficaz para aumentar a rentabilidade do núcleo e da competitividade de quintas 1.

Até à data, vários factores intrínsecos e extrínsecos têm sido identificados para manipular characterist fibra muscularics 1. Esta manipulação pode ser obtida através da escolha adequada dos animais com genes específicos, tais como o gene da miostatina em gado 3, o gene Callipyge em ovelhas 4, e o RYR1 e genes IGF2 em porcos 5. Além disso, o controle da dieta e tratamentos com hormônios específicos desempenham um papel importante em características da fibra muscular 6. Assim, uma abordagem que combina fatores genéticos e nutricionais pode ser capaz de melhorar o teor de carne magra e qualidade da carne. No entanto, os estudos sobre fibras musculares estão limitados na indústria da carne, porque a elucidação da estrutura de fibras musculares é ainda um desafio.

propriedades da fibra muscular são identificados utilizando métodos histoquímicos, tais como o ensaio de miosina adenosina trifosfatase (ATPase). Este método baseia-se no facto de enzimas localizadas em secções finas (6-8? M) congelados defibras musculares pode ser feito reagir quimicamente com determinados produtos. No entanto, o teor de água de músculos é maior do que 75% em porcos, coelhos, ratos e seres humanos, independentemente da posição (isto é, costas, abdómen, ou dos membros posteriores) 7. Tal teor de humidade elevado em músculos provoca um problema vulgarmente encontrado - congelação artefactos - durante a preparação dos criocortes, como anteriormente descrito 8, 9. Na maioria dos casos, é quase impossível para congelar adequadamente tecidos musculares em uma linha de produção matadouro, de acordo com a nossa experiência.

O protocolo aqui apresentado descreve um método simples e eficiente utilizado no nosso laboratório para congelar tecidos musculares para cryosectioning de um modo de elevado rendimento. O destaque do presente método é um novo frasco de congelação que é concebido para tecidos musculares de flash-congelação em azoto líquido. O fluxo de trabalho de corrente pode simultaneamente facilitar tecidoscongelamento e processamento para uma excelente criocorte muscular, com um compartimento citoplasmático claramente visível e a aposição apertada de miofibras para o tecido circundante. Além disso, este protocolo pode ser aplicado a uma grande variedade de opções para a análise de tecido por causa de azoto líquido não se mistura com os tecidos.

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Protocol

O método atual foi estabelecido e validado para colher e armazenar mais de 1.000 amostras de músculo para a coloração histológica em nosso laboratório. Todos os procedimentos envolvendo cuidados com os animais e uso seguiu as diretrizes estabelecidas pelo Ministério da Agricultura da China.

1. Equipamentos para Coleta de Amostras

  1. Rotular a identidade da amostra em cada frasco criogénico.
    Nota: O criotubo foi especialmente concebido para congelar amostras de tecido fresco para o procedimento criocorte (Figura 1A). Os frascos para injectáveis são feitas de polipropileno numa fábrica de molde (Figura 1C).
  2. Obter o seguinte equipamento: azoto líquido em um tanque de azoto líquido apropriado, óculos de segurança ou uma viseira, luvas congeladores, 10 cm fórceps, 25 pinças cm, uma caixa de isopor (dimensões internas: 20 cm de comprimento x 12 cm de largura x 13,5 cm de altura ; dimensões externas: 24 cm de comprimento x 16 cm de largura x 15 cm de altura), película de plástico (2,5 cm de comprimento x 0,8 cm de largura x 0,1 mm de espessura),um bisturi, e as tampas de ligação A4 PVC (21 cm x 29,5 centímetros) (Figura 1B).

2. Preparação de amostras de músculo

  1. Encher a caixa de isopor com azoto líquido 5 min antes da recolha da amostra.
    NOTA: O grande coluna de azoto líquido é essencial porque parte do azoto líquido evapora e se transforma em gás quando amostras frescas tocá-lo. A fim de reduzir a frequência de transferência de azoto líquido para repor a perda, uma caixa de isopor dimensionado apropriadamente deve ser adquirida antecipadamente de acordo com o número de amostras.
  2. Uma vez que uma amostra é obtida, gentilmente colocá-lo sobre uma peça de cobertura de ligação A4 PVC e observar o sentido das fibras musculares.
    NOTA: Aqui, usamos o corte transversal do músculo longissimus doris da primeira para a última vértebra lombar em porcos. Os espécimes são cerca de 12 cm de comprimento, 8 cm de largura e 5 cm de altura.
  3. Use um bisturi para fazer duas incisões paralelas através do i espécimen a direcção das fibras musculares, aproximadamente 3 cm de comprimento e 0,6 cm de distância. Aparar a incisão do músculo num rectângulo de aproximadamente 0,6 cm de largura x 0,6 cm de altura x 1,5 cm de comprimento.
    NOTA: A fiabilidade da medição da área da secção transversal das fibras musculares depende principalmente da orientação das fibras do músculo incisa.
  4. Usar 10 cm fórceps para colocar suavemente a amostra sobre uma peça de película de plástico, com o eixo longitudinal do músculo paralelo incisão ao longo do bordo do filme (Figura 2A).
    NOTA: O filme plástico tem duas funções: uma função de exploração, que ajuda na fixação da orientação das fibras musculares e uma função de adesão que impede fissuras na amostra devido a congelação rápida.
  5. Usando fórceps, colocar o tecido muscular em parte inferior central de um criotubo marcado, apenas entre os orifícios de entrada de ar, e, em seguida, tapar bem o frasco (Figura 2B).

3. Congelamento e Armazenamento de amostra de músculos

  1. Usando pinças 25 cm, rapidamente submergir todo o frasco criogénico em azoto líquido na caixa de isopor pré-arrefecida, espera até que o azoto líquido não ferva (aproximadamente 10-20 s).
    NOTA: O criotubo irá flutuar quando o azoto líquido está em ebulição, então cuidadosamente imergir o frasco em azoto líquido em ebulição durante 10-20 s.
  2. Transferir as amostras de músculo a um tanque de armazenamento de azoto líquido ou uma -80 ° C congelador para armazenamento a longo prazo.

4. Preparação corrediça

  1. Precool um criostato a entre -20 ° C e -22 ° C.
  2. Remover e descartar o velho lâmina micrótomo, limpar o suporte da faca e a placa de anti-rolo no criostato, instalar uma nova lâmina micrótomo no criostato, e definir a espessura de corte de 8? M.
  3. Transfira a amostra muscular no frasco criogico a partir do tanque de armazenamento de azoto líquido ou a -80 ° C para o congelador criostato, transportando-o em azoto líquido ou em gelo seco. Esperar 30 min para o espécime para equilibrar com a temperatura do criostato.
    NOTA: Qualquer equipamento que possa tocar o espécime tem de ser pré-arrefecido, porque uma temperatura elevada pode provocar a formação de cristais de gelo na amostra.
  4. Montar a amostra no suporte da amostra, sob a formulação temperatura de corte óptima de glicóis e resinas solúveis em água (PTU). Cortar as secções 8 mícrons.
    NOTA: Ajustar o ângulo de corte de forma perpendicular à orientação das fibras musculares, porque o CSAF é a área da secção transversal das fibras musculares.
  5. Montar as secções em direcção ao centro de uma microlâmina à temperatura ambiente. colocar imediatamente a deslizar para uma caixa de corrediça numa -80 ° C congelador. Não permita que o slide para secar em temperatura ambiente.

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Representative Results

A ilustração criotubo e o equipamento laboratorial comum para a congelação de músculos durante a preparação de secções congeladas são mostrados na Figura 1. Os criotubos são feitos de polipropileno num molde fábrica. Cada frasco tem um total de 14 orifícios de entrada: um está no tampão; outra está na parte inferior; e os restantes 12 formam quatro linhas paralelas, cada uma com quatro orifícios a 90 ° um do outro. Estes orifícios de entrada de ar pode acelerar a velocidade de fluxo de azoto líquido ao lado do tecido para evitar o efeito de "cobertor de vapor" quando os contactos de azoto líquido o tecido. Consequentemente, muito poucos cristais de gelo se formam nas amostras congeladas. Importante, isopentano, o líquido extremamente volátil e inflamável com um ponto de ebulição a 28 ° C, não é necessário neste processo.

Para destacar ainda mais a vantagem deste método, que congelou o músculo longissimusem porcos usando cinco métodos de congelação e, em seguida, observou as suas propriedades de coloração e detalhes histológicas usando um corante de hematoxilina / eosina (HE), (Figura 3). Um problema comumente encontrado foi a formação de cristais de gelo durante a preparação dos músculos para criocorte. Quando a amostra foi colocada directamente num congelador a -80 ° C (Figura 3A), os grandes cristais de gelo formados e, em seguida, causou um efeito bem conhecido "queijo suíço" no criocorte muscular. Além disso, os cristais de gelo também formado quando o tecido muscular foi imerso directamente em azoto líquido (Figura 3B). Apesar de azoto líquido é um líquido muito fria (-190 ° C), a sua constante de calor é extremamente baixo. Quando quaisquer contactos espécime o azoto líquido, um cobertor de vapor pode acumular-se ao lado do tecido e isolar a penetração de frio para dentro do tecido. Além disso, um procedimento de rotina para a congelação de amostras em laboratórios de patologia não é ainda aplicável ao tecido muscular. UMAs mostrados na Figura 3C, muitos cristais de gelo em forma de agulha formado no compartimento citoplásmico de miofibras após o tecido muscular foi mergulhado em outubro meio de montagem na orientação correcta e, em seguida, rapidamente congeladas em uma lama de isopentano (-160 ° C). Em conclusão, a taxa de congelamento apropriado para tecidos musculares devem ser rigorosamente cumpridas na operação.

O actual protocolo permite obter um excelente integridade espécime, com um compartimento citoplasmático claramente visível e a aposição apertada de miofibras para o tecido circundante (Figura 3D). Ele permite uma excelente visualização das propriedades metabólicas de fibras musculares, utilizando o ensaio de ATPase da miosina (Figura 3E). Para este ensaio, a actividade de ATPase de miosina foi analisada com base no facto de que as fibras musculares rápido-contratantes (tipo de mamífero 2A e 2B) hidrolisar ATP mais rapidamente do que as fibras lento-contratantes (mamero de tipo 1). Quando dada equivaemprestaram vezes, fibras fast-contratantes aparecem luz, com dois graus, e fibras slow-contratantes aparecem em preto. Importante, este método pode ser utilizado de forma eficiente num ambiente de alto rendimento, porque é fácil de realizar e economiza tempo (Figura 4). Hoje em dia, um método de congelação bem estabelecido é a submergir os tecidos musculares em uma lama de isopentano sem contacto com outubro meio de montagem, tal como anteriormente descrito 8, 9 (Figura 3F). Neste procedimento, que demora aproximadamente 30 minutos para um estado de suspensão sólido-líquido de 240 ml de isopentano a ser conseguido por pré-arrefecimento do isopentano no azoto líquido e agitando até pequenos precipitados brancos aparecem na parte inferior (Figura 4). Existem três dificuldades práticas dos investigadores na tentativa de congelar tecidos musculares em isopentano pré-arrefecido: (1) Um estado suspensão sólido-líquido de isopantane é difícil de manter quando otempo de amostragem é mais do que 1 h. Nas nossas tentativas passadas, os artefactos de congelamento usualmente ocorreu nas amostras que foram feitas nos estágios médio e tardio do processo, quando dezenas de tecidos musculares foram recolhidas uma vez. (2) como um líquido perigoso, isopantane não é permitido em qualquer lugar no transporte público. (3) O isopentano não está disponível, excepto em laboratórios. Muitos pesquisadores de ciências carne geralmente congelar tecidos musculares num matadouro que está longe de um laboratório e que não é permitido ter isopentano. Além disso, biópsias musculares de diagnóstico são frequentemente sub-optimamente processado devido à falta de isopentano em instalações médicas. Assim, o nosso protocolo é um desenvolvimento importante para a congelação de amostras do músculo em situações em que o isopentano é indisponíveis.

figura 1
Figura 1: O aparelho para congelação do músculo. (A) As ilustraçõesdo criotubo utilizado neste estudo. 14 orifícios de entrada de ar são perfurados na parede do tubo: um é na tampa; outra está na parte inferior; e os restantes 12 formam quatro linhas paralelas, cada uma com quatro orifícios a 90 ° um do outro. (B) Uma fotografia do aparelho de congelao. Um meio seguro e eficiente de congelação em azoto líquido músculos envolve a utilização de uma película de plástico criotubo, óculos de protecção, luvas de congelação, 10 cm fórceps, 25 cm pinças, uma caixa de isopor, um bisturi, e a tampa de ligação A4 PVC. (C) As ilustrações do molde criotubo fornecida por um engenheiro, Yonghua Wang, na fábrica de moldes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Preparação de amostras de músculo. (A (B) O tecido muscular deve ser colocado entre os orifícios de entrada de ar no frasco criogénico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Imagens representativas da avaliação histológica de músculos Pig longissimus dorsi após Eles são congelados usando cinco diferentes métodos.
Cristais de gelo destruir a legibilidade do criosecções musculares fotografada com coloração HE quando os músculos estão congelados para análise histológica utilizando métodos inadequados, como mostrado na (AC). Artefactos de congelação consideráveis ocorreu quando as amostras do músculo foram directamente colocada num congelador de 80 ° C (A) ou mergulhado no líquidoazoto (B). Muitos cristais de gelo em forma de agulha formada no interior das células musculares individuais após o tecido muscular foi mergulhado em outubro e então directamente colocados em uma lama de isopentano (C). O protocolo apresentado no presente estudo podem eliminar a formação de cristais de gelo quando o tecido muscular é simplesmente imerso em azoto líquido (D). Este protocolo é aplicável à análise de actividade enzima em músculo congelado com base no ensaio de ATPase da miosina (E). O método de congelamento padrão para o músculo não executa melhor; o tecido muscular é mergulhado numa lama de isopentano, sem contacto directo com outubro meio de montagem (F). Todas as imagens são sob uma objetiva de 10X, exceto aqueles com bordas pretas (20x). Barras de escala: 100? m. A ponta de seta indica na Figura 3C, pequenos cristais de gelo em forma de agulha. A ponta de seta e texto na Figura 3E indicar o tipo de fibras musculares: Tipo 1 representa as fibras lenta da miosina de cadeia pesada, tipo 2A significa miosina intermediário fibras de cadeia pesada, e tipo 2B indica rápido de miosina de fibras de cadeia pesada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Comparação dos fluxos de trabalho para procedimentos de congelamento baseados em azoto líquido e baseados em isopentano. No protocolo baseado em azoto líquido, o tecido muscular no novo frasco de congelação é imerso em azoto líquido. No protocolo baseado em isopentano, um estado pastoso de isopentano deve ser feito antecipadamente por préarrefecimento o isopentano no azoto líquido e agitando até pequenas, precipitados brancos aparecem na parte inferior. Em seguida, o tecido muscular é mergulhado na isopentano pré-arrefecido. Comparado com o 35 min no processo à base de isopentano, como descrito na Figura 3F, que leva apenas 5 min t O completar o procedimento de congelamento apresentado neste protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Azoto líquido fluir através de um orifício com arestas vivas. Quando mergulhando todo o criotubo multi-buracos em azoto líquido, as forças de pressão atmosférica de azoto líquido para dentro do tubo através dos orifícios de entrada 14. A presença dos furos faz acelerar o fluxo através deles, aumentando assim a velocidade. Um fluxo de recirculação (em azul) desenvolve imediatamente a jusante do orifício (cor de laranja). D1 indica o diâmetro do orifício na parede do tubo e D2 representa a distância entre o orifício e a amostra muscular (em vermelho).= "_ Blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, descrevemos um novo, cryovial multi-buraco para congelar e armazenar os tecidos musculares para realizar avaliações histológicas da função muscular. O passo crítico modificado neste protocolo é que a amostra no criotubo multi-furo é directamente imerso em azoto líquido. Para o nosso conhecimento, esta é a maneira mais simples e rapidest obter excelentes amostras congeladas para cryosectioning muscular entre os métodos de congelação existentes (ver os resultados representativos).

O desafio técnico enfrentado pelos pesquisadores musculares é que cristais de gelo são mais propensos a se formar quando usando congelamento como os meios para endurecer o tecido muscular para o corte. Conforme observado nos resultados representativos, três factores desempenham um papel significativo na determinação de congelação muscular adequado para estudos patológicos, incluindo a escolha de uma fonte de frio adequado, minimizando a humidade da amostra, e aumentando a percentagem do total da superfície em contacto com a fonte de frio. Primeiro,a velocidade de congelação é crítica para evitar danos durante a preparação do tecido congelado para seccionamento. Quando o congelamento é lento, músculos congelados mostrar o efeito conhecido por "queijo suíço", porque grandes cristais de gelo são formados extracelularmente. Quando o congelamento é rápida, mas não é suficientemente rápida, um grande número de pequenos cristais de gelo, em forma de agulha são formados no interior das células musculares individuais. Estes cristais de gelo em forma de agulha causam pouco dano estrutural detectável, mas que trazem os seguintes efeitos: mitocôndria são danificados 10, o tamanho das fibras musculares são artificialmente aumentada 11, e a integridade das estruturas fibrosas 11 é destruída. Assim, uma fonte fria, a uma temperatura suficientemente baixa e uma velocidade de congelação suficientes são essenciais para evitar a formação de cristais de gelo em criocortes musculares.

Idealmente, a fonte fria é a temperaturas extremamente frias e está disposta tO contato com todas as superfícies. Ambos azoto líquido (-190 ° C) e isopentano num estado misto sólido-líquido (-160 ° C) satisfazer esta condição. No entanto, os dois meios de congelamento tem suas desvantagens. O nitrogénio líquido possui uma constante de calor específico extremamente baixo. O resultado é que o contacto entre o azoto líquido e o tecido faz com que uma barreira de vapor que se acumula ao lado do tecido e retarda grandemente a penetração de frio para dentro do tecido 12. Assim, os artefactos de congelamento significativos ocorrem dentro do músculo congelado. O estado da lama de isopentano é um meio de congelação ideal que não formar barreiras de vapor, mas o principal problema é que isopentano deve ser usado em conjunto com azoto líquido a fim de alcançar uma temperatura do banho de líquido de 160 ° C. Além disso, o isopentano é um líquido extremamente volátil e inflamável à temperatura ambiente. Em segundo lugar, o músculo contém água em excesso (> 75%), de modo que qualquer maneira para introduzir humidade exógena no espécime causaria congelamento artefatos. Por exemplo, o meio de montagem outubro adiciona água extra para o músculo, de modo que os cristais de gelo são muito mais proeminente nos criocortes musculares em comparação com aqueles sem outubro meio de montagem. Finalmente, a espessura do tecido muscular também é importante a congelá-lo de forma apropriada, porque a taxa de congelamento depende, em parte, a percentagem do total da superfície em contacto com a fonte fria (geralmente, a espessura <0.5 cm). Por conseguinte, a única maneira existente para congelar adequadamente o tecido é imergir tecido muscular com uma espessura inferior a 0,5 cm no isopentano pré-arrefecido (160 ° C), como anteriormente descrito 8.

Este protocolo descreve pela primeira vez como congelar correctamente os tecidos musculares, imergindo-os directamente em azoto líquido. O problema com o uso de azoto líquido por si só, é a formação de azoto gasoso sobre a superfície do tecido, que actua como um isolador e inibir o arrefecimento do tecidof "> 13. Tal cobertor de vapor pode formar apenas quando a fusão de bolhas é tão rápida que o azoto gasoso pode separar o tecido a partir do azoto líquido. De acordo com a dinâmica de bolha, um fluxo rápido de líquido irá resultar em bolhas menores, como ele tem menos possibilidades de fusão 14. Portanto, perfurado 14 buracos na parede do criotubo para aumentar a velocidade do fluxo de líquido em torno do tecido e para ajudar a evitar o efeito de "cobertor de vapor" quando os contactos de azoto líquido o tecido.

Considerando-se que a um factor que determina sucesso experimental é a velocidade do fluxo de líquido em volta do tecido, três parâmetros do criotubo são muito importantes, incluindo a posição e número de orifícios, o diâmetro dos furos de entrada, e a distância entre o orifício e a amostra. dinâmica líquidos mostra que a taxa de fluxo através de um orifício é determinado pelo diâmetro dos furos e que um fluxo de recirculação desenvolve imediatamente para baixofluxo do orifício (Figura 5) 15, 16. Correspondentemente, a distância entre o orifício e a amostra determina principalmente a área de contacto entre o fluxo de fluido de alta velocidade e da amostra, como mostrado na Figura 5. Por conseguinte, o criotubo multi-buracos na Figura 1A é apropriado para uma amostra de músculo que é de 0,6 cm de largura x 0,6 cm de altura x 1,5 cm de comprimento. Para fragmentos musculares maiores, vale a pena tentar este método com um tubo maior e mais furos. No entanto, este protocolo não é adequado para a congelação de amostras do músculo de animais de pequeno porte, tal como num modelo de murino, porque os orifícios de entrada pode ser demasiado grande para amostras pequenas.

Além disso, três passos críticos devem ser estritamente seguido no protocolo. Em primeiro lugar, o azoto líquido deve ser adequada para mergulhar todo o criotubo, e o frasco criogénico deve ser inteiramente abaixo do nível do líquido. Em segundo lugar, é necessário umcontacto acidental vazio entre os músculos congelados e recipientes em temperatura ambiente ou instrumentos. Por exemplo, sem o transporte cuidadoso, novos cristais de gelo pode formar quando se transfere uma amostra congelada a partir do tanque de armazenamento de azoto líquido ou a -80 ° C congelador a um criostato. Em terceiro lugar, não deve ser demasiado outubro utilizado quando as amostras são montados sobre o suporte, devido ao elevado risco de formação de cristais de gelo em torno da área de contacto entre os músculos congelados e outubro

Na indústria da carne, um procedimento criocorte músculo é indispensável porque o processo de fixação de formalina e parafina incorporação causa o encolhimento em fibras musculares, o que prejudica a avaliação de alguns traços musculares, tais como TNF e CSAF. Além disso, o músculo congelado é necessária quando se avalia FTC utilizando o ensaio de ATPase da miosina. Como se mostra na Figura 3E, este protocolo pode satisfazer os requisitos tanto da análise patológica e manchas histoquímicas nos músculos. A preparaçãode um criocorte é uma operação de rotina em laboratórios clínicos patologia muscular. Tal como descrito por Meng et al. 8, um procedimento de operação padrão para a congelação de tecidos musculares é imergir amostras de autópsia em isopentano pré-arrefecido. No entanto, isopentano não está disponível para congelar os espécimes de autópsia em instituições sem laboratórios clínicos patologia muscular. Consequentemente, biópsias musculares de diagnóstico são frequentemente subótimamente processados ​​em muitas instalações médicas. Assim, o nosso protocolo poderia melhorar substancialmente a capacidade para pequenos hospitais ou laboratórios para executar biópsias musculares de diagnóstico de qualidade adequada. Considerando a elevada eficiência e simples operação deste protocolo, pode ser uma alternativa promissora para o método de congelação à base de isopentano corrente e pode ser amplamente aplicada para estudos histológicos no futuro.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse, financeiro ou outro, são declarados pelos autores.

Acknowledgments

Este projecto foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (NSFC): 31301950 e 31671288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

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Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

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