बायोमोलेस्क्यू संरचना निर्धारण के लिए एकल अणु स्तर पर उच्च शुद्धता FRET

Biochemistry

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Summary

एकल अणु स्तर पर उच्च-सटीक FRET प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। इसके अतिरिक्त, इस पद्धति का उपयोग एन-मिथाइल-डी-एस्पेटेट (एनएमडीए) रिसेप्टर के लिगंड-बाइंडिंग डोमेन में तीन गठनात्मक स्थितियों को पहचानने के लिए किया जा सकता है। सटीक दूरी निर्धारित करना FRET प्रयोगों के आधार पर संरचनात्मक मॉडल बनाने की दिशा में पहला कदम है।

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Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

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Abstract

मल्टीपरैमेटर फ्लोरोसेंस डिटेक्शन (एमएफडी) मोड में एक-अणु स्तर पर फ़ॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) का उपयोग करते हुए उच्च-सटीक अंतराल दूरी माप के लिए एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। एमएफडी photophysical और प्रायोगिक कलाकृतियों को कम करने के लिए प्रतिदीप्ति के सभी "आयामों" के उपयोग को अधिकतम करता है और कठोर बायोमोलेक्लस में ~ 1 ए तक सटीकता के साथ अंतराल दूरी के माप की अनुमति देता है। इस विधि का इस्तेमाल लिगैंड बाइंडिंग पर रिसेप्टर की सक्रियता को समझने के लिए एन-मिथाइल-डी-एस्पेपेटेट (एनएमडीए) रिसेप्टर के लेगंड बाइंडिंग डोमेन के तीन गठबंधन वाले राज्यों की पहचान करने के लिए किया गया था। प्रायोगिक माप के साथ ज्ञात क्रिस्टलोग्राफिक संरचनाओं की तुलना करते समय, वे और अधिक गतिशील जीवोलेक्लस के लिए 3 से कम आधे के भीतर सहमत हुए। बायोमोलेक्लस की संपूर्ण आयाम को कवर करने वाली दूरी संयम के एक सेट को इकट्ठा करने से गतिशील जैव-आणविक का एक संरचनात्मक मॉडल प्रदान करना संभव होगातों।

Introduction

संरचनात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन का एक मूल लक्ष्य, बायोमोलेक्युलर मशीनों की संरचना और कार्य के बीच संबंध को सुलझाना है। बायोमोलेक्लस ( जैसे, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड) का पहला दृश्य प्रभाव 1 9 50 के दशक में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 1 , 2 के विकास में हुआ । एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ़ी क्रिस्टल पैकिंग द्वारा विवश किए गए उच्च-रिज़ॉल्यूशन, स्थिर संरचनात्मक जानकारी प्रदान करती है। इसलिए, एक्स-रे संरचनात्मक मॉडल की अंतर्निहित गतिशीलता जैव-ऊर्जा के गतिशील प्रकृति को दूर करती है, एक ऐसा कारक जो अधिकांश जैविक कार्यों को प्रभावित करता है 3 , 4 , 5 । परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) 6 , 7 , 8 ने जलीय समाधानों में संरचनात्मक मॉडल को हल करके समस्या का एक वैकल्पिक समाधान प्रदान किया है। एक महान लाभएनएमआर का जैव-घनत्व और गठनात्मक ensembles के आंतरिक गतिशील प्रकृति को पुनर्प्राप्त करने की इसकी क्षमता है, जो संरचना, गतिशीलता और 3 , 4 , 5 समारोह के बीच आंतरिक रिश्तों को स्पष्ट करने में मदद करता है। फिर भी, एनएमआर, नमूना आकार और बड़ी मात्रा में नमूना द्वारा सीमित है, बड़े प्रणालियों के लिए जटिल लेबलिंग रणनीति की आवश्यकता होती है। इसलिए, संरचनात्मक जीव विज्ञान में वैकल्पिक तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता है।

ऐतिहासिक रूप से, फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) 9 ने गलत धारणा के कारण संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका नहीं ली है कि FRET कम सटीकता दूरी माप प्रदान करता है। नैनोमीटर पैमाने पर दूरी तय करने के लिए FRET की क्षमता को फिर से प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य है, जैसे कि ये दूरी बायोमोलेक्लस के संरचनात्मक मॉडल के निर्माण के लिए इस्तेमाल की जा सकती हैं। पहला प्रायोगिक verific1 9 67 10 में आरएफटीटी दक्षता पर आर -6 की निर्भरता को स्ट्रैयर ने विभिन्न लंबाई के पॉलीप्रोलिन को मापकर "स्पेक्ट्रोस्कोपिक शासक" के रूप में किया था। 2005 11 में एकल-अणु स्तर पर एक समान प्रयोग पूरा किया गया था। पॉलीप्रोलिन अणु गैर-आदर्श बन गए, और इस तरह, डबल-फंसे डीएनए अणुओं को बाद में 12 का इस्तेमाल किया गया। यह सटीक दूरी मापन के लिए खिड़की खोलता है और बायोमोलेक्लस के संरचनात्मक गुणों की पहचान करने के लिए FRET का उपयोग करने का विचार है।

FRET इष्टतम है जब अंतरार्इ दूरी सीमा ~ 0.6-1.3 आर 0 से है , जहां आर 0 फ़र्स्टर दूरी है। एकल अणु FRET प्रयोगों में प्रयुक्त विशिष्ट फ्लोरोफोर्स के लिए, आर 0 ~ 50 Å है। आमतौर पर, एफईआरटी अन्य तरीकों से अधिक लाभ प्रदान करता है जिसमें संरचनाओं और गतिशीलता को हल करने और अंतर करने की अपनी क्षमता होती है।विषम प्रणालियों: (i) प्रतिदीप्ति की अंतिम संवेदनशीलता के कारण, एकल अणु FRET प्रयोगों 13 , 14 , 15 , 16 विषुव गलतियों को सीधे गिनती और एक साथ अपने व्यक्तिगत सदस्यों की संरचनाओं को चिह्नित करके हल कर सकती है। (Ii) कॉम्प्लेक्स रिएक्शन पाथवे को अकेले अणु FRET अध्ययनों में सीधे समझा जा सकता है क्योंकि किसी कलाकार की टुकड़ी की जरूरत नहीं है। (Iii) एफईआरटी समय-समय पर 10 दशकों से अधिक समय तक अस्थायी डोमेनों तक पहुंच सकता है, जिसमें विभिन्न प्रकार की जैविक रूप से प्रासंगिक गतिशीलता शामिल है। (Iv) एफआरईटी प्रयोग किसी भी समाधान की स्थिति में किया जा सकता है, इन विट्रो और विवो में । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ FRET का संयोजन सीधे जीवित कोशिकाओं 15 , 16 में आणविक संरचनाओं और अंतःक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है , Sup> 17 , 18 , 19 , यहां तक ​​कि उच्च परिशुद्धता 20 के साथ (V) FRET लगभग किसी भी आकार ( जैसे, पॉलीप्रोलिन ऑलिगॉमर 21 , 22 , 23 , 24 , एचएसपीडीएडी 25 , एचआईवी रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ 26 , और राइबोसोम 27 ) के सिस्टम पर लागू किया जा सकता है। (Vi) अंत में, बायोमोलेक्लस के सभी आयाम में शामिल दूरीों का एक नेटवर्क स्थिर या गतिशील अणुओं 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 के संरचनात्मक मॉडल प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है रेफरी "> 35 , 36 , 37

इसलिए, एकल-अणू FRET स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग दूरस्थ दूरी को रोकने के लिए किया जा सकता है, जो दूरी-प्रतिरोधित संरचनात्मक मॉडलिंग 26 के लिए पर्याप्त सटीक हैं। प्रतिदीप्ति जानकारी ( यानी, उत्तेजना स्पेक्ट्रम, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम, अनिसोट्रॉपी, प्रतिदीप्ति जीवनकाल, प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज, आईसीआईडीएक्स, फ्लोरोसेंट्स) के आठ आयामों का उपयोग करते हुए, multiparameter fluorescence detection (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 का लाभ उठाकर संभव है। मैक्रोस्कोपिक समय, प्रतिदीप्ति तीव्रताएं, और फ्लोरोफोर्स के बीच की दूरी) को ठीक से और ठीक से दूरी की रोकथाम प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, स्पंदित इंटरलीव्ड उत्तेजना (पीआईई) को एमएफडी के साथ जोड़ा जाता है(पीआईई-एमएफडी) 42 सीधे उत्तेजना स्वीकारकर्ता प्रतिदीप्ति पर नजर रखने के लिए और एकल 1: 1 दाता-से-स्वीकार्य स्टेइचीयमेट्री वाले नमूनों से उत्पन्न एकल-अणु घटनाओं का चयन करने के लिए। एक ठेठ पीआईई-एमएफडी सेटअप दो स्पंदित इंटरलीव्ड उत्तेजना लेज़रों का उपयोग एक confocal खुर्दबीन शरीर से जुड़ा है, जहां फोटोन का पता लगाने के विभिन्न वर्णक्रमीय खिड़कियों और ध्रुवीकरण विशेषताओं में चार अलग-अलग चैनलों में विभाजित है। अधिक जानकारी चित्रा 1 में पाई जा सकती है।

यह ध्यान रखना जरूरी है कि एफआरईटी को परमाणु जैसी संरचनात्मक मॉडल हासिल करने के लिए कम्प्यूटेशनल विधियों के साथ जोड़ा जाना चाहिए जो कि FRET परिणाम 26 , 30 के अनुरूप हैं। FRET- व्युत्पन्न दूरी के साथ संरचनात्मक मॉडल बनाने के लिए संबंधित पद्धति पर जाने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य नहीं है। हालांकि, इन तरीकों को अन्य तकनीकों के साथ संयोजन में लागू किया गया है ( उदाहरण के लिए, छोटे-कोण एक्स-रे स्कैटरआईएनजी या इलेक्ट्रॉन परमैग्नेटिक अनुनाद), एकीकृत संरचनात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में जन्म देने के लिए 43 , 44 , 45 , 46 । वर्तमान लक्ष्य संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक मात्रात्मक उपकरण के रूप में FRET के लिए मार्ग प्रशस्त करना है। एक उदाहरण के रूप में, इस पद्धति का उपयोग एन-मिथाइल-डी-एस्पेटेट (एनएमडीए) रिसेप्टर के लेगंड-बाइंडिंग डोमेन (एलबीडी) में तीन गठनात्मक राज्यों की पहचान करने के लिए किया गया था। अंतिम लक्ष्य उच्च परिशुद्धता के साथ मापा दूरी प्रदान करके बायोमोलेक्लस के संरचनात्मक दृढ़ संकल्प के लिए इस्तेमाल की जाने वाली समेकित विधियों के बीच पूर्वनिर्धारित सीमाओं को दूर करना है और FRET को लाने के लिए है।

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Protocol

1. पीबीएस बफर तैयारी और चैंबर उपचार

नोट: गीला रासायनिक प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय एक प्रयोगशाला कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें। लेजर को संरेखित करते समय आंख की सुरक्षा का उपयोग करें।

  1. पीबीएस बफर तैयारी
    1. 4.5 ग्राम ना 2 एचपीओ 4 , 0.44 ग्राम एनएएच 2 पीओ 4 , और 3.5 ग्राम NaCl में आसुत पानी के 400 एमएल में भंग करें। 7.5 का एक पीएच सुनिश्चित करें और 1 घंटे के लिए तरल चक्र पर आटोक्लेविंग द्वारा आटोक्लेविंग (आटोक्लेव सिस्टम पर निर्भर) को बाधित करें।
    2. पीबीएस समाधान के 15 एमएल ले लो और इसे 0.1 ग्राम कोयला के साथ मिलाएं। एक 0.2 माइक्रोन छिद्र आकार के साथ एक नियमित 20 एमएल सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके मिश्रण फ़िल्टर करें । कमरे के तापमान पर पीबीएस बफर को सील करें और स्टोर करें।
  2. माइक्रोस्कोप संभाग कवर ग्लास उपचार
    1. डिस्टिल्ड वॉटर के 500 μL और पोलीसोर्बेट 20 नोनियोनिक सर्फटेन्ट के 5 μL जोड़ें (सामग्री सूची देखें)एक संभाग कवर गिलास प्रणाली (सामग्री सूची देखें) और अच्छी तरह से मिश्रण करें इसे 30 मिनट के लिए भिगो दें Polysorbate 20 समाधान निकालें और आसुत जल के साथ चैम्बर को दो बार धो लें। इसे सूखने दें।
      नोट: कक्ष अब उपयोग करने के लिए तैयार है

2. डीएनए नमूना तैयार करना

नोट: डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) मानक नमूने बनाने के लिए डिज़ाइन किए गए लेबल डीएनए किस्में (सामग्री सूची देखें) का उपयोग करें। तैयार किए गए ऑलीगोओं में डिजाइनरों से बचने के लिए निर्धारित दूरी निर्धारित करने से बचने के लिए एक पॉलिमर के अंत में डाइज नहीं होना चाहिए। डीएनए अनुक्रम को एक कठोर शरीर के रूप में व्यवहार करने के लिए चुना जाना चाहिए।

  1. एक डीएनए किनारों के 1.5 μL और माइक्रोफ्यूज ट्यूब में एक मानार्थ (स्वीकार्य-लेबल या गैर-लेबल वाले) डीएनए स्ट्रैंड के 4.5 μL डालें और उन्हें 24 μL नूसलेज़-फ्री पानी के साथ मिलाएं।
    नोट: चयनित ओलिगोनक्लियोटाइड्स के मिश्रण के आधार पर, निम्न नमूने उत्पन्न किए जाएंगे: नो-फ़्रेट, लोW-FRET, या उच्च FRET डीएसडीएनए।
  2. डीएनए को थर्मल मिक्सर और निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग करें: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस, 10 डिग्री के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 50 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट के लिए, 40 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए, 30 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट, 10 डिग्री सेल्सियस के लिए 20 डिग्री सेल्सियस, 10 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 डिग्री सेल्सियस और 5 डिग्री सेल्सियस पर पकड़े रहें।
    नोट: उत्पन्न डीएसडीएनए मानकों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जा सकता है या तुरंत उपयोग किया जा सकता है।

3. प्रोटीन नमूना तैयार करना

नोट: जीवाणु तंत्र में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए पुनः संयोजक डीएनए के साथ शुरू करना, अवशेषों को बदलना संभव है जिससे दूरी को सिस्टीन में मापा जाना है। ऐसा करने के लिए, मानक साइट-निर्देशित उत्परिवर्ती तकनीक 47 का उपयोग करें । प्रोटीन शुद्धि की सुविधा के लिए, एक शुद्धिकरण टैग वाले वेक्टर में पुनः संयोजक और उत्परिवर्तित डीएनए को क्लोन करें ( जैसे,एक उसका टैग) एनएमडीए ग्लूटामेट ionotropic रिसेप्टर (ग्लूएन 1) एलबीडी ( यानी, एनएमडीए ग्लुएन 1 एलबीडी पीईटी -22 बी (+) वेक्टर में क्लोन किया गया) से ग्लूटामेट सबिनिट 1 लेगंड-बाइंडिंग डोमेन (एलबीडी) का इस्तेमाल किया गया था।

  1. प्रोटीन अभिव्यक्ति
    1. डीएनए प्लाज्मिड को पसंद की अभिव्यक्ति प्रणाली में ट्रांसफ़ॉर्म करना 48
      नोट: निम्नलिखित कदम मान लेंगे कि घुलनशील प्रोटीन की अभिव्यक्ति एस्चेरिशिया कोली में बदल जाती है । उदाहरण के लिए, ट्रांसफ़ेक्ट स्तनधारी कोशिकाओं 49 या ट्रांसडुस्ड कीटक कोशिकाओं 50 से शुद्धि, भी संभव है, और विस्तृत चरण कहीं और पाया जा सकता है। यह सुनिश्चित करें कि ई। कोलाई के चयन में रुचि ब्याज की प्रोटीन के लिए उपयुक्त है। उदाहरण के लिए, डिस्टोफाइड पुलों वाले प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए सक्षम कोशिकाओं का एक कम-कम करने वाले इंट्रासेल्युलर डिब्बे (सामग्री सूची देखें) के साथ एक तनाव की आवश्यकता होती है।
    2. एक स्टार्टर टीका डालें <em> ई। कोली संस्कृति एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करके एक भी रूपांतरित कलोनी चुनने के लिए 48 इसे चुनिंदा एलबी माध्यम के 100 एमएल (सामग्री सूची देखें) में छोड़ दें और संस्कृति को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ने दें।
    3. एलबी ब्रोथ तैयार करें (सामग्री सूची देखें)। आटोक्लेव करने के लिए यह बाँझ।
    4. एक 1: 500 अनुपात में चयनात्मक एलबी माध्यम के 2 एल के लिए रातोंरात संस्कृति को जोड़कर परिवर्तित ई। कोली के बड़े पैमाने पर संस्कृतियों को टीका डालना
    5. अगले कुछ घंटों में, 600 एनएम पर संस्कृति के अवशोषण रीडिंग (एबीएस) की निगरानी के द्वारा संस्कृति के विकास का आकलन करें, कभी-कभी 600 एनएम (ओडी 600 ) पर ऑप्टिकल घनत्व के रूप में संदर्भित किया जाता है या सेल घनत्व मीटर का उपयोग कर। ध्यान दें कि समय के साथ रीडिंग बढ़ता है
    6. 0.5 एमएम isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (आईपीटीजी) के अंतिम एकाग्रता के साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति को अभिव्यक्त करते हैं, जब संस्कृति ओडी 600 0.7 तक पहुंचती है। शेक प्रेरित ई। कोली 20 डिग्री सेल्सियस के लिए 20-24 घंटे
    7. प्रोटीन शामिल करने के बाद, ई। कोली को 3,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कताई करके गोली करें सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और ई। कोलाई गोली का उपयोग करें जब तक कि -80 डिग्री सेल्सियस तक इंट्रासेल्युलर प्रोटीन न हो।
  2. प्रोटीन शुद्धि
    1. Lyse E. कोली , पसंद की एक विधि विधि ( उदाहरण के लिए, sonication, फ्रांसीसी प्रेस, नाइट्रोजन cavitation, आदि ) का उपयोग कर 51
    2. 1 घंटे के लिए lysate centrifuging 185,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस से झिल्ली और सेल मलबे नीचे स्पिन
    3. उनकी प्रोटीन युक्त प्रोटीन के लिए, तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) प्रणाली ( सामग्री तालिका देखें ) 52 का उपयोग करके एक समसामयिक, निकल-चार्ज, स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (आईएमएसी) स्तंभ पर सतह पर तैरनेवाला लोड करें।
      नोट: एनएमडीए GluN1 एलबीडी के लिए समीकरण बफर: 200 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, और 1 मिमी ग्लाइसिन, पीएच 8. एनएम के लिए अल्युशन बफरडीए ग्लुएन 1 एलबीडी: 200 मिमी NaCl, 20 मिमी ट्रिस, 1 मिमी ग्लाइसीन, और 400 मिमी इमिडाज़ोल, पीएच 8
      1. आईएमएसी कॉलम को बफर में धो लें जिसमें कम मात्रा में (~ 12 मिमी) इमिडाज़ोल है।
      2. आईएमएसी कॉलम से प्रोटीन को 12 एमएम से 400 एमएम तक इमिडाज़ोल के रेखीय ढाल का उपयोग करके एल्यूट करें।
    4. डायलिसिस टयूबिंग में चरण 3.2.3.2 से एलीवेट रखकर और 2-3 घंटे के लिए लगातार सरगर्मी के तहत संतुलन बफर में डुबकी करके इमीडाज़ोल 53 के बिना संतुलन बफर में रात भर प्रोटीन डायल करें। कम से कम एक बार दोहराएं।
      नोट: चरण 3.2.3-3.2.6 उनके टैग प्रोटीन की शुद्धिकरण मानते हैं। यदि किसी अन्य विधि के माध्यम से शुद्ध हो, तो तदनुसार प्रोटोकॉल समायोजित करें।
    5. डायलिसिस प्रोटीन के 280 एनएम पर अवशोषण लेते हुए बीयर का कानून ( अवशेष इकाई = ε एल सी , जहां ε में प्रोटीन की मात्रा को बढ़ाएं विलोपन गुणांक है (एम -1 सेमी -1), जो यहां प्राप्त किया जा सकता है 54 ; एल प्रकाश पथ लंबाई (सेमी) है; और सी प्रोटीन एकाग्रता (एम) है)।
      नोट: ब्रैडफ़ोर्ड परख और बिकिचोनिनिक एसिड परख सहित विभिन्न प्रोटीन मात्रा का ठहराव के ऐश उपलब्ध हैं। दोनों सटीक परिणाम प्रदान करते हैं
  3. प्रोटीन लेबलिंग
    1. 1: 1: 8 प्रोटीन में शुद्ध प्रोटीन के लिए दाता (नरमाइड रिएक्टिव सियान-ग्रीन डाई) और स्वीकार्य (नरमाइड प्रतिक्रियाशील दूर-लाल डाई) फ्लोरोफोर्स जोड़ें: दाता: स्वीकार्य दाढ़ अनुपात।
    2. 30 मिनट के लिए बर्फ पर प्रोटीन और फ्लोरोफोरे मिश्रण को सेते। लंबे समय तक ऊष्मायन समय संभव है।
    3. 0.5 मिलीलीटर नी-नाइट्रिलोट्रैटेसेटिक एसिड (नी-एनटीए) एगरोज कॉलम (सामग्री सूची देखें) को पैक करें और चरण 3.2.3 में उसी संतुलन बफर का उपयोग करके संतुलित करें, जबकि प्रोटीन इनक्यूबेटिंग है।
      नोट: राल बंधन क्षमता के अनुसार भरी हुई प्रोटीन की मात्रा को रखें।
    4. 30 मिनट के बाद मेंचरण -3.3.3 में तैयार किए गए कॉलम पर प्रोटीन / फ्लोरायोफोरे मिश्रण लोड करें और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से शुद्ध करें।
    5. 5 मिलीलीटर संतुलन बफर के साथ अतिरिक्त फ्लोरोफोरे को धो लें।
    6. एल्यूएशन बफर के 0.5 मिलीलीटर के साथ चार बार स्तंभ से गुरुत्वाकर्षण द्वारा लेबल प्रोटीन नमस्कार करें। क्योंकि प्रोटीन पहले ही अन्य प्रोटीनों से शुद्ध हो चुका है, इसलिए कोई ढाल आवश्यक नहीं है।
    7. प्रत्येक यूवी-स्पेस स्पेक्ट्रोमीटर के साथ प्रत्येक एल्वेट की जांच करें ताकि लेबल के प्रोटीन में कौन सा अंश शामिल हो। प्रोटीन (280 एनएम) और प्रत्येक फ्लोराफोरे (सियान-हरी फ्लोरोफोरे के लिए 493 एनएम और दूर-लाल फ्लोरोफोरे के लिए 651 एनएम) से अवशोषित चोटियों को सुनिश्चित करने के लिए 230-700 एनएम से अवशोषण को स्कैन करें। eluate।
      नोट: आमतौर पर, प्रोटीन अंश 2 में पढ़ा जाएगा
    8. लकड़ी का कोयला के इलाज वाले पीबीएस (चरण 1.1) के साथ डिस्लेटिंग कॉलम ( सामग्री तालिका देखें) को संतुलित करें
    9. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा desalting स्तंभ पर लेबल प्रोटीन लोड।
      नोट: चुने हुए desalting स्तंभ क्षमता के अनुसार भरी हुई प्रोटीन की मात्रा 55 रखें।
    10. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा 3.5 एमएल की लकड़ी का कोयला-इलाज पीबीएस का उपयोग करके एल्यूलेट के 0.5 एमएल अंश इकट्ठा करें।
    11. यूवी-स्पेस स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करें ताकि प्रत्येक प्रोटीन के आकार को 230-700 एनएम से अवशोषित किया जा सके।
      नोट: चरण 3.3.8-3.3.11 मूल रूप से बफर एक्सचेंज स्टेप के रूप में कार्य करता है। इस उद्देश्य की सेवा करने वाले अन्य प्रोटोकॉल भी संभव हैं ( जैसे, व्यापक डायलिसिस)। वैकल्पिक रूप से, कोई भी कदम 3.3.2 से सीधे 3.3.8 पर जा सकता है।

4. एन्स्म्बल स्थितियों में आवश्यक माप (क्यूबेट में)

  1. फोर्स्टर निरंतर का निर्धारण
    1. फ्लोरोफोर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (सीपीएस) स्कैन एफ डी , रोमांचक दाता द्वारा 15 एनएम पर अपनी अधिकतम शोषक तरंग दैर्ध्य के लिए फ्लोरोमीटर में, पूर्ण करने के लिएजारी किए गए स्पेक्ट्रम उत्सर्जन की तरंग दैर्ध्य के बाद 5 एनएम की शुरुआत के बाद उत्सर्जन की निगरानी करें और बाद में 150 एनएम समाप्त हो जाएंगे। एग्निशन पॉलरिएजर को 54.7 डिग्री तक सेट करके जादू कोण स्थितियों का उपयोग करें और उत्तेजना polarizers 0 करने के लिए 56
      नोट: यहां इस्तेमाल किए गए दाता फ्लोरोफोरे के लिए, एब्स अधिकतम 490 एनएम पर होता है; 475 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के रूप में प्रयोग किया जाता है, और 480-650 एनएम से उत्सर्जन की निगरानी की जाती है। स्वीकर्ता के लिए, अधिकतम अधिकतम 645 एनएम पर होता है; 630 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए उपयोग किया जाता है, और 635-735 एनएम से उत्सर्जन की निगरानी की जाती है।
    2. 400-700 एनएम से लेकर स्वीकर्ता फ्लोरोफोरे (एबीएस ) की उत्तेजना स्कैन करने के लिए फ्लोरियममीटर का उपयोग करें और एग्निशन पोलरिएज़र को 54.7 डिग्री तक सेट करके जादू कोण स्थितियों का उपयोग करें और उत्तेजना polarizers 0 करने के लिए 56 अधिकतम-उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के बाद उत्सर्जन मोनोक्रोमेटर को 15 एनएम तक सेट करें। अधिकतम एक्ससी को सामान्य करेंTation value
    3. प्रकाशित सारणी में, स्वीकार्य, ε (एम -1 सेमी -1 ) 56 की विलुप्त होने के गुणांक का पता लगाएं, या निर्माता द्वारा प्रदत्त मूल्यों का उपयोग करें।
      नोट: इस पांडुलिपि में प्रयुक्त स्वीकर्ता फ्लोराफोरे के लिए प्रकाशित मूल्य ε ए 647 = 270,000 सेमी -1 एम -1 56 है
    4. जे = सैंडफ डी · (एब्स · ε ) · λ 4 का उपयोग करके वर्णक्रमीय ओवरलैप की गणना करें, जहां एफ डी , एब्स और ε को ऊपर दी गई है λ और तरंगलांब (एनएम) है। 4.1.1-4.1.3 के चरण में प्राप्त सभी तरंगदैर्य-आश्रित मूल्यों में स्तंभों की सूची के लिए कार्यपत्रक का उपयोग करें। तरंग दैर्ध्य के अनुसार उन्हें संरेखित करें। दाता उत्सर्जन की न्यूनतम तरंग दैर्ध्य (λ मिन ) से स्वीकार्य अवशोब्ण के अधिकतम तरंग दैर्ध्य को सम्मिलित करेंई (λ अधिकतम )
    5. निम्न सूत्र आर 6 = 8.7 9 x 10 -5 · जे · κ 2 · एफ एफ डी 4 एन 4 का उपयोग करके फोर्स्टर निरंतर (आरओ) की गणना करें, जहां जे परवर्ती चरण ओवरलैप चरण 4.1.4 में गणना की गई है, Κ 2 उन्मुखीकरण कारक है, Φ एफ, डी दाता फ्लोरायोफोरे की प्रतिदीप्ति क्वांटम यील्ड है, और एन मध्यम के अपवर्तक सूचकांक है जिसमें फ्लोरोफोरे स्थित है।
      नोट: एन = 1.33 का उपयोग करें (यदि जलीय बफर का उपयोग किया जाता है) और κ2 = 2/3
    6. दाता फ्लोरोफोरे के क्वांटम यील्ड वैल्यू का पता लगाएँ (Φ एफ, डी , पर्यावरण पर निर्भर) प्रकाशित सारणी पर (संदर्भ 57 देखें) और चरण 4.1.4 में प्राप्त वर्णक्रमीय ओवरलैप के मूल्य का उपयोग करके फोर्स्टर निरंतर के अंतिम मूल्य की गणना EQचरण 4.1.5 से यूएआई
      नोट: यदि क्वांटम उपज उपलब्ध नहीं है, तो यह गणना करने के लिए नीचे दिए गए चरण 4.2 का पालन करें। इस मामले में, Φ एफ, डी = 0.8 का उपयोग करें, जो दाता के जीवनकाल से संबंधित है τ डी, आर = 4.0 एनएस
  2. प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज का निर्धारण
    नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया केवल गतिशील शमन को मानती है। स्थैतिक शमन पर विचार करने के लिए, संदर्भ 56 का संदर्भ लें। हालांकि, स्थिर शमन (परिणाम देखें) के मामले में, क्वांटम उपज का निर्धारण करने में पीआईई-एमएफडी प्रयोग भी उपयोगी हैं।
    1. क्वांटम यील्ड (Φ आर ) का निर्धारण किया गया है, जिसके लिए दोनों स्वीकार्य और दाता फ्लोराफोर्स के लिए समान शोषक और उत्सर्जन प्रोफाइल के साथ संदर्भ फ्लोरोफोरे का चयन करें।
      नोट: दाता के लिए, Φ आर = 0.8 और τ आर = 4 एनएस, जबकि स्वीकर्ता के लिए, Φ आर = 0.32 और τ आर = 1.17 एनएस, wहाई सियान-हरी फ्लोरोफोरे के लिए Φ आर और τ आर के अनुरूप हैं- और दूर-लाल फ्लोरोफोरे-लेबल वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड, क्रमशः 57
    2. समय-संकुचित प्रतिदीप्ति क्षय (एफ (टी)) को मापने के समय-सहसंबंधित एकल-फोटॉन गिनती (टीसीएसपीसी) विधि का प्रयोग जादू-कोण परिस्थितियों में करें।
    3. एफ (टी) = Σ i x i-टी / τ i के रूप में एक मोनो- या मल्टी-एक्सपोनेंशन डैश फ़ंक्शन के साथ प्रतिदीप्ति क्षय फ़िट करें, जहां x i आबादी का अंश और τ i है जनसंख्या प्रतिदीप्ति जीवनकाल है
    4. प्रजातियों की औसत जीवन काल की गणना करें, <τ> एक्स = Σx i τ i , जहां x i आबादी का अंश और τ i है जनसंख्या प्रतिदीप्ति जीवनकाल है
    5. इसका उपयोग करोई सूत्र Φ एफ, डी = <τ डी > एक्स * Φ आर / τ आर प्रतिदीप्ति जीवनकाल में प्लगिंग करके दाता फ्लोरोफोरे की प्रतिदीप्ति क्वांटम यील्ड की गणना और संदर्भ के क्वांटम उपज, साथ ही दाता फ्लोरोफोरे के प्रतिदीप्ति जीवनकाल का आकलन करने के लिए।
      नोट: यह विधि गतिशील शमन को ग्रहण करती है अन्य Φ एफ, डी निर्धारण के लिए, लॉकोवज़ 56 का पालन करें।

5. पीआईई-एमएफडी सिंगल-अणु डिटेक्शन (एसएमडी) के लिए प्रयोग संरेखण

नोट: माप लेते समय रोशनी बंद करना बेहतर होता है।

  1. उपकरण समायोजन (चित्रा 1)
    नोट: आकृति 1 में दर्शाया गया एक गृह निर्मित एमएफडी सेटअप, दो स्पंदित लेज़रों के साथ और एक उल्टे माइक्रोस्कोप बॉडी में 4 पता लगाने के चैनल, इस प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है। समान वाणिज्यिक प्रणालियां हैं
    1. 485-एनएम और 640-एनएम पराबैंगनीकिरण और एमएफडी सेटअप के सभी डिटेक्टरों को चालू करें। टीसीएसपीसी अधिग्रहण और पराबैंगनीकिरण को नियंत्रित करने वाले सॉफ्टवेयर को खोलें सुनिश्चित करें कि लेजर पुनरावृत्ति दर 40 मेगाहर्टज है
    2. 60 एक्स 1.2 एनए पानी-विसर्जन उद्देश्य के चित्र विमान पर 485-एनएम स्पंदित लेजर पावर को 60 μW और स्पंदित इंटरलीव्ड उत्तेजना मोड (पीआईई-एमएफडी) 42 में 23 μW तक 640-एनएम स्पंदित लेजर शक्ति निर्धारित करें।
      नोट: पीआईई-एमएफडी सेट करने के लिए, लेजर नियंत्रक सॉफ़्टवेयर में दो लेजर दाल विलंबित हैं। 485-एनएम लेजर उत्तेजना के लिए, पता लगाने टीसीएसपीसी चैनल (टीएसी चैनल) 1-12,49 9 ("प्रॉम्प्ट" चैनल) हैं। 640 एनएम लेजर उत्तेजना के लिए, पता लगाने टीसीएसपीसी चैनल (टीएसी चैनल) 12,499-50,000 ("देरी" चैनल) हैं।
    3. माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस और एक आवरण कांच स्लाइड के बीच उद्देश्य विसर्जन तरल (डबल आसुत जल की एक बूंद) जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि छवि विमान समाधान के अंदर है और कांच से दूर हैसीई, ग्लास-तरल अंतरफलक पर पराबैंगनीकिरण के प्रतिबिंब के कारण दूसरा उज्ज्वल फोकल बिंदु ढूंढने के बाद समायोजन घुंडी बारी में बदल जाता है।
    4. आवरण कांच के केंद्र में 100 μL 100 ग्राम आसवाली के 110 μL 110 μL का 70 ग्राम जोड़ें। सुनिश्चित करें कि समाधान माइक्रोस्कोप उद्देश्य के केंद्र में भी है।
    5. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर फोटॉन गिनती दर की निगरानी करते हुए पिनहोल (आकार: 70 माइक्रोन) स्थितियों (एक समय में एक्स और वाई दिशा एक) समायोजित करें।
  2. मानक माप एसएमडी (एक अंधेरे कमरे में काम)
    1. चरण 5.1.4 से नमूना का उपयोग करें और अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पर "* .ht3" प्रारूप 58 में टाइम-टैग समय-हल (TTTR) नियंत्रण कक्ष पर "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करके गणना दर के 120 स्केल का रिकॉर्ड करें।
    2. ऑफ़लाइन प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) 59 , < कंप्यूटिंग/ Sup> 60 , 61 ( यानी, एफसीएस माप) प्रसार की विशेषता समय निर्धारित करने के लिए, confocal मात्रा में अणुओं की संख्या, तीन राज्य कैनेटीक्स, और आणविक चमक 62
      1. एफसीएस (क्रिस्टीन, एमएफडी सुइट) के लिए सॉफ्टवेयर खोलें "विकल्प" -> "सेट अप करें" पर क्लिक करके प्रयोगात्मक सेटिंग चुनें। समान प्रायोगिक सेटिंग्स वाला एक फ़ाइल चुनें और फ़ाइल पर हेडर जानकारी पढ़ने के लिए "फ़ाइल से पैरामीटर प्राप्त करें" पर क्लिक करें।
      2. "संचालन" -> "सहसंबद्ध" का चयन करने के लिए एफसीएस करें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि चैनल संख्या ठीक से निर्दिष्ट की गई है और "टीएसी गेट" (टीसीएसपीसी चैनल) को तदनुसार तत्काल या देरी चैनल चुनने के लिए चेक किया गया है।
      3. फिट रोज़ाना खोलने के लिए "ऑपरेशन" -> "सहसंबंध कुंज की वैश्विक फिट" चुनें। सॉफ्टवेर पर "समीकरण # 24" का उपयोग करेंई और "शुरू" पर क्लिक करें।
        नोट: सॉफ़्टवेयर पर समीकरण # 24, तीन-आयामी गाऊसीयन रोशनी प्रोफ़ाइल पर स्वतंत्र रूप से फ्लोरोसेंट अणुओं को फैलाने वाले ऑटोकोएरलिलेशन फ़ंक्शन (जीसी) का वर्णन करता है, जैसे कि 61 :
        समीकरण 36
        जहां एन पता लगाने की मात्रा में अणुओं की औसत संख्या है, एक्स टी गुणक समय टी टी , टी सी के साथ त्रिभुज-राज्य कैनेटीक्स उत्पन्न करने वाले अणुओं का एक अंश है, टी अंतर एक ज्यामितीय से संबंधित प्रसार का समय है पैरामीटर ω , और ω गाऊसी रोशनी प्रोफ़ाइल का वर्णन करता है। फिट होने के बाद, इन्फोक्यूशल वॉल्यूम में प्रसार समय और अणुओं की संख्या का ध्यान रखें।
    3. डिस्टिल्ड के 50 μL में 100 एनएम Rhodamine 101 के 10 μL जोड़ेंपानी और अच्छी तरह मिक्स कवर ग्लास के ऊपर इस मिश्रण को रखें और सुनिश्चित करें कि छोटी बूंद उद्देश्य लेंस के केंद्र में है। टीटीटीआर प्रारूप में 120 एस डेटा को रिकॉर्ड करने के लिए टीटीटीआर कंट्रोल पैनल पर "स्टार्ट" बटन पर क्लिक करें।
    4. 100 μL दूर-लाल फ्लोरोफोर के 1 μL को आसुत जल के 50 μL में जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। इस मिश्रण को उद्देश्य लेंस के केंद्र में रखें। "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें और टीटीटीआर प्रारूप में 120 एस डेटा रिकॉर्ड करें।
    5. उद्देश्य लेंस के केंद्र में आसुत जल के 50 μL रखें। "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें और टीटीटीआर प्रारूप में 300 एस डेटा रिकॉर्ड करें।
    6. उद्देश्य लेंस के केंद्र में 50 μL पीबीएस बफर रखें। "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें और टीटीटीआर प्रारूप में 300 एस डेटा रिकॉर्ड करें।
    7. चरण 5.1.4 से मिश्रण का 1 μL लें और आसुत पानी के 50 μL के साथ मिश्रण करें। इस मिश्रण को कवर ग्लास पर रखें। सबसे पहले, "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें और टीटीटीआर मोड में 10 एस डेटा जमा करें। फिर, टीटी का विश्लेषण करेंचरण 5.3 में बताए अनुसार, फट इंटिग्रेशन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (बीआईएफएल) विश्लेषण सॉफ्टवेयर (पेरिस, एमएफडी सूट) का इस्तेमाल करते हुए टीआर मोड फ़ाइल।
      नोट: विस्फोट चयन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर 26 , 61 से प्रति सेकंड फट की संख्या को सत्यापित करें। यदि बस्ट स्तर 35 के आसपास हर 10 एस है, तो यह एकल अणु माप के लिए उपयुक्त है।
    8. 1.5 एच के लिए टीटीटीआर प्रारूप में गिनती दर को रिकॉर्ड करना जारी रखें ( अर्थात एसएमडी पर टीसीएसपीसी) एकल-अणु माप मानक के रूप में व्यवहार करने के लिए।
      नोट: बड़ी फ़ाइल आकार के कारण, बीआईएफएल का उपयोग करने और लोड करने के लिए छोटी-छोटी फाइलों में कच्चे "* .ht3" फाइलें विभाजित।
  3. बीआईएफएल का इस्तेमाल करते हुए मानक नमूने का विश्लेषण
    1. बीआईएफएल सॉफ्टवेयर (पेरिस) खोलें
    2. स्वचालित पॉप-अप विंडो को "सेट अप की पुष्टि करें" में पीआईई के लिए सेटअप का चयन करें और समान प्रायोगिक सेटिंग के साथ फाइल को चुनकर शीर्ष लेख पढ़ें। क्लिक करें "पैरामीटर प्राप्त करें froमी फ़ाइल। "क्लिक करें" ठीक। "ध्यान दें कि पॉप-अप विंडो बंद हो जाती है और पेरिस फ्रंट-एंड में एकीकृत हो जाती है।" अगला "के तहत" ओके "पर क्लिक करें।
    3. विश्लेषण करने के लिए माप का चयन करने के लिए "डेटा पथ सरणी" पर "चुनें" पर क्लिक करके विश्लेषण करने के लिए फ़ाइलें चुनें
      1. "ग्रीन स्कैटर" (पानी के माप के लिए), "ग्रीन बिग" (बफर माप के लिए), "ग्रीन मोटी" (2 एनएम रोडडाइन 110 माप के लिए), "रेड स्कैटर" (पानी के माप के लिए) पर क्लिक करें " लाल बीजी "(एक बफर या पानी के माप के लिए)," लाल मोटी "(20-एनएम रोडैमिने 101 माप के लिए)," पीला स्कैटर "(जल माप के लिए)," पीला बीजी "(बफर माप के लिए), और "पीला मोटा" (2 एनएम दूर-लाल फ्लोरोफोरे माप के लिए)
      2. "अगला" के नीचे "ठीक" क्लिक करें।
        नोट: "ग्रीन" चैनल "प्रांप्ट" टीसीएसपीसी चैनलों में ग्रीन डिटेक्टरों के संकेत के अनुरूप है।4 "लाल" चैनल "शीघ्र" टीसीएससीपी चैनलों में लाल डिटेक्टरों के सिग्नल से मेल खाती है। "पीला" चैनल देरी टीसीएसपीसी चैनलों में लाल डिटेक्टरों के संकेत के अनुरूप होता है।
    4. एक-अणु चयन पैरामीटर को समायोजित करने के लिए "डेटा कट बस्टिव" के आगे स्थित "समायोजित करें" पर क्लिक करें नई पॉप अप विंडो में, "थ्रेसहोल्ड" के अंतर्गत इंटरफ़ोटन आगमन समय को बदलकर और "न्यूनतम के तहत प्रति एकल अणु प्रति फोटोन की न्यूनतम संख्या बदलकर मध्य इंटरफ़ोन आगमन समय (" डीटी ") से दो मानक विचलन के साथ सिंगल-अणु घटनाओं का चयन करें #। " पॉप-अप विंडो को बंद करने के लिए "रिटर्न" पर क्लिक करें। "अगला" के नीचे "ठीक" क्लिक करें।
      नोट: थ्रेशोल्ड, एमएस इकाइयों में, पृष्ठभूमि गणना दर पर निर्भर करता है। इस्तेमाल की गई फोटॉनों की सामान्य संख्या 60 है
    5. उत्पन्न करने के लिए प्रारंभिक प्रतिदीप्ति जीवनकाल "रंग फिट मापदंडों" ( जैसे , से, से, और रूपांतरण) समायोजित करें"ग्रीन", "लाल," और "पीला" रंगों पर प्रतिदीप्ति क्षय पैरामीटर उसी विंडो में, "शीघ्र" और "देरी" के लिए "से" और "से" मान समायोजित करें। पॉप-अप विंडो को बंद करने के लिए "रिटर्न" पर क्लिक करें। "अगला" के नीचे "ठीक" क्लिक करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि 2-रंग उत्तेजना चेक-बॉक्स का चयन किया गया है। प्रतिदीप्ति क्षय हिस्टोग्राम (टीएसी चैनल नंबर) पर प्रारंभिक और अंत डिब्बे से "से" और "से" अनुरूप होता है। अगर प्रारंभिक फिट मापदंडों का चयन ठीक से किया जाता है, तो प्रत्येक चैनल पर प्रतिदीप्ति decays में एक फिट समारोह जोड़ा जाता है।
    6. उस हार्ड ड्राइव पर स्थान का चयन करें जिसमें सभी संसाधित आस्की फ़ाइलों को एक मूल फ़ोल्डर में सहेजना है।
      नोट: पेरिस सभी चुने हुए विस्फोटों को संसाधित करता है और कई एएससीआई आउटपुट फाइल बनाता है , जो दृश्य के लिए अन्य कार्यक्रमों द्वारा उपयोग किए जा सकते हैं ( जैसे, मार्गारीटा एमएफडी सूट)।

6. डीएसडीएनए मानक और नमूना उपायurements

  1. एक कक्षित कवर शीशे में 500 μL पीबीएस बफर जोड़ें और चैम्बर और उद्देश्य लेंस के बीच आसुत जल की एक बूंद रखें। नियंत्रण पेडल पर "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें और विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए टीटीटीआर मोड में 5 मिनट का डेटा एकत्र करें।
  2. डीएसडीएनए मानक की एक छोटी सी राशि (आमतौर पर लगभग 0.1 माइक्रोन, लगभग 1 सुक्ष्ममापी की एकाग्रता) लें, इसे पीबीएस बफर में जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। सबसे पहले, "प्रारंभ" पर क्लिक करके 10 एस डेटा एकत्र करें। इसके बाद, फट को 10 फुट में 35 बस्ट्स प्राप्त करें (जैसे चरणों 5.2.7 और 5.3 में) अंत में, ऊपर वर्णित के अनुसार, टीटीटीआर प्रारूप में 2 एच डेटा एकत्र करें।
  3. चरण 5.3.3 के अनुसार, डीएसडीएनए नमूने के लिए एकत्र किए गए आंकड़ों का विश्लेषण करें।
  4. एमएफडी सूट (मार्गारीटा) का उपयोग करके फट हिस्टोग्राम को विज़ुअलाइज़ करें और FRET दक्षता बनाम <τ डी (ए) > एफ या एफ डी / एफ बनाम <τ डी (ए) > एफ को प्रदर्शित करें
    1. ओपन टीवह मार्गारीटा सॉफ्टवेयर और "फाइल" का चयन करें -> "सभी आयात करें।" 4 और * .एमटीआई फ़ाइलें। " विभिन्न सबफ़ोल्डर्स वाला मूल फ़ोल्डर चुनें
    2. पेरिस से प्राप्त पैरामीटर में से एक के "एक्स" (फरवरी) के आगे क्लिक करके कल्पना करने के लिए पैरामीटर चुनें ( जैसे, ताऊ हरा या <τ डी (ए) > ); इसी प्रकार, अनुरेखण "वाई" के लिए वांछित पैरामीटर को विज़ुअलाइज़ करने के लिए ( उदाहरण के लिए, FRET दक्षता, एफ डी / एफ , या एस पीआईई पीआईई) के लिए इसे दोहराएं।
      नोट: इस मामले में, FRET दक्षता, एफ डी / एफ , या एस पीआईई, हरे रंग, लाल और पीले चैनलों में उचित पृष्ठभूमि गिनती दर के लिए सही है; दाता और स्वीकर्ता के क्वांटम पैदावार के लिए; पहचान दक्षता अनुपात (जी जी / जी आर ) के लिए; और क्रोसस्टल (α) के लिए यहाँ, जी जी / जी आर = 3.7 और α = 0.017, केवल उपकरण पर निर्भर करते हुए। पृष्ठभूमि गणना दरइस्तेमाल किया बफ़र पर निर्भर करते हैं, और क्वांटम उपज मान पहले से निर्धारित हैं।
    3. "प्रदर्शन" -> "ओवरले समीकरण" पर क्लिक करके "ओवरले समीकरण" विंडो खोलकर एक FRET पंक्ति जोड़ें। पॉप-अप मेनू से स्थिर FRET लाइन का चयन करें उचित दाता जन्म के समय का चयन करें और क्वांटम रिजल्ट पैरामीटर उचित एफआरटीटी लाइन उत्पन्न करें।
      नोट: विभिन्न झल्लाहट संकेतकों के संबंध के लिए झल्लाहट लाइनें उत्पन्न हो सकती हैं।
  5. मार्गारीटा में एफईटीटी दक्षता बनाम स्टोइकीओमेट्री (एस पीआईई) (समीकरण 1, नीचे) प्रदर्शित करके स्टोइकीओमेट्री पैरामीटर का उपयोग करके दाता उत्तेजना स्रोत (β) द्वारा स्वीकार्य उत्तेजना के लिए सुधार कारक निर्धारित करें।
    नोट: β इस तरह चुना जाता है कि दाता नमूना स्टेइइचीमेट्री स्केल में एस पीआईई = 1.0 पर चरम है; केवल स्वीकर्ता के नमूने में एस पीआईई = 0.0 का एक स्टेइइचीमेट्रटरी होनी चाहिए, और दोनों लेबलों के साथ डीएसडीएन को एस पीआईई ~ 0.5 के एक स्टेइइचियोमिति होना चाहिए।Br /> नोट: उपकरण अब तैयार है, और FRET- लेबल वाले नमूनों को मापना संभव है।
  6. निम्न चरणों 6.3-6.4 द्वारा अनुभाग 3 में तैयार किए गए FRET- लेबल वाले नमूनों को मापें और विश्लेषण करें।

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Representative Results

एक एमएफडी सेटअप (लेजर लाइनों: 48 μW पर 60 μW और 640 एनएम पर 23 μW, अनुभाग 5.1) का उपयोग करते हुए ठेठ smFRET प्रयोगों में, प्रतिदीप्ति नमूना निम्न-पिकोकोलोलर एकाग्रता (10 -12 एम = 1 पीएम) के लिए पतला होता है और रखा जाता है एक confocal सूक्ष्मदर्शी में, जहां एक उप-नैनोसेकंड लेजर पल्स उत्साह मात्रा के माध्यम से स्वतंत्र रूप से diffusing लेबल अणु उत्तेजित। एक ठेठ confocal मात्रा <4 femtoliters (एफएल) है इतनी कम सांद्रता पर, केवल एक अणु एक बार में एक का पता चला है। लेबल वाले अणुओं से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को उद्देश्य के माध्यम से एकत्र किया जाता है और एक पैनहोल का उपयोग करके स्पेक्टिलिक फ़िल्टर्ड किया जाता है। यह चरण एक प्रभावी confocal पता लगाने मात्रा को परिभाषित करता है फिर, संकेत दो (या अधिक) अलग-अलग वर्णक्रमीय खिड़कियों ( जैसे "हरी" और "लाल") पर समानांतर और सीधा घटकों में विभाजित है। तब प्रत्येक फोटान डिटेक्टर चैनल को समय-सहसंबद्ध एक-फोटॉन गिनती (TCSPC) के साथ युग्मित किया जाता है) डेटा पंजीकरण के लिए इलेक्ट्रॉनिक्स ( चित्रा 1 )।

एमएफडी सेटअप के अंशांकन का पालन करने के बाद, तालिका 1 (चरण 5-6) में सारांशित एक प्रक्रिया, डीएसडीएनए मानकों का माप, शुरू किया जा सकता है। इसके बाद, पीआईई-एमएफडी का उपयोग कई मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जैसे कि अर्थ मैक्रोटाइम, प्रतिदीप्ति जीवनकाल, फट-एकीकृत अनिसोट्रॉपी, सिग्नल के लाल रंग में संकेत के अनुपात, शीघ्र चैनल में फट अवधि (टी (जी + आर) | डी ), विलंबित चैनल (टी आर | ए ) में फट अवधि, और अन्य 65 , 66 ( चित्रा 2 )। इस विश्लेषण में महत्वपूर्ण स्टोइकीओमेट्री पैरामीटर ( एस पीआईई) है, जिसे परिभाषित किया गया है:

समीकरण 45

जहां एफ जी | डी = एफ डी , एफ आर | डी = एफ , और एफ आर | पृष्ठभूमि-सही प्रतिदीप्ति तीव्रताएं 63 हैं उदाहरण के लिए, एफ जी | डी = मैं जी | डी - < बी जी >, जहां मैं जी | डी दाता और < बी जी > से हरे रंग की चैनल में खोज की गई तीव्रता है ग्रीन चैनल पर औसत पृष्ठभूमि गिनती दर है। स्वीकर्ता के प्रत्यक्ष उत्तेजना ( एफ आर | ) से स्वीकर्ता के प्रतिदीप्ति के लिए और स्वीकार्य ( एफ आर | डी ) के संवेदित उत्सर्जन के लिए इसी तरह के सुधार किए गए हैं। समीकरण 1 में, α दाता-फ्लो के लिए सुधार कारक हैस्वीकर्ता चैनल में क्रोसस्टॉक को पुन: आरक्षित करें; Β दाता उत्तेजना स्रोत द्वारा स्वीकार्य उत्तेजना के लिए सुधार कारक है; और γ , जहां

समीकरण 56

दाता और स्वीकर्ता क्वांटम की पैदावार का एक कार्य है, Φ एफ, डी और Φ एफ, ए , क्रमशः, और हरे और लाल डिटेक्टरों पर पता लगाने की क्षमता, जी जी और जी आर एस पीआईई का उपयोग करना, स्वीकार्य केवल नमूने के लिए एस पीआईई = 0, और एस के लिए केवल दाता-केवल लेबल नमूने के लिए एस पीआईई = 1 को संतुष्ट करने के लिए, उचित सहायक कारक, जैसे α, β , और γ , को जांचना संभव है। एफईईटी नमूने के लिए पीआईई = 0.5। वैकल्पिक रूप से, यहउपयोग करने के लिए संभव है:

समीकरण 59

एक दूसरे नमूने के क्वांटम उपज प्राप्त करने के लिए, यह देखते हुए कि एक नमूना की मात्रा उपज ( समीकरण 60 ) और ज्ञात है कि समीकरण 61 तथा समीकरण 62 पीआईई-एमएफडी प्रयोग से निर्धारित होते हैं इस मामले में, यह माना जाता है कि उच्च एफआरटीटी डीएसडीएनए का क्वांटम उपज 0.32 है और कम एफआरईटी डीएसडीएनए की क्वांटम यील्ड निर्धारित की जाती है। इस प्रक्रिया का कारण यह है क्योंकि यह ध्यान दिया गया है कि एस पीआईई दोनों कम-फ़्रेट और उच्च-फ़्रेट नमूनों के लिए अलग है, भले ही दोनों एक ही स्थान पर एक दाता और केवल एक स्वीकार्य है, लेकिन अंतर परपूर्व स्थान मानक नमूनों की उचित मात्रा की उपज का निर्धारण करने के बाद, जैसा कि समीकरण (3) में वर्णित है, FRET दक्षता ( ) बनाम < τ D ( A ) > f और एफ डी / एफ बनाम < τ डी ( ) > एफ अभ्यावेदन आगे मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है। FRET दक्षता ( स्थिर ), एफ डी / एफ , और < τ डी ( ) > एफ के बीच पैरामीट्रिक रिश्ते पैरामीटर समीकरणों के निम्नलिखित सेट (समीकरण 4) द्वारा वर्णित है:

समीकरण 63

समीकरण 64

यहां, एफ डी | डी दाता या हरे रंग की चैनल में पाया दाता प्रतिदीप्ति है; एफ | डी स्वीकार्य-संवेदनशील उत्सर्जन है; समीकरण 67 स्वीकर्ता के अभाव में दाता प्रतिदीप्ति जीवनकाल है; और < τ डी ( ) > एक्स एक प्रजाति औसत जीवनकाल है, जो एक प्रजनन बहुपद द्वारा प्रतिदीप्ति औसत जीवनकाल से संबंधित है समीकरण 69 56 , 57 इन समीकरणों को स्थिर FRET 57 , 67 के रूप में जाना जाता है क्योंकि लाइनों को दोनों आबादी को समान रूप से अच्छी तरह से पार करना चाहिए, अनुपस्थिति मेंच गतिशीलता ( चित्रा 3 )।

अंतिम दो डीएसडीएनए नमूने 68 , 69 के लिए संभाव्यता वितरण विश्लेषण (पीडीए) का उपयोग करते हुए FRET दक्षता हिस्टोग्राम का विश्लेषण ( चित्रा 4 ) आता है। पीडीए को उच्च सटीकता 57 के साथ smfret हिस्टोग्राम मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है। एकल या बहु-स्थिर प्रजातियों की जानकारी एक हिस्टोग्राम से प्राप्त की जा सकती है। प्राप्त प्रायोगिक आंकड़ों के लिए अपेक्षित वितरण के आकार को ढंकने के बाद, दाता और स्वीकर्ता के बीच की दूरी का पता चला जा सकता है। संक्षेप में, FRET दक्षता, या एफ डी / एफ एक वितरण, पहले "ग्रीन" ( जी ) और "लाल" ( आर ) पहचान चैनल में एकत्र किए गए फोटॉनों के एक निश्चित संयोजन को देखने की संभावना [समीकरण] के द्वारा गणना की जाती है एक निश्चित समय-हवा दिया ओउ; समीकरण 5 का उपयोग करें:

समीकरण 71

यहां, प्रतिदीप्ति तीव्रता वितरण, पी ( एफ ), कुल संकेत तीव्रता वितरण पी ( एस ) से प्राप्त किया गया है, यह मानते हुए कि बीजी और बी आर पृष्ठभूमि का संकेत पॉसॉन वितरण, पी ( बी जी ) और पी ( पी ) के अनुसार वितरित किया जाता है बी आर ), ज्ञात औसत पृष्ठभूमि गिनती दर तीव्रता के साथ, < B जी > और < बी आर > सशर्त संभावना पी ( एफ जी , एफ आर | एफ ) एक निश्चित एफआरईटी राज्य के लिए हरे और लाल प्रतिदीप्ति फोटॉनों, एफ जी और एफ आर के एक विशेष संयोजन को देखने की संभावना है।

पीडीए विश्लेषण से पता चलता है कि उच्च FRET डीएसडीएनए के लिए अंतराल दूरी < आर डीए > (एचएफआरईटी) = 45.7 Å है, जबकि कम एफआरईटी डीएसडीएनए के लिए, ई- टिकटें दूरी < आर डीए > (एलएफईआरटी) = 59.7 Å जब एफएआरटी पोजीशनिंग और स्क्रीनिंग सिस्टम (एफपीएस) 26 का उपयोग करते हुए अपेक्षित दूरी की तुलना में, अपेक्षित अंतराल दूरी < आर डीए > , एवी (एचएफआरटी) = 44.7 एक था एफपीएस के उपयोग के लिए एफपीएस के उपयोग के रूप में पाया जाता है , एफएस टूलकिट में एम्बेडेड सुलभ वॉल्यूम गणना के लिए एसी उच्च एफआरटीटी डीएसडीएनए और < आर डीए > , एवी (एलएफआरईटी) = 59.1 ए के लिए कम एफआरईटी डीएसडीएनए है। एवी एक मोटे- माने कार्लो सिमुलेशन, जहां फ्लोरोफोर्स तीन त्रिज्या हार्ड क्षेत्र मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं जो बायोम में लगाव बिंदु से जुड़ा होता हैएक लचीला कनेक्टिंग लिंकर के साथ ऑल्क्यूल 26 , 57 मापा एस पीआईई के आधार पर, कम-एफआरटीटी डीएसडीएनए के लिए क्वांटम प्राप्ति के लिए सुधार आवश्यक है। इन शर्तों के साथ, एवी सिमुलेशन से प्रयोगात्मक मूल्य और अपेक्षित मूल्य के बीच ~ 1 ए के समझौते को प्राप्त करना संभव है।

अगला, एनएमडीए GluN1 एलबीडी मापा जाता है। एनएमडीए रिसेप्टर (एनएमडीएआर) एक हेल्टेरोमेरिक, गैर-चयनात्मक कैशन चैनल है जिसके लिए ग्लेटाइन और ग्लूटामेट की बाध्यकारी आवश्यकता 70 है । एलबीडी, जिसमें एक सीपी-समान संरचना है, क्रिस्टलोग्राफ़िक जानकारी 71 , 72 के आधार पर लिगंद बाध्यकारी पर एक खुले सीपी और बंद सीपी-विन्यास को अपनाने के लिए जाना जाता है। एमएफडी प्रयोगों के लिए, एनएमडीए ग्लुएन 1 एलबीडी को सीआर 507 और थ्र 3701 (पूर्ण लंबाई अनुक्रम) पर विपरीत दिशा में बदल दिया गया थाफांक, जैसा कि पहले वर्णित किया गया है। इसके बाद इसे सियान-ग्रीन फ्लोराफोरे और एक दूर-लाल फ्लोरोफोरे (सामग्री सूची देखें) की FRET जोड़ी का उपयोग कर लेबल किया गया था, जिसमें आर 52 के आर इस निर्माण का इस्तेमाल लिगंड-बाइंडिंग डोमेन की गति का अध्ययन करने के लिए किया गया था, बिना एक solubilized रिसेप्टर के साथ काम करने की जटिलता के बिना। इस निर्माण का उपयोग करते हुए, एलबीडी के कम से कम तीन विन्यास पाए गए थे। यह सुझाव दिया गया था कि एक गठनात्मक चयन तंत्र ने चुनिंदा आबादी में लिगंड बाइंडिंग 73 पर एक आबादी बनाई। निषिद्ध रूप में, या 5,7-डिच्लोरोकिनेरिनिक एसिड (डीसीकेए) की उपस्थिति में, अधिकतर मध्यम-निम्न-फ़्रेटी राज्यों का पता लगाया जाता है, एक लंबा दाता प्रतिदीप्ति जीवनकाल के साथ और बड़ा दाता-से-स्वीकर्ता फ्लोरोसेंस अनुपात बढ़ता है एफ डी / एफ ए पर 3.3 = ( चित्रा 5 ए )। यह एक खुली-समाधि रचना के स्थिरीकरण के अनुरूप है।पीडीए और समय खिड़की के विश्लेषण का उपयोग तीन विन्यासों की पहचान करने के लिए किया गया था जो कि एलबीडी अपनाने (उच्च-एफआरटी (एचएफ) (< आर डीए > = 33.9 ए), मध्यम-एफआरटी (एमएफ) (< आर डीए > = 45.8 ए ), और निम्न-फ़्रेट राज्य (एलएफ) (< आर डीए > = 55.8 ए))। हालांकि, ज्यादातर माध्यम-एफआरटी और लो-फ़्रेटी आबादी वाले थे। इससे पता चलता है कि हाई-फ़्रेटी राज्य है जो एनएमडीएआर के सक्रियण की ओर जाता है। यह ध्यान देने योग्य है कि प्रयोगात्मक व्युत्पन्न दूरी और सिलो लेबलिंग और क्रिस्टलोग्राफिक सूचना (प्रोटीन डेटा बैंक पहचान (पीडीबीआईडी): 1 पीबी 7 और 1 पीबीक्यू) का इस्तेमाल करते हुए एफपीएस द्वारा प्राप्त किए गए थे। यह पाया गया कि मध्यम-झुकाव और कम FRET आबादी के लिए अंतराल की दूरी क्रमशः दोनों संरचनाओं के लिए < R डीए > , ए वी = 48.7 Å और 54.2 Å थीं ( चित्रा 5 बी)। 2.9 Å का सबसे बड़ा विचलन माध्यम-एफआरईटी राज्य में पाया गया। Κ 2 की धारणा से, वितरण की अनिश्चितता पर विचार करते समय = 2/3, मापा दूरी में 2.5% की अधिकतम त्रुटि है। संक्षेप में, एक यह निष्कर्ष निकाल सकता है कि प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित दूरी पर अंगस्ट्रॉम सटीकता तक पहुंचना संभव है।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रायोगिक सेटअप और पीआईई-एमएफडी के लिए डाटा पंजीकरण। ( ) एक ठेठ multiparameter प्रतिदीप्ति पता लगाने की स्थापना दिखाया गया है और दो अलग अलग वर्णक्रमीय खिड़कियों को कवर चार डिटेक्टरों के होते हैं। डिटेक्टरों को समय-सहसंबंधित एकल फोटॉन गिनती (टीसीएसपीसी) इलेक्ट्रॉनिक्स से जुड़े हैं। ( बी ) टीसीएसपीसी में, प्रत्येक फोटोन को तीन मापदंडों से पहचाना जाता है: (i) माइक्रो-टाइम या उत्तेजना पल्स के बाद का समय; (Ii) मैक्रो-टाइम या नंबरप्रयोग की शुरुआत से उत्तेजना दालों का; और (iii) चैनल नंबर ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए इन तीन मापदंडों की आवश्यकता है ( सी ) एकल अणुओं को स्वतंत्र रूप से confocal मात्रा के माध्यम से फैलाना, और फोटॉन उत्सर्जित होते हैं, समय के एक समारोह के रूप में फोटॉनों को फट जा रहा है। ( डी ) प्रत्येक चुने हुए फट तदनुसार लगाए जाते हैं और बहु-आयामी हिस्टोग्राम प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: विभिन्न प्रतिदीप्ति मापदंडों का उपयोग करके फट विश्लेषण। ( ) फ्रेट दक्षता बनाम मैक्रोटाइम, ( बी ) एफटीटी दक्षता बनाम टी (जी + आर) | डी - टी आर | ए , और ( सी ) एफटीटी दक्षता बनाम एस पीआईई के लिएकम-फेरेटी या 15 बीपी डीएसडीएनए टी (जी + आर) | डी प्रॉम्प्ट चैनल में फट अवधि है, और टी आर | ए विलंबित चैनल ( आर आर | ए ) में फट अवधि है इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: एफ डी / एफ और दाता बनाम FRET दक्षता के जीवनकाल FRET दक्षता ( ) का प्रतिनिधित्व करने के लिए दो आयामी हिस्टोग्राम; स्वीकर्ता फ्लोरोसेंस पर दाता का अनुपात, एफ डी / एफ , ( बी ); और दाता anisotropy आर डी ( सी ) स्वीकर्ता < τ डी ( ) > एफ की उपस्थिति में दाता के औसत प्रतिदीप्ति जीवनकाल बनाम। निर्धारित सहीकारकों पर हैं: < B जी > = 0.64, < B R > = 0.37, β = 0.08 (दाता उत्तेजना लेजर के साथ स्वीकार्य की सीधी उत्तेजना का अंश), α = 0.017, और जी जी / जी आर = 3.7 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: पीडीए तुलना उच्च FRET और कम FRET डीएसडीएनए की। समय खिड़की 2 एमएस पर पीडीए विश्लेषण, औसत FRET दक्षता दूरी के 6% की आधी चौड़ाई के साथ। प्रत्येक दूरी गाऊसी की चौड़ाई (एचडब्ल्यू डीए ) के रूप में < आर डीए > के 6% के साथ वितरित की जाती है। ( ) नमूना HFRET के लिए, अंतराल दूरी < आर डीए > (एचएफआरईटी) = 45.7 एक ( बी ) नमूना एलएफईआरटी के लिए, दूरी < आर डीए > (एलएफआरईटी) = 59.7 एक है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: प्रतिद्वंद्वी, डीसीकेए की उपस्थिति में एनएमडीए रिसेप्टर के लिगंड बाध्यकारी डोमेन के पीआईई-एमएफडी। ( ) स्वीकार्य < τ डी ( ) > एफ और दाता बनाम < τ डी ( ) > एफ की उपस्थिति में दाता के जीवनकाल में एफ डी / एफ के दो-आयामी हिस्टोग्राम डीसीकेए के साथ एलबीडी के लिए एक-आयामएफ डी / एफ ए के लिए अल अनुमान और यह भी दिखाए गए हैं। स्थैतिक FRET लाइन को लाल रंग में दिखाया गया है शुद्ध दाता और स्वीकार्य प्रतिदीप्ति ( एफ डी और एफ ) पृष्ठभूमि (< B जी > = 0. 940 किलोहर्ट्ज़ और < बी आर > = 0.522 kHz), वर्णक्रमीय क्रॉस-टॉक (α = 1.7%), और पहचान दक्षता के लिए सही हैं अनुपात (जी जी / जी आर = 3.7) Anisotropy बनाम < τ डी ( ) > histograms पर, पेरिन के समीकरण में ρ = 2.5 एनएस का घूर्णीत्मक संबंध है ( बी ) पीडीए 10-एमएस समय खिड़की पर Δt एक एकल राज्य की आवश्यकता है मॉडल सभी समय खिड़कियां अच्छी तरह से फिट बैठता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

कार्य लक्ष्य
केंद्र लेजर बीम
पिनहोल संरेखित करें एफसीएस प्रयोग (खंड 5)
डिटेक्टरों को संरेखित करें सीपीएम को अधिकतम करें
उद्देश्य सुधार अंगूठी समायोजित करें टी अंतर को कम करें और सीपीएम को अधिकतम करें
साधन प्रतिक्रिया फ़ंक्शन (आईआरएफ) निर्धारित करें टीटीएसटीपी टीटीटीआर मोड में एसएमडी @ स्कैटर क्षय पैटर्न को मापें
प्रत्येक वर्णक्रमीय विंडो के लिए जी-फर्क निर्धारित करें। टीटीएसटीपी टीटीटीआर मोड में एसएमडी @ ध्रुवीकरणों के लिए तीव्रता की तुलना में क्षय की पूंछ की तुलना करें।
वर्णक्रमीय खिड़कियों (जी आर / जी जी ) में पहचान क्षमता अनुपात निर्धारित करें। (I) व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम (एनएम एकाग्रता) के साथ एक डाई की तीव्रता माप। (Ii) संदर्भ संदर्भ FRET शासकों (पीएम केंद्रितव्यावहारिक)। एमएफडी में उप-लोकेशन को स्थैतिक FRET लाइन पर गिरना चाहिए।
अंतिम जांच (जीवनकाल और अनिसोट्रॉपी) करें अकेले घातीय क्षय ( उदा। रोडैमिने 110) के साथ आज़ादी से डाई रंग के एक-अणु माप से फ़िट जीवनकाल और अनिसोट्रॉपी को नियंत्रित करें।
दाता क्वांटम उपज पर स्वीकार्य का अनुपात निर्धारित करें। (I) स्टोइचीओमेट्री प्लॉट (एस पीआईई) ईक। 1. और 4.2
पृष्ठभूमि गणना दर निर्धारित करें चयनित "बफर" की तीव्रता माप
क्रॉस-टॉक (α) निर्धारित करें प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और पता लगाने की क्षमता में दाता डाई के तीव्रता माप

तालिका 1: एकल-अणु प्रयोगों में FRET प्रयोगों के लिए कैलिब्रेशन चरण।

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Discussion

इस काम में प्रोटोकॉल पीआईई-एमएफडी एकल-अणू FRET प्रयोगों का उपयोग करते हुए उच्च परिशुद्धता के साथ अंतराल दूरी को संरेखित करने, जांचना और मापना है। ध्यान से सभी सहायक मापदंडों को मापने के द्वारा, एक मापा दूरी की शुद्धता बढ़ा सकता है और अंगस्टॉर्म सटीकता तक पहुंच सकता है। ऐसा करने के लिए, विभिन्न बहुआयामी हिस्टोग्राम का इस्तेमाल और लक्षण वर्णन के लिए जनसंख्या की पहचान और पहचान करने के लिए किया जाता है। मापा नमूनों की स्थिरता की पुष्टि करने के लिए मतलब मैक्रो समय का उपयोग करना, दाता और स्वीकर्ता फोटोबलिचिंग के लिए सही करना और स्ट्रोकोमेट्री पैरामीटर के आधार पर FRET आबादी का चयन करना संभव है। हालांकि, स्वीकार्य के फोटोफिजिकल गुण लेबल के स्थान के आधार पर बदल सकते हैं। इस प्रकार, एक एस पीआईई वितरण का उपयोग स्वीकर्ता क्वांटम उपज के लिए ठीक से ठीक करने के लिए कर सकता है। गामा कारक (ƴ) को निर्धारित करने के लिए उचित फोटोग्राफ़िक लक्षण वर्णन आवश्यक है, जो अन्य सुधार तथ्य के साथOrs ( उदाहरण के लिए, क्रॉस्स्टॉक के लिए α और दाता लेजर के साथ स्वीकार्य उत्तेजना के लिए β), मापा इंटरडीय दूरी की सटीकता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण दो डिज़ाइन किए गए डीएसडीएनए मानक नमूनों का उपयोग करते हुए, और अपेक्षित मूल्यों की तुलना में ~ 1 Å की शुद्धता का निर्धारण किया गया था।

विभिन्न डाई चयनों को चुने गए रंगों की उचित वर्णक्रमीय खिड़की को समायोजित करने के लिए माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल तत्वों, जैसे कि डाइक्रोकिक और बैंडपास फिल्टर, को अनुकूल करना आवश्यक है। तदनुसार, स्पंदित लेज़रों को चुना जाना चाहिए। इससे भी महत्वपूर्ण बात, रंगों का चयन महत्वपूर्ण है क्योंकि स्वीकार्य और दाता विरंजन, त्रिपाठी या डाई ब्लिंकिंग या प्रोटीन सतहों पर चिपके रंग के रूप में कई संभव फोटोफिजिकल कलाकृतियों की वजह से। ये कलाकृतियों प्रयोगात्मक आंकड़ों की व्याख्या के साथ समझौता कर सकती हैं। एमएफडी इस परिदृश्य में आदर्श है, क्योंकि कई मापदंडों का निरीक्षण करके, इन कलाकृतियों के स्रोतों को पहचानना संभव है, सहीउनके लिए, या कम से कम उनके अस्तित्व के बारे में पता है द्विध्रुवीय ओरिएंटेशन पैरामीटर, ज्यादातर समय κ 2 के रूप में मान लिया गया = 2/3, निर्धारित दूरी के बड़े विचलन का कारण हो सकता है अगर डाई जैव-घनत्व की सतह को अधिमान्य रूप से चिपक जाती है। दाता नमूने की अनिसोट्रॉपी, स्वीकर्ता नमूना, और दाता स्वीकर्ता यह हल करने में मदद कर सकता है कि क्या यह धारणा मान्य है या नहीं। इस प्रयोग में, यह पाया गया है कि उचित सुधार और 10-20% त्रुटि प्राप्त करने के मुकाबले मापा दूरी पर ~ 2.5% की अधिकतम त्रुटि नहीं है। स्वीकर्ता की क्वांटम यील्ड त्रुटि का एक बड़ा स्रोत बना सकता है। इस प्रकार, एस पीआईई इस महत्वपूर्ण मुद्दे को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

एनएमडीएआर पर एगोनिज़्म के तंत्र को समझने के लिए एनएमडीए रिसेप्टर के लेगंड-बाइंडिंग डोमेन के गठनात्मक परिदृश्य को समझने के लिए समान रणनीति लागू करना संभव है। यह पाया गया कि एलबीडी टी मेंवह एक प्रतिपक्ष की उपस्थिति को उच्च-श्रेय राज्य की पहुंच को दूर करता है, जिसे चैनल 73 खोलने के लिए जिम्मेदार माना जाता है। क्रिस्टलोग्राफ़िक जानकारी पर आधारित प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त दूरी और अपेक्षित मूल्यों की तुलना करते समय, 3 ए के भीतर एक समझौता हासिल किया गया था। इससे भी महत्वपूर्ण बात, नए कम आबादी वाले राज्यों को समान परिशुद्धता के साथ पहचाना जा सकता है।

संक्षेप में, एमएफडी मोड 42 में सिंगल-अणू FRET प्रयोगों ने एक प्रयोगात्मक कलाकृतियों के लिए ठीक से खाते और ~ 30-70 Å की सीमा में अंतराल दूरी प्राप्त करने के लिए अनुमति दी। यदि, एक ही दूरी की दूरी के बजाय, दूरी का एक नेटवर्क तैयार किया जाता है, तो संरचनात्मक मॉडलिंग में इन्हें संयोजक के रूप में उपयोग करना संभव है, खासकर उन राज्यों के लिए जिन्हें संरचनात्मक जीव विज्ञान के अधिक मानक तरीकों के साथ चिह्नित करना मुश्किल है।

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Disclosures

सभी लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास इस लेख की सामग्री के साथ कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

वीजे और एचएस एनआईएच आर 01 जीएम094246 से वीजे के लिए समर्थन का समर्थन करते हैं। एचएस क्लेमसन यूनिवर्सिटी क्रिएटिव इनक्वायरी प्रोग्राम और कलेमोसन यूनिवर्सिटी में ऑप्टिकल मटेरियल साइंस एंड इंजीनियरिंग टेक्नोलॉजीज के केंद्र से शुरूआती निधि को स्वीकार करता है। इस परियोजना को खाड़ी तट consortia (एनआईजीएमएस ग्रांट नंबर 1 टी 32 जीएम 0889657-05) के इंटरडिसीप्लिनरी बायोसाइंस ट्रेनिंग के लिए केक सेंटर से प्रशिक्षण फेलोशिप और डीडी के लिए आम मानव रोगों के अनुवाद अध्ययन के लिए स्किसलर फाउंडेशन फैलोशिप भी समर्थित था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20 µm
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24 x 60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25x36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10 x 10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

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References

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