طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

حبيبات الإجهاد (سغس) هي الهياكل السيتوبلازمية غير الغشائية التي تشكل في الخلايا المعرضة لمجموعة متنوعة من الضغوط. سغس تحتوي على مرناس، والبروتينات ملزم رنا، الوحدات الفرعية الريباسي الصغيرة، العوامل المرتبطة الترجمة، والبروتينات خلية إشارة مختلفة. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يستخدم العديد من النهج التجريبية للكشف عن، وتحديد، وتحديد الكميات سغس حسن النية .

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وغالبا ما تتحدى الخلايا التغيرات البيئية المفاجئة. حبيبات الإجهاد (سغس)، المجمعات ريبونوكلوبروتين السيتوبلازمية التي تشكل في الخلايا المعرضة لظروف الإجهاد، متورطة في جوانب مختلفة من استقلاب الخلية والبقاء على قيد الحياة. تقوم سغس بتعديل مسارات الإشارات الخلوية، التعبير الجيني بعد النسخي، وبرامج الاستجابة للإجهاد. تشكيل هذه الحبيبات التي تحتوي على مرنا يرتبط مباشرة إلى الترجمة الخلوية. يتم تشغيل الجمعية سغ من قبل بدء الترجمة المثبطة، ويتم تشجيع التفكيك سغ عن طريق تفعيل الترجمة أو عن طريق استطالة الترجمة المثبطة. ويبرز تكوين لجنة الدراسات هذه العلاقة. مكونات سغ الأساسية توقفت مجمعات ما قبل البدء في الترجمة، مرنا، والبروتينات ملزمة رنا مختارة (ربس). والغرض من الجمعية سغ هو الحفاظ على الطاقة الخلوية عن طريق عزل مرناس التدبير المنزلي المتوقفة ترانزلاتيونالي، مما يسمح للترجمة المحسنة للبروتينات تستجيب للضغط. في أديتيعلى المكونات الأساسية، مثل المجمعات الترجمة الأولية المتوقفة، سغس تحتوي على عدد كبير من البروتينات الأخرى وجزيئات الإشارة. العيوب في تشكيل سغ يمكن أن يضعف التكيف الخلوي إلى الإجهاد، وبالتالي يمكن أن تعزز موت الخلايا. وقد ربطت سغس والحبيبات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مماثلة لعدد من الأمراض البشرية، بما في ذلك الاضطرابات العصبية والسرطان، مما أدى إلى الاهتمام الأخير في تصنيف وتعريف الأنواع الفرعية الحبيبية الحمض النووي الريبي. يصف هذا البروتوكول فحوصات لتوصيف وتحديد سغس الثدييات.

Introduction

الخلايا توظف العديد من الآليات للرد على الإجهاد. تحدث بعض الردود على مستوى ما بعد النسخي وتشمل تنظيم ترجمة مرنا و / أو الاستقرار 1 ، 2 . يرتبط ترانزلاتد مرنا اعتقال متعدية وتدهور مع تشكيل بؤر الخلوية غير الغشائية محددة، والأكثر تميزا كونها حبيبات الإجهاد (سغس) 3 . سغس هي البؤر السيتوبلازمية التي تركز ترانزلاتس نونترانزلاتينغ في ترانزلاتيونالي-القبض على خلايا الاستجابة للضغط (على سبيل المثال، الأكسدة، صدمة الحرارة، المغاعة المغذية، والعدوى الفيروسية) 4 . بالإضافة إلى مرناس نونترانزلاتينغ، سغس تحتوي على عوامل بدء الترجمة، والبروتينات ملزمة رنا، والبروتينات التشوير المختلفة 5 . سغس هي المؤشرات الحيوية لترجمة البروتين تحولت وتغيير الأيض رنا وتم ربطها إلى بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج، مسار إشارةs، والعمليات النووية 5 .

سغس هي الكيانات الحيوية، وتشكيلها يرتبط ارتباطا وثيقا بحالة الترجمة الخلوية 6 . على الرغم من مظهرها على ما يبدو الصلبة، معظم مكونات البروتين سغ المكوك بسرعة داخل وخارج، مع وقت الإقامة ثانية. في حين تستمر سغس لمدة دقائق إلى ساعات، معظم مكوناتها في التدفق السريع. تثبيط بدء الترجمة وما يترتب على ذلك من تفكيك بوليسوميس ترجمة تعزيز تشكيل لجان الدراسات؛ وبالتالي، سغس هي في حالة توازن مع ترجمة بوليسوميس. هذا التوازن بوليسوم / سغ هو المفتاح لتمييز سغس حسن النية من غيرها من بؤر التوتر الناجم 6 ، 7 .

ويستتبع توقيف بدء الترجمة تحويل مجمعات ما قبل الشروع في الترجمة المؤهلة التي تحتوي على مرنا، وعوامل بدء الترجمة (إيف)، و 40 S وحدات فرعية ريبوسومية س يسمى المجمعات 48S) في المجمعات المتوقفة ترانزلاتيونالي (ما يسمى 48S * المجمعات) التي يمكن أن تتجمع في سغس 4 ، 6 . يتم تشجيع سغس عن طريق الاعتقال متعدية في خطوتين مختلفتين المنبع من تشكيل 48S معقدة: التدخل مع وظائف مجمع EIF4F ملزمة ملزمة (على سبيل المثال، استهداف الوحدة الفرعية eIF4A) أو فسفرة من وحدة α من عامل بدء الترجمة eIF2، بوساطة واحدة أو أكثر من كيناسيس eIF2 الأربعة. وجود المجمعات 48S المتوقفة ( أي 40S الوحدات الفرعية الريباسي وعوامل بدء الترجمة المختارة) هي سمة من سغس 8 ، 9 .

وقد تم ربط سغس إلى حالات المرضية المختلفة، مثل العدوى الفيروسية، التنكس العصبي، المناعة الذاتية، والسرطان 3 ، 10 ، 11 ،سس = "كريف"> 12 ، 13 . وترتبط أشكال متغيرة من العديد من مكونات سغ مع الأمراض العصبية التناسلية (على سبيل المثال، التصلب الجانبي الضموري) التي الخلايا العصبية عرض الإدخالات المرضية داخل الخلايا التي قد تلعب أدوارا نشطة في وفاة الخلايا العصبية 13 . بعض الفيروسات خطف مكونات سغ لتمنع تشكيل سغ وتعزيز تكاثر الفيروس 14 . وتربط الدراسات الحديثة أيضا بين سغس والسرطان 15 وبقاء الخلايا السرطانية تحت العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي 10 و 16 و 17 و 18 و 19 و 20 . في حين أن هذه النتائج قد أثارت اهتماما كبيرا في علم الأحياء سغ، العديد من التقارير المنشورة تفتقر إلى ضوابط هامة للتمييز بين تشكيل لجان الدراسات النية الحسنة من بؤر أخرى الناجم عن الإجهاد.

وقد وصفت سغس في البداية على أنها بؤر السيتوبلازمية غير الغشائية تتألف من البروتينات مرنا ملزم مختارة (ربس)، بما في ذلك مستضد الخلايا التائية الخلايا التائية 1 (تيا-1) والبولي ملزم A- البروتين (باب). عوامل بدء الترجمة؛ مرنا بوليادينيلاتد؛ ووحدات صغيرة ريبوسومية 4 ، 6 ، 21 ، 22 . تقليديا، وقد تم تحديد تكوينها من خلال تقنيات مثل إمونوستينينغ والتعبير خارج الرحم من البروتينات الموسومة فلورزنتلي 23 ، 24 . نظرا لطبيعة دينامية للغاية، و إمونولوكاليزاشيون من البروتينات سغ و / أو مرناس لا تزال منهجية تحديد للكشف عن سغس 23 ، 24 . حتى الآن، يتم وصف العديد من الممارسات التجارية التقييدية والبروتينات الأخرى (أكثر من 120 بروتينات متميزة) كمكونات سغ 11 . كما العديد من Sالبروتينات G محلية تغيير توطينها في كل من تعتمد على الإجهاد ومستقلة ويمكن أن تتراكم في مقصورات داخل الخلايا والبؤر الأخرى، فمن المهم اختيار علامات سغ الصحيح وتوظيف معايير وظيفية للتمييز سغس من أنواع أخرى من الإجهاد الناجم عن البؤر. تحتوي سغس حسن النية على مرنا، عوامل بدء الترجمة، وحدات فرعية ريبوسومية صغيرة وهي في توازن ديناميكي مع الترجمة.

تم تصميم هذا سير العمل البسيط لتحديد ما إذا كانت بؤر التوتر الناجم عن سغس حسن النية . ويشمل هذا العمل عدة نهج تجريبية باستخدام خلايا U2OS، والخلايا التي تستخدم عادة لدراسة لجان الدراسات. هذه الخلايا مثالية، كما أن لديها السيتوبلازم كبير، هي مسطحة نسبيا، ونعلق بقوة على كوفرسليبس الزجاج. أنواع الخلايا الأخرى يمكن استخدامها لدراسة سغس، ولكن من المهم أن ندرك أن الاختلافات في توقيت وتركيز الدواء، وفرة من البروتينات سغ نواة يمكن أن يغير حركية و كومبوsition. بالإضافة إلى ذلك، بعض الخلايا تستجيب لتثبيت بارافورمالدهيد من خلال تشكيل بقايا سطح الخلية، وإعطاء ثم مظهر تكدرت أن يسبب توطين منقط بعض علامات سغ. دون تحليل دقيق، وهذه يمكن أن تصنف على أنها سغس. وهذا يسلط الضوء على ضرورة تقييم جميع المعايير المطلوبة لتحديد البؤر التي يسببها التوتر كما سغس حسن النية . يستخدم فينورلبين (فرب)، والعلاج السرطان الذي يعزز سغس 20 ، فضلا عن أرسينايت الصوديوم (سا)، قوية ومميزة سغ محرض، كضغوط للتجارب في هذا البروتوكول.

سغس الكنسي تحتوي على علامات سغ متعددة (كل من البروتينات و مرناس) أن كولوكاليز في البؤر السيتوبلازم. يستخدم هذا البروتوكول على حد سواء المناعي والمضان في التهجين الموضعي (فيش) للكشف عن توطين علامات البروتين و مرنا بوليادينيلاتد 22 ، على التوالي. باختصار، المناعي غير المباشر يستخدم الأجسام المضادة ( ط.ه. الأجسام المضادة الأولية) محددة لبروتين معين للكشف عن ذلك داخل الخلية. ثم، الأجسام المضادة الثانوية (عادة الأنواع محددة) تعلق على فلوروكروميس التعرف على الأجسام المضادة الأولية وتكشف عن توطين البروتين المستهدف. يستخدم الفلورسنت المجهري للكشف عن إشارة مترجمة داخل الخلية. استخدام الأجسام المضادة المنتجة في أنواع مختلفة والكشف عنها مع الأجسام المضادة الثانوية الملونة بشكل مختلف يسمح للكشف عن كولوكاليزاتيون من الأجسام المضادة متعددة، مشيرا إلى أن أهداف البروتين وجدت في نفس الموقع 23 . من المهم تحديد علامات التي تم التحقق منها إلى كولوكاليز في سغس حسن النية .

يستخدم فيش مسبار المسمى أن قاعدة أزواج لتسلسل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي محددة 25 . للكشف عن مرنا، يستخدم هذا البروتوكول قليل البيروكسيديز (دت) 40 التحقيق التي تهجين (أو قاعدة أزواج) إلى ذيل بوليا من مرنا ( أي بوليا فيSH). ثم يتم الكشف عن التحقيق البيروكسيديز باستخدام ستريبتافيدين مترافق فلورزنتلي، كما ستريبتافيدين لديه تقارب عالية لالبيوتين. عند تقييم سغس، من المهم للزوجين بوليا فيش مع المناعي الكشف عن علامة سغ، كما هو الحال في سغس حسن النية ، يجب أن إشارات اثنين كولوكاليز.

باستخدام هذا البروتوكول، يتم تقييم كولوكاليزاشيون بطرق متعددة. في صورة متعددة القنوات ( أي رغب: الأحمر والأخضر والأزرق)، سوف كولوكاليزاتيون تغيير لون إشارة متداخلة (على سبيل المثال كولوكاليزد الأحمر والأخضر تظهر الصفراء) 23 . بالإضافة إلى ذلك، يتم قياس كولوكاليزاتيون بيانيا باستخدام تحليل المسح خط، حيث يتم قياس كثافة كل لون عبر خط معين 8 ، 20 . يصف هذا البروتوكول خطين إجراءات تحليل المسح الضوئي باستخدام إيماجيج 26 . إجراء واحد هو دليل ويذهب من خلال العملية برمتها، ويلو الآخر يستخدم ماكرو، أو برنامج بسيط أن أتمتة الخطوات اليدوية. من المهم أن تذهب من خلال البرنامج اليدوي لفهم الإجراء الكلي.

سغس تشكل في الخلايا حيث يتم قمع الترجمة؛ وبالتالي، يجب أن الخلايا مع سغس عرض مستويات منخفضة من الترجمة العالمية مقارنة مع الخلايا غير المعالجة. تجريبيا، يتم استخدام ريبوبوروميسلاتيون. ويضاف بوروميسين و إميتين إلى خلايا لفترة قصيرة قبل التثبيت، والسماح لل بوروميسين لدمج في بولي ببتيدس تشكيل بنشاط، مما تسبب في إنهاء 27 ، 28 . العلاج مع إميتين مطلوب لمنع إعادة بدء 29 . يمكن بعد ذلك الكشف عن بوروميسين باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة بوروميسين، وإعطاء لقطة من الترجمة النشطة. يستخدم هذا الأسلوب لأنه سريع، لا يتطلب ما قبل الجوع مع وسط تفتقر إلى حمض أميني معين (ويحتمل أن تكون مسبقة الخلايا)، ويكشف عنالتوطين تحت الخلوية للترجمة البروتين. وقد استخدمت طرق أخرى، لا سيما باستخدام النظير الأحماض الأمينية المعدلة، مثل الميثيونين التناظرية L-أزيدوهوموالين (أها)، إلى جانب "كليك-إيت" الكيمياء 30 ، لإظهار أن الخلايا التي تحتوي على سغس تظهر ترجمة أقل بكثير من الخلايا المجاورة 31 . ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب جوعا ميثيونين تليها النبض العلامات لمدة 15-30 دقيقة. يشكل المجاعة ميثيونين ضغوطا إضافية، في حين أن الوقت الطويل وضع العلامات ( أي 15-30 دقيقة) يؤدي إلى قياس الترجمة التراكمية بدلا من الترجمة الجارية ويسمح أيضا البروتينات حديثا توليفها للانتقال من موقع تخليق إلى وجهتهم النهائية داخل خلية - زنزانة. في المقابل، ريبوبوروميسيلاتيون هو أسرع بكثير ومتوافق مع أي وسيلة، مثل المتوسطة الخالية من الجلوكوز المستخدمة للحث على سغس عن طريق المجاعة الجلوكوز.

سغس الكنسي هي في التوازن الديناميكيمع ترجمة نشطة بوليسوميس. ويمكن تقييم هذا تجريبيا من خلال علاج العينات مع الأدوية التي استقرار أو زعزعة بوليسوميس، وبالتالي تحريك التوازن بين سغس و بوليسوميس 23 . سيكلوهكسيميد (أو إميتين، الذي يتصرف على نحو مماثل) كتل استطالة عن طريق "تجميد" ريبوسوم على مرنا، وبالتالي تقليل مجموعة من مرنبس غير بوليسومال قادرة على تشكيل سغس. من الناحية التجريبية، يمكن استخدام ذلك بطريقتين: عن طريق إضافة سيكلوهيكسيميد (أو إميتين) قبل الإجهاد لمنع تشكيل سغ أو بإضافة سيكلوهيكسيميد (أو إميتين) بعد تشكيل سغس، حتى من دون إزالة عامل تشديد، مما تسبب في تفكيك سغ، كما توقف يتم إدخال مجمعات برينيتياتيون ببطء في جزء بوليسوم. في المقابل، بوروميسين يسبب إنهاء سابق لأوانه ويعزز التفكيك بوليسوم، وزيادة مجموعة من مرناس بدء قادرة على تجميع في سغس. من الناحية التجريبية، والعلاج بوروميسين يزيد من عدد سغس أو يخفض ثريشولد التي تشكل في استجابة للضغط متدرج أو جرعة الدواء. عند تقييم تأثير البوروميسين، فمن المهم استخدام مستوى دون الحد الأقصى للدواء من الفائدة، كما من المتوقع بوروميسين لزيادة تأثير الدواء وزيادة النسبة المئوية للخلايا عرض سغس - وهذا لا يمكن أن يحدث إذا كان الدواء / الإجهاد يسبب سغس في 100٪ من الخلايا في البداية. هذا يتناقض مع العلاج سيكلوهكسيميد، الذي يفكك سغس ويعمل بشكل أفضل عندما ~ 95٪ من الخلايا في البداية عرض سغس بحيث يمكن ملاحظة أكبر انخفاض ممكن وكمية بدقة.

يوفر هذا البروتوكول إطارا لدراسة سغس في خلايا الثدييات. وتشمل الطرق: (1) تلطيخ إمونوفلورزنت وتحليل إيماجيج لتقييم كولوكاليزاتيون الكلاسيكية سغ المرتبطة علامات eIF4G، eIF3b، و راس غتباز تفعيل البروتين ملزمة البروتين 1 (G3BP1) في سغس المفترضة. (2) أوليغو (دت) مضان في الموقع التهجين (بوليا فيش) للكشف عن مرنا بوليادنيلاتد. (3) سيكلوهيكسيميد والعلاج بوروميسين لتحديد ما إذا كان البؤر الناجم عن التوتر في التوازن الديناميكي مع بوليسوميس. و (4) ريبوبوروميلاتيون لتقييم الوضع متعدية من الخلايا التي تحتوي على سغس المفترض. معا، يمكن لهذه المقايسات تحديد ما إذا كان يمكن أن تصنف بؤر التوتر الناجم عن سغس حسن النية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلية

  1. إضافة كوفرسليبس تعقيمها إلى 12 بئرا من لوحة 24 جيدا، كما هو مبين في الشكل 1A . وهذا يمكن القيام به باستخدام ماصة باستير العقيمة تعلق على فراغ لالتقاط كل ساترة. اضغط بلطف ساترة على جانب البئر للافراج عن شفط، والسماح ساترة الوقوع في البئر.
  2. لوحة 1 × 10 5 U-2 أوس (U2OS) الخلايا العظمية لكل بئر في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر من المتوسط. نقل الجانب لوحة إلى الجانب وصعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أن الخلايا موزعة بالتساوي.
  3. اضغط بلطف كوفرسليبس أسفل مع طرف P1000 نظيفة لضمان أن ساترة هو في الجزء السفلي من البئر وأنه لا توجد فقاعات تحت ساترة.

2. تشديد الخلايا

  1. في اليوم التالي، والتحقق بصريا لوحة لضمان أن الخلايا موزعة بالتساوي ومتوازنة بالتساوي عبر ساترة، كما الاختلافات بين ساقد تؤثر على التأثيرات السلبية سلبا على استنساخ النتائج. استخدام هدف 10X على مقلوب ثقافة الأنسجة المجهر.
  2. سخن المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. تجنب استخدام وسائل الإعلام الباردة أو الساخنة إلى الخلايا، وهذه تسبب صدمة باردة أو صدمة الحرارة، على التوالي.
  3. تمييع المخدرات في وسائل الإعلام مسخن. لكل تركيز الدواء المختلفة، وإعداد 2 الآبار التي تحتوي على 500 ميكرولتر من المتوسط. إعداد 500 ميكرولتر إضافية للسماح للخسارة في حين بيبتينغ. قسامة 4 أنابيب، تحتوي كل منها 1.5 مل.
    1. لزرنيخ الصوديوم: إلى كل بئر تحتوي على 500 ميكرولتر، إضافة 1.5 ميكرولتر من 100 ملم زرنيخ الصوديوم (التركيز النهائي: 100 ميكرومتر) أو إضافة 0.75 ميكرولتر من 100 ملي زرنيت الصوديوم (التركيز النهائي: 50 ميكرومتر).
    2. ل فينورلبين: لكل بئر تحتوي على 500 ميكرولتر، إضافة 22.5 ميكرولتر من 10 ملم فينورلبين (التركيز النهائي: 150 ميكرومتر) أو إضافة 18.75 ميكرولتر من 10 ملم فينورلبين (التركيز النهائي: 100 ميكرومتر).
      ملاحظة: زرنيخ الصوديوم هو جيدا-- تتميز وتستخدم عادة الإجهاد الحبيبية المحرض، وبالتالي تستخدم بشكل كلاسيكي باعتبارها السيطرة الإيجابية.
  4. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام من الآبار B1 - 4 و C1 - 4. إضافة وسائل الإعلام مع الأدوية والانتظار لمدة 60 دقيقة (الشكل 1A).
    1. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة مع 100 ميكرومتر الزرنيخ الصوديوم لآبار B1 و B2. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط ​​مع 50 ميكرومتر الزرنيخ الصوديوم لآبار B3 و B4.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة مع 150 ميكرومتر فينورلبين لآبار C1 و C2. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط ​​مع 125 ميكرومتر فينورلبين لآبار C3 و C4.
  5. 30 دقيقة قبل التثبيت، وعلاج الآبار في العمود 2 مع 5 ميكرولتر من سيكلوهكسيميد (1 ملغ / مل الأسهم) والآبار في العمود 4 مع 2 ميكرولتر من البوروميسين (1.25 ملغ / مل الأسهم). بلطف الصخرة لوحة لخلط قبل وضع لوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية.

3. تثبيت الخلية ومناعي

نت "> قبل التجربة، تأكد من تبريد الميثانول إلى -20 درجة مئوية، وجعل المخازن المؤقتة، بما في ذلك الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، 5٪ مصل الحصان العادي (نهس) في برنامج تلفزيوني، و بارافورمالدهيد 4٪ (بفا ) في برنامج تلفزيوني.

  1. تجاهل وسائل الإعلام وغسل الآبار التي تحتوي على كوفرسليبس مع برنامج تلفزيوني. اعتمادا على الأدوية المستخدمة، قد يكون من المهم التخلص بشكل صحيح من الأدوية التي تحتوي على المخدرات. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تعليمات محددة. لغسل بكفاءة، وملء زجاجة الضغط مع برنامج تلفزيوني، وقطع الظهر غيض من أجل السماح لتدفق لطيف بدلا من تيار ضيق، واستخدام هذا لإضافة برنامج تلفزيوني إلى كل بئر بعد الشفط برنامج تلفزيوني الأصلي.
  2. إصلاح الخلايا باستخدام ~ 250 ميكرولتر من 4٪ بفا لمدة 15 دقيقة في رت تحت الإثارة لطيف. تغطية تماما الجزء العلوي من ساترة مع بفا. 250 ميكرولتر يجب أن تكون كافية، ولكن إذا لم يكن كذلك، إضافة أكثر من ذلك. تجنب دائما بيبتينغ مباشرة على كوفرسليبس، وبعض الخلايا (أو علاجات الإجهاد من الخلايا) يمكن تغيير المرفق، و tوقال انه قوة من بيبتينغ يمكن طرد الخلايا.
  3. إزالة بفا وتجاهل بشكل صحيح. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تفاصيل حول كيفية التخلص بشكل صحيح من بارافورمالدهيد.
  4. إضافة ~ 250 ميكرولتر من الميثانول (-20 درجة مئوية) واحتضان لمدة 5 دقائق في رت تحت هزاز لطيف، هذا على حد سواء بيرمابيليزس ويسطح الخلايا.
  5. إزالة وتجاهل الميثانول ومنع الخلايا عن طريق تطبيق ~ 250 ميكرولتر من 5٪ نهس لمدة 1 ساعة في رت O / N عند 4 درجات مئوية. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تفاصيل حول كيفية التخلص من الميثانول بشكل صحيح.
  6. للأجسام المضادة الأولية، وتمييع الأجسام المضادة في 5٪ نهس.
    ملاحظة: استخدام علامات سغ متعددة هو المفتاح للتأكد مما إذا كانت الحبيبات لاحظ هي سغس حسن النية . عدد علامات سغ التي يمكن استخدامها يعتمد على المرشحات المتاحة في المجهر. في حالة توفر مجموعات مرشح خضراء وأحمر وبعيدة حمراء، استخدم G3BP1 و eIF4G و eIF3b عند تخفيف 1/250.
  7. غسل الآبار 3X مع برنامج تلفزيوني، واحتضان كل غسل لمدة 5 دقائق.
  8. للأجسام المضادة الثانوية، وتمييع جميع الأجسام المضادة الثانوية (1/250 التخفيف) وصبغ هويشت (1 / 1،000 التخفيف) في 5٪ نهس.
    1. لهذه التجربة (12 كوفرسليبس في 250 ميكرولتر لكل توتال: 3 مل من 5٪ نهس)، إضافة 12 ميكرولتر من كل مما يلي: Cy2 ماوس، Cy3 الأرنب، و Cy5 الماعز (تخفيف 1/250 من كل ) وإضافة 3 ميكرولتر من هويشت صبغ.
    2. احتضان كوفرسليبس مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في رت. خلال هذا والخطوات التالية، وحماية العينات من الضوء من خلال تغطية لوحة مع مربع أو عن طريق وضع احباط على الجزء العلوي من طبق زراعة الأنسجة.
  9. غسل نحنيس ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  10. جبل كوفرسليبس على الشرائح الزجاج المسمى باستخدام تصاعد المتوسطة. تسخين وسط تصاعد في كتلة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وهذا يقلل من اللزوجة ويجعل من السهل ماصة. مع قطع طرف P200، ماصة 25 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة لكل ساترة على شريحة زجاجية. 4-8 كوفرسليبس يمكن أن يصلح على شريحة زجاجية واحدة، على افتراض أن مرحلة المجهر يسمح هذا. باستخدام ملقط غرامة، ونقل ساترة من البئر إلى الشريحة، والتأكد من وضع الجانب الخلية لأسفل على وسط تصاعد. باستخدام طرف P200 نظيفة، اضغط على ساترة أسفل.
  11. مرة واحدة وقد تم تركيب جميع كوفرسليبس، استخدام الأنسجة المخملية مطوية لتنظيف زيادة تصاعد المتوسطة عن طريق الضغط على الأنسجة المختبرية بقوة بقوة على الشريحة. استخدام زجاجة ضغط تحتوي على H 2 O لطرد قبالة متزايدة تصاعد المتوسطة ثم كرر النشاف مع الأنسجة المخملية مطوية لإزالة الماء.

4. فلورزنس في الموقع </ إم> التهجين (فيش)

  1. لوحة وعلاج الخلايا، وذلك باستخدام الخطوات 1 و 2.1-4 كدليل؛ فمن الضروري فقط لوحة الخلايا في العمود 1، كما هو مطلوب فقط 3 كوفرسليبس في التجربة التالية.
  2. تأكد من إعداد جميع المخازن المؤقتة ( أي 4٪ بفا في برنامج تلفزيوني، و 70٪ من الإيثانول في الماء، 2X المالحة الصوديوم سيترات (سك)، و 5٪ نهس)، أن يتم تبريد الميثانول إلى -20 درجة مئوية، يتم تسخين الفرن التهجين تصل إلى درجة الحرارة المناسبة.
  3. تنفيذ الخطوات 3.1-3.3 لغسل وإصلاح الخلايا.
  4. بيرمابيليز الخلايا عن طريق إضافة -20 درجة مئوية الميثانول لمدة 10 دقيقة.
  5. إزالة الميثانول واحتضان كوفرسليبس في الايثانول 70٪. وضع لوحة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ختم لوحة باستخدام بارافيلم لمنع التبخر.
  6. في اليوم التالي، وإزالة الإيثانول وترطيب الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من سك 2X. احتضان كوفرسليبس لمدة 5 دقائق مع التحريض لطيف في رت.
  7. إزالة 2X سك وإضافة 500ميكرولتر من 2X سك. احتضان لمدة 5 دقائق تحت الإثارة لطيف.
  8. وضع قطعة من شقة بارافيلم على الجزء السفلي من الفرن التهجين. ماصة 25 ميكرولتر من العازلة التهجين على بارافيلم لكل ساترة. إزالة ساترة من طبق 24-جيدا (في هذه المرحلة، كوفرسليبس هي من جانب الخلية حتى) ووضع ساترة جانب الخلية أسفل على المخزن المؤقت التهجين. القيام بذلك في 42 درجة مئوية أو اختياريا عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: إكمال هذه الخطوة عند 65 درجة مئوية سوف ينكر رنا الخلوية. وهذا يمكن تحسين إشارة إذا كان ملثمين بوليا من التفاعلات مع البروتينات.
  9. تمييع البيوتين-أوليغو (دت) التحقيق (100 نانوغرام / ميكرولتر) في العازلة التهجين لتركيز 2 نانوغرام / ميكرولتر. 25 ميكرولتر لكل ساترة كافية.
  10. لكل ساترة، ماصة 25 ميكرولتر من العازلة التهجين التي تحتوي على البيوتين أوليغو (دت) على بارافيلم. التقاط ساترة مع ملقط وتلمس بلطف حافة ساترة على الأنسجة المختبر لإزالة الزائدةالتهجين العازلة. نقل ساترة إلى المخزن المؤقت التهجين مع البيوتين أوليغو (دت). تذكر للحفاظ على الجانب الخلية إلى أسفل.
  11. وضع كوفرسليبس في مربع التهجين للحد من التبخر. احتضان كوفرسليبس مع البيوتين أوليغو (دت) في العازلة التهجين لمدة 60 دقيقة في 42 درجة مئوية.
  12. ضع 2X سك في الفرن التهجين للسماح لها أن يتوازن إلى 42 درجة مئوية.
  13. إضافة ~ 500 ميكرولتر من 2X سك تحسنت إلى الآبار في طبق 24-جيدا واستخدام ملقط لنقل كوفرسليبس إلى البئر. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  14. كرر خطوة غسل أعلاه مرتين في 42 درجة مئوية ثم مرتين في رت.
  15. الخطوات الكاملة 3.5-3.10، والتأكد من استخدام ستريبتافيدين فلوريكروم للكشف عن البيوتين أوليغو (دت) بدلا من الأجسام المضادة التقليدية واحد.

5. ريبوبوروميسلاتيون فحص لتقييم الوضع متعدية

  1. الخلايا U2OS لوحة على كوفرسليبس، كما هو مبين في الخطوة 1، ولكن لوحة فقط ساترة واحدة لكل حالة (في هذاحالة، 3 كوفرسليبس: غير المعالجة، 100 ميكرومتر أرسنيت الصوديوم، و 150 ميكرومتر فينورلبين) ( الشكل 1 A).
  2. خلايا الإجهاد باستخدام بروتوكول في الخطوة 2، واستكمال الخطوات 2.1-2.4.
  3. 5 دقائق قبل التثبيت، إضافة 2 ميكرولتر من البوروميسين (الأوراق المالية: 1.25 ملغ / مل، تمييع 2 ميكرولتر في 500 ميكرولتر للحصول على تركيز بوروميسين النهائي من 5 ميكروغرام / مل) و 2.9 ميكرولتر من إميتين (الأسهم: 20 ميكروغرام / مل، 2.9 ميكرولتر إلى نفس الحل تحتوي بالفعل على بوروميسين) إلى كل جيدا تحتوي على 0.5 مل.
  4. الخطوات الكاملة 3.1-3.10 كما هو مبين أعلاه، وذلك باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة بوروميسين (1/1000 التخفيف) للكشف عن بوروميسين. من الناحية المثالية، استخدم اثنين من علامات سغ أخرى في القنوات المتبقية.
  5. عند قياس إشارة بوروميسين، واتخاذ جميع الصور باستخدام نفس التعرض. اختيار هذا التعرض باستخدام ألمع (غير مضغوط) عينة وأخذ صورة كما مشرق ممكن دون التشبع.
    ملاحظة: شدة المضادة لل بوروميسين إشارة الفلورسنت ريبرزالترجمة المستمرة، كما بدائل بوروميسين للأحماض الأمينية، ويدمج في البروتين الوليد، ويفرض إنهاء سابق لأوانه من البروتين.

6. صورة الاستحواذ والتحليل

  1. تحديد حبيبات الإجهاد
    1. لتحديد سغس، والحصول على 3 - 5 صور مجموعها> 100 خلية لكل عينة باستخدام هدف 40X. بدلا من ذلك، الحصول على الصور باستخدام أهداف أخرى، ولكن تأكد من أن> 100 خلايا تحسب في ساترة وأن التكبير كبير بما فيه الكفاية لتصور بوضوح الحبيبات. القيام بذلك عن طريق قسمة ساترة في خمس مناطق متساوية تقريبا واختيار عشوائيا حقل من كل منطقة ( الشكل 1B ). يجب أن تتضمن صور المجال نفسه جميع القنوات لتقييم استقطاب العلامات.
    2. بمجرد الحصول على جميع الصور، دمج القنوات. بعض برامج الكاميرا سوف تفعل ذلك تلقائيا، في حين أن البعض الآخر يتطلب دمج يدوي. وهذا يمكن القيام به معإيماجيج عن طريق فتح جميع الصور ومن ثم تحديد [إيماج | اللون | دمج القنوات].
    3. يدويا عد العدد الإجمالي للخلايا عن طريق عد عدد من نوى، وذلك باستخدام هويشت كما نواة علامة. عد عدد الخلايا التي تحتوي على أكثر من سغس لكل خلية يدويا.
      ملاحظة: على سبيل المثال، باستخدام صورة ثلاث قنوات مدمجة تعرض G3BP1 (أخضر)، eIF4G (أحمر)، و هوشست (الأزرق)، عد النوى (أو عدد الخلايا) باستخدام القناة الزرقاء. ثم، عد الخلايا سغ إيجابية مثل تلك مع اثنين أو أكثر من بؤر صفراء في الخلية. سوف تظهر حبيبات الصفراء، والأخضر من G3BP1 والأحمر من eIF4G تظهر الأصفر إذا كولوكاليزد.
    4. تحديد النسبة المئوية للخلايا التي هي سغ إيجابية من خلال الجمع بين البيانات من 3-5 مناطق مستقلة ومن ثم حساب:
      عدد سغ إيجابية / عدد من نويات) * 100 = في المئة من الخلايا سغ إيجابية
  2. تقييم كولوكاليزاتيون من قبل تحليل خط المسح الضوئي - الطريقة اليدوية
    1. فتحيماغيج. تنزيل البرنامج مجانا من ()
    2. افتح مدير عائد الاستثمار: [أنليز | أدوات | مدير عائد الاستثمار ...].
    3. افتح الصورة المدمجة في إيماجيج: [ملف | فتح].
    4. باستخدام أداة الخط الموجودة في شريط الأدوات إيماجيج، إضافة سطر الذي يمر عبر سغ، والتأكد من تضمين قبل وبعد سغ. أضف هذا السطر إلى مدير عائد الاستثمار من خلال النقر على [إضافة] في نافذة مدير عائد الاستثمار.
    5. تقسيم الصورة المدمجة إلى قنوات منفصلة لتقييم توطين كل علامة إلى الحبيبية: [إيماج | اللون | سبليت تشانل]؛ سيؤدي هذا إلى تقسيم الصورة المدمجة إلى ثلاث صور بالأسود والأبيض.
    6. في الصورة بالأسود والأبيض، تأكد من تحديد الخط؛ يتم تحديد الخط إذا ظهر في الصورة. إن لم يكن، في نافذة مدير العائد على الاستثمار، انقر على الخط في لوحة. وهذا سوف تسليط الضوء على خط باللون الأزرق في نافذة مدير العائد على الاستثمار، وسوف تجعل خط مرئية على الصورة بالأسود والأبيض. إذا كان الخط لا يزال لا يظهر، تأكد من أن "إظهار الكل" هو تشفي مدير عائد الاستثمار ثم انقر على السطر الموجود في الصورة.
    7. تحليل شدة الخط: [تحليل | ملف المؤامرة]؛ وهذا سوف تبرز نافذة "المؤامرة الملف الشخصي"، الذي يرسم شدة الإشارة عبر الخط.
    8. ضمن نافذة "مؤامرة الملف الشخصي"، انقر على [قائمة]، التي تعرض نافذة تحتوي على البيانات الأولية من الرسم البياني. انسخ جميع البيانات في هذه النافذة والصقه في ملف جدول بيانات. للقيام بذلك، حدد كافة البيانات في النافذة: [إديت | اختر الكل]. انسخ التاريخ: [إديت | نسخ]. افتح ملف جدول بيانات والصق البيانات: [إديت | معجون].
    9. الخطوات الكاملة 6.2.6 - 6.2.8 لكل قناة على حدة. تأكد من تتبع القناة التي يتم تقييمها.
    10. في جدول بيانات، أنشئ رسم بياني خطي للنتائج. حدد الأعمدة التي تتضمن البيانات عن طريق الضغط على [كونترول] والنقر فوق الحرف الموجود أعلى كل عمود. ثم حدد الرسم البياني الخطي: [إنزيرت | خط الرسم البياني].
    11. كرر هذا التحليل لعدةإيبل حبيبات الإجهاد عبر تجارب مستقلة متعددة.
  3. تقييم كولوكاليزاتيون من قبل تحليل خط المسح الضوئي - إيماجيج البرنامج المساعد
    1. تحميل وتثبيت أداة الملف الشخصي رغب من موقع إيماجيج (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)؛ عند تثبيته بشكل صحيح، يجب أن يظهر رمز حمراء وأخضر وأزرق (رغب) في شريط الأدوات.
    2. فتح الصورة (على سبيل المثال، تيف، جبغ) في إيماجيج: [ملف | فتح].
    3. انقر على رمز رغب الموجود في شريط أدوات إيماجيج.
    4. انقر واسحب لإضافة سطر يمتد من خلال سغ، والتأكد من أن تشمل المناطق المجاورة؛ ستظهر صورة الرسم البياني في نافذة منبثقة.
    5. حفظ البيانات كصورة: [ملف | حفظ باسم | شجار]. بدلا من ذلك، تصدير ثم الرسم البياني البيانات في برنامج رسوم بيانية آخر باستخدام الخطوة 6.2.8 من أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البؤر الناجم عن الإجهاد ليست بالضرورة سغس. وتصنف سغس على أنها بؤر السيتوبلازمية التي تحتوي على مرناس، عوامل بدء الترجمة، والبروتينات ملزمة رنا وتكون في حالة توازن مع الترجمة النشطة. يمكن استخدام البروتوكول أعلاه كقالب لتوصيف ما إذا كان الإجهاد معين يدفع سغس حسن النية .

سغس كولوكاليز مع غيرها من علامات سغ المعروفة، بما في ذلك كل من البروتينات والمرنا. سا و فرب لحث البؤر السيتوبلازمية التي تحتوي على G3BP1، eIF4G، و eIF3b ( الشكل 2A ). يتم تأكيد كولوكاليزاتيون من هذه العلامات باستخدام تحليل مسح خط والصور قناة واحدة مع زيادة التكبير ( الشكل 2A ). بالإضافة إلى ذلك، هذه البؤر تحتوي على مرنا، كما هو مبين من قبل بوليا فيش، و أوليغو (دت) كولوكاليزس إشارة مع إشارة المناعي G3BP1 ( الشكل 2B ). فمن الأهمية بمكان أن تظهر أن بوليا-فيشإشارة تتداخل مع علامة سغ معروفة، كما يمكن أن الإجهاد تعزيز أنواع متعددة من بؤر.

تحدث سغس خلال حالة مثبطة ترانزلاتيونالي. كلا فرب و سا تعزيز الدولة قمعت ترانسلاتيونالي، كما تم تقييمها تجريبيا مع ريبوبوروميسلاتيون ( الشكل 3 ). الشركات ذات النوايا الحسنة هي في التوازن الديناميكي مع بوليسوميس ترجمة بنشاط. يتم حل SA- و فرب الناجم عن سغس مع تشك، الذي الفخاخ بوليسوميس على مرناس، وبالتالي وقف بوليسوم التفكيك ومنع سغس ( الشكل 4A، 4B ). وعلى العكس من ذلك، يتم تحفيز المزيد من سا و فرب سغس بعد العلاج مع البورو، كما بورو يعزز بوليسوم التفكيك، وبالتالي لصالح تشكيل سغ ( الشكل 4A، 4C ).

وباختصار، كما هو الحال مع سا السيطرة الإيجابية، فرب يدفع حسن النية سغس أن: (1) كولوكاليز مع علامات سغ المعروفة، (2) تشمل كلا من البروتين والمرنا (فيغو (3)، و (3) في الخلايا حيث يتم قمع الترجمة ( الشكل 3 )، و (4) في التوازن الديناميكي مع ترجمة نشطة ( الشكل 4A-4C ).

شكل 1
الشكل 1: المخططات التجريبية. ( A ) خلايا البذور على كوفرسليبس وضعت سابقا في لوحة 24 جيدا، كما هو مبين. علاج الصفوف A و B لمدة 60 دقيقة مع سا أو فرب باستخدام تركيز في ميكرومتر كما هو مبين. بعد 60 دقيقة، إضافة تشك (تركيز النهائي: 20 ميكروغرام / مل للعمود 2) أو بورو (20 ميكروغرام / مل بوروميسين للعمود 4) إلى المتوسطة التي تحتوي على المخدرات. مواصلة الحضانة لمدة 30 دقيقة إضافية قبل التثبيت وتلطيخ. ( ب ) الرسم البياني لساترة، مشيرا إلى الحقول التي ينبغي تصويرها للعد. وينقسم ساترة إلى خمس مناطق متساوية تقريبا. يتم التقاط صورة واحدة في كل منطقة."http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" تارجيت = "_ بلانك"> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: سا و فرب إقصاء البؤر السيتوبلازمية التي تحتوي على علامات سغ أنبولي (A) مرنا. ( A ) خلايا U2OS إمونوستيند ل G3BP1 (الأخضر)، eIF3b (الأحمر)، و eIF4G (الأزرق). تم علاج الخلايا مع 100 ميكرومتر سا أو 150 ميكرومتر فرب لمدة 60 دقيقة أو لم يعامل (السيطرة). يتم تكبير المناطق المميتة (2X) وعرضها كقنوات منفصلة باللونين الأسود والأبيض (أدناه). الرسم البياني يشير إلى تحليل مسح خط للمنطقة (الخط الأبيض) الحبيبية ويظهر مدى التداخل أو كولوكاليزاشيون. شريط مقياس يمثل 10 ميكرون. ( B ) بوليا فيش إلى جانب المناعية بالكشف عن مرنا بوليا مع قليل (دت) 40 التحقيق (الأحمر)، تم الكشف عن G3BP1 (الأخضر) باستخدام مكافحة G3BP، ويتم الكشف عن الحمض النووي النووي باستخدام هويشت صبغ (الأزرق). المناطق التكبير (2X)، صور قناة واحدة، وتحليل خط المسح تظهر كولوكاليزاشيون. شريط مقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: سا و فرب العلاج كوسيترانسلاتيون القمع. المناعي من خلايا U2OS النبض المسمى مع بوروميسين لمدة 5 دقائق بعد العلاجات المشار إليها. بوروميسين (الأخضر)، eIF3b (الأحمر)، والحمض النووي ملطخة هويشت (الأزرق). تم علاج الخلايا مع 100 ميكرومتر سا أو 150 ميكرومتر فرب لمدة 60 دقيقة أو لم يعامل (السيطرة). شريط مقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسأيون من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: سا و فرب إقصاء البؤر السيتوبلازمية التي هي في التوازن الديناميكي مع بوليسوميس. ( A ) مخطط عام يصف العلاقة بوليسوم / سغ. (بك) U2OS الخلايا الملون ل G3BP1 (الأخضر)، eIF3b (الأحمر)، والحمض النووي باستخدام هويشت (الأزرق). تم علاج الخلايا مع 100 ميكرومتر سا أو 150 ميكرومتر فرب لمدة 60 دقيقة أو لم يعامل (السيطرة) قبل إضافة ( B ) تشك (سيكلوهيكسيميد، 20 ميكروغرام / مل)، ( C ) البورو (بوروميسين، 10 ميكروغرام / مل )، أو أي إضافات لمدة 30 دقيقة إضافية من الحضانة. الأرقام تتوافق مع نسبة الخلايا مع سغس في تجربة تمثيلية. شريط مقياس = 25 ميكرون، في (قبل الميلاد). الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما يتضح من الدراسات المناعية في أمراض متعددة، والإجهاد المزمن يؤدي إلى تشكيل بؤر الخلايا المختلفة. على سبيل المثال، وتتميز معظم الأمراض العصبية من المجاميع داخل الخلايا من البروتينات غير قابلة للذوبان. وجود البروتينات المرتبطة سغ في مثل هذه المجاميع غالبا ما يكون الأساس لاستنتاج أن هذه البؤر هي سغس. يتم استخلاص استنتاج مماثل أيضا عند ملاحظة سغ بؤر سيتوبلازمية إيجابية في خلايا تعامل مع محفزات الإجهاد الجديدة. يوفر هذا البروتوكول سير عمل بسيط لتحديد سغس حسن النية .

ولا بد من استيفاء عدة معايير لتأكيدها على هذه اللجان، بما في ذلك توصيف كل من التكوين والديناميات. أولا، سغس هي البؤر السيتوبلازمية التي تحتوي على مرنبس ترانسلاتيونالي متوقفة. وبالتالي، فإن النهج الأول هو وصف تكوينها باستخدام اثنين من التقنيات المستندة إلى المجهري، وهي بوليا-فيش و إف. فيش هو وسيلة موثوقة البصريةإيز مرناس أن كولوكاليز مع سغس. ويستخدم قليل (دت) 40 التحقيق للكشف عن مرناس بوليادينيلاتد أن حزمة في سغس تحت ظروف الإجهاد. منذ قليل (دت) لن تكتشف مرناس ديديناتيلد، والتي هي المكونات الأساسية للهيئات المعالجة (بس)، وجود إشارة ضئيلة صغيرة (دت) في بؤر السيتوبلازمي هو مؤشر الأول (وإن لم يكن كافيا لتعريف) أن هذه البؤر هي لجان الدراسات. الاختبار الثاني هو إثبات كولوكاليزاتيون من إشارة بولي (A) مع علامات سغ أخرى (على سبيل المثال، G3BP1) ( الشكل 2A ). ويتم ذلك عن طريق أداء إف ضد البروتينات سغ علامة. وتستخدم علامات سغ eIF3b، eIF4G، و G3BP1 بشكل روتيني لأن eIF3b و eIF4G هي عوامل بدء الترجمة المعروفة لتكون مكونات 48S * المجمعات و G3BP1 مطلوب لتشكيل سغ ( الشكل 2B ). ومن المهم التأكيد على أن هناك حاجة إلى أكثر من علامة سغ واحدة، كما الضغوط المختلفة تجنيد مختلف العوامل المرتبطة سغ ل سغس، ويمكن لبعض الضغوط جأوس تجميع البروتين التي يمكن أن يكون مخطئا لتشكيل سغ.

ثانيا، تتشكل سغس بسبب تثبيط الترجمة. في حين يمكن الكشف عن تثبيط الترجمة من خلال نهج مختلفة (على سبيل المثال، من قبل التسمية التقليدية [ 35 S] مطاردة مطاردة)، ويفضل ريبوبوروميسلاتيون، كما أنه يكشف عن ترجمة البروتين المستمر في الخلايا المعالجة. هذه التقنية هي أيضا متوافقة مع المناعي القياسية ضد علامات سغ، مما يسمح للمراقبة في وقت واحد من سغس ودرجة تثبيط الترجمة في الخلايا الفردية. كما رأينا في الشكل 3 ، سا و فرب على حد سواء تعزيز تشكيل سغ لدرجات مختلفة. بينما سا يسبب سغس في ما يقرب من 100٪ من الخلايا، فرب يعزز تشكيل سغ في حوالي 75٪ من الخلايا. القدرة على تعزيز سغس يرتبط مع درجة تثبيط الترجمة: في حين أن الخلايا غير المعالجة لديها مستوى أساسي أساسي للترجمة، سا يمنع الترجمة تماما، ولكن فرب فقط سنويارتيالي يمنع الترجمة ( الشكل 3 ).

ثالثا، سغس دينامية وهي في حالة توازن مع ترجمة بوليسوميس. علاج الخلايا مع سيكلوهيكسيميد قبل الإجهاد أو بالتزامن مع الإجهاد يمنع بوليسوم التفكيك وتشكيل سغ. إن توازن سغ-بوليسوم ثنائي الاتجاه، كما أن الخلايا المعرضة ل سغس يمكن معالجتها باستخدام سيكلوهكسيميد لفرض تفكيك سغ عن طريق محاصرة مرناس في بوليسوميس أو مونوسوميس كلما بدأت بشكل منتج. السيطرة الهامة هي استخدام بوروميسين، الذي يمنع استطالة عن طريق تشجيع إنهاء سابق لأوانه، وبالتالي زيادة كمية مرنبس غير بوليسومال المتاحة لتشكيل سغ. ويلاحظ التغيرات الدرامية في سغس عندما يقترن سا أو فرب العلاج مع شك أو العلاج بورو ( الشكل 4 ). وبالتالي، فإن تقييم ما إذا كانت سغس المفترضة يتم حلها على العلاج سيكلوهيكسيميد ولكن يتم زيادة أو تتأثر بوروميسين هو المعلمة التجريبية الرئيسية لاستخدامها في سغ تعريف الكاتيون. وقد أثبتت بنجاح التفكيك سغ إميتين في خلايا صغيرة جدا، غير ملتصقة، الأولية نخاع العظم CD34 + الخلايا من خلال علاج الخلايا في تعليق قبل سيتوسبينينغ 32 .

ويستخدم على نطاق واسع الزرنيخ الصوديوم لتحريك سغس عن طريق حفز eIF2-α الفسفرة 33 ، ولكن ينبغي أن يكون معايرة بعناية ، لأنه يستهدف العديد من البروتينات وينشط عدد من مسارات الإشارات 34 ، 35 . خطوط الخلايا المختلفة يحمل درجات متفاوتة من الحساسية لزرنيخ الصوديوم. U2OS حساسة نسبيا (100 ميكرومتر)، في حين COS7، ميفس، و هيلا تتطلب 200 ميكرومتر. دو-145 6 ، الابتدائي الطبيعي نخاع العظام البشري خلايا CD34 + 32 ، الخلايا الليمفاوية البشرية 36 ، الخلايا العصبية الماوس القشرية 37 ، وخلايا Huh7 31 تتطلب 500-1،000 ميكرومتر.

أس = "jove_content"> كما أن تصنيف سغس هو أساسا المنهج القائم على المجهري، فمن المهم للحصول على صور منحازة، ذات جودة. من المهم التقاط الصور بطريقة غير منحازة، حيث أن اختيار المناطق التي لديها أعداد عالية أو منخفضة من لجان الدراسات يمكن أن تؤدي إلى تحريف النتائج. وتشمل الاعتبارات الأخرى التقاط الصور في كل قناة باستخدام نفس التعرض؛ وهذا يضمن أن أي تغييرات في كثافة عبر كوفرسليبس هي دلالة على التغييرات في تلك العلامة. بالإضافة إلى ذلك، تأخذ جميع الصور في مستويات غير المشبعة من شدة بحيث يمكن تقييم شدة عبر التجربة بأكملها. الحصول على جميع الصور في نفس اليوم باستخدام نفس المجهر / الكاميرا، والتغيرات في كثافة لمبة يمكن أن تختلف يوما بعد يوم وبين المجاهر. وأخيرا، من المهم للتحقق من المرشحات وإعدادات المجهر التي سيتم استخدامها لصورة الشرائح. تم تعيين هذا البروتوكول حتى للمجهر مع مجموعات تصفية تمكين التصور للأشعة فوق البنفسجية والأخضر والأحمر، والقنوات الحمراء البعيدة. قد تكون التعديلاتاللازمة لمختلف المجاهر.

سير العمل التجريبي الموصوفة هنا يسمح للكشف عن سغس في خلايا مختلفة وتحت الضغوط المختلفة. الميزة الرئيسية لهذا العمل هو أنه بسيط ويسمح للكشف لا لبس فيه من سغس حسن النية ، وكذلك للتحقق في وقت واحد من الترجمة الخلوية في الخلايا التي يعالج الإجهاد. يستخدم هذا البروتوكول خلايا U2OS، ولكن يمكن تعديلها لخطوط الخلايا المختلفة أو حتى للخلايا الأولية. وهناك قائمة حديثة وشاملة من الخلايا المستخدمة لدراسات الحبيبية الإجهاد هو استعراض 11 . وينبغي تعديل عدد الخلايا لتصل إلى 80٪ كونفلنسي في يوم العلاج من تعاطي المخدرات. وينبغي تعديل تركيز ومدة العلاج من تعاطي المخدرات أيضا، كما تستجيب الخلايا بشكل مختلف. بالإضافة إلى ذلك، في حين يتم تعيين هذا البروتوكول حتى لتنسيق 24 جيدا، ويمكن تعديلها إلى أي حجم لوحة أو طبق حيث كوفرسليبس (من أي حجم) يمكن وضع مسطحة خلال الطلاء والدواء علاجالإقليم الشمالي. وقد استخدمت خطوط الخلايا معربا بشكل ثابت سغ / ي علامات في الإنتاجية العالية، وشاشات القائم على سيرنا 33 والتصوير الخلية الحية 38 . تم استخدام الفحص القائم على الصورة باستخدام خلايا هيلا الملون ل سغ علامة علامة الذاتية الذاتية للكشف عن المركبات الكيميائية عرقلة سغ التجمع 39 . ومن المتوقع أن يكون هذا العمل مفيدا في الدراسات والتطبيقات المستقبلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ونشكر أعضاء مختبري إيفانوف وأندرسون على مناقشاتهما المفيدة وردود الفعل بشأن هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [GM111700 و CA168872 إلى السلطة الفلسطينية، NS094918 إلى بي]، والمركز الوطني للعلوم في بولندا [منحة أومو 2012/06 / M / NZ3 / 00054 إلى وس]. كما تعترف وزارة الصحة والتعليم العالي في بولندا (برنامج موبيليتي بلس) ولجنة فولبرايت البولندية الأمريكية لدعمهم المالي لبحوثه في الولايات المتحدة الأمريكية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20, (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11, (8), (2014).
  4. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  5. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38, (10), 494-506 (2013).
  6. Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151, (6), 1257-1268 (2000).
  7. Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43, (4), e26 (2015).
  8. Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212, (7), 845-860 (2016).
  9. Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215, (3), 313-323 (2016).
  10. Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849, (7), 861-870 (2015).
  11. Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).
  12. Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253, (1), 253-272 (2013).
  13. Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17, (91), 47-52 (2014).
  14. Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, (3), 317-331 (2013).
  15. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208, (7), 913-929 (2015).
  16. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. (2015).
  17. Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).
  18. Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18, (7), 2603-2618 (2007).
  19. Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5, (5), 429-441 (2004).
  20. Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7, (21), 30307-30322 (2016).
  21. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15, (12), 5383-5398 (2004).
  22. Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147, (7), 1431-1442 (1999).
  23. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  24. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
  25. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (14), 4381-4385 (1982).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  27. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, (1), 45-57 (2012).
  28. Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
  29. David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139, (3), 501-504 (2013).
  30. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13, (7), 897-905 (2010).
  31. Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12, (1), 71-85 (2012).
  32. Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420, (4), 768-774 (2012).
  33. Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10, (10), 1224-1231 (2008).
  34. Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18, (54), 7794-7802 (1999).
  35. Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113, (10), 7769-7792 (2013).
  36. McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20, (7), 1400-1410 (2011).
  37. Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209, (1), 73-84 (2015).
  38. Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
  39. Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152, (4), 791-805 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics