Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans l'azote liquide

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Biology

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Summary

Ce protocole décrit un procédé pour congeler les tissus musculaires en les plongeant directement dans l'azote liquide. Ce protocole met également en évidence une nouvelle cryovial qui permet d'éviter « l'effet de couverture » de l'azote gazeux lorsque les contacts de l'azote liquide de la surface tissulaire d'un échantillon.

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Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

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Abstract

Les études sur la physiologie des muscles squelettiques doivent relever le défi technique du traitement de façon appropriée les échantillons pour obtenir des sections avec des compartiments cytoplasmiques clairement visibles. Un autre obstacle est serré de l'apposition myofibres aux tissus environnants. Du fait que le processus de fixation de tissu et inclusion dans la paraffine conduit à la contraction des fibres musculaires, la congélation est un moyen optimal de durcissement des tissus musculaires pour le sectionnement. Cependant, un problème fréquemment rencontré, la formation de cristaux de glace, se produit lors de la préparation des coupes congelées en raison de la forte teneur en eau du muscle. Le protocole présenté ici d'abord décrit une méthode simple et efficace pour la congélation correctement les tissus musculaires en les plongeant dans de l'azote liquide. Le problème avec l'utilisation de l'azote liquide seul est qu'il provoque la formation d'une barrière de gaz d'azote à côté du tissu, qui agit comme un isolant et empêche le refroidissement des tissus. Pour éviter cet effet « couverture vapeur », un new cryovial a été conçu pour augmenter la vitesse d'écoulement du liquide autour de la surface du tissu. Ceci a été réalisé en découpant un total de 14 trous d'entrée dans la paroi du flacon. Selon la dynamique des bulles, un taux plus élevé de résultats d'écoulement de liquide en bulles plus petites et moins de chances de former une barrière contre les gaz. Lorsque l'azote liquide circule dans le tube cryogénique à travers les trous d'entrée, la vitesse d'écoulement à travers le tissu est suffisamment rapide pour éliminer la barrière de gaz. Par rapport à la méthode de congélation des tissus musculaires en utilisant isopentane prérefroidi, ce protocole est plus simple et plus efficace et peut être utilisé pour geler les muscles de façon débit. De plus, cette méthode est optimale pour les institutions qui n'ont pas accès à isopentane, qui est extrêmement inflammable à la température ambiante.

Introduction

Le muscle squelettique est le composant le plus précieux d'un animal producteur de viande du point de vue nutritionnel et de traitement. Dans l'industrie de la viande, il y a deux aspects particulièrement critiques: l'efficacité de la croissance musculaire et la qualité de la viande résultant. En tant que composant principal du muscle, les fibres musculaires sont directement liées à la performance de la croissance et la qualité de la viande fraîche chez les animaux 1. Par exemple, le nombre total de fibres (TNF) et la zone transversale des fibres (CSAF) déterminent principalement la masse musculaire et la qualité de la viande; En outre, le type de fibre Composition (FTC) affecte fortement la qualité de la viande fraîche 2. Par conséquent, la manipulation des caractéristiques de la fibre musculaire chez les animaux est une méthode très efficace pour augmenter la rentabilité de base et de la compétitivité des exploitations 1.

À ce jour, plusieurs facteurs intrinsèques et extrinsèques ont été identifiés pour manipuler la fibre musculaire caractéristique etics 1. Cette manipulation peut être réalisé par la sélection ciblée des animaux avec des gènes spécifiques, tels que le gène de myostatine chez les bovins 3, le gène Callipyge chez le mouton 4, et les gènes RYR1 et IGF2 chez les porcs 5. En outre, le contrôle de l' alimentation et des traitements avec des hormones spécifiques jouent un rôle important dans les caractéristiques des fibres musculaires 6. Ainsi, une approche qui combine des facteurs génétiques et nutritionnels pourrait être en mesure d'améliorer la teneur en viande maigre et la qualité de la viande. Cependant, des études sur les fibres musculaires sont limitées dans l'industrie de la viande parce que l'élucidation de la structure des fibres musculaires est toujours un défi.

les propriétés des fibres musculaires sont identifiés en utilisant des procédés histochimiques, tels que le dosage de l'adénosine triphosphatase de myosine (ATPase). Cette méthode repose sur le fait que les enzymes situé dans des coupes congelées minces (6-8 pm) deles fibres musculaires peuvent être amenés à réagir chimiquement avec certains produits. Cependant, la teneur en eau des muscles est supérieure à 75% chez les porcs, les lapins, les souris et les humains, quelle que soit la position (c. -à- dos, l' abdomen, ou des membres postérieurs) 7. Un tel taux d'humidité élevé dans les muscles provoque un problème fréquemment rencontré - artefacts de congélation - lors de la préparation de coupes cryogéniques, comme décrit précédemment 8, 9. Dans la plupart des cas, il est presque impossible de geler de façon appropriée les tissus musculaires dans une ligne de production d'abattoir, selon notre expérience.

Le protocole présenté ici décrit une méthode simple et efficace utilisé dans notre laboratoire pour geler les tissus musculaires pour cryosectioning de manière à haut débit. Le point culminant de cette méthode est une nouvelle cryovial qui est conçu pour les tissus musculaires surgélation dans l'azote liquide. Le flux de travail peut faciliter en même temps que le tissucongélation et de traitement pour un excellent cryosection musculaire, avec un compartiment cytoplasmique clairement visible et l'apposition serré de fibres musculaires au tissu environnant. De plus, ce protocole peut être appliqué à un large éventail d'options pour l'analyse des tissus parce que l'azote liquide ne se mélange pas avec les tissus.

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Protocol

La méthode actuelle a été établi et validé pour récolter et stocker plus de 1000 échantillons de muscles pour la coloration histologique dans notre laboratoire. Toutes les procédures impliquant les soins des animaux et l'utilisation ont suivi les lignes directrices établies par le ministère de l'Agriculture de la Chine.

1. L'équipement pour le prélèvement d'échantillons

  1. L'identité de l'étiquette échantillon sur chaque flacon cryogénique.
    Remarque: Le flacon cryogénique est spécialement conçu pour congeler des échantillons de tissus frais pour la procédure de cryosection (Figure 1A). Les flacons sont faits de polypropylène dans une usine de moule (Figure 1C).
  2. Obtenir les équipements suivants: azote liquide dans un réservoir d'azote liquide approprié, des lunettes de sécurité ou un écran facial, des gants de congélation, une pince de 10 cm, 25 une pince à épiler cm, un refroidisseur de mousse de polystyrène (dimensions intérieures: 20 cm de longueur x 12 cm de largeur x 13,5 cm de hauteur ; dimensions extérieures: 24 cm de long x 16 cm de largeur x 15 cm de haut), film de matière plastique (2,5 cm long x 0,8 cm de largeur x épaisseur 0,1 mm),un scalpel, et A4 couvercles de liaison en PVC (21 cm x 29,5 cm) (figure 1B).

2. Préparation des échantillons musculaires

  1. Remplir le refroidisseur de mousse de polystyrène avec de l'azote liquide 5 min avant la collecte des échantillons.
    REMARQUE: La grande colonne d'azote liquide est essentielle parce qu'une partie de l'azote liquide se résume loin et se transforme en gaz lorsque toucher des échantillons frais il. Afin de réduire la fréquence de transfert de l'azote liquide pour reconstituer la perte, un refroidisseur en polystyrène de taille appropriée doit être acquise à l'avance en fonction du nombre d'échantillons.
  2. Une fois qu'un échantillon est obtenu, placer délicatement sur une feuille de couverture de liaison A4 PVC et d'observer la direction des fibres musculaires.
    REMARQUE: Ici, nous avons utilisé la section du muscle long dorsal doris de la première à la dernière vertèbre lombaire chez le porc. Les échantillons sont environ 12 cm de long, 8 cm de large et 5 cm de haut.
  3. Utilisez un scalpel pour réaliser deux incisions parallèles à travers l'échantillon in la direction des fibres musculaires, à environ 3 cm de longueur et 0,6 cm de distance. Coupez le muscle incisés dans un rectangle d'environ 0,6 cm de large x 0,6 cm de hauteur x 1,5 cm de long.
    REMARQUE: La fiabilité de la mesure de la surface de section transversale des fibres musculaires dépend essentiellement de l'orientation des fibres du muscle incisé.
  4. Utiliser des pinces 10 cm de mettre doucement l'échantillon sur un morceau de film plastique, avec l'axe longitudinal du muscle incisé parallèle au bord long de la feuille (figure 2A).
    REMARQUE: le film en matière plastique a deux fonctions: une fonction de maintien qui aide à fixer l'orientation des fibres musculaires et d'une fonction d'adhérence qui empêche des fissures dans l'échantillon due à la congélation rapide.
  5. En utilisant des pinces, placer le tissu musculaire dans le milieu inférieur d'un flacon cryogénique marqué, juste entre les trous d'entrée, puis fermer hermétiquement le flacon (figure 2B).

3. congélation et stockage d'échantillon de muscles

  1. En utilisant des pinces 25 cm, plonger rapidement l'ensemble du flacon cryogénique dans l'azote liquide dans le refroidisseur en polystyrène pré-refroidi, dans l'attente jusqu'à ce que l'azote liquide ne bout pas (environ 10 à 20 s).
    NOTE: Le cryovial flottera lorsque l'azote liquide est en ébullition, donc plonger soigneusement le flacon dans l'azote liquide bouillant pendant 10-20 s.
  2. Transférer les échantillons de muscles à un réservoir de stockage d'azote liquide ou d'un congélateur à -80 ° C pour le stockage à long terme.

4. Préparation Diapo

  1. Pré-refroidir un cryostat à -20 ° C et -22 ° C.
  2. Enlever et jeter le vieux lame microtome, essuyer le porte-couteau et la plaque anti-roulis dans le cryostat, installer une nouvelle lame microtome dans le cryostat, et régler l'épaisseur de coupe de 8 um.
  3. Transférer l'échantillon de muscle dans le flacon cryogénique du réservoir de stockage d'azote liquide ou -80 ° C congélateur au cryostat, le transporter dans de l'azote liquide ou de la glace sèche. Attendre 30 min pour l'échantillon à équilibrer la température du cryostat.
    NOTE: Tout équipement qui pourrait toucher l'échantillon doit être pré-refroidi, car une température élevée peut provoquer la formation de cristaux de glace dans l'échantillon.
  4. Monter l'échantillon dans le porte-échantillon en vertu de la formulation de température de coupe optimale des glycols et des résines solubles dans l'eau (OCT). Couper des sections de 8 um.
    REMARQUE: Réglage de l'angle de coupe perpendiculairement à l'orientation des fibres musculaires, parce que la CSAF est la surface en coupe transversale des fibres musculaires.
  5. Monter les sections vers le centre d'une microplaque à température ambiante. Placer immédiatement la lame dans une zone de glissement dans un congélateur à -80 ° C. Ne pas laisser la lame sécher à la température ambiante.

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Representative Results

L'illustration cryovial et l'équipement de laboratoire commun pour la congélation des muscles lors de la préparation des coupes congelées sont présentés à la figure 1. Les cryotubes sont en polypropylène dans une fabrique de moule. Chaque flacon a un total de 14 trous d'entrée: celui-ci est sur le capuchon; un autre est en bas; et les 12 forment quatre lignes parallèles restantes, chacune avec quatre trous à 90 ° l'un de l'autre. Ces trous d'entrée peuvent accélérer la vitesse d'écoulement de l'azote liquide à côté du tissu pour éviter l'effet de « couverture vapeur » lorsque les contacts de l'azote liquide du tissu. Par conséquent, très peu de cristaux de glace se forment dans les échantillons congelés. Fait important, l'isopentane, le liquide extrêmement volatil et inflammable avec un point d'ébullition à 28 ° C, est pas nécessaire dans cette procédure.

Pour mettre davantage en évidence l'avantage de cette méthode, nous avons gelé le muscle long dorsalchez les porcs en utilisant cinq méthodes de congélation, puis observé leurs propriétés de coloration et les détails histologiques en utilisant une tache hématoxyline / éosine (HE) (figure 3). Un problème couramment rencontré est la formation de cristaux de glace lors de la préparation des muscles pour cryosection. Lorsque l'échantillon a été placé directement dans un congélateur à -80 ° C (figure 3A), de gros cristaux de glace formés et ensuite provoqué un effet bien connu de « fromage suisse » dans la cryosection musculaire. En outre, les cristaux de glace formés également quand on a immergé les tissus musculaires directement dans de l' azote liquide (figure 3B). Bien que l'azote liquide est un liquide très froid (-190 ° C), sa constante de chaleur est extrêmement faible. Lorsque les contacts d'échantillons de l'azote liquide, une couverture de vapeur peuvent se former à côté du tissu et isoler la pénétration du froid dans le tissu. En outre, une procédure de routine pour la congélation des échantillons dans les laboratoires de pathologie ne sont pas encore applicables aux tissus musculaires. UNES représenté sur la figure 3C, un grand nombre de cristaux de glace en forme d' aiguille formée dans le compartiment cytoplasmique de myofibres après que le tissu musculaire a été plongé dans un milieu de montage octobre dans l'orientation appropriée et ensuite congelé rapidement dans une suspension d'isopentane (-160 ° C). En conclusion, le taux de congélation approprié pour les tissus musculaires doivent être strictement réunies dans l'opération.

Le protocole actuel atteint une excellente intégrité de l' échantillon, avec un compartiment cytoplasmique clairement visible et l'apposition étroite de myofibres au tissu environnant (figure 3D). Il permet une excellente visualisation des propriétés métaboliques des fibres musculaires en utilisant le test ATPase de la myosine (Figure 3E). Pour cet essai, myosine ATPase a été analysée en fonction du fait que les fibres musculaires rapides (-traitance de type mammifères 2A et 2B) hydrolyser ATP plus rapidement que les fibres lentes (type-traitantes de mammifères 1). Administré équiprêtées fois, fibres-traitance rapide apparaissent léger, avec deux degrés, et les fibres lentes contractantes apparaissent en noir. Fait important, cette méthode peut être utilisée efficacement dans un environnement à haut débit car il est facile à réaliser et un gain de temps (figure 4). De nos jours, un procédé de congélation bien établie consiste à immerger les tissus musculaires dans une suspension d'isopentane sans contact avec un milieu de montage octobre, comme décrit précédemment 8, 9 (figure 3F). Dans cette procédure, il faut environ 30 minutes pour un état de suspension solide-liquide de 240 ml d'isopentane à réaliser par pré-refroidissement de l'isopentane dans l' azote liquide et en agitant jusqu'à ce que de petits précipités blancs apparaissent en bas (figure 4). Il y a trois difficultés pratiques rencontrées par les chercheurs tout en essayant de geler les tissus musculaires dans isopentane prérefroidi: (1) est difficile Un état de suspension solide-liquide de isopantane pour maintenir lorsque lale temps d'échantillonnage est de plus de 1 h. Dans nos tentatives passées, des artefacts de gel ont été généralement observées dans les échantillons qui ont été faites aux étapes intermédiaires et à la fin du processus, lorsque des dizaines de tissus musculaires ont été prélevés une fois. (2) En tant que liquide dangereux, isopantane est autorisé nulle part dans les transports publics. (3) isopentane est disponible, sauf dans les laboratoires. De nombreux chercheurs en sciences de la viande gèlent habituellement les tissus musculaires dans un abattoir qui est loin d'un laboratoire et qui ne peut pas avoir isopentane. En outre, des biopsies musculaires de diagnostic sont souvent sous-traitées de manière optimale en raison du manque d'isopentane dans les établissements médicaux. Ainsi, notre protocole est un développement important pour la congélation des échantillons musculaires dans des situations où l'isopentane est indisponible.

Figure 1
Figure 1: Dispositif pour la congélation musculaire. (A) Les illustrationsdu cryovial utilisé dans cette étude. 14 trous d'entrée sont percés dans la paroi du tube: on est sur le capuchon; un autre est en bas; et les 12 forment quatre lignes parallèles restantes, chacune avec quatre trous à 90 ° l'un de l'autre. (B) Une photographie de l'appareil de congélation. Un moyen sûr et efficace de congélation muscles dans l'azote liquide implique l'utilisation d'un film plastique cryovial, des lunettes de sécurité, des gants de congélation, pinces 10 cm, pinces 25 cm, un refroidisseur de mousse de polystyrène, un scalpel, et la couverture de liaison A4 PVC. (C) Les illustrations du moule cryovial fourni par un ingénieur, Yonghua Wang, dans l'usine de moule. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Préparation des échantillons musculaires. (A (B) Le tissu musculaire doit être placé entre les orifices d'entrée dans le flacon cryogénique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Images représentatives de l'évaluation histologique de porc muscles après Longissimus Dorsi Ils sont congelés à l' aide de cinq méthodes différentes.
Des cristaux de glace détruisent la lisibilité des cryosections musculaires imagées avec coloration HE lorsque les muscles sont congelés pour l' analyse histologique en utilisant des méthodes inappropriées, comme le montre (AC). Artefacts de congélation considérables se sont produits lorsque des échantillons de muscle ont été directement placés dans un congélateur 80 ° C (A) ou trempé dans un liquidel' azote (B). De nombreux cristaux de glace en forme d' aiguilles formées à l' intérieur des cellules musculaires individuelles après que le tissu musculaire a été plongé dans octobre et ensuite versé directement dans une suspension de l' isopentane (C). Le protocole présenté dans cette étude peut éliminer la formation de cristaux de glace quand le tissu musculaire est simplement immergé dans l' azote liquide (D). Ce protocole est applicable à l'analyse de l' activité enzymatique dans le muscle congelé sur la base du dosage d'ATPase de la myosine (E). La méthode de congélation standard pour le muscle n'effectue pas mieux; le tissu musculaire est trempé dans une suspension épaisse d'isopentane sans contact direct avec un milieu de montage OCT (F). Toutes les images sont dans un objectif 10X, à l'exception de ceux qui ont des bords noirs (20X). Barres d'échelle: 100 um. La pointe de flèche indique la figure 3C, les petits cristaux de glace en forme d'aiguilles. La pointe de flèche ou un texte sur la figure 3E indiquent le type de fibres musculaires: type 1 représente les fibres de chaîne lourde de myosine lente, type 2A moyen de fibres intermédiaires de la chaîne lourde de myosine, et le type 2B indique fibres de chaîne lourde de myosine rapide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Comparaison des Workflows pour les procédures de congélation à base isopentane- à base d' azote et de liquide. Dans le protocole à base d'azote liquide, le tissu musculaire dans la nouvelle cryotube est immergé dans de l'azote liquide. Dans le protocole basé sur l'isopentane, l'état de suspension de l'isopentane doit être obtenue à l'avance par le prérefroidissement de l'isopentane dans l'azote liquide et en agitant jusqu'à ce que de petits précipités blancs apparaissent en bas. Ensuite, le tissu musculaire est plongé dans l'isopentane prérefroidi. Par rapport à 35 min dans la procédure sur la base de l'isopentane, comme décrit sur la figure 3F, il ne faut que 5 min t o terminer la procédure de congélation présenté dans ce protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: l' azote liquide écoulement à travers un orifice à arêtes vives. Lors de l'immersion de l'ensemble cryovial à trous multiples dans de l'azote liquide, les forces de pression atmosphérique de l'azote liquide dans le tube à travers les 14 trous d'entrée. La présence des trous rend le flux d'accélérer à travers eux, augmentant ainsi la vitesse. Un écoulement de recirculation (en bleu) se développe immédiatement en aval de l'orifice (en orange). D1 indique le diamètre de l'orifice sur la paroi du tube et D2 représente la distance entre l'orifice et l'échantillon de muscle (en rouge).= « _ Blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous décrivons ici une nouvelle cryovial plusieurs trous pour la congélation et le stockage de tissus musculaires pour effectuer des évaluations histologiques de la fonction musculaire. L'étape critique dans la modification de ce protocole est que l'échantillon dans le tube cryogénique à trous multiples est immergé directement dans de l'azote liquide. À notre connaissance, c'est la façon la plus simple et rapidest pour obtenir d'excellents échantillons congelés pour cryosectioning musculaire parmi les méthodes de congélation existantes (voir les résultats représentatifs).

Le défi technique rencontré par les chercheurs du muscle est que les cristaux de glace sont à former le plus probable par congélation, comme le moyen de durcir le tissu musculaire pour sectionner. Comme il est indiqué dans les résultats représentatifs, trois facteurs jouent un rôle important dans la détermination de la congélation des muscles pour les études pathologiques, y compris le choix d'une source froide appropriée, ce qui réduit l'humidité de l'échantillon, et en augmentant le pourcentage de la surface totale en contact avec la source froide. Premier,le taux de gel est essentiel pour éviter des dommages lors de la préparation du tissu congelé pour sectionner. Lorsque le gel est les muscles lents, congelés montrent le bien connu effet « fromage suisse » parce que les grands cristaux de glace se forment extracellulairement. Lorsque le gel est rapide, mais pas suffisamment rapide, un grand nombre de petits cristaux de glace en forme d'aiguille sont formés dans les cellules musculaires individuelles. Ces cristaux de glace en forme d' aiguille provoquent des dommages structuraux peu détectable, mais ils apportent les effets suivants: les mitochondries sont endommagées 10, la taille des fibres musculaires sont artificiellement augmenté de 11, et l'intégrité des structures fibreuses 11 est détruite. Ainsi, une source froide à une température suffisamment froide et une vitesse de congélation suffisante sont indispensables pour éviter la formation de cristaux de glace dans cryosections musculaires.

Idéalement, la source froide est à des températures extrêmement froides et est disposé to communiquer avec toutes les surfaces. Tant l'azote liquide (-190 ° C) et d'isopentane dans un état mixte solide-liquide (-160 ° C) satisfont à cette condition. Cependant, les deux milieux de congélation ont leurs propres inconvénients. L'azote liquide a une constante de chaleur spécifique extrêmement faible. Le résultat est que le contact entre l' azote liquide et le tissu provoque une barrière à la vapeur qui se forme à côté du tissu et ralentit considérablement la pénétration du froid dans le tissu 12. Ainsi, des artefacts de congélation importants se produisent à l'intérieur du muscle congelé. L'état de la suspension de l'isopentane est un milieu de congélation idéal qui ne forme pas de vapeur barrières, mais le problème principal est que l'isopentane doit être utilisé conjointement avec de l'azote liquide afin d'obtenir une température du bain de liquide de 160 ° C. En outre, l'isopentane est un liquide extrêmement volatil et inflammable à la température ambiante. Deuxièmement, le muscle contient de l'eau excessive (> 75%), de sorte que toute façon d'introduire l'humidité exogène dans l'échantillon causerait des artefacts gel. Par exemple, le milieu de montage ajoute de l'eau supplémentaire octobre au muscle, donc des cristaux de glace sont beaucoup plus importants dans les cryosections musculaires par rapport à ceux sans moyen de montage octobre Enfin, l'épaisseur du tissu musculaire est également important de congeler de façon appropriée, car la vitesse de congélation dépend en partie de la proportion de la surface totale en contact avec la source froide (en général, l'épaisseur <0,5 cm). En conséquence, le seul moyen existant pour congeler correctement le tissu consiste à immerger le tissu musculaire d'une épaisseur inférieure à 0,5 cm dans l' isopentane préalablement refroidi (160 ° C), comme décrit précédemment 8.

Ce protocole décrit comment d'abord geler correctement les tissus musculaires en les plongeant directement dans de l'azote liquide. Le problème avec l'utilisation de l'azote liquide seul est la formation d'azote gazeux sur la surface du tissu, agissant comme un isolant et d'inhiber le refroidissement du tissuf "> 13. Une telle couverture de vapeur peut se former uniquement lorsque la fusion des bulles est si rapide que l'azote gazeux peut séparer le tissu de l'azote liquide. Selon la dynamique des bulles, un écoulement de liquide plus rapide se traduira par des bulles plus petites, car il a moins de chances de fusionner 14. Par conséquent, nous poinçonné 14 trous dans la paroi du cryovial pour augmenter la vitesse d'écoulement du liquide autour du tissu et pour éviter l'effet « couverture vapeur » lorsque les contacts de l' azote liquide du tissu.

Considérant que l'un des facteurs qui détermine le succès expérimental est la vitesse d'écoulement du liquide à travers le tissu, trois paramètres du cryotube sont très importantes, y compris la position et le nombre de trous, le diamètre des trous d'entrée, et la distance entre l'orifice et l'échantillon. la dynamique liquide montre que le débit d'écoulement à travers un orifice est déterminé par le diamètre des trous et en ce qu'un écoulement de recirculation se développe immédiatement vers le bascourant de l'orifice (figure 5) 15, 16. En conséquence, la distance entre l'orifice et l'échantillon détermine principalement la zone de contact entre le flux de fluide à grande vitesse et l'échantillon, comme représenté sur la Figure 5. Par conséquent, le cryovial à trous multiples sur la figure 1A est adapté pour un échantillon de muscle qui est de 0,6 cm de large x 0,6 cm de haut x 1,5 cm de long. Pour des fragments musculaires plus importants, il est intéressant d'essayer cette méthode avec un plus grand tube et plus de trous. Cependant, ce protocole ne convient pas pour la congélation des échantillons de muscle de petits animaux, comme dans un modèle murin, parce que les trous d'entrée pourraient être trop grand pour les petits échantillons.

En outre, trois étapes critiques doivent être strictement respectées dans le protocole. Tout d'abord, l'azote liquide doit être suffisant pour immerger l'ensemble cryovial, et le flacon cryogénique doit être entièrement au-dessous du niveau du liquide. En second lieu, il faut unevide contact accidentel entre les muscles congelés et des conteneurs ou des instruments à température ambiante. Par exemple, sans le transport soigneux, les nouveaux cristaux de glace peuvent se former lorsque le transfert d'un échantillon congelé de la cuve de stockage d'azote liquide ou -80 ° C congélateur à un cryostat. Troisièmement, il ne devrait pas être trop utilisé lorsque les octobre échantillons sont montés sur le support en raison de la forte probabilité de formation de cristaux de glace autour de la zone de contact entre les muscles gelés et octobre

Dans l'industrie de la viande, une procédure de cryosection musculaire est indispensable parce que le processus de fixation au formol et de paraffine provoque le retrait plongement dans les fibres musculaires, ce qui nuit à l'évaluation de certains traits musculaires, comme le TNF et CSAF. De plus, il faut le muscle congelé lors de l'évaluation de la FTC en utilisant le test ATPase de la myosine. Comme le montre la figure 3E, ce protocole peut répondre aux exigences à la fois l' analyse pathologique et les taches histochimie dans les muscles. La préparationd'un cryosection est une opération de routine dans les laboratoires de pathologie musculaire cliniques. Comme cela est décrit par Meng et al. 8, un mode opératoire normalisé pour la congélation des tissus musculaires est d'immerger les spécimens d' autopsie dans l' isopentane préalablement refroidi. Cependant, l'isopentane est indisponible pour geler les échantillons d'autopsie dans les établissements sans laboratoires de pathologie musculaire cliniques. Par conséquent, les biopsies musculaires de diagnostic sont souvent traitées dans de nombreux établissements sous-optimale médicaux. Ainsi, notre protocole pourrait améliorer considérablement la capacité des petits hôpitaux ou des laboratoires pour effectuer des biopsies musculaires de diagnostic de qualité adéquate. Compte tenu de la grande efficacité et un fonctionnement simple de ce protocole, il pourrait être une alternative prometteuse à la méthode de congélation à base isopentane courant et peut être largement appliquée à des études histologiques à l'avenir.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêts, financiers ou autres, sont déclarés par les auteurs.

Acknowledgments

Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC): 31301950 et 31671288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

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References

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Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

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