Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Developmental Biology

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt histologische Analysen der Leber aus Zebrafisch-Larven, die mit 2% Ethanol für 24 Stunden behandelt wurden. Eine solche akute Ethanolbehandlung führt zu einer hepatischen Steatose und einer Schwellung des Lebergefäßsystems.

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Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

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Abstract

Alkoholische Lebererkrankung (ALD) bezieht sich auf Schädigung der Leber durch akuten oder chronischen Alkoholmissbrauch. Es gehört zu den führenden Ursachen für alkoholbedingte Morbidität und Mortalität und betrifft mehr als 2 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten. Ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Alkohol-induzierten Leberverletzung zugrunde liegen, ist entscheidend für die Entwicklung einer effektiven Behandlung für ALD. Zebrafisch-Larven zeigen hepatische Steatose und Fibrogenese nach nur 24 h Exposition gegenüber 2% Ethanol, so dass sie nützlich für die Untersuchung der akuten alkoholischen Leberverletzung. Diese Arbeit beschreibt das Verfahren für die akute Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und zeigt, dass es eine Steatose und Schwellung der Leberblutgefäße verursacht. Ein detailliertes Protokoll für Hämatoxylin- und Eosin- (H & E) -Färbung, das für die histologische Analyse der Zebrafisch-Larvenleber optimiert ist, wird ebenfalls beschrieben. H & E-Färbung hat mehrere einzigartige Vorteile gegenüber der Immunfluoreszenz, da sie alle liv markiertEr-Zellen und extrazellulären Komponenten gleichzeitig und kann leicht erkennen Leber-Verletzungen, wie Steatose und Fibrose. Angesichts der zunehmenden Verwendung von Zebrafisch bei der Modellierung von Toxin und Virus-induzierter Leberverletzung sowie vererbter Lebererkrankungen dient dieses Protokoll als Referenz für die histologischen Analysen, die in all diesen Studien durchgeführt wurden.

Introduction

Alkoholische Lebererkrankung (ALD), die durch Alkoholüberkonsum verursacht wird, ist eine Hauptursache für alkoholbedingte Morbidität und Mortalität. In den Vereinigten Staaten, fast die Hälfte der Leberkrankheit Todesfälle beinhalten Alkohol 1 , und ALD ist verantwortlich für fast 1 in 3 Lebertransplantationen 2 . ALD hat ein breites Spektrum. Die Steatose, die durch eine überschüssige Lipidakkumulation in Hepatozyten charakterisiert ist, tritt im frühen Stadium des schweren Trinkens auf und ist bei Beendigung des Alkoholkonsums reversibel. Unter dem Einfluss von genetischen und umweltbedingten Faktoren und der anhaltenden Alkoholkonsum kann die hepatische Steatose zur alkoholischen Hepatitis und schließlich zur Zirrhose führen. Studien mit dem Nagetier ALD-Modelle haben erhebliche Einblicke in die Krankheit, aber sie haben Einschränkungen (siehe Referenz 3 ). Mündliche Fütterung einer Alkohol-Diät verursacht nur Steatose bei Nagetieren 4 , </ Sup> 5 Entwicklung von Entzündungen und Fibrose erfordert entweder eine zweite Beleidigung 6 , 7 oder chronische intragastrischen Infusion, die invasiv und technisch anspruchsvoll ist 8 , 9 . Der Zeolith des Zeoliths erzeugt auch eine Leberverletzung als Reaktion auf die chronische und akute Alkoholbehandlung 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Insbesondere stellt der Larven-Zebrafisch einen attraktiven komplementären Modellorganismus dar, in dem akute alkoholische Leberverletzungen 10 , 11 , 13 , 15 untersucht werden können . Die Zebrafisch-Leber ist funktionell und produziert Schlüsselenzyme für den Ethanol-Stoffwechsel um 4 TageNach der Befruchtung (dpf) 13 , 16 , 17.Ethanol kann direkt dem Wasser zugesetzt werden, und die Exposition gegenüber 2% Ethanol für 24 h ist ausreichend, um hepatische Steatose und fibrogene Reaktionen in Zebrafischlarven 13 , 15 zu induzieren.

Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit 2% Ethanol für 24 h eine Gewebe-Ethanol-Konzentration von 80 mM in Zebrafisch-Larven 13 ergab. Andere haben gezeigt, dass Larven diese Konzentration tolerieren und die Leberphänotypen, die in den behandelten Tieren gesehen werden, spezifisch für die Ethanol-Exposition sind 11 , 13 , 15 , 18 . Da jedoch 80 mM bei Menschen 19 nahezu tödlich ist, ist es wichtig, die Leberhistologie des mit Ethanol behandelten Zebrafischs zu bewerten und zu detektierenRmine die physiologische Relevanz für den Menschen.

Die schnelle externe Entwicklung und Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht es, die Wirkung von Alkohol in der Leber in Echtzeit und in festen Proben zu charakterisieren. Die Verfügbarkeit von zelltypspezifischen fluoreszierenden transgenen Linien und die jüngsten Fortschritte in der konfokalen Mikroskopie erleichtern die Untersuchung, wie verschiedene Leberzelltypen ihre Morphologie und ihr Verhalten in Reaktion auf die akute Ethanolbehandlung 11 , 15 verändern. Allerdings kann die konfokale Bildgebung des fluoreszierenden transgenen Zebrafischs bei der Untersuchung der Leberhistologie nicht vollständig gegen Hämatoxylin und Eosin (H & E) färben. Die Markierung aller Leberzelltypen zur gleichen Zeit mit transgenem Zebrafisch erfordert die Erzeugung von einzelnen transgenen Linien, die jeweils einen Leberzelltyp mit einem einzigartigen Fluorophor markieren. Die Einführung verschiedener transgener Hintergründe in denselben Fisch erfordert BreedinG Mehrfachgenerationen, die zeitaufwändig und teuer ist. Zusätzliche Immunfluoreszenzfärbung ist erforderlich, um extrazelluläre Matrixkomponenten zu detektieren. H & E-Färbung dagegen markiert gleichzeitig alle Leberzelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten und gibt so einen Überblick über die Leber 20 . Darüber hinaus zeigt es leicht einige histopathologische Merkmale von Lebererkrankungen, wie Hepatocyten Tod, Steatose und Fibrose. Obwohl H & E ein routinemäßiger Fleck in der Säugetier-Histologie ist, wird er nicht häufig in der Zebrafisch-Leberforschung verwendet, und das Protokoll ist weniger gut etabliert.

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die akute Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und für die nachfolgenden histologischen Analysen mit H & E-Färbung. Das H & E-Färbeprotokoll kann in allen Studien der Leberentwicklung und -funktion verwendet werden. Darüber hinaus können die Paraffinschnitte für die Immunhistochemie sowie für andere spezielle sta verwendet werdenIns in der Leberpathologie, einschließlich der Trichromfleck, Reticulinfleck usw.

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Protocol

AB WT-Erwachsener und Larven-Zebrafisch wurden unter Standardbedingungen 21 gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Institutes of Health Publikation 86-23, überarbeitet 1985) aufrechterhalten; Ihre Verwendung wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee im Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) genehmigt.

1. Vorbereitung von Lösungen

  1. Ei-Wasser zubereiten.
    1. Die Salzlösung wird durch Auflösen von 40 g handelsüblichem Meersalz in 1 l doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) zubereitet. Rühren, bis alle Salze vollständig aufgelöst sind.
    2. 0,1% ige Methylenblau-Lösung durch Zugabe von 0,1 g Pulver zu 100 ml ddH 2 O zubereiten.
      ACHTUNG: Methylenblau ist ein Reizmittel, wenn es mit den Augen oder der Haut in Berührung kommt. Beim Umgang mit dem Pulver immer einen Laborkittel und Handschuhe tragen.
    3. Kombinieren Sie 28.125 mL Lager Salz soLution und 7 ml Methylenblau-Lösung in einem 50 ml konischen Röhrchen. Gut mischen. Füge diese Mischung zu 15 l ddH 2 O hinzu. Gründlich schütteln und bei RT aufbewahren.
  2. 100 ml 1 M Tris-HCl durch Zugabe von 12,1 g Tris-Pulver zu 100 ml ddH 2 O zubereiten. Den pH-Wert mit Salzsäure (HCl) auf 9,0 einstellen.
    ACHTUNG: HCl kann bei Einatmen schwere Verbrennungen und Schleimhautreizungen verursachen. Tragen Sie immer einen Laborkittel und Handschuhe und behandeln Sie die Flasche in einer Chemikalienhaube.
  3. Bereiten Sie 0,4% Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat-methansulfonat) -Lösung vor.
    1. 2 g Triacinpulver in 489,5 ml ddH 2 O lösen. 10,5 ml Tris-HCl, pH 9-Lösung zugeben. Mit einem Rührstab mischen, bis sich das gesamte Pulver gelöst hat. Auf pH 7.0 einstellen.
      ACHTUNG: Tricaine Pulver kann ein Atemreizmittel sein. Beim Umgang mit dem Pulver immer eine Staubmaske tragen.
    2. Aliquot 45 ml der Tricainlösung in 50 ml konische Röhrchen. Halten Sie die LösungN bei 4 ° C für den sofortigen Gebrauch und bei -20 ° C für die Langzeitlagerung.
  4. Bereiten Sie Dietrichs Fixiermittel vor, indem Sie 30 ml 95% Ethanol, 10 ml 37% Formaldehyd, 2 ml Eisessig und 58 ml ddH 2 O in einer Glasmedienflasche vereinigen. Mischen Sie gut durch Wirbeln und lagern bei RT.
    ACHTUNG: Formaldehyd ist ein mutmaßliches Karzinogen, und jede Lösung mit Formaldehyd sollte in einer chemischen Haube verwendet werden. Eisessig kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Tragen Sie immer einen Laborkittel und Handschuhe und behandeln Sie die Lagerlösung in einer Chemikalienhaube. Formaldehyd, Eisessig und 95% Ethanol sind alle brennbaren Flüssigkeiten und sollten in einem dafür vorgesehenen brennbaren Schrank aufbewahrt werden.
    HINWEIS: Das Fixiermittel von Dietrich ist für 1 Jahr bei RT stabil.
  5. 1 l 10x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Zugabe von 80 g Natriumchlorid (NaCl), 2 g Kaliumchlorid (KCl), 14,4 g Dinatriumphosphat (Na 2 HPO 4 ) und 2 zubereiten.4 g Monokaliumphosphat (KH 2 PO 4 ) bis 800 ml ddH 2 O. Mit Natriumhydroxid (NaOH) auf pH 7,4 einstellen und ddH 2 O zu einem 1 l Endvolumen zugeben. Diese Lösung bei RT nach dem Autoklavieren auf einem flüssigen Zyklus aufbewahren, der für 1 min spült und bei 121 ° C für 20 min inkubiert.
  6. Machen Sie 1 l von 1x PBS durch Verdünnen von 100 ml der 10x PBS-Lösung in 900 ml ddH 2 O. Mischen Sie gut durch Schütteln und speichern bei RT nach dem Autoklavieren.
  7. Bereiten Sie 3% Agarose in einer Glasmedienflasche für Embryo-Montage vor.
    1. Füge 3 g Agarose zu 100 ml ddH 2 O hinzu und vermische durch Wirbeln. Die Mischung durch Mikrowellen erhitzen, um die Agarose aufzulösen, und sorgfältig während der Erwärmung zu beobachten, um sicherzustellen, dass es minimales Kochen gibt.
      ACHTUNG: Die Flasche wird wahrscheinlich heiß, wenn sie aus der Mikrowelle entfernt wird, trotz kurzer Erwärmung. Verwenden Sie einen Schutzhandschuh oder einen Handschuh, um die Flasche aus der Mikrowelle zu entfernen.
    2. Entfernen Sie die Flasche aus der Mikrowelle.Während Sie sanft wirbeln, suchen Sie nach Kristallen, die nicht vollständig aufgelöst sind; Wenn es keine Kristalle gibt, ist die Lösung gebrauchsfertig. Die 3% Agarose bei RT aufbewahren und vor Gebrauch wieder erhitzen lassen.
  8. Filter Harris Hämatoxylin Lager Lösung, um alle Feststoffe, die gefällt haben zu entfernen.
    1. Falten Sie einen Kaffeefilter halb so, dass der Filter einen Kegel erzeugt. Öffnen Sie die Seitenwand, so dass die Flüssigkeit durch den Filter läuft, so dass irgendwelche Trümmer gefangen werden können.
    2. Setzen Sie den Filter in einen Trichter und der Trichter in eine Glasmedienflasche. Allmählich das Hämatoxylin durch den Filter gießen.
      ACHTUNG: Hämatoxylin ist bei Augenkontakt, Verschlucken und Einatmen gefährlich. Tragen Sie immer einen Laborkittel und Handschuhe und behandeln Sie die Lagerlösung in einer Chemikalienhaube.
  9. 0,05% HCl durch Zugabe von 125 μl 12 N HCl zu 250 ml ddH 2 O zubereiten.
  10. Vorbereitung der Eosin-Y-Phloxin-B-Lösungsmischung durch Kombination von 25 ml 1% eOsin Y (aq), 2,5 ml 1% Phloxin B (aq), 195 ml 95% igem Ethanol und 1 ml Eisessig in einer Glasflasche. Mischen Sie gut durch Wirbeln und lagern bei RT
    ACHTUNG: Eosin Y ist bei Augenkontakt, Verschlucken und Einatmen gefährlich. Tragen Sie immer einen Laborkittel und Handschuhe und behandeln Sie die Lagerlösung in einer Chemikalienhaube.
  11. 2% iges Ethanol durch Zugabe von 2 ml reinen Ethylalkohol zu 98 ml Ei-Wasser zubereiten.
    ACHTUNG: Ethylalkohol ist ein Augenreizmittel. Bei der Handhabung von Ethylalkohol immer eine angemessene Schutzausrüstung tragen. Es ist auch brennbar und sollte entsprechend gehandhabt und gelagert werden.
    HINWEIS: Vor der Durchführung der akuten Ethanolbehandlung frische 2% Ethanol vorbereiten.

2. Führen Sie eine akute Ethanolbehandlung in Zebrafisch-Larven durch

  1. Um Embryonen zu erzeugen, kreuzen Sie Kreuze mit einem Wildtyp-Männchen und einem WT-weiblichen Fisch pro Paarungstank. Trennen Sie sie durch Einsetzen eines Plastikteilers in den Gegenbehälter.
    HINWEIS: SetUp Kreuze nach der endgültigen Fütterung des Tages, so dass die Fische gut gefüttert werden.
    1. Um 8 Uhr am nächsten Morgen, ziehe den Teiler, damit das Paar paaren kann.
    2. Nach 1 h Rückgabe der erwachsenen Fische in ihren ursprünglichen Panzer. Sammle die Embryos, indem du das Wasser, das die Embryonen enthält, in ein Sieb gießt. Drehen Sie das Sieb in eine 100 mm Petrischale und waschen Sie die Embryos in die Schale mit einer Waschflasche mit Eiwasser. Legen Sie die Schale mit den Embryonen in einen Inkubator bei 28 ° C.
    3. Wenn Embryonen mindestens das 4-Zellen-Stadium (1 hpf) erreichen, entfernen Sie alle unbefruchteten Embryonen und Trümmer im Wasser mit einer Pasteurpipette und legen Sie die Schale mit den befruchteten Embryonen in einen Inkubator bei 28 ° C. Halten Sie die Embryonen im Inkubator bei 28 ° C bis 96 h nach der Befruchtung.
    4. Anästhesieren Sie den Larvenfisch durch Zugabe der Tricainlösung zu Eiwasser bei einem Verhältnis von 1-10 (Volumen / Volumen).
    5. Wählen Sie bis zu vierzig Huf-Larven aus, die eine aufgeblasene Schwimmblase habenEine Pasteurpipette und spaltete sie gleichmäßig in zwei neue Petrischalen.
    6. Nehmen Sie so viel Rest Ei Wasser wie möglich. Bei einer Dichte von einer Larve pro ml wird Ei-Wasser mit 2% Ethanol zu einer Schale gegeben. Fügen Sie die gleiche Menge an Ei Wasser auf die andere Schale, um als Kontrolle zu dienen.
    7. Halten Sie die Kontrolle und Ethanol-behandelte Larven im Fischraum für 24 Stunden.
      HINWEIS: Die Durchführung von Ethanol-Behandlung in einem Fischraum, der einen 14-h-Licht / 10-h-Dunkel-Zyklus aufweist, führt zu einer gleichmäßigeren und robusteren Leberverletzung, als das Experiment im Dunkeln in einem Inkubator durchzuführen.
    8. Sammle die Larven in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit nicht mehr als 20 Larven pro Röhrchen.
    9. So entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich von den Larven und fügen Sie mindestens 1 ml (10x Gewebevolumen) von Dietrichs Fixiermittel in der chemischen Haube hinzu. Lassen Sie den Fisch mindestens 30 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Nährstoff fixieren.
      ANMERKUNG: Die Fische sind in der Fährmittel von Dietrich für mehrere Wochen stabil.
<P class = "jove_title"> 3 Vorbereitung der Tissue-Kassetten und Verarbeitung

  1. Legen Sie die notwendige Anzahl von Gewebekassetten und zwei blaue Biopsie-Pads pro Kassette fest. Legen Sie eine Biopsie-Pad an der Unterseite jeder Kassette. Etikettieren Sie jede Kassette in Bleistift, um die Probe klar zu identifizieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie keinen Stift oder Marker, um die Kassetten zu beschriften, da die Etikettierung in späteren Schritten verloren geht.
  2. Die Larven in 3% Agarose einbetten, um die gleichmäßige Orientierung aller Proben zu gewährleisten.
    1. Entfernen Sie das Fixiermittel aus den Röhrchen in einer Chemikalienhaube und waschen Sie die Larven 3 mal für jeweils 5 min mit 1 ml 1x PBS. Legen Sie die Röhrchen auf einen Nussator bei RT während der Wäsche.
    2. Während der Wäsche erhitzt man die hergestellte 3% Agarose in Wasser unter Verwendung einer Mikrowelle, um den Feststoff zu schmelzen. Hitze für 30 s zu einer Zeit und beobachten Sie sorgfältig, um das Kochen zu minimieren. Halten Sie die flüssige Agarose auf eine heiße Platte, die auf 90 ° C unter leichtem Rühren eingestellt ist.
    3. Mit einer Transferpipette bis zu 8 l übertragenArvae zu einer plastischen histologieform und entfernen so viel PBS wie möglich. Mit einer Transferpipette mit abgesperrter Spitze die Form mit 3% Agarose vollständig füllen.
    4. Mit einer Insulinspritze sammeln Sie die Larven in die Mitte der Form und schieben sie nach unten. Für sagittale Abschnitte, positioniere die Larven in einer Linie, mit den Köpfen in Richtung der Oberseite der Form. Um sicherzustellen, dass die Leber in einer konsequenten Weise orientiert sind, drehen Sie die Larven, so dass die linke Seite des Körpers nach unten und flach gegen den Boden der Form ist.
      HINWEIS: Da sich die Leber auf der linken Seite des Körpers befindet, minimiert diese Positionierung die Anzahl der Abschnitte, die vor dem Erreichen der Leber geschnitten werden müssen. Halten Sie die Larven so nah wie möglich aneinander.
    5. Setzen Sie die Form für 4-5 min zur Seite, damit die Agarose vollständig eingestellt werden kann. Entfernen Sie den Agaroseblock aus der Form und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Agarose um die Larven zu schneiden. Stehen Sie den Block am Ende und schneiden Sie die Dicke in der Hälfte sO, dass der letzte Block etwa 2-3 mm dick ist.
    6. Übertragen Sie den kleinen Agarose-Block auf die vorbereitete Gewebekassette (Schritt 3.1) und legen Sie den zweiten Biopsie-Pad auf den Block. Schließen Sie die Kassette und legen Sie die fertig montierte Kassette in einen verschließbaren Behälter mit frisch zubereiteten 70% Ethanol in ddH2O.
      HINWEIS: Wenn die Kassetten nicht sofort verarbeitet werden, legen Sie sie in 70% Ethanol in einen Behälter bei 4 ° C, um einen Verlust der Fixierung zu vermeiden. Kassetten sind bei 4 ° C für bis zu 3 Tage stabil.
  3. Gewebeverarbeitung
    ANMERKUNG: Proben können einem Histologie- oder Pathologielabor vorgelegt werden, das mit einem Gewebeprozessor zur Verarbeitung der Kassetten in Paraffin ausgestattet ist. Fordern Sie ein Standard-O / N-Verarbeitungsprogramm anstatt ein kurzes Programm an, damit das Paraffin die Agarose vollständig durchdringen kann.
    1. Verarbeiten Sie die Gewebekassetten, indem Sie sie durch eine Verdünnungsreihe von Ethanol mit einer ansteigenden Menge an Alkohol überführenDehydrieren das Gewebe wie folgt: 70% Ethanol 2 mal, jeweils 45 min; 80% Ethanol, 45 min; 95% Ethanol, 2 mal, jeweils 45 min; 100% Ethanol, 2 mal, jeweils 45 min.
    2. Ersetzen Sie den Alkohol mit einem Lösungsmittel (100% Xylol, 2 mal, jeweils 45 min), damit das Paraffin das Gewebe infiltrieren kann.
      ACHTUNG: Xylol ist reizend und bei Einatmen schädlich. Achten Sie darauf, immer eine chemische Haube zu verwenden. Xylol ist brennbar und muss entsprechend gelagert werden.
    3. Inkubieren Sie die Kassetten in Paraffin O / N in einem Inkubator bei 60-65 ° C. Halten Sie die Kassetten warm bis zum Einbetten.
  4. Die verarbeiteten Agaroseblöcke in Paraffin einbetten.
    1. Nehmen Sie eine Kassette aus der Wärmeschublade der Einbettmaschine heraus und entfernen Sie den Deckel der Kassette und die obere Biopsieauflage von der Kassette. Füllen Sie eine Histologie Schimmel mit flüssigem Paraffin und halten Sie es auf der warmen Platte auf der Einbettmaschine.
    2. Mit warmer Pinzette, holen Sie den Agarose-Block aus dem CassettE und übertrage es mit der Histologieform mit Paraffin. Stellen Sie sicher, dass die Seite des Agarose-Blocks mit dem Fisch, der der Oberfläche am nächsten liegt, nach unten zeigt. Werfen Sie die untere Biopsie-Auflage weg und übertragen Sie die gesamte Histologie-Form auf die coole Platte auf der Einbettmaschine.
    3. Mit Pinzette schnell den Agarose-Block in der Mitte der Form positionieren; Setzen Sie den Block an der Unterseite der Form. Sobald der Block richtig platziert ist, legen Sie den Boden der Kassette auf die Histologie-Form und füllen Sie ihn auf halbem Weg mit flüssigem Paraffin. Legen Sie die Form direkt auf die 4 ° C Platte und stören Sie die Blöcke für mindestens 10-15 min, damit das Paraffin erstarren kann. Während der erste Block eingerichtet ist, wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Blöcke.
    4. Sobald das Paraffin für alle Blöcke eingestellt ist, entfernen Sie die Histologieform aus dem Paraffinblock, indem Sie vorsichtig auf die Form drücken, um sie zu lösen. Diese Paraffinblöcke können bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit gelagert werden.
  5. 4. Aufstellung von Paraffinblöcken

    1. Der Tag vor dem Schneiden, Face-in der Paraffin-Block mit einem Mikrotom, um überschüssiges Paraffin zu entfernen, das das Gewebe bedeckt. Abschnitt 5 μm zu einer Zeit, bis das Gewebe an der Oberfläche des Paraffinblocks ausgesetzt ist. Stoppen und verwerfen alle Abschnitte, die geschnitten werden Tauchen Sie die Blöcke in 1x PBS bei 4 ° CO / N nach unten.
      HINWEIS: Die Blöcke sollten mindestens 8 Stunden lang eingeweicht werden. Starten Sie das Einweichen am Ende des Tages. Wenn die Blöcke zu lange in 1x PBS gelassen werden, kann das Gewebe anschwellen und verzerrt werden.
    2. Entfernen Sie einen Block zu einem Zeitpunkt aus dem 1x PBS und schneiden Sie 5-μm-Abschnitte mit einem Mikrotom. Trennen Sie das Band der Abschnitte von der Klinge, indem Sie den letzten Abschnitt vorsichtig mit einer Pinzette oder einem Pinsel von der Klinge wegziehen. Nehmen Sie das Band durch den letzten Abschnitt mit der Pinzette auf und übertragen Sie es in ein Wasserbad bei 42 ° C. Lassen Sie die Bänder mindestens 5 min auf der Oberfläche des Wassers schwimmen.
      HINWEIS: WheN Übertragung von Abschnitten, lassen Sie sich nicht die Pinzette berühren das Wasser, während noch in Kontakt mit dem Paraffin. Ansonsten schmelzt das Paraffin auf die Pinzette und macht die Trennung sehr schwierig. Wenn nötig, zerlegen Sie die Abschnitte in kleinere Gruppen mit sauberen Pinzetten, so dass sie leicht auf die Folien passen können. Berühren Sie die Naht zwischen den Abschnitten, um die Trennung ohne Beschädigung zu erzeugen.
    3. Setzen Sie einen Ladeschieber in das Wasser in einem 45-Grad-Winkel und stellen Sie ihn sorgfältig unter die Gruppe der zu sammelnden Abschnitte. Ziehen Sie den Schieber vorsichtig aus dem Wasser und lassen Sie die Abschnitte an der Folie befestigen.
    4. Blasen Sie überschüssiges Wasser aus den Abschnitten mit fusselfreiem Gewebe. Legen Sie den Schlitten in einen Schiebehalter oder eine Schachtel. Weiter, um den Block zu schneiden, bis das gewünschte Gewebe gesammelt wurde. Wiederholen Sie den Schnittvorgang für alle Blöcke.
    5. Die Schieber in einem 55 ° C Inkubator oder Ofen für 3-16 h backen, um das Paraffin zu schmelzen. Entfernen Sie die Folien aus dem Ofen und lassen Sie sie tO kühl vor Beginn der Färbung.
      HINWEIS: Paraffinschnitte können bei RT unbegrenzt, vor und nach dem Backen aufbewahrt werden.

    5. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von Paraffin-Sektionen

    1. Deparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie in 100% Xylol für 15 min eintauchen; Ändere es zu frischen 100% Xylol für weitere 15 min.
    2. Rehydrieren Sie die Folien, indem Sie sie durch die folgende Reihe von abgestuftem Ethanol tauchen, bis die Flüssigkeit sauber von den Folien läuft. Für jede Lösung tauchen 8-10 mal ein, 2 s pro Dip: 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, 50% Ethanol, 30% Ethanol und entionisiertes Wasser.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, und die Dias können bei RT in Wasser für mehrere Stunden gelassen werden. Bei Bedarf können die Objektträger bei 4 ° C in Wasser O / N gelagert werden.
    3. Legen Sie die Folien in 100% gefilterten Harris Hämatoxylin für 4 min. Sofort mit dem entionisierten Wasser in den Behälter zurückführen. Führe entionisiertes Wasser in tEr hintere Ecke des Containers am weitesten von den Abschnitten entfernt. Leeren Sie den Behälter regelmäßig, bis das Wasser nicht mehr lila ist.
      HINWEIS: Lassen Sie das Wasser nicht direkt auf die Rutschen laufen, da die Abschnitte von den Rutschen kommen können.
    4. Überprüfen Sie schnell die Hämatoxylin-Intensität auf einem Seziermikroskop mit Schwanenhals-Lichter; Lassen Sie die Dias nicht trocknen. Wenn der Fleck die gewünschte Intensität erreicht hat, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn die Farbe nicht dunkel genug ist, legen Sie die Objektträger in 100% Hämatoxylin für 1 min und wiederholen Sie die Wasserwäsche, bevor Sie erneut überprüfen.
      HINWEIS: Das Hämatoxylin muss dunkel genug sein, damit die Farbe während der Eosinfärbung nicht verloren geht. Wenn jedoch eine Hämatoxylin-Färbung im Zytoplasma zu sehen ist, sind die Abschnitte überfärbt.
    5. Tauchen Sie die Folien zweimal in 0,05% HCl und übertragen Sie sie sofort mit sauberem deionisiertem Wasser in den Behälter. Leeren Sie das Wasser und füllen Sie den Behälter zweimal mit Wasser auf.
    6. Übertragen Sie die Folien auf 95% etHanol für 30 s und übertrage sie dann 30 s mit 95% igem Ethanol in einen neuen Behälter.
    7. Legen Sie die Folien in die Eosin Y-Phloxin B-Lösung für 2 min. Übertragen Sie die Folien zurück in den vorherigen 95% Ethanol-Behälter und überprüfen Sie schnell die Intensität der Farbe unter dem Seziermikroskop. Wenn die Färbung ausreichend ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn nicht, kehren Sie zur eosin-Lösung für 30 s zurück, überprüfen Sie erneut und wiederholen Sie, wenn nötig.
      HINWEIS: Ausreichende Eosin-Färbung ist hellrosa und erscheint im Gegensatz zum Hämatoxylin-Fleck. Achten Sie darauf, jede Lösung von der Rückseite der Folien zu wischen, wenn Sie unter dem Mikroskop überprüfen, so dass keine falsche Farbe beobachtet wird. Weil Eosin aus 95% Ethanol besteht, können längere Zeiträume in 95% Ethanol bei der Überprüfung der Farbintensität etwas aus der Farbe auslaugen.
    8. Übertragen Sie die Objektträger auf 15% Isopropanol für 15 s. Ersetzen Sie mit frischem 100% Isopropanol und legen Sie die Folien für weitere 15 s wieder in das Isopropanol. Wiederholen Sie diese pFür insgesamt 6 Isopropanol-Waschungen.
      ACHTUNG: Isopropanol ist ein Augen- und Atemreizmittel. Achten Sie stets darauf, dass Sie geeignete Schutzausrüstung tragen und Spritzwasser vermeiden. Es ist auch leicht entflammbar und sollte entsprechend gelagert und gehandhabt werden.
      HINWEIS: Um Reagenzien zu sparen, verwerfe nur die erste (rosaeste) Isopropanolwäsche. Halten Sie die anderen fünf Waschlösungen in den Flaschen 1 bis 5, um für die nächste Färbung wiederverwendet zu werden. Bei der Wiederverwendung von Waschungen beginnen Sie mit der Flasche mit der Nummer "1" und verwerfen nach Gebrauch. Sobald die Wäsche "2" verwendet wurde, gießen Sie sie in die Flasche "1" und so weiter. Die endgültige Wäsche sollte immer frisches Isopropanol sein.
    9. Legen Sie die Objektträger in 100% Xylol für 3 min. Entfernen Sie eine Folie zu einer Zeit und legen Sie ein Deckglas.
      1. Fügen Sie ausreichend Befestigungsmedium hinzu, um die Abschnitte zu bedecken und tauchen Sie sie in 100% Xylol ein.
        HINWEIS: Dieser Schritt wird die Oberfläche des Montagemediums glätten und Blasen entfernen.
      2. Trage ein Deckglas anAuf der Unterseite der Rutsche.
        HINWEIS: Das Montagemedium sollte den Schlitten in Position bringen. Wenn das Deckglas nicht gerade oder vollständig sitzt, klopfen Sie es vorsichtig ein.
      3. Blättern Sie ein überschüssiges Montagemedium auf ein Papiertuch, bis nur eine dünne Linie gesehen wird. Tauchen Sie ein Gewebe in das Xylol ein und wischen Sie die Rückseite des Objektträgers, um jedes Medium zu entfernen, das getropft ist. Legen Sie die Folie flach auf eine stabile, aber mobile Oberfläche, wie ein Stück Karton. Deckel alle restlichen Folien in der gleichen Weise. Lassen Sie das Xylol 10 Minuten lang in der Kapuze verdampfen.
        HINWEIS: Alle mit Xylol verunreinigten Materialien sollten in einem verschlossenen Behälter in der Haube entfernt und entsorgt werden, um zu verhindern, dass Dämpfe entweichen.
    10. Lassen Sie das Montagemedium bei RT O / N aushärten.

    6. Bildgebung und Lagerung von gefärbten Dias

    1. Bildabschnitte auf einem zusammengesetzten invertierten Mikroskop 18 .
      HINWEIS: Folien können im Raum gehalten werdenFalsch unbegrenzt

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Representative Results

10% gepuffertes Formalin und 4% Paraformaldehyd (PFA) sind zwei der häufigsten Fixiermittel, die für histologische Praktiken verwendet werden. Allerdings geben sie keine optimalen Fixationsergebnisse für Zebrafisch-Lebergewebe (Abbildung 1 und Tabelle 1 ). Die Fixierung mit 10% Formalin oder 4% PFA führt oft zu Schrumpfungen, wodurch große Lücken zwischen der Leber und den umgebenden Geweben entstehen (Abbildung 1A , B , Abbildung 1B zeigt ein Beispiel für die Gewebeschrumpfung). Teile des Lebergewebes können auch aus dem Abschnitt herausfallen. Das Cytoplasma der Hepatozyten ist oft verloren (Abbildung 1A , 1B ). Beide Fixiermittel können eine Verzerrung der Hepatozyten verursachen, da sie entweder schrumpfen oder quellen und nicht mehr die für Epithelzellen charakteristische säulenförmige Morphologie aufrechterhalten. Ein weiteres Problem mit der PFA-Fixierung istDass es Zwischenräume zwischen den Hepatozyten gibt, die nicht real sind, was dazu führt, dass das Gewebe gebrochen aussieht (Abbildung 1B ). Weiterhin werden, wenn eines dieser beiden Fixiermittel verwendet wird, die Hepatozyten gut mit Hämatoxylin gefärbt, aber weniger mit Eosin (Abbildung 1A ). Das Säure-basierte Dietrich-Fixiermittel überwindet die Probleme mit den Formalin- und PFA-Fixiermitteln (Abbildung 1C ).

Bei der menschlichen ALD ist die Steatose, die aus kleinem und großem Tröpfchenfett besteht, in der Nähe der zentralen Vene am deutlichsten und erstreckt sich mit zunehmender Schwere nach außen in Richtung der Portaltriade. Bei Zebrafisch induziert die Behandlung mit 2% Ethanol von 96-120 hpf auch eine hepatische Steatose, die durch die übermäßige Ablagerung von runden Tröpfchen in den Hepatozyten verglichen wird (Abbildung 2B , Pfeile). Allerdings sind die Tröpfchen nicht ausgestelltTa ähnliches Verteilungsmuster, wie es in menschlicher ALD zu sehen ist, weil es keine klare Unterscheidung von Portal und zentralen Venen in der Zebrafischleber 23 gibt . Die hepatischen Blutgefäße in der mit Ethanol behandelten Larvenleber sind im Vergleich zu denen in der Kontrollleber geschwollen (Abbildung 2B , Sternchen).

Abbildung 1
Abbildung 1 : Vergleiche von H & E-Färbung in den Lebern der Zebrafisch-Larven, die mit verschiedenen Fixativen bei 120 hpf fixiert wurden ( A ) 10% Formalin bei RT O / N; ( B ) 4% PFA bei 4 ° CO / N; ( C ) Dietrichs Fixiermittel bei RT für 24 h. Mit 10% Formalin verlieren die Hepatozyten oft ihr Cytoplasma (A). Das Gewebe ist nicht richtig mit Eosin gefärbt und erscheint lila. Nach fixaMit 4% PFA, Lücken zwischen den Hepatozyten (B) gesehen werden. 4% PFA veranlaßt das Lebergewebe zu schrumpfen, so scheint es eine große Lücke zwischen der Leber und dem umliegenden Gewebe zu geben. Die gestrichelte Linie in B markiert die Grenze der umliegenden Gewebe. Dietrichs Fixiermittel liefert das optimale Ergebnis unter den drei (C). Maßstab = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 : Akute Ethanolbehandlung Ursachen Hepatische Steatose und Blutgefäß Schwellung in Zebrafisch Larval Leber. ( A ) H & E-Färbung der Leber in einer kontrollierten, unbehandelten WT-Larve. ( B ) H & E-Färbung der Leber in einer Larven, die mit 2% Etha behandelt wurdeNol von 96 - 120 hpf. Beide Tiere wurden mit Dietrichs Fixiermittel bei 120 hpf fixiert. Pfeile in (B) zeigen auf die Hepatozyten mit übermäßiger Ablagerung von runden Tröpfchen. Sternchen markieren die geschwollenen Leberblutgefäße. Maßstab = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

10% Formalin 4% PFA Dietrichs Fixiermittel
Fixierungsbedingung Mindestens 24 h bei RT 3 h bei RT oder O / N bei 4 ° C Mindestens 24 h bei RT
Sample Storage Post Fixierung Unbestimmt bei RT Bis zu 2 Wochen bei 4 ° C Bis zu 2 Monate bei RT
CompatibMit genomischer DNA-Extraktion Ja Ja Nein
Schrumpfen Ja Ja Minimum
Verzerrung der Zellen Ja Ja Minimum
Verlust der zellulären Details Ja Bescheiden Minimum
Ausgeglichener H & E-Fleck Schwacher Eosinfleck Schwacher Eosinfleck Ja
Kompatibilität mit Immunhistochemie Ja Ja Ja

Tabelle 1: Vergleiche von 10% Formalin, 4% PFA und Dietrichs Fixativen für Zebrafisch-Leberhistologie.

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Discussion

Das aktuelle Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur akuten Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und die nachfolgenden histopathologischen Analysen mit H & E-Färbung. Eine akute Ethanolbehandlung sollte nicht früher als 96 h nach der Befruchtung durchgeführt werden, da dies die Stufe ist, in der die Zebrafisch-Leber beginnt, alkohol-metabolisierende Enzyme auszudrücken 13 . 2% Ethanol ist die maximale Dosis, die Larven 13 , 14 tolerieren können. Die mit Ethanol behandelten Larven beginnen, eine hepatische Steatose um 8 h Behandlung zu zeigen, und die Prozentsätze der Larven, die die Steatose entwickeln, steigen weiter bis 24 h kontinuierliche Behandlung 14 . Zebrafisch-Larven absorbieren Nährstoffe ausschliesslich aus dem Eigelb bis 120 hpf. Daher wird eine Ethanolbehandlung über 120 hpf nicht empfohlen, da das Fasten auch zur Steatose beitragen kann 14 . Im Vergleich zu Protokollen, die von anderen Labors veröffentlicht wurdenOratorien 13 , 24 ist die Hauptänderung des aktuellen Protokolls, dass die Ethanolbehandlung in einer Fischanlage durchgeführt wird, die einen 14 h Licht / 10 h dunklen Zyklus aufweist. Dies führt zu konsistenteren und robusteren stototischen Reaktionen als die, die bei der Behandlung im Dunkeln in einem Inkubator auftreten. Dies kann mit der Tatsache zusammenhängen, dass die Lipid-metabolischen Gene in der Zebrafisch-Leber eine tägliche Rhythmus-Expression als Reaktion auf den Hell-Dunkel-Zyklus zeigen.

ALD ist eine chronische Krankheit und nimmt Jahre des Alkoholmissbrauchs. Die kritische Begrenzung des aktuellen Ethanol-Behandlungsprotokolls besteht darin, dass es nur die akuten Wirkungen von Alkohol auf die Leber auslöst. Die Behandlung mit einer so hohen Ethanolkonzentration für mehr als 48 h verursacht eine hohe Mortalität und verhindert das Studium der chronischen Leberverletzung. Eine aktuelle Studie ergab, dass kontinuierliche Behandlung von adulten Zebrafisch mit 1% Ethanol für bis zu dreiMonate führte zu Steatose, Steatohepatitis und Fibrose 12 . Eine vielversprechende zukünftige Richtung könnte sein, einen potenziellen Modulator von ALD mit dem akuten Ethanol-Behandlungsprotokoll zu identifizieren und dann seine Wirkung im chronischen Verletzungsmodell zu validieren.

H & E-Färbung wird durchgeführt, um die hepatozellulären Schäden zu bewerten, die durch akute Ethanolbehandlung induziert werden. Aufgrund der Leichtigkeit der Durchführung der Fluoreszenz-Bildgebung in Zebrafisch wird die H & E-Färbung nicht routinemäßig in der Zebrafisch-Leber-Histologie verwendet, und das Verfahren ist weniger gut beschrieben. Das aktuelle Protokoll liefert eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der H & E-Färbung in der Larvenleber. Die Wahl des richtigen Fixiermittels ist der erste und wichtigste Schritt für die H & E-Färbung. Obwohl 10% gepuffertes Formalin und 4% PFA häufig in der Histologie verwendet werden, verursachen sie beide Gewebeschrumpfungen und Teile der Leber, die aus dem Abschnitt herausfallen. 10% Formalin-Fixierung führt zum Verlust des Zytoplasmas im HepatOcytes 4% PFA-Fixierung führt zu künstlichen Lücken zwischen den Hepatozyten. Eosin-Färbung scheint viel schwächer zu sein als Hämatoxylin-Färbung in den Lebern, die mit entweder fixativ fixiert sind. Das Säure-basierte Dietrich-Fixiermittel eignet sich eher für die H & E-Färbung der Zebrafisch-Leber, da es zelluläre Details bewahrt und die Schrumpfung minimiert. Es scheint auch, Fettgewebe, wie die Leber, schneller als Formalin und PFA zu durchdringen. Die Färbung mit Hämatoxylin und Eosin ist ausgeglichener. Ein Vorbehalt von Dietrichs Fixiermittel ist, dass es für die genomische DNA-Extraktion nicht kompatibel ist. In einem Versuchsexperiment wurde genomische DNA aus den Larven extrahiert, die mit 10% Formalin, 4% PFA oder Dietrichs Fixiermittel 26 fixiert wurden. Die Larven wurden in 50 & mgr; l 50 mM NaOH bei 95 ° C für 20 min inkubiert und dann auf 4 ° C abgekühlt. Dann wurden 5 & mgr; l 1 M Tris-HCl, pH 8,0, zugegeben, um die basische Lösung zu neutralisieren. Nach einer kurzen Zentrifugation wurde der Überstand wWie in der PCR verwendet. Mit den gleichen PCR-Primern und dem PCR-Programm lieferte die genomische DNA sowohl der Formalin- als auch der PFA-fixierten Larven PCR-Produkte mit den vorhergesagten Größen, während die genomische DNA aus den Fixier-fixierten Larven von Dietrich keine PCR-Produkte lieferte.

H & E-Färbung kann sowohl an Paraffinabschnitten als auch an gefrorenen Abschnitten durchgeführt werden. Allerdings haben Paraffinabschnitte die folgenden Vorteile gegenüber eingefrorenen Abschnitten: 1) Während Paraffinschnitte bei Raumtemperatur unbegrenzt gelagert werden können, können gefrorene Abschnitte nur bei -80 ° C bis zu einem Jahr gelagert werden. 2) Für gefrorene Abschnitte kann die Bildung von Eiskristallen innerhalb der Zellen die Zellmorphologie und das subzelluläre Detail stören. Darüber hinaus sind gefrorene Abschnitte oft dicker als Paraffinschnitte. Dies kann zu schlechten Bildern der Gewebemorphologie führen, verglichen mit denen, die aus Paraffinschnitten hergestellt werden.

Bei der Herstellung von Paraffinblöcken für Lebergewebe, das aktuelle ProtokollBetont die Larven in Agarose. Die Larven sind seitlich positioniert, wobei die linke Seite des Körpers nach unten zeigt und flach gegen den Boden der Form liegt. Dies sorgt für die gleichbleibende Orientierung der Leber, so dass, wenn Abschnitte nacheinander geschnitten werden, äquivalente Bereiche der Leber von Fisch zu Fisch verglichen werden können 27 . Ein weiterer wichtiger Schritt, der eine erfolgreiche H & E-Färbung sicherstellt, ist die Farbentwicklung. Es ist entscheidend, die Färbung häufig zu überprüfen, bis die gewünschte Farbintensität erreicht ist.

H & E-Färbung sollte verwendet werden, um eine vorläufige Beurteilung der Leberverletzung zu erhalten. Die mit Ethanol behandelten Larven zeigen eine übermäßige Ablagerung von runden Tröpfchen in den Hepatozyten, was auf die Steatose 13 , 14 , 18 hindeutet. Die Markierung mit Lipidfarbstoffen, wie Ölrot O und Nilrot, ist notwendig, um zu bestätigen, dass diese Tröpfchen tatsächlich Lipide sind. Das Leberblut istEls in den behandelten Tieren erscheinen erweitert und geschwollen. Rasterelektronenmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sollten durchgeführt werden, um die ultrastrukturellen Veränderungen in den Sinusoiden zu untersuchen. Es wurde bereits berichtet, dass die extrazelluläre Matrixproteinablagerung in der mit Ethanol behandelten Zebrafisch-Leber erhöht ist, wie durch Immunfluoreszenz 18 nachgewiesen wird. Angesichts der Tatsache, dass die Expressionsniveaus von fibrogenen Genen nur bescheiden in den behandelten Fischen 18 erhöht sind, kann H & E nicht empfindlich genug sein, um eine solche kleine Menge an extrazellulären Matrixproteinen zu detektieren. Die gleichen Fixier- und Färbemethoden wurden an den chronisch verletzten adulten Zebrafischlebern getestet und waren ausreichend für die Erkennung von Fibrose (Yin, unveröffentlichte Daten).

Obwohl das aktuelle Protokoll auf die Untersuchung der Leberhistologie in Zebrafisch-Larven abgestimmt ist, hat es eine breitere Anwendung auf die Zebrafisch-Forschungsgemeinschaft, wie die samE-Protokoll kann auf andere Gewebe und auf adulte Zebrafisch angewendet werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Dr. Katy Murray im Zebrafish International Resource Center anerkennen; Dr. Stacey Huppert und Kari Huppert bei CCHMC, für ihre hilfreiche Beratung zum Protokoll; Und CCHMC Veterinärdienst, für die Fischpflege. Diese Arbeit wurde von NIH Grant R00AA020514 und einem Forschungsstipendium vom Zentrum für pädiatrische Genomik bei CCHMC (nach CY) unterstützt. Es wurde auch teilweise unterstützt von NIH grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) der Verdauungsstudie Research Core Center in Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

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References

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