생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

Biochemistry

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Summary

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

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Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

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Abstract

다중 매개 변수 형광 검출 (MFD) 모드에서 단일 분자 수준에서 Förster 공명 에너지 전달 (FRET)을 사용하여 고정밀 interdye 거리 측정을 수행하는 방법에 대한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. MFD는 광 물리 및 실험 결과물을 줄이기 위해 형광의 모든 "차원"의 사용을 극대화하고 단단한 생체 분자에서 ~ 1Å까지의 정확도로 interdye 거리를 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 - 결합 도메인의 3 개의 구조 상태를 확인하여 리간드 결합시 수용체의 활성화를 설명하는데 사용되었다. 알려진 결정학 구조를 실험 측정과 비교할 때, 그들은 더 동적 인 생체 분자에 대해 3Å 미만으로 동의했다. 생체 분자의 전체 차원을 커버하는 일련의 거리 구속을 모으면 동적 생체 분자의 구조 모델을 제공 할 수 있습니다es.

Introduction

구조 생물학 연구의 근본적인 목표는 생체 분자 기계의 구조와 기능 사이의 관계를 밝히는 것입니다. 생체 분자 ( 예 : 단백질 및 핵산)의 첫 번째 시각적 인상은 1950 년대에 X 선 결정학 (X-Ray Crystallography) 1 , 2 를 통해 발생했습니다. X 선 결정학은 결정 포장에 의해 제약 된 고해상도 정적 구조 정보를 제공합니다. 따라서 X- 선 구조 모델의 내재적 부동성은 생체 분자의 동적 인 특성을 회피하며 이는 대부분의 생물학적 기능에 영향을 미칩니다 3 , 4 , 5 . 핵 자기 공명 (NMR) 6 , 7 , 8 은 수용액에서 구조 모델을 분석함으로써이 문제에 대한 대안적인 해결책을 제시했습니다. 큰 이점NMR은 구조, 동역학 및 기능 3 , 4 , 5 사이의 본질적인 관계를 명확히하는 데 도움이되는 생체 분자 및 구조적 앙상블의 본질적인 동적 특성을 회복 할 수있는 능력입니다. 그럼에도 불구하고 시료 크기와 많은 양의 시료에 의해 제한되는 NMR은 대형 시스템에 대한 복잡한 표지 전략을 필요로합니다. 그러므로 구조 생물학에서 대안적인 방법을 개발할 긴급한 필요가있다.

역사적으로 FRET가 낮은 정확도 거리 측정을 제공한다는 오해 때문에 Fösterster 공명 에너지 전달 (FRET) 9 는 구조 생물학에서 중요한 역할을하지 못했습니다. 이 프로토콜의 목적은 FRET가 나노 미터 규모의 거리를 결정하는 능력을 재검토하여 이러한 거리가 생체 분자의 구조 모델을 구축하는 데 사용될 수 있도록하는 것입니다. 첫 번째 실험적 검증FRET 효율에 대한 R - 6 의존성은 1967 년 Stryer가 "분광적 인 통치자"로서 다양한 길이의 폴리 프롤린을 측정함으로써 행해졌 다. 유사한 실험이 2005 년에 단일 분자 수준에서 이루어졌다. Polyproline 분자는 이상적이지 않은 것으로 밝혀졌고, 따라서 이중 가닥의 DNA 분자는 나중에 사용되었다. 이것은 정확한 거리 측정을위한 창을 열었고 FRET을 사용하여 생체 분자의 구조적 특성을 확인했습니다.

FRET은 interdye 거리 범위가 ~ 0.6-1.3 R 0 인 경우 최적입니다. 여기서 R 0 은 Förster 거리입니다. 단일 분자 FRET 실험에 사용 된 일반적인 형광체의 경우 R 0 은 ~ 50Å입니다. 일반적으로 FRET은 다른 방법보다 구조 및 역학을 해결하고 차별화 할 수있는 많은 장점을 제공합니다.(i) 형광의 궁극적 인 민감성 때문에, 단일 분자 FRET 실험 13 , 14 , 15 , 16 은 개별 구성원의 구조를 직접 세고 동시에 특성화함으로써 이질적인 앙상블을 해결할 수있다. (ii) 앙상블의 동기화가 필요 없기 때문에 단일 분자 FRET 연구에서 복잡한 반응 경로를 직접 해독 할 수 있습니다. (ⅲ) FRET는 생물학적으로 관련된 다양한 역학 관계를 다루면서 10 년 이상 시간 영역의 넓은 영역에 접근 할 수있다. (iv) FRET 실험은 in vitroin vivo의 모든 용액 조건에서 수행 될 수있다. FRET와 형광 현미경의 조합은 생체 내 세포에서 직접적으로 분자 구조와 상호 작용을 연구 할 수있게합니다 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 고정밀도 20 . (v) FRET은 거의 모든 크기의 시스템 ( 예 : 폴리 프롤린 올리고머 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV 역전사 효소 26 및 리보솜 27 )에 적용 할 수 있습니다. (vi) 마지막으로, 생체 분자의 모든 차원을 포함하는 거리의 네트워크는 정적 또는 동적 분자 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35의 구조 모델을 도출하는데 사용될 수있다 .ref "> 35 , 36 , 37 .

따라서 단일 분자 FRET 분광기를 사용하여 거리가 구속 된 구조 모델링에 사용하기에 충분히 정확한 거리를 유도 할 수 있습니다 26 . 이것은 8 개 차원의 형광 정보 ( 즉, 여기 스펙트럼, 형광 스펙트럼, 이방성, 형광 수명, 형광 양자 수율, 형광 양자 효율 등)를 이용하는 다중 매개 형광 검출 (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 거시적 인 시간, 형광 강도 및 형광체 사이의 거리)를 정확하고 정확하게 거리 제한을 제공합니다. 또한, 펄스 인터리빙 된 여기 (PIE)는 MFD(PIE-MFD) (42) 를 사용하여 직접 여기 수용체 형광을 모니터하고 1 : 1 공여체 - 수용체 화학 양롞을 포함하는 샘플에서 발생하는 단일 분자 이벤트를 선택합니다. 일반적인 PIE-MFD 설정은 공 초점 현미경 몸체에 연결된 2 개의 펄스 인터리빙 된 여기 레이저를 사용합니다.이 광자 검출은 서로 다른 스펙트럼 창과 편광 특성의 4 가지 채널로 분할됩니다. 자세한 내용은 그림 1을 참조하십시오.

FRET 결과와 일치하는 원자 론적 구조 모델을 얻기 위해 FRET가 계산 방법과 결합되어야한다는 점에 유의해야한다. FRET에서 유도 된 거리를 가진 구조 모델을 구축하는 것은 관련된 방법론을 검토하는 것이 현재의 프로토콜의 목표는 아니다. 그러나 이러한 접근법은 다른 기술 ( 예 : 소각 X 선 산란ing 또는 전자 paramagnetic 공명), 통합 구조 생물학 43 , 44 , 45 , 46 의 분야를 낳았다. 현재의 목표는 구조 생물학에서 정량적 도구로서 FRET의 길을 열어주는 것입니다. 예를 들어,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 - 결합 도메인 (LBD)에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용되었다. 궁극적 인 목표는 앞서 언급 한 한계점을 극복하고 고정밀 도로 측정 된 거리를 제공함으로써 생체 분자의 구조적 결정에 사용되는 통합 방법 가운데 FRET를 가져 오는 것입니다.

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Protocol

1. PBS 완충제 준비 및 챔버 처리

참고 : 습식 화학 실험을 수행 할 때는 실험실 코트와 일회용 장갑을 착용하십시오. 레이저를 정렬 할 때 눈 보호 장치를 사용하십시오.

  1. PBS 완충액 제조
    1. 400g의 증류수에 4.5g의 Na2HPO4, 0.44g의 NaH2PO4 및 3.5g의 NaCl을 용해시킨다. 7.5의 pH를 확보하고 액체 사이클에서 1 시간 동안 오토 클레이브하여 (오토 클레이브 시스템에 따라) 용액을 멸균하십시오.
    2. PBS 용액 15 mL를 취하여 숯 0.1 g과 섞는다. 0.2 μm의 공극 크기가 있는 일반 20 mL 주사기 필터를 사용하여 혼합액을 여과 합니다. 봉인하고 실온에서 PBS 버퍼를 저장하십시오.
  2. 현미경 챔버 유리 커버
    1. 500 μL의 증류수와 5 μL의 폴리 솔 베이트 20 비이 온성 계면 활성제를 첨가하십시오 (재료 목록 참조)챔버 커버 유리 시스템 (재료 목록 참조)에 잘 섞으십시오. 30 분간 담가 두십시오. 폴리 솔 베이트 20 용액을 제거하고 증류수로 챔버를 두 번 씻어냅니다. 말리자.
      참고 : 이제 챔버를 사용할 준비가되었습니다.

2. DNA 시료 준비

참고 : 이중 가닥 DNA (dsDNA) 표준 시료를 만들려면 표지 된 DNA 가닥 (재료 목록 참조)을 사용하십시오. 디자인 된 올리고는 결정된 거리를 손상시킬 수있는 인공물을 피하기 위해 폴리머 끝에 염료가 없어야합니다. DNA 서열은 강체로 행동하도록 선택해야합니다.

  1. 1.5μL의 공여체 표지 DNA 가닥과 4.5μL의 상보 적 (수용체 표지 또는 비 표지) DNA 가닥을 microfuge tube에 넣고 nuclease가없는 물 24 μL와 혼합합니다.
    참고 : 선택한 올리고 뉴클레오티드의 혼합에 따라 다음 샘플이 생성됩니다 : no-FRET, low-FRET, 또는 높은 FRET dsDNA를 포함한다.
  2. 열 혼합기 및 다음 공정을 사용하여 DNA를 하이브리드 화하십시오 : 95 ℃에서 10 분, 90 ℃에서 10 분, 80 ℃에서 10 분, 70 ℃에서 10 분, 60 ℃에서 10 분, 50 ℃ 10 분, 40 ℃에서 10 분, 30 ℃에서 10 분, 20 ℃에서 10 분, 10 ℃에서 10 분, 5 ℃에서 유지.
    참고 : 생성 된 dsDNA 표준은 장기 보관을 위해 -20 ° C의 냉동고에 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다.

3. 단백질 시료 준비

주 : 박테리아 시스템에서 목적 단백질의 발현을위한 재조합 DNA로 시작하여, 거리가 측정 될 잔기를 시스테인으로 돌연변이시키는 것이 가능하다. 그렇게하기 위해, 표준 부위 지정 돌연변이 유발 기술 47을 사용 하십시오. 단백질 정제를 용이하게하기 위해, 재조합 및 돌연변이 된 DNA를 정제 태그가 들어 있는 벡터 ( 예 :His-tag). NMDA 글루타메이트 이온 성 수용체 (GluN1) LBD ( 즉, pET-22b (+) 벡터에 클로닝 된 NMDA GluN1 LBD)로부터의 글루타메이트 서브 유닛 1 리간드 결합 도메인 (LBD)을 사용 하였다.

  1. 단백질 발현
    1. DNA 플라스미드를 선택 시스템 48 으로 형질 전환하십시오.
      참고 : 다음 단계는 가용성 단백질의 발현이 Escherichia coli 에서 변형 된 것으로 가정합니다. 예를 들어 형질 감염된 포유류 세포 ( 49) 또는 형질 도입 된 곤충 세포 ( 50 )로부터의 정제 또한 가능하며 상세한 단계는 다른 곳에서 찾을 수있다. 선택한 대장균 균주가 관심있는 단백질에 적합한 지 확인하십시오. 예를 들어, 디설파이드 브릿지를 포함하는 단백질의 발현은 세포 내 구획을 줄이는 능력있는 세포의 변형을 필요로합니다 (재료 목록 참조).
    2. 시동기 접종 <em> E. 멸균 피펫 팁을 사용하여 하나의 변환 식민지를 데리러 대장균 배양 48 . 선택적 LB 배지 (물질 목록 참조) 100 mL에 넣고 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.
    3. LB 배지를 준비하십시오 (재료 목록 참조). 오토 클레이브로 멸균하십시오.
    4. 하룻밤 배양액을 2L의 선택적인 LB 배지에 1 : 500 비율로 첨가하여 형질 전환대장균 의 대규모 배양을 접종한다.
    5. 다음 몇 시간 동안 600 nm에서 배양 물의 흡광도 (Abs)를 모니터링하여 배양 물의 성장을 평가합니다. 600 nm에서의 광학 밀도 (OD 600 ) 또는 세포 밀도 측정기를 사용합니다. 측정 값은 시간이 지남에 따라 증가합니다.
    6. 배양액의 OD 600 이 0.7 일 때 이소 프로필 -β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)의 최종 농도를 0.5 mM로하여 단백질 발현을 유도한다. 20 ° C에서 20-2 초 동안 유도 대장균 을 흔들어주세요.4 시간.
    7. 단백질 유도 후, 3,000 xg 및 4 ℃에서 20 분 동안 회전시켜 대장균 을 펠렛 화시킨다. 뜨는을 버리고 사용할 때까지 -80 ° C에서 세포 내 단백질을 포함하는 대장균 펠렛을 저장하십시오.
  2. 단백질 정제
    1. 용해 방법 ( 예 : 초음파, 프렌치 프레스, 질소 캐비테이션 )을 사용하여 대장균 을 추출하십시오 51 .
    2. 185,000 xg 및 4 ° C에서 1 시간 동안 용 해물을 원심 분리하여 막과 세포 잔해물을 스핀 다운합니다.
    3. His- 태그 단백질의 경우, 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 시스템 ( 물질 표 참조)을 사용하여 평형화 된 니켈 - 충전 된 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC) 컬럼에 상등액을 적재 하십시오.
      참고 : NMDA GluN1 LBD 용 평형 완충액 : 200 mM NaCl, 20 mM Tris 및 1 mM Glycine, pH 8. NM 용 용리액 완충액DA GluN1 LBD : 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glycine 및 400 mM Imidazole, pH 8.
      1. imidazole의 낮은 금액 (~ 12 MM)을 포함하는 버퍼로 IMAC 열을 씻으십시오.
      2. 12 mM ~ 400 mM의 imidazole의 선형 구배를 사용하여 IMAC 컬럼에서 단백질을 용출시킨다.
    4. 3.2.3.2 단계의 용리액을 투석 튜브에 넣고 2-3 시간 동안 연속적으로 저어 주면서 평형 완충액에 침지시켜 imidazole 53이 없는 평형 완충액에서 단백질을 밤새도록 투석하십시오. 적어도 한 번 이상 반복하십시오.
      참고 : 3.2.3-3.2.6 단계는 His-tagged protein의 정제를 가정합니다. 다른 방법을 통해 정화하는 경우 그에 따라 프로토콜을 조정하십시오.
    5. 투석 된 단백질의 280 nm에서 흡광도를 측정하고 맥주의 법칙을 사용하여 단백질 양을 정량화하십시오 ( 흡광도 단위 = ε L c , 여기서 ε 흡광 계수 (M -1 cm -1), 여기서 얻을 수있다 54 ; L 은 광 경로 길이 (cm)입니다. c 는 단백질 농도 (M)).
      참고 : Bradford 분석 및 bicinchoninic acid 분석을 비롯한 다양한 단백질 정량 분석이 가능합니다. 둘 다 정확한 결과를 제공합니다.
  3. 단백질 표시
    1. 1 : 1 : 8 protein : donor : acceptor 몰비로 정제 된 단백질에 donor (maleimide reactive cyan-green dye)와 acceptor (maleimide reactive far-red dye) fluorophores를 첨가하십시오.
    2. 단백질과 형광 단 혼합물을 얼음에서 30 분 동안 품어 낸다. 더 긴 배양 시간이 가능합니다.
    3. 단백질이 잠복하고있는 동안 0.5 mL Ni-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) 아가로 오스 칼럼 (재료 목록 참조)을 채우고 3.2.3에서와 같은 평형화 완충액을 사용하여 평형화하십시오.
      참고 : 수지 결합 용량에 따라 단백질의 양을 유지하십시오.
    4. 30 분 후단백질 / 형광 물질 혼합물을 단계 3.3.3에서 준비된 컬럼에 올려 놓고 중력 흐름에 의해 정제한다.
    5. 과량의 형광 물질을 5 mL의 평형 완충액으로 씻어 낸다.
    6. 중금속에 의해 라벨 단백질을 용출 완충액 0.5 mL로 4 회 용리한다. 단백질은 이미 다른 단백질에서 정제되었으므로 기울기가 필요 없습니다.
    7. UV-Vis 분광계로 각 용출액을 점검하여 분류 된 단백질이 포함 된 분획을 확인하십시오. 230-700 nm에서 흡광도를 스캔하여 흡광도가 단백질 (280 nm)과 각 형광체 (시안 색 녹색 형광체의 경우 493 nm 및 원적외선 형광체의 경우 651 nm)에서 최대 값을 갖도록 할 수 있습니다. 용리액.
      참고 : 일반적으로 단백질은 분획 2에서 용리됩니다.
    8. 탈염 컬럼 ( 재료 표 참조)을 목탄 처리 된 PBS로 평형시킨다 (단계 1.1).
    9. 중력 흐름에 의해 탈염 칼럼에 표시된 단백질을로드하십시오.
      참고 : 선택한 탈염 칼럼 용량에 따라 적재 된 단백질의 양을 유지하십시오 55 .
    10. 중력 흐름에 의해 3.5 mL의 목탄 처리 된 PBS를 사용하여 용리시키고 용리액의 0.5 mL 분획을 수집한다.
    11. UV-Vis 분광계를 사용하여 230-700 nm에서 각 용리 물의 흡광도를 스캔하여 분류 된 단백질이 포함되어있는 분획을 확인하십시오.
      참고 : 3.3.8-3.3.11 단계는 기본적으로 버퍼 교환 단계로 사용됩니다. 이 목적에 부합하는 다른 프로토콜 ( 예 : 광범위한 투석)도 가능합니다. 또는 3.3.2 단계에서 3.3.8 단계로 바로 갈 수 있습니다.

4. 앙상블 조건에서 필요한 측정 (큐벳에서)

  1. Förster 상수의 결정
    1. 전체 파장을 얻기 위해 최대 흡광 파장으로 15 nm에서 공여체를 여기하여 형광 측정기에서 형광 물질 형광 방출 (cps)을 스캔합니다ission 스펙트럼. 여기 파장 5 nm에서 시작하여 150 nm 끝에서 방출을 모니터링하십시오. 방출 편광판을 54.7 °로 설정하여 마술 각도 조건을 사용하십시오. 여기 편광판은 0 ° 56 °까지.
      참고 : 여기에 사용 된 도너 형광 단에 대해 Abs 최대 값은 490 nm에서 발생합니다. 475 nm를 여기 파장으로 사용하고 480-650 nm에서의 방출을 모니터링합니다. 억 셉터의 Abs 최대치는 645 nm에서 발생합니다. 630 nm를 여기 파장으로 사용하고 635-735 nm에서의 방출을 모니터링합니다.
    2. 형광 측정기를 사용하여 400-700 nm 범위의 수용체 형광 단 (Abs A )의 여기 스캔을 수행하고 방출 편광자를 54.7 °로 설정하여 마술 각도 조건을 사용합니다 여기 편광판은 0 ° 56 °까지. 최대 발사 파장 후 방출 모노 크로 미터를 15 nm로 설정하십시오. 최대 exci로 표준화tation 값.
    3. 발표 된 표에서 수용체 ε A (M -1 cm -1 ) 56 의 흡광 계수를 찾거나 제조업체가 제공 한 값을 사용하십시오.
      참고 :이 원고에 사용 된 수용체 형광 단을 위해 발표 된 값은 ε A647 = 270,000 cm -1 M -1 56 이다.
    4. J = ΣfD · (AbsA · εA ) · λ4를 사용하여 스펙트럼 중첩을 계산합니다. 여기서 fD, AbsA 및 εA는 λ 이상으로 정의되고 파장 (nm)입니다. 워크 시트를 사용하여 4.1.1-4.1.3 단계에서 얻은 모든 파장 종속 값을 열에 나열하십시오. 파장에 따라 정렬하십시오. 도너 방출의 최소 파장 (λ min )에서 수용체 흡수의 최대 파장까지 합계를 수행합니다e ( λmax )이다.
    5. 다음 식을 사용하여 Foerster 상수 (R o )를 계산합니다. R o 6 = 8.79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 여기서 J는 단계 4.1.4에서 이전에 계산 된 스펙트럼 중첩이며, κ 2 배향 인자, Φ F, D 도너 플루오로 포어의 형광 양자 수율이고, n은 플루오로 포어가 위치한 매질의 굴절률이다.
      참고 : n = 1.33 (수성 완충액이 사용되는 경우) 및 κ 2 = 2/3을 사용하십시오.
    6. 도너 fluorophore (Φ F, D , 환경에 따라 다름)을 사용하고, 4.1.4에서 얻은 스펙트럼 중첩의 값을 사용하여 eq ()를 사용하여 Foerster 상수의 최종 값을 계산합니다단계 4.1.5.
      참고 : 양자 생산량을 사용할 수없는 경우 아래의 4.2 단계를 따라 계산하십시오. 이 경우 도너 수명 τD , r = 4.0 ns에 해당하는 ΦF , D = 0.8을 사용하십시오.
  2. 형광 양자 효율의 결정
    참고 : 다음 절차에서는 동적 급냉 만 가정합니다. 정적 소광을 고려하려면 참고 문헌 56을 참조하십시오. 그러나 PIE-MFD 실험은 정적 소쇠의 경우에도 양자 효율을 결정하는 데 유용합니다 (결과 참조).
    1. 양자 수율 (Φ r )이 결정된 수용체와 공여체 모두에 대해 유사한 흡광도 및 방출 프로파일을 갖는 기준 발색단을 선택한다.
      참고 : 기증자의 경우 Φ r = 0.8 및 τ r = 4 ns 인 반면 수용체의 경우 Φ r = 0.32 및 τ r = 1.17 ns이며, which는 cyan-green 형광 단 및 far-red 형광 단 표지 올리고 뉴클레오타이드의 Φ r 과 τ r 에 각각 해당한다.
    2. 마법 각도 조건에서 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 방법을 사용하여 시간 분해 형광 붕괴 (f (t))를 측정합니다.
    3. f (t) = Σ i x i e -t / τ i 의 형태로 단일 또는 다중 지수 붕괴 함수로 형광 붕괴를 맞춘다. 여기서 x i 인구 분율 및 τi 인구 형광 수명입니다.
    4. 종 평균 수명을 계산하라. <τ> x = Σx i τ i , 여기서 x i 인구 분율 및 τi 인구 형광 수명입니다.
    5. th 사용e 공식 Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r 참조의 형광 수명 및 양자 수율뿐만 아니라 도너 형광 단의 형광 수명을 막음으로써 도너 형광 단의 형광 양자 수율을 계산 하였다.
      참고 :이 방법은 동적 급냉을 전제로합니다. 다른 Φ F, D 결정에 대해서는 Lakowicz 56을 따른다.

5. PIE-MFD 단일 분자 검출 (SMD)을위한 실험 정렬

참고 : 측정시 조명을 끄는 것이 좋습니다.

  1. 장비 조정 (그림 1)
    참고 :이 실험에는 그림 1에 묘사 된 집에서 만든 MFD 설정과 2 개의 펄스 레이저 및 4 개의 감지 채널이 역 현미경 본체에 사용됩니다. 비슷한 상용 시스템이 있습니다.
    1. 485nm 및 640nm 레이저 및 MFD 설정의 모든 감지기를 켭니다. TCSPC 수집 및 레이저를 제어하는 ​​소프트웨어를 엽니 다. 레이저 반복 속도가 40 MHz인지 확인하십시오.
    2. 60X 1.2 NA 물방울 대물 렌즈의 이미지 평면에서 485 nm 펄스 레이저 출력을 60 μW로 설정하고 640-nm 펄스 레이저 출력을 펄스 인터리브 모드 (PIE-MFD) 42 에서 23 μW로 설정하십시오.
      참고 : PIE-MFD를 설정하려면 두 레이저 펄스가 레이저 컨트롤러 소프트웨어에서 지연됩니다. 485 nm 레이저 여기에서 탐지 TCSPC 채널 (TAC 채널)은 1-12,499 ( "프롬프트"채널)입니다. 640 nm 레이저 여기의 경우, 검출 TCSPC 채널 (TAC 채널)은 12,499-50,000 ( "지연"채널)입니다.
    3. 현미경 대물 렌즈와 커버 유리 슬라이드 사이에 객관적인 침지 액체 (두 번 증류수 한 방울)를 추가하십시오. 이미지 평면이 용액 내부에 있고 유리에서 멀리 떨어져 있는지 확인하려면 surfa유리 - 액체 인터페이스에서 레이저 반사로 인해 두 번째 밝은 초점을 찾은 후 조정 손잡이를 반 바퀴 돌리십시오.
    4. 커버 유리의 중앙에 50 μL의 증류수에 100 nM Rhodamine 110 1 μL를 첨가합니다. 솔루션이 현미경 대물 렌즈의 중심에도 있는지 확인하십시오.
    5. 획득 소프트웨어에서 광자 카운트 속도를 모니터링하면서 핀홀 (크기 : 70 μm) 위치 (한 번에 하나씩 x 및 y 방향)를 조정하여 감지 된 광자 수를 최대화하십시오.
  2. 표준 측정 SMD (어두운 방에서 작업)
    1. 수집 소프트웨어의 "* .ht3"형식 58 의 시간 태그가 지정된 시간 분해 (TTTR) 제어판에서 "시작"버튼을 클릭하여 5.1.4 단계의 샘플을 사용하고 120 초 카운트 속도를 기록하십시오.
    2. 오프라인 형광 상관 분광법 (FCS) 계산 59 ,확산의 특징적인 시간, 공 초점 체적 내의 분자 수, 삼중 항 상태 동력학 및 분자 휘도를 결정하기 위해 60 , 61 ( 즉, FCS 측정)
      1. FCS 용 소프트웨어 (Kristine, MFD suite)를 엽니 다. '옵션'-> '설정 선택'을 클릭하여 실험 설정을 선택하십시오. 비슷한 실험 설정을 가진 파일을 선택하고 "파일에서 매개 변수 가져 오기"를 클릭하여 파일의 헤더 정보를 읽습니다.
      2. FCS를 수행하려면 "Operate"-> "Correlate"를 선택하십시오.
        참고 : 채널 번호가 올바르게 지정되었는지 확인하고 "TAC 게이트"(TCSPC 채널)를 선택하여 프롬프트 또는 지연 채널을 선택합니다.
      3. "작동"-> "상관 곡선의 전역 적합"을 선택하여 적합 루틴을 엽니 다. softwar에서 "equation # 24"를 사용하십시오.e를 클릭하고 "시작"을 클릭하십시오.
        참고 : 소프트웨어의 등식 # 24는 3 차원 가우스 조명 프로파일 (예 : 61 : 1 )에 대해 자유롭게 확산하는 형광 분자의 자기 상관 함수 (Gc)
        방정식 36
        여기서 N 은 검출 체적 내의 분자의 평균 수이고, T 는 특성 시간 t 와 함께 삼중 항 상태 동력학을 발휘하는 분자의 분율이며, tc 는 상관 시간, tdiff는 기하학적 파라미터 ωω 는 가우시안 조명 프로파일을 나타낸다. 적합 후에는 공 초점 부피에서 확산 시간과 분자 수를 기록하십시오.
    3. 증류수 50 μL에 100 nM Rhodamine 101 10 μL를 넣는다.물과 잘 섞는다. 이 혼합물을 커버 유리 위에 올려 놓고 물방울이 대물 렌즈의 중앙에 오도록하십시오. TTTR 제어판에서 "시작"버튼을 클릭하면 120 초 분량의 데이터가 TTTR 형식으로 기록됩니다.
    4. 증류수 50 μL에 100 nM 원적외선 형광 물질 1 μL를 넣고 잘 섞는다. 이 혼합 물을 대물 렌즈의 중앙에 놓습니다. "시작"버튼을 클릭하고 120 초 분량의 데이터를 TTTR 형식으로 기록하십시오.
    5. 대물 렌즈의 중앙에 증류수 50 μL를 놓습니다. "시작"버튼을 클릭하고 300 초 분량의 데이터를 TTTR 형식으로 기록하십시오.
    6. 대물 렌즈의 중앙에 PBS 버퍼 50 μL를 놓습니다. "시작"버튼을 클릭하고 300 초 분량의 데이터를 TTTR 형식으로 기록하십시오.
    7. 단계 5.1.4의 혼합물 1 μL를 취해 50 μL의 증류수와 섞는다. 이 혼합물을 커버 유리 위에 놓습니다. 먼저, "시작"버튼을 클릭하고 TTTR 모드에서 10 초 분량의 데이터를 수집하십시오. 그런 다음 TT를 분석합니다.TR 모드 파일을 단계 5.3에서 설명한대로 BIFL (Burst Integration Fluorescence Lifetime) 분석 소프트웨어 (Paris, MFD suite)를 사용하여 분석합니다.
      참고 : 버스트 선택 및 분석 소프트웨어 26 , 61 에서 초당 버스트 수를 확인하십시오. 버스트 레벨이 매 10 초마다 35 회라면 단일 분자 측정에 적합합니다.
    8. 단일 분자 측정 표준으로 취급하기 위해 TTTR 형식으로 계수 시간을 1.5 시간 동안 계속 기록하십시오 ( 즉, SMD 에서 TCSPC).
      참고 : 큰 파일 크기로 인해 원시 "* .ht3"파일을 작은 크기의 파일로 분할하여 BIFL을 사용하여로드하고 처리합니다.
  3. BIFL을 이용한 표준 시료 분석
    1. BIFL 소프트웨어 (파리)를 엽니 다.
    2. "설정 확인"자동 팝업 창에서 PIE 설정을 선택하고 비슷한 실험 설정으로 파일을 선택하여 헤더를 읽으십시오. '다음에서 매개 변수 가져 오기'를 클릭하십시오.m 파일 "을 클릭하십시오"확인 "을 클릭하십시오 팝업 창이 닫히고 파리 프론트 엔드에 통합되었습니다."다음 "에서"확인 "을 클릭하십시오.
    3. "Data Path Array"에서 "Select"를 클릭하여 분석 할 측정 값을 선택하여 분석 할 파일을 선택하십시오.
      1. "Green scatter"(물 측정), "Green BG"(버퍼 측정 용), "Green thick"(2nM Rhodamine 110 측정 용), "Red scatter"(용수 측정 용), " Red BG "(완충액 또는 수분 측정 용),"Red thick "(20nM Rhodamine 101 측정 용),"Yellow scatter "(용수 측정 용),"Yellow BG "(완충액 측정 용) 및 "Yellow Thick"(2nM 원적외선 형광 측정).
      2. "다음"에서 "확인"을 클릭하십시오.
        참고 : "녹색"채널은 "프롬프트"TCSPC 채널의 녹색 탐지기 신호에 해당합니다. 그만큼4 "빨간색"채널은 "프롬프트"TCSCP 채널의 빨간색 탐지기 신호에 해당하며 "황색"채널은 지연 TCSPC 채널의 빨간색 탐지기 신호에 해당합니다.
    4. 단일 분자 선택 매개 변수를 조정하려면 "데이터를 버스트로 잘라 내기"옆의 "조정"을 클릭하십시오. 새로운 팝업 창에서 "Threshold"아래의 인터 포톤 도착 시간을 변경하고 단일 분자 이벤트 당 최소 광자 수를 "min"미만으로 변경하여 평균 interphoton arrival time ( "dt")에서 두 표준 편차가있는 단일 분자 이벤트를 선택하십시오 . #. " "돌아 가기"를 클릭하여 팝업 창을 닫습니다. "다음"에서 "확인"을 클릭하십시오.
      참고 : 임계 값은 ms 단위로 백그라운드 카운트 속도에 따라 다릅니다. 사용 된 광자의 전형적인 최소 수는 60이다.
    5. 생성을 위해 초기 형광 수명을 "Color fit parameters"( 예 : from, to 및 convolution)로 조정합니다."녹색", "적색"및 "황색"색상의 형광 감쇠 매개 변수. 같은 창에서 "프롬프트"및 "지연"에 대한 "시작"및 "끝"값을 조정하십시오. "돌아 가기"를 클릭하여 팝업 창을 닫습니다. "다음"에서 "확인"을 클릭하십시오.
      참고 : 2 색 여기 확인란이 선택되어 있는지 확인하십시오. "From"과 "to"는 형광 감쇠 막대 그래프의 초기 및 최종 저장 상자 (TAC 채널 번호)에 해당합니다. 초기 맞춤 매개 변수가 적절하게 선택되면 각 채널의 형광 감쇠에 적합 함수가 추가됩니다.
    6. 상위 폴더에서 처리 된 모든 ASCII 파일을 저장할 하드 드라이브 위치를 선택하십시오.
      참고 : 파리는 모든 선택된 버스트를 처리하고 시각화를 위해 다른 프로그램에서 사용할 수있는 것보다 많은 ASCII 출력 파일을 만듭니다 ( 예 : Margarita MFD suite).

6. dsDNA 표준 및 샘플 측정urements

  1. 챔버 덮개 유리에 PBS 버퍼 500 μL를 추가하고 챔버와 객관적인 렌즈 사이에 증류수 한 방울을 놓습니다. 컨트롤 페달에서 "Start"버튼을 클릭하고 분석을 위해 TTTR 모드에서 5 분간의 데이터를 수집하십시오.
  2. 소량 (일반적으로 약 0.1 μL, 약 1 μM의 농도) dsDNA 표준을 취해 PBS 완충 용액에 넣고 잘 섞는다. 먼저 "시작"을 클릭하여 10 초간의 데이터를 수집하십시오. 그런 다음 버스트를 확인하여 10 초당 35 개의 버스트를 얻습니다 (5.2.7 및 5.3 단계와 동일). 마지막으로 위에서 설명한대로 TTTR 형식의 데이터를 2 시간 이상 수집하십시오.
  3. 단계 5.3.3에서와 같이 dsDNA 샘플에 대한 수집 된 데이터를 분석합니다.
  4. MFD suite (Margarita)를 사용하여 버스트 히스토그램을 시각화하고 FRET 효율 대 <τ D (A) > f 또는 F D / F A 대 <τ D (A) > f를 표시 하십시오.
    1. 열 t그는 마가리타 소프트웨어를 선택하고 "파일"-> "모두 *. ?? 4 및 * .mti 파일 가져 오기"를 선택하십시오. 다양한 하위 폴더가 포함 된 상위 폴더를 선택하십시오.
    2. 파리에서 파생 된 매개 변수 중 하나 ( 예 : tau green 또는 <τ D (A) > f )의 "X"(가로 좌표) 옆을 클릭하여 시각화 할 매개 변수를 선택합니다. 마찬가지로, 세로 좌표 "Y"에 대해이를 반복하여 원하는 매개 변수를 시각화합니다 ( 예 : FRET 효율, F D / F A 또는 S PIE PIE).
      참고 :이 경우, FRET 효율, F D / F A 또는 S PIE 는 녹색, 적색 및 황색 채널에서 적절한 배경 카운트 속도를 보정합니다. 기증자와 수용자의 양자 수율에 대해; 검출 효율 비 (gG / gR)에 대해; 그리고 누화 (α)에 대해서. 여기서 g G / g R = 3.7 및 α = 0.017은 계측기에만 의존합니다. 백그라운드 카운트 속도사용 된 버퍼에 의존하며, 양자 수율 값은 미리 결정된다.
    3. "Display"-> "Overlay Equation"을 클릭하여 "Overlay Equation"창을 열어 FRET 라인을 추가하십시오. 팝업 메뉴에서 정적 FRET 라인을 선택하십시오. 적절한 FRET 라인을 생성하기 위해 적절한 도너 수명과 양자 생산량 매개 변수를 선택하십시오.
      참고 : 다양한 FRET 지표를 상관시키기위한 FRET 라인을 생성 할 수 있습니다.
  5. 마가리타에서 FRET 효율 대 화학 양롞 (S PIE )을 표시하여 화학 양롞 파라미터를 사용하여 공여체 여기 소스 (β)에 의한 액 셉터 여기에 대한 보정 계수를 결정합니다 (아래의 수학 식 1).
    주 : β는 도너 샘플이 화학량 론적 스케일에서 S PIE = 1.0에서 피크를 갖도록 선택된다; 수용체 - 전용 샘플은 S PIE = 0.0의 화학량 론을 가져야하고, 두 라벨을 갖는 dsDNA는 S PIE 0.5의 화학량 론을 가져야한다.br /> 참고 : 이제 장비가 준비되었으며 FRET 표본 샘플을 측정 할 수 있습니다.
  6. 6.3-6.4 단계에 따라 3 장에서 준비한 FRET 표본 시료를 측정하고 분석합니다.

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Representative Results

MFD 설정 (레이저 라인 : 60 μW에서 485 nm, 23 μW에서 640 nm, 섹션 5.1)을 사용하는 전형적인 smFRET 실험에서 형광 샘플을 낮은 피코 몰 농도 (10 -12 M = 1 pM)로 희석하고 공진 현미경 (sub-nanosecond laser pulse)은 여기 볼륨 (excitation volume)을 통해 자유롭게 확산되는 라벨 분자를 여기시킨다. 일반적인 공 초점 부피는 <4 펨토텔 (fL)입니다. 그러한 저농도에서는 한 번에 하나의 분자 만 하나씩 검출됩니다. 표지 된 분자에서 방출 된 형광은 대물 렌즈를 통해 수집되고 핀 홀을 사용하여 공간적으로 필터링됩니다. 이 단계는 효과적인 공 초점 감지 볼륨을 정의합니다. 그런 다음 신호는 두 개 (또는 그 이상)의 다른 스펙트럼 창 ( 예 : "녹색"및 "적색")에서 평행 및 수직 구성 요소로 분리됩니다. 각각의 광자 검출기 채널은 시간 - 상관 된 단일 광자 카운팅 (TCSPC) 데이터 전자 등록 ( 그림 1 ).

MFD 설정의 보정 후, dsDNA 표준의 측정 인 표 1 (단계 5-6)에 요약 된 절차를 시작할 수 있습니다. 그런 다음 PIE-MFD는 평균 매크로 시간, 형광 수명, 버스트 적분 이방성, 빨간색 신호의 녹색 신호 비율, 프롬프트 채널의 버스트 지속 시간 (T (G + R)) 등의 여러 매개 변수를 분석하는 데 사용됩니다. | D ), 지연된 채널에서의 버스트 지속 시간 (T R | A ) 및 기타 65 , 66 ( 그림 2 ). 이 분석에서 중요한 것은 다음과 같이 정의 된 화학 양롞 파라미터 ( S PIE )입니다 :

방정식 45

여기서 F G | D = F D , F R | D = F AF R | 에이 배경 보정 된 형광 강도 ( 63) 이다. 예를 들어, F G | D = I G | D - < B G >, 내가 어디 G | 기증자의 녹색 채널에서 검출 된 강도이며 < B G > 녹색 채널의 평균 배경 수입니다. 유사한 보정이 수용체의 직접 여기 ( F R | A )와 수용체의 민감한 방출 ( F R | D )에서 수용체의 형광에 대해 수행됩니다. 수학 식 1에서, α 는 도너 - 플루 오에 대한 보정 계수억 셉터 채널로 누화를 다시 시작합니다. β 는 도너 여기 소스에 의한 억 셉터 여기에 대한 보정 계수이다. 및 γ , 여기서

방정식 56

는 도너 및 억 셉터 양자 수율의 함수이고, ΦF , D ΦF , A , 녹색 및 적색 검출기 g Gg R 에서의 검출 효율의 결과를 나타낸다. S PIE 를 사용하여, 도너 전용 라벨링 샘플의 경우 S PIE = 1, 수용자 전용 샘플의 경우 S PIE = 0, S 샘플링의 경우 S PIE = 0을 만족시키기 위해 α, βγ 와 같은 적절한 도구 요소를 보정 할 수 있습니다. FRET 샘플의 PIE = 0.5. 또는,사용 가능 :

방정식 59

두 번째 샘플의 양자 수율을 도출하기 위해, 한 샘플의 양자 수율 ( 방정식 60 )이 알려져 있고 방정식 61 방정식 62 PIE-MFD 실험으로부터 결정된다. 이 경우, 고 FRET dsDNA의 양자 수율은 0.32이고, 저 FRET dsDNA의 양자 수율이 결정된다고 가정한다. 이 절차를 수행하는 이유는 낮은 위치의 FRET 샘플과 높은 FRET 샘플 모두에서 S PIE 가 다르다는 것입니다. 왜냐하면 둘 다 동일한 위치와 하나의 수용기에 하나의 기증자를 갖지만 diff에서다른 위치. 방정식 (3)에 기술 된 바와 같이, 표준 샘플의 적절한 양자 수율을 결정한 후에, FRET 효율 ( E ) 대 <τD ( A ) > f F D / F A 대 < τ D ( A ) > f 표현은 추후 평가에 사용된다. FRET 효율 ( E 정적 ), F D / F A 및 < τ D ( A ) > f 의 파라 메트릭 관계 파라미터는 다음 방정식 세트 (방정식 4)로 설명됩니다.

방정식 63

등식 64

여기서 F D | D 는 도너 또는 녹색 채널에서 검출 된 도너 형광체이며; F A | 수용체에 민감한 방출; 방정식 67 수용체가없는 경우의 도너 형광 수명이다. 및 < τ D ( A ) > x 는 종 평균 수명이며, 경험적 다항식에 의한 형광 평균 수명과 관련이있다 방정식 69 56 , 57 . 이 방정식은 정적 FRET 라인 57 , 67 으로 알려져 있습니다. 왜냐하면 라인이 두 개의 모집단을 똑같이 잘 교차해야하기 때문입니다.f 역학 ( 그림 3 ).

마지막으로 2 개의 dsDNA 샘플 68 , 69 에 대한 확률 분포 분석 (PDA)을 사용하여 FRET 효율 히스토그램 ( 그림 4 )을 분석합니다. PDA는 smFRET 히스토그램을 높은 정확도로 모델링하는 데 사용되었습니다. 단일 또는 다중 정적 종의 정보는 단일 히스토그램에서 얻을 수 있습니다. 얻은 실험 데이터에 기대 분포의 모양을 맞추면 기증자와 수용자 사이의 거리를 알 수 있습니다. 간단히 말해, FRET 효율 또는 F D / F A 분포는 "녹색"( G ) 및 "적색 ( R )"검출 채널에서 수집 된 광자의 특정 조합을 관찰하는 확률 일정한 시간을 감안할 때 아우; 방정식 5를 사용하십시오.

방정식 71

여기서, 배경 신호 B GB R 이 포아송 분포, P ( B G ) 및 P ( B )에 따라 분포된다고 가정하면, 전체 신호 강도 분포 P ( S )로부터 형광 강도 분포 P B R ), 알려진 평균 배경 카운트 율 강도, < B G > 및 < B R >. 조건부 확률 P ( F G , F R | F )는 주어진 FRET 상태에 대해 녹색과 적색 형광 광자 F GF R 의 특정 조합을 관찰 할 확률입니다.

PDA 분석 결과, 높은 FRET dsDNA의 interdye 거리가 < R DA > E (HFRET) = 45.7Å 인 반면, 낮은 FRET dsDNA의 경우, < R DA > E (LFRET) = 59.7Å FRET 포지셔닝 및 스크리닝 시스템 (FPS) 26 을 사용하여 예상 거리와 비교할 때 기대되는 중간 거리 < R DA > E , AV (HFRET) = 44.7Å high-FRET dsDNA에는 FPS, low-FRET dsDNA에는 < R DA > E , AV (LFRET) = 59.1Å, FPS 툴킷에 내장 된 접근 가능한 볼륨 계산은 AV로, fluorophore가 biom의 부착 점에 연결된 세 개의 반지름 구형 모델을 나타내는 거친 몬테카를로 시뮬레이션유연한 연결 링커 (26 , 57 )를 갖는 로프. 측정 된 S PIE를 기반으로 낮은 FRET dsDNA에 대한 양자 수율에 대한 보정이 필요합니다. 이러한 조건을 통해 AV 시뮬레이션에서 실험값과 예상 값 사이에 ~ 1Å의 일치도를 얻을 수 있습니다.

다음으로, NMDA GluN1 LBD를 측정한다. NMDA 수용체 (NMDAR)는 게이팅 70 을위한 글리신과 글루타메이트의 결합을 필요로하는 헤테로 메릭, 비 선택적 양이온 채널입니다. 클램 쉘과 같은 구조를 갖는 LBD는 결정 정보 (71 , 72) 에 기초한 리간드 결합시에 개방형 클램 쉘 및 폐쇄 형 클램 쉘 형 구성을 채택하는 것으로 알려져있다. MFD 실험에서, NMDA GluN1 LBD는 Ser507 및 Thr701 (전장 서열)에서 돌연 변이되어이전에 설명 된 것처럼 틈새. 이어서 시안 색 녹색 형광 물질과 원적외선 형광 물질의 FRET 쌍 (재료 목록 참조)을 사용하여 52Å의 R 0 으로 라벨을 붙였습니다. 이 구조는 가용화 된 수용체로 작업하는 것과 관련된 복잡성없이 리간드 결합 도메인의 운동을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 구조를 사용하여 LBD의 세 가지 구성이 발견되었습니다. conformational selection mechanism은 리간드 결합에 따라 확인 된 개체군 중 하나를 선택적으로 채웠다. 불 활성화 된 형태 또는 길항제 5,7- 디클로로 키 뉴레 닉산 (DCKA)의 존재하에, 대부분 중간 내지 낮은 FRET 상태가 탐구되고,보다 긴 공여체 형광 수명 및 더 큰 공여체 대 수용체 형광 비가 정점에 도달한다 F D / F A = 3.3 일 때 ( 그림 5A ). 이것은 열린 틈새 형태의 안정화와 일치합니다.LBD가 채택 할 수있는 3 가지 구성 (high-FRET (HF) ( R DA > E = 33.9Å), medium-FRET (MF) ( R DA > E = 45.8Å ), 낮은 FRET 상태 (LF) (< R DA > E = 55.8Å)). 그러나 대부분이 중형 FRET과 저 FRET로 구성되었다. 이것은 높은 FRET가 NMDAR의 활성화로 이어진 국가임을 시사합니다. 실험적으로 도출 된 거리와 in silico 라벨링을 사용하고 결정 정보 (PDBID : 1PB7 및 1PBQ)를 사용하는 FPS에 의해 유도 된 거리를 비교하는 것은 가치가있다. 중 FRET 및 저 FRET 모집단의 interdye 거리는 두 구조 모두에서 각각 < R DA > E , AV = 48.7Å 및 54.2Å이라는 것을 발견했다 ( 그림 5B). 2.9Å의 가장 큰 편차는 중 - FRET 상태에서 발견되었다. 분포의 불확실성을 고려할 때, κ 2 의 가정으로부터 = 2/3 인 경우, 측정 된 거리에서 최대 오차는 2.5 %입니다. 즉, 실험적으로 결정된 거리에서 Angstrom 정확도에 도달 할 수 있다고 결론 지을 수 있습니다.

그림 1
그림 1 : PIE-MFD의 실험 설정 및 데이터 등록. ( A ) 일반적인 다중 매개 변수 형광 감지 설정이 나와 있으며 두 개의 다른 스펙트럼 창을 덮는 4 개의 탐지기로 구성됩니다. 탐지기는 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 전자 장치에 연결됩니다. ( B ) TCSPC에서, 각각의 광자는 (i) 마이크로 - 시간 또는 여기 펄스 후의 시간; (ii) 매크로 시간 또는 숫자실험 시작으로부터의 여기 펄스의; 및 (iii) 채널 번호. 이 세 가지 매개 변수는 오프라인 분석에 필요합니다. ( C ) 단일 분자는 공 초점 체적을 통해 자유롭게 확산하고, 광자가 방출되어 시간의 함수로서 광자의 폭발을 남긴다. ( D ) 각 선택된 버스트는 그에 따라 맞추어지고 다차원 히스토그램을 표시하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 다양한 형광 매개 변수를 사용하는 파열 분석. ( A ) FRET 효율성 대 매크로 시간, ( B ) FRET 효율 대 T (G + R) | D - T R | A 그리고 ( C ) FRET 효율 대 S PIE낮은 FRET 또는 15 bp dsDNA. T (G + R) | D 는 프롬프트 채널의 버스트 지속 시간이며, T R | A 는 지연된 채널의 버스트 지속 시간 (T R | A ) 입니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : F D / F A 와 기증자의 수명 대 FRET 효율. FRET 효율을 나타내는 2 차원 히스토그램 ( A ); 수용체 형광에 대한 도너의 비율, F D / F A , ( B ); 및 수용체 <τD ( A ) > f 의 존재 하에서 도너의 평균 형광 수명 대 도너 이방성 rD ( C ). 결정된 교정B = 0.64, < B R > = 0.37, β = 0.08 (도너 여기 레이저에 의한 억 셉터의 직접 여기 분율), α = 0.017, g G / g R = 3.7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 높은 FRET 및 낮은 FRET dsDNA의 PDA 비교. 시간 창 평균 FRET 효율 거리의 6 %의 절반 폭을 갖는 2ms에서의 PDA 분석. 각 거리는 폭 (hw DA )으로 < R DA > E 의 6 %로 분포 된 가우스 분포입니다. ( A ) 샘플 HFRET의 경우 interdye distance는 < R DA > E (HFRET) = 45.7 Å이다. ( B ) 시료 LFRET의 경우, 거리는 < R DA > E (LFRET) = 59.7Å 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5 : 길항제 DCKA의 존재하에 NMDA 수용체의 리간드 - 결합 도메인의 PIE-MFD. ( A ) 수용체 < τ D ( A ) > f 및 공여체의 이방성 대 < τ D ( A ) > f 의 존재 하에서 F D / F A 의 2 차원 히스토그램 대 기증자의 수명 DCKA가있는 LBD의 경우. 1 차원F D / F A 에 대한 예상치도 표시됩니다. 정적 FRET 라인은 빨간색으로 표시됩니다. 순수한 도너 및 수용체 형광 ( F DF A )은 배경 (< B G > = 0.940 kHz 및 < B R > = 0.522 kHz), 스펙트럼 크로스 토크 (α = 1.7 %) 및 검출 효율 비율 ( gG / gR = 3.7). 이방성 대 < τ D ( A ) > f 히스토그램에서, Perrin의 방정식은 ρ = 2.5 ns의 회전 상관 관계를 갖는다. ( B ) 10ms 시간 윈도우에서의 PDA Δt. 단일 상태가 필요합니다. 이 모델은 모든 시간 창을 잘 맞 춥니 다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동작
센터 레이저 빔.
핀홀 정렬. FCS 실험 (5 절).
감지기 정렬. CPM 최대화.
목표 보정 링을 조정하십시오. diff 를 최소화하고 CPM을 극대화하십시오.
계기 응답 기능 (IRF)을 결정하십시오. TTTR 모드에서 TCSPC @ SMD. 산란 패턴을 측정합니다.
각 스펙트럼 창에 대한 G- 인자를 결정합니다. TTTR 모드에서 TCSPC @ SMD. 편파에 맞는 감쇠 꼬리 형태의 강도를 비교하십시오.
스펙트럼 창에서 검출 효율 비율을 결정합니다 (g R / g G ). (i) 넓은 방출 스펙트럼 (nM 농도)을 갖는 염료의 강도 측정. (ii) 기준 FRET 자 (pM concentration). MFD에서 subpopulation은 정적 FRET 라인에 있어야합니다.
최종 점검 (수명 및 이방성)을 수행하십시오. 단일 지수 붕괴 ( 예 : Rhodamine 110)가있는 자유롭게 확산되는 염료의 단일 분자 측정에서 적합 수명 및 이방성을 제어합니다.
수용체와 양자 양자의 비율을 결정합니다. (i) 화학량 론적 플롯 (S PIE ) 식 1. 및 4.2.
백그라운드 카운트 속도를 결정하십시오. 선택된 "버퍼"의 강도 측정.
누화 (α)를 결정하십시오. 형광 방출 스펙트럼 및 검출 효율을 고려한 도너 염료의 강도 측정.

표 1 : 단일 분자 실험에서 FRET 실험을위한 보정 단계.

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Discussion

이 연구에서는 PIE-MFD 단일 분자 FRET 실험을 사용하여 interdye distance를 고정밀 도로 정렬, 교정 및 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 모든 기기 파라미터를 신중하게 교정하여 측정 된 거리의 정확도를 높이고 Angstrom 정확도에 도달 할 수 있습니다. 이를 위해 다양한 다차원 히스토그램을 사용하여 추가 특성 분석을위한 모집단을 분석하고 식별합니다. 측정 된 샘플의 안정성을 확인하기 위해 평균 매크로 시간을 사용하여, 공여체 및 수용체 광 표백을 보정하고 화학량 론적 매개 변수를 기반으로 FRET 모집단을 선택할 수 있습니다. 그러나, 수용체의 광 물리 특성은 라벨의 위치에 따라 변할 수있다. 따라서, 억 셉터 양자 수율을 적절히 보정하기 위해 S PIE 분포를 사용할 수 있습니다. 감마 인자 (ƴ)를 결정하기 위해서는 적절한 광 물리 특성 분석이 필요하며, 이는 다른 보정 사실ors (누화에 대해서는 α, 도너 레이저로는 acceptor 여기에 대해 β)는 측정 된 interdye 거리의 정확도를 높이는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 2 개의 설계된 dsDNA 표준 샘플을 사용하여 확증되었고 예상 값과 비교했을 때 ~ 1Å의 정확도가 결정되었습니다.

다른 염료 선택은 선택된 염료의 적절한 스펙트럼 창을 수용하기 위해 이색 성 및 밴드 패스 필터와 같은 현미경 광학 요소를 적용해야합니다. 따라서 펄스 레이저를 선택해야합니다. 더 중요한 것은, 수용체 및 공여체 표백, 삼중 항 또는 염료 깜박임, 단백질 표면에 염료 부착과 같은 여러 가지 가능한 광 물리적 인 인공물 때문에 염료 선택이 결정적이라는 것입니다. 이러한 인공물은 실험 데이터의 해석을 손상시킬 수 있습니다. 이 시나리오에서는 MFD가 이상적입니다. 여러 매개 변수를 검사하여 이러한 아티팩트의 소스를 식별하고 올바른그 (것)들을 위해, 또는 적어도 그들의 존재를 인식하고 있으십시오. 쌍극자 배향 매개 변수는 κ 2로 가정합니다. = 2/3 인 경우 염료가 생체 분자의 표면에 우선적으로 달라 붙으면 결정된 거리의 더 큰 편차가 발생할 수 있습니다. 기증자 샘플, 수용체 샘플 및 기증자 수용체의 이방성은이 가정이 유효한지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 실험에서 적절한 거리를 보정하지 않고 10-20 %의 오차를 얻는 것에 비해 측정 된 거리에 최대 오차가 ~ 2.5 %라는 것을 알게되었습니다. 수용체의 양자 수율은 더 큰 오차 원을 만들 수 있습니다. 따라서 S PIE 는이 중요한 문제를 해결하는 데 중요합니다.

유사한 전략을 적용하여 NMDA 수용체의 리간드 - 결합 도메인의 입체적 풍경을 이해함으로써 NMDAR에서의 작용 기전을 이해할 수있다. LBD가 t적대자의 존재는 채널을 여는 책임이 있다고 가정 된 높은 FRET 상태의 접근 가능성을 피한다 73 . 실험적으로 도출 된 거리와 결정 학적 정보에 기초한 예상 값을 비교할 때 3Å 이내의 일치도가 달성되었습니다. 더 중요한 것은 새로운 인구 밀집 국가가 비슷한 정밀도로 식별 될 수 있다는 것입니다.

요약하면, MFD 모드 42 에서의 단일 분자 FRET 실험은 실험적 인공물을 적절하게 설명하고 ~ 30-70Å의 범위 내에서 interdye distance를 유도 할 수있게한다. 단일 측정 거리 대신에 거리 네트워크가 도출 된 경우이를 구조 모델링의 구속으로 사용할 수 있습니다. 특히 구조 생물학의 표준 방법으로는 특성화하기 어려운 상태의 경우 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

모든 저자는이 기사의 내용과 경쟁 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

VJ와 HS는 NIH R01 GM094246에서 VJ 로의 지원을 인정합니다. HS는 Clemson University 창의적 탐구 프로그램 및 Clemson University의 광학 재료 과학 및 엔지니어링 기술 센터로부터 창업 자금을 인정합니다. 이 프로젝트는 걸프 코스트 컨소시엄의 학제 간 생물 과학 교육 센터 (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05)의 켁 센터 (Keck Center)와 일반적인 인간 질병의 번역 연구를위한 시스 손 재단 파운데이션 (Schissler Foundation Fellowship)의 연수 프로그램도 지원했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 나타내는 것은 아닙니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20 µm
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24 x 60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25x36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10 x 10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

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