स्तनधारी तनाव ग्रॅन्यूलस के रूप में साइकोस्लैस्मीनिक फॉस्ट को वर्गीकृत करने के तरीके

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Biology

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Summary

तनाव ग्रंथि (एसजी) गैर-मस्तिष्कशोथ कोशिकामालिक संरचनाएं हैं जो विभिन्न तनावों के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में होते हैं। एसजीएस में एमआरएनए, आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन, छोटे राइबोसोमल सब्यूनिट्स, ट्रांसलेशन-संबंधी कारक, और विभिन्न सेल सिग्नल प्रोटीन होते हैं। यह प्रोटोकॉल एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है जो वास्तविकता का पता लगाने, उसे चिह्नित करने, और मात्रात्मक एसजीओं को मापने के लिए कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग करता है।

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Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

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Abstract

अचानक पर्यावरणीय परिवर्तनों से सेल को चुनौती दी जाती है तनाव ग्रैन्यूल (एसजीएस), कोशिका-कोशिका रिबन्यूक्लोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स, जो कि तनाव की स्थिति के संपर्क में आने वाले कोशिकाओं में होते हैं, कोशिका चयापचय और अस्तित्व के विभिन्न पहलुओं में फंसा हैं। एसजीएस सेलुलर सिग्नलिंग पथ, पोस्ट ट्रांस्क्रिप्शनल जीन एक्सप्रेशन, और तनाव प्रतिक्रिया कार्यक्रमों को विनियमित करते हैं। इन एमआरएनए युक्त ग्रैन्यूलल्स का गठन सीधे सेलुलर अनुवाद से जुड़ा हुआ है। एसजी विधानसभा को हिचकते हुए अनुवाद दीक्षा से ट्रिगर किया गया है, और एसजी डिससैप्पडमेंट को अनुवाद सक्रियकरण के द्वारा प्रोत्साहित किया गया है या इन्हेंबल्ड ट्रांसलेशन बढ़ा दिया गया है। इस रिश्ते को आगे एसजी रचना द्वारा हाइलाइट किया गया है। कोर एसजी घटकों ने अनुवाद पूर्व-दीक्षा परिसरों, एमआरएनए, और चयनित आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) को रोक दिया है। एसजी विधानसभा का उद्देश्य अनुवादित रूप से रुके हुए हाउसकीपिंग एमआरएनए को एकजुट करके सेलुलर ऊर्जा का संरक्षण करना है, जिससे तनाव-उत्तरदायी प्रोटीन के बढ़ते अनुवाद की अनुमति मिलती है। अदिति मेंमुख्य घटक के लिए, जैसे कि स्टॉल किए गए अनुवाद प्रेयनियेशेशन कॉम्प्लेक्स, एसजीएस में अन्य प्रोटीन और सिग्नलिंग अणुओं की अधिक मात्रा होती है एसजी के गठन में होने वाले दोष तनाव को सेलुलर अनुकूलन को कम कर सकते हैं और सेल मृत्यु को बढ़ावा दे सकते हैं। एसजीएस और इसी तरह के आरएनए युक्त ग्रैन्यूल को कई मानव रोगों से जोड़ दिया गया है, जिनमें neurodegenerative विकार और कैंसर शामिल हैं, जिससे आरएनए ग्रेन्युल उपप्रकारों को वर्गीकृत करने और परिभाषित करने में हाल ही में दिलचस्पी हो सकती है। यह प्रोटोकॉल स्तनधारी एसजीएस को चिह्नित और मात्रा देने के लिए assays का वर्णन करता है।

Introduction

कोशिकाओं तनाव को जवाब देने के लिए कई तंत्रों को रोजगार देते हैं। कुछ प्रतिक्रियाएं पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर होती हैं और इसमें एमआरएनए अनुवाद और / या स्थिरता 1 , 2 को विनियमित करना शामिल है। तनाव-समायोजित एमआरएनए ट्रांसलेशन की गिरफ्तारी और गिरावट विशिष्ट गैर-मस्तिष्क सेलुलर फ़ॉसी के गठन से जुड़ी हुई है, सबसे अच्छी तरह से विशेषता तनाव ग्रैन्यूल (एसजीएस) 3 है । एसजीएस cytoplasmic foci है जो ट्रांससनली-गिरफ्तार कोशिकाओं में नॉनट्रांससेटिंग एमआरएनपी को ध्यान केंद्रित करती है ( जैसे, ऑक्सीकरण, गर्मी झटका, पोषक तत्वों की भूख और वायरल संक्रमण) 4 । एमआरएनए नॉनट्रांससटिंग के अलावा, एसजीएस में ट्रांसलेशन दीक्षा कारक, आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन और विभिन्न सिग्नल प्रोटीन होते हैं। एसजीएस प्रोटीन अनुवाद और बदलते आरएनए चयापचय के बायोमार्कर हैं और सेल अस्तित्व और एपप्टोसिस से जुड़े हैं, संकेत मार्गएस, और परमाणु प्रक्रियाओं 5

एसजीएस गतिशील संस्थाएं हैं, और उनका गठन सेलुलर अनुवाद 6 की स्थिति से कसकर जुड़ा हुआ है। अपने प्रतीत होता है कि ठोस स्वरूप के बावजूद, अधिकांश एसजी प्रोटीन घटकों को सेकंड के निवास समय के साथ तेजी से और बाहर शटल, जबकि एसजीएस मिनटों से घंटों तक चले जाते हैं, उनके अधिकांश घटक तेजी से प्रवाह में होते हैं। अनुवाद दीक्षा का निषेध और परिणामस्वरूप पॉलिस्मों के अनुवाद के परिणामस्वरूप असंतुलन एसजीओं के गठन को बढ़ावा देते हैं; इस प्रकार, एसजीएस पॉलिस्मों के अनुवाद के साथ संतुलन में हैं यह पॉलिसम / एसजी संतुलन अन्य तनाव प्रेरित foci 6 , 7 से भरोसेमंद भेदभाव एसजीओं को भेद करने की कुंजी है।

अनुवाद की दीक्षा गिरने से अनुवाद-सक्षम पूर्व-दीक्षा के परिसरों में रूपांतरण होता है जिसमें एमआरएनए, अनुवाद आरंभ कारक (ईआईएफ), और 40 एस के राइबोसोमल सबिनिट्स (एस ओ-कॉल 48 एस कॉम्प्लेक्स) में अनुवादित रूप से स्थगित परिसरों (तथाकथित 48 एस * परिसरों) में एसजीएस 4 , 6 में शामिल हो सकते हैं । एसएजी को 48 एस जटिल संरचना के ऊपर की तरफ दो अलग-अलग चरणों में एसोसिएट्स की पदोन्नति में पदोन्नत किया गया है: टोपी बाध्यकारी ईआईएफ 4 एफ कॉम्प्लेक्स ( जैसे, ईआईएफ 4 ए सबयूनेट को लक्षित करना) या अनुवाद दीक्षा कारक ईआईएफ 2 के α सबिनिट की फास्फोरायलेशन, एक द्वारा मध्यस्थता या चार से अधिक ईआईएफ 2 कैनेसेस रुके हुए 48 एस परिसरों की उपस्थिति ( यानी 40 एस राइबोसोमल सबिनिट्स और चयनित अनुवाद दीक्षा कारक) एसजीएस 8 , 9 की पहचान है

एसजीएस विभिन्न रोग राज्यों से जुड़ा हुआ है, जैसे कि वायरल संक्रमण, न्यूरॉइडजन, ऑटोइम्यूनिटी, और कैंसर 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 कई एसजी घटकों के उत्परिवर्तित रूप, न्यूरोडेनेरेटिव रोगों ( जैसे एमीयोट्रॉफ़िक पार्श्व स्केलेरोसिस) के साथ जुड़ा हुआ है जिसमें न्यूरॉन्स इंट्रासेल्युलर रोग से जुड़े इनवर्न्स प्रदर्शित करते हैं जो न्यूरॉनल मौत 13 में सक्रिय भूमिका निभा सकते हैं। कुछ वायरस एसजी घटकों का अपहरण एसजी के गठन को बाधित करने और वायरल प्रतिकृति 14 को बढ़ाने के लिए करता है। हाल के अध्ययनों में एसजीएस कैंसर 15 और केमो-कैंसर सेल के अस्तित्व के लिए भी शामिल है- और रेडियोथेरेपी उपचार 10 , 16 , 17 , 18 , 1 9 , 20 । हालांकि इस तरह के निष्कर्षों ने एसजी जीव विज्ञान में बहुत रुचि पैदा कर दी है, जबकि कई प्रकाशित रिपोर्टों में अन्य तनाव-प्रेरित फॉचों से वास्तविकता वाले एसजीओं के निर्माण में अंतर रखने के लिए महत्वपूर्ण नियंत्रणों की कमी है।

एसजीएस को शुरू में गैर-मस्तिष्कशोथ साइटोप्लाज्मिक फॉइस के रूप में वर्णित किया गया था, जिसे टी-सेल नॉटोसेल्युलर एंटीजन 1 (टीआईए -1) और पॉली-ए-बाइंडिंग प्रोटीन (पीएपीपी) समेत चयनित एमआरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) से बना है; अनुवाद दीक्षा कारक; बहुआयामी एमआरएनए; और छोटे राइबोसोमल सबिनट्स 4 , 6 , 21 , 22 परंपरागत रूप से, उनकी रचना का निर्धारण तंत्र द्वारा निर्धारित किया गया है जैसे कि immunostaining और फ्लोरोसेंटली टैगीटिन प्रोटीन 23 , 24 की एक्टोपिक अभिव्यक्ति। उनकी अत्यधिक गतिशील प्रकृति के कारण, एसजी प्रोटीन और / या एमआरएनए के इम्युनोलोकलाइजेशन एसजीएस 23 , 24 का पता लगाने के लिए परिभाषित कार्यप्रणाली बनी हुई है। आज तक, कई आरबीपी और अन्य प्रोटीन (120 से अधिक विशिष्ट प्रोटीन) एसजी घटकों 11 के रूप में वर्णित हैं। कई एस के रूप मेंजी-स्थानीयकृत प्रोटीन तनाव-आश्रित और एक स्वतंत्र तरीके से दोनों में अपना स्थानीयकरण बदलते हैं और अन्य इंटरेसेल्युलर डिब्बों और फ़ॉग्ज में जमा कर सकते हैं, एसजी मार्करों को सही चुनना और अन्य प्रकार के तनाव-प्रेरित से एसजी को अलग करने के लिए कार्यात्मक मानदंडों को रोजगार करना महत्वपूर्ण है। फोकी। यथार्थवादी एसजीएस में एमआरएनए, अनुवाद दीक्षा कारक, और छोटे राइबोसोमल सबिनिट होते हैं और अनुवाद के साथ गतिशील संतुलन में हैं।

यह सरल वर्कफ़्लो यह निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि क्या तनाव-प्रेरित फ़ॉसी सदाशयी एसजीएस हैं या नहीं। इस वर्कफ़्लो में U2OS कोशिकाओं का उपयोग करने वाले कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण शामिल हैं, जो आमतौर पर एसजीओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल होते हैं। ये कोशिकाएं आदर्श हैं, क्योंकि उनके पास एक बड़े कोशिका द्रव्य है, अपेक्षाकृत सपाट होते हैं, और कांच के कवरलापों के लिए दृढ़ता से संलग्न होते हैं। एसजी के अध्ययन के लिए अन्य सेल प्रकार का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह जानना महत्वपूर्ण है कि समय, ड्रग एकाग्रता और एसजी-न्यूक्लिअलेटिंग प्रोटीन की बहुतायत में कैनेटीक्स और कंपोsition। इसके अतिरिक्त, कुछ कोशिकाओं सेल की सतह के खूनों के गठन के द्वारा पैराफॉर्मालाइहाइड फिक्स्डेशन का जवाब देते हैं, फिर एक रफ़ीदार उपस्थिति देता है जो कुछ एसजी मार्करों के स्थानीयकरण का कारण बनता है; सावधान विश्लेषण के बिना, इन्हें एसजीएस के रूप में गलत वर्गीकृत किया जा सकता है। यह तनावपूर्ण प्रवृत्त foci को पहचानने के लिए आवश्यक सभी मानदंडों का मूल्यांकन करने की आवश्यकता को उजागर करता है जैसे कि सदाशयी एसजीएस। Vinorelbine (VRB), एसजीएस 20 को बढ़ावा देने वाले एक कैंसर के चिकित्सीय, और साथ ही साथ एक मजबूत और अच्छी तरह से एसजी इंड्युसेर सोडियम आर्सेनाइट (एसए) को इस प्रोटोकॉल में प्रयोगों के लिए जोर दिया जाता है।

कैनोनिकल एसजीएस में एकाधिक एसजी मार्कर (प्रोटीन और एमआरएनए दोनों) होते हैं जो कि कोशिका-कोशिका फॉस्फेट में कोलोकैलिस होते हैं। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन मार्करों के स्थानीयकरण और बहुआयामी एमआरएनए 22 का पता लगाने के लिए क्रमशः स्वस्थानी संकरण (एफआईएसएच) में immunofluorescence और प्रतिदीप्ति का उपयोग करता है। संक्षेप में, अप्रत्यक्ष immunofluorescence एंटीबॉडी का उपयोग करता है ( i।ई। प्राथमिक एंटीबॉडीज) विशिष्ट प्रोटीन के लिए विशिष्ट इसे सेल के भीतर का पता लगाने के लिए। फिर, फ्लोरोरेम्रेम्स से जुड़े माध्यमिक एंटीबॉडी (आमतौर पर प्रजाति-विशिष्ट) प्राथमिक एंटीबॉडी को पहचानते हैं और लक्ष्य प्रोटीन स्थानीयकरण को प्रकट करते हैं। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेल के भीतर स्थानीय सिग्नल का पता लगाने के लिए किया जाता है। विभिन्न प्रजातियों में उत्पादित एंटीबॉडी का उपयोग करना और उन्हें अलग-अलग रंगीन माध्यमिक एंटीबॉडी से पता लगाने से कई एंटीबॉडी के colocalization का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, यह दर्शाता है कि उनके प्रोटीन लक्ष्य एक ही स्थान 23 में पाए जाते हैं। मार्करों का चयन करना महत्वपूर्ण है जो कि सदाबहार एसजीएस पर कॉलोकैलिस किए गए हैं।

मछली एक लेबल जांच का उपयोग करता है जो एक विशिष्ट आरएनए या डीएनए अनुक्रम 25 के आधार-जोड़े होते हैं। एमआरएनए का पता लगाने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक बायोटिनिलाटेड ओलोगो (डीटी) 40 जांच का उपयोग करता है जो हाइब्रिज्ड (या आधार-जोड़े) को एमआरएनए की पॉलीए पूंछ ( यानी पॉलीए एफआईएसएच)। बायोटिनिलेटेड जांच तब फ्लोरोसेंटली संयुग्मित स्ट्रेक्टाविडीन का पता लगाया जाता है, क्योंकि स्ट्रेप्टिविडिन बायोटिन के लिए एक उच्च समानता है। एसजीएस का आकलन करते समय, एसएजी मार्कर का पता लगाने में immunofluorescence के साथ युगल पॉलिया फिश के लिए महत्वपूर्ण है, जैसा कि सदाबहार एसजीएस, दो सिग्नल को कॉलोकालेज करना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, colocalization का मूल्यांकन कई तरीकों से किया जाता है। बहु-चैनल ( यानी आरजीबी: लाल, हरे, और नीली) छवि में, colocalization ओवरलैप्ड सिग्नल के रंग को बदल देगा ( उदा।, Colocalized लाल और हरे रंग पीले दिखाई देते हैं) 23 इसके अतिरिक्त, लाइन स्केन विश्लेषण का उपयोग करते हुए, colocalization ग्राफिक मात्रा निर्धारित किया जाता है, जहां प्रत्येक रंग की तीव्रता दी गई 8 , 20 पंक्ति में मापा जाता है। इस प्रोटोकॉल ने ImageJ 26 का उपयोग करते हुए दो लाइन स्कैन विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन किया है। एक प्रक्रिया मैनुअल है और पूरी प्रक्रिया में जाती है, whiले अन्य एक मैक्रो का उपयोग करता है, या एक सरल प्रोग्राम है जो मैन्युअल चरणों को स्वचालित करता है मैक्रो प्रक्रिया को समझने के लिए मैनुअल प्रोग्राम के माध्यम से जाना महत्वपूर्ण है।

कोशिकाओं में एसजीएस फॉर्म जहां अनुवाद का दमन होता है; इसलिए, एसजीएस वाले कोशिकाओं को अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में वैश्विक अनुवाद के कम स्तर को प्रदर्शित करना चाहिए। प्रयोगात्मक रूप से, रिबोपायरोमाइसेलेशन का उपयोग किया जाता है। Puromycin और emetine को स्थिरता से पहले एक छोटी अवधि के लिए कोशिकाओं में जोड़ा जाता है, जिससे पुरीमोसिकिन को सक्रिय रूप से बनाने वाले पॉलीपेप्टाइड में शामिल किया जा सकता है, जिससे 27 , 28 को समाप्त होता है । रीसेटेशन 29 को रोकने के लिए एमिनेट के साथ उपचार आवश्यक है Puromycin को बाद में सक्रिय अनुवाद का एक स्नैपशॉट देकर, पोरोमिसीन विरोधी एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। इस विधि का प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह जल्दी है, किसी विशेष एमिनो एसिड (और संभावित रूप से कोशिकाओं को पेश करने) की कमी के कारण पूर्व-भूख से मरने की आवश्यकता नहीं होती है, और यह पता चलता है किप्रोटीन अनुवाद का सबसेलुलर स्थानीयकरण अन्य तरीकों, विशेषकर संशोधित अमीनो एसिड एनालॉग, जैसे कि मेथियोनीन एनालॉग एल-अज़ीडोहोमोलालाइन (एएचए), "क्लिक-ए" रसायन 30 के साथ-साथ, एसजीएस वाले कोशिकाओं को पड़ोसी कोशिकाओं 31 की तुलना में बहुत कम अनुवाद प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, इस तकनीक को 15-30 मिनट के लिए पल्स-लेबलिंग के बाद मेथियोनीन भुखमरी की आवश्यकता है मेथियोनीन भुखमरी एक अतिरिक्त तनाव का गठन करती है, जबकि लंबे समय तक लेबलिंग समय ( यानी 15-30 मिनट) चल रहे अनुवाद के बजाय संचयी के माप में परिणाम देता है और नए संश्लेषित प्रोटीन को संश्लेषण की अपनी साइट से उनके अंतिम गंतव्य तक स्थानांतरित करने की भी अनुमति देता है सेल। इसके विपरीत, रिबोपायरोसायक्लाइज़ेशन बहुत तेजी से और किसी भी माध्यम से संगत है, जैसे कि ग्लूकोज से भुखमरी के माध्यम से एसजीओं को प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

प्रामाणिक एसजीएस गतिशील संतुलन में हैंसक्रिय रूप से polysomes अनुवाद के साथ यह नमूने का उपयोग दवाओं के साथ इलाज के द्वारा किया जा सकता है जो पॉलिस्मों को स्थिर या अस्थिर कर देते हैं, इस प्रकार एसजीएस और पॉलिओमस 23 के बीच संतुलन को टिपते हैं। Cycloheximide (या emetine, जो इसी तरह से व्यवहार करता है) एमआरएनए पर "फ्रीजिंग" रिबोसोम द्वारा बढ़ाव, इस तरह एसजीएस बनाने में सक्षम गैर-पॉलिस्मोल एमआरएनपी के पूल को कम कर देता है। प्रयोगात्मक रूप से, यह दो तरीकों से इस्तेमाल किया जा सकता है: एसजी के गठन को रोकने या एसजीएस के गठन के बाद cycloheximide (या emetine) को जोड़ने से तनाव से पहले cycloheximide (या emetine) को जोड़कर, तनावपूर्ण एजेंट को हटाने के बिना भी, एसजी disassembly के कारण, रुका हुआ प्रीविनियेशन कॉम्प्लेक्स को धीरे-धीरे पॉलिस्मम अंश में भर्ती कराया जाता है। इसके विपरीत, पोरोमासिकिन समयपूर्व समापन का कारण बनता है और पोलियोमोम डिस्ैप्सैप को बढ़ावा देता है, जो कि एसआरजी में इकट्ठा करने में सक्षम एमआरएनए शुरू करने के पूल को बढ़ाता है। प्रयोगात्मक रूप से, प्योरोमायसिन उपचार एसजी की संख्या बढ़ाता है या थेशनल को कम करता हैघ जिस पर वे वर्गीकृत तनाव या दवा की खुराक के जवाब में बनते हैं। पुरोमोसीन के प्रभाव का मूल्यांकन करते समय, ब्याज की दवा के उप-अधिकतम स्तर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि पुरोमोसीन दवा के प्रभाव को बढ़ाने और एसजीओं को प्रदर्शित करने वाले कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि की उम्मीद कर रहा है - यह तब नहीं हो सकता है जब दवा / तनाव से पहले 100% कोशिकाओं में एसजी का कारण बनता है। यह cycloheximide उपचार के साथ विरोधाभासी है, जो एसजीओं को अलग करता है और जब ~ 95% कोशिकाएं शुरू में एसजीएस प्रदर्शित करती हैं, तो सबसे बड़ा संभव कमी देखी जा सकती है और सही मात्रा में मापा जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं में एसजी का अध्ययन करने के लिए एक ढांचा प्रदान करता है। तरीके शामिल हैं: (1) immunofluorescent धुंधला हो जाना और ImageJ विश्लेषण क्लासिक एसजी-जुड़े मार्करों eIF4G, eIF3b, और रास GTPase सक्रिय प्रोटीन बाध्यकारी प्रोटीन 1 (G3BP1) कृत्रिम एसजीएस में मूल्यांकन करने के लिए colocalization; (2) पॉलीएडेनीलाटेड एमआरएनए को पता लगाने के लिए स्वस्थानी संकरण (पॉलीए एफआईएसएच) में ऑलोगोगो (डीटी) प्रतिदीप्ति; (3) cycloheximide और puromycin उपचार यह निर्धारित करने के लिए कि तनाव-प्रेरित foci polysomes के साथ गतिशील संतुलन में हैं; और (4) खगोलीय एसजीएस युक्त कोशिकाओं की अनुवादकारी स्थिति का आकलन करने के लिए रिबोपायरोमाइसेलेशन। साथ में, यह assays निर्धारित कर सकते हैं कि तनाव प्रेरित प्रेरित foci को सदाबहार एसजीएस के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है।

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Protocol

1. सेल तैयारी

  1. चित्रा 1 ए में बताए अनुसार, 24-अच्छी तरह से एक प्लेट के 12 कुओं को आटोक्लावेड कवर लिप्स जोड़ें; यह प्रत्येक कंसलिप को लेने के लिए वैक्यूम से जुड़ी बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके किया जा सकता है। सक्शन के रिलीज के लिए कूल के किनारे पर धीरे-धीरे कंसलिप को टैप करें, जिससे कूलरिप को अच्छी तरह से गिरने की अनुमति मिलती है
  2. प्लेट के 1 एक्स 10 5 यू -2 ओएस (यू 2 ओएस) ओस्टियोसॉर्का कोशिकाएं प्रति मिनट 500 μL के अंतिम मात्रा में अच्छी तरह से भरती हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जाता है, प्लेट साइड की ओर और ऊपर और नीचे कई बार ले जाएँ।
  3. धीरे से कवर एलिप्स को साफ P1000 टिप के साथ दबाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कवच का टुकड़ा अच्छी तरह से नीचे हो और कंसोलिप के नीचे कोई बुलबुले न हो।

2. तनाव कोशिकाओं

  1. अगले दिन, नेत्रहीन प्लेट की जांच करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को समान रूप से फैलाया जाता है और समान रूप से मिलते-जुलते हुए coverslip के बीच,नमूनों परिणाम की reproducibility पर प्रतिकूल असर पड़ सकता है औंधा ऊतक-संस्कृति माइक्रोस्कोप पर 10 एक्स उद्देश्य का उपयोग करें
  2. Preheat मध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं को ठंडा या गर्म मीडिया लगाने से बचें, क्योंकि ये क्रमशः शीत शॉक या गर्मी झटका है।
  3. Preheated मीडिया में दवाओं पतला। प्रत्येक अलग दवा एकाग्रता के लिए, 500 कुओं, जिसमें 500 μL मध्यम होते हैं, तैयार करें। Pipetting के दौरान नुकसान के लिए अतिरिक्त 500 μL तैयार करें विभाज्य 4 ट्यूब, जिसमें प्रत्येक 1.5 एमएल है।
    1. सोडियम आर्सेनाइट के लिए: 500 μL युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से, 1.5 एमएल का 100 एमएम सोडियम आर्सेनाइट (अंतिम एकाग्रता: 100 माइक्रोन) जोड़ें या 100 एमएम सोडियम आर्सेनाइट (अंतिम एकाग्रता: 50 सुक्ष्ममापी) के 0.75 μL जोड़ें।
    2. Vinorelbine के लिए: 500 μL युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से, 22.5 μL 10 मिमी vinorelbine (अंतिम एकाग्रता: 150 माइक्रोन) जोड़ें या 18.75 μL 10 एमएम vinorelbine (अंतिम एकाग्रता: 100 सुक्ष्ममापी) जोड़ें।
      नोट: सोडियम आर्सेनाइट एक अच्छी तरह से विशेषता और आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तनाव ग्रेन्युल इंडुसर है और इसलिए क्लासिक रूप से एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है।
  4. निकालें और कुएं बी 1 - 4 और सी 1 से मीडिया को त्यागें। 4. मीडिया को दवाओं के साथ जोड़ें और 60 मिनट (चित्रा 1 ए) के लिए प्रतीक्षा करें।
    1. कुएं बी 1 और बी 2 को 100 माइक्रोन सोडियम आर्सेनाइट के साथ 500 μL मध्यम जोड़ें। 500 सुक्ष्ममापी सोडियम आर्सेनाइट के साथ बीस और बी 4 को 500 μL मध्यम जोड़ें।
    2. 150 μM vinorelbine के साथ कुएं सी 1 और सी 2 के लिए 500 μL मध्यम जोड़ें। 125 μM vinorelbine कुओं C3 और C4 के साथ 500 μL मध्यम जोड़ें।
  5. फिक्सेशन से 30 मिनट पहले, 5 μL साइक्लोहेक्सिमइड (1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक) और 2 μL पॉरोमीसिन (1.25 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक) के साथ कॉलम 4 में कुएं के साथ कॉलम 2 में कुओं का इलाज करें। थाली को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखने से पहले प्लेट को धीरे से रॉक कर दें।

3. सेल फिक्सेशन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: प्रयोग करने से पहले, सुनिश्चित करें कि मेथनॉल को -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है। पीएसए में फॉस्फेट-बफर्ड सेलीन (पीबीएस), 5% सामान्य हार्स सीरम (एनएचएस) और 4% पैराफार्मैडाइहाइड (पीएफए) ) पीबीएस में

  1. मीडिया को त्याग दें और पीबीएस के साथ कवरलिप युक्त कुओं को धोएं। इस्तेमाल दवाओं के आधार पर, दवाओं युक्त मीडिया को ठीक से छोड़ना महत्वपूर्ण हो सकता है; विशिष्ट निर्देशों के लिए स्थानीय पर्यावरण सुरक्षा कार्यालय से संपर्क करें। कुशलतापूर्वक धोने के लिए, पीबीएस के साथ एक निचोड़ बोतल भरें, टिप को काटने में कटौती करने के बजाय कोमल प्रवाह की अनुमति दें, और इसका प्रयोग पीबीएस को मूल पीबीएस की इच्छा के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए करें।
  2. नरम आंदोलन के तहत आरटी पर 15 मिनट के लिए ~ 250 μL का 4% पीएफए ​​का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें। पूरी तरह से पीएफए ​​के साथ coverslip के शीर्ष को कवर; 250 μL पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन यदि नहीं, तो अधिक जोड़ें। हमेशा सीधे कवरलेटों पर पिपेट करने से बचें, क्योंकि कुछ कोशिकाएं (या कोशिकाओं के तनाव उपचार) अनुलग्नक को बदल सकते हैं, औरवह pipetting से बल कोशिकाओं को स्थानांतरित कर सकते हैं
  3. पीएफए ​​निकालें और ठीक से छोड़ दें। पैराफार्मलडायहाइड को ठीक से कैसे हटाएं, इसके विवरण के लिए स्थानीय पर्यावरण सुरक्षा कार्यालय से संपर्क करें।
  4. ~ 250 μL मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें और आरटी पर कोमल कमाल के तहत 5 मिनट के लिए सेते करें; यह दोनों कोशिकाओं को फैलाने और चपटे करता है
  5. मेथनॉल निकालें और त्याग दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी ओ / एन पर 1 घंटे के लिए 5% एनएचएस के ~ 250 μL लगाने से कोशिकाओं को अवरुद्ध करें। मेथनॉल के ठीक तरीके से निकलने के तरीके के बारे में जानकारी के लिए स्थानीय पर्यावरण सुरक्षा कार्यालय से संपर्क करें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडीज के लिए, 5% एनएचएस में एंटीबॉडी को पतला।
    नोट: कई एसजी मार्करों का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या देखे गए ग्रैन्यूलल्स सच्चे भक्त एसजीएस हैं। एसजी मार्करों की संख्या का उपयोग किया जा सकता है माइक्रोस्कोप में उपलब्ध फिल्टर पर निर्भर करता है। यदि मानक हरा, लाल, और दूर-खाली फ़िल्टर सेट उपलब्ध हैं, तो 1/250 कमजोर पड़ने पर जी 3 बीपी 1, ईआईएफ 4 जी और ईआईएफ 3 बी का उपयोग करें।
  7. पीबीएस के साथ कुओं को 3x धो लें, और 5 मिनट के लिए प्रत्येक धोने सेवन करें।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, 5% एनएचएस में सभी माध्यमिक एंटीबॉडी (1/250 कमजोर पड़ने) और होचस्ट डाई (1/1000 कमजोर पड़ने) को पतला।
    1. इस प्रयोग के लिए (250 कुल μL पर 12 कवरलेट्स: प्रत्येक 5 एमएल 5% एनएचएस), इनमें से प्रत्येक के 12 μL जोड़ें: साइ-माउस-साइ-रे-रेबिट, और साइर-बकरी (प्रत्येक के 1/250 कमजोर पड़ने वाले) ) और Hoechst डाई के 3 μL जोड़ें।
    2. आरटी पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कवरलेट्स सेते हैं। इस और निम्न चरणों के दौरान, एक बॉक्स के साथ प्लेट को कवर करके या टिशू कल्चर डिश के शीर्ष पर पन्नी डालकर नमूनों को प्रकाश से बचाएं।
  9. हम धो लें5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ तीन बार लालच
  10. बढ़ते माध्यमों के उपयोग से लेबल वाले ग्लास स्लाइड्स पर कवरलेट को माउंट करें 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में बढ़ते माध्यम को गरम करें; यह चिपचिपापन कम हो जाती है और विंदुक के लिए आसान बनाता है। एक कटा हुआ P200 टिप के साथ, एक गिलास स्लाइड पर 25 μL प्रति आवरण के माध्यम से बढ़ते मध्यम; 4-8 कवरलाइन एक गिलास स्लाइड पर फिट हो सकते हैं, यह मानते हुए कि खुर्दबीन मंच इसको अनुमति देता है। ठीक संदंश का उपयोग करना, कंसलिप को अच्छी तरह से स्लाइड तक स्थानांतरित करें, जिससे सुनिश्चित करें कि माउंटेनिंग माध्यम पर सेल की तरफ डालना क्लीन P200 टिप का उपयोग करके, कवरलिप नीचे दबाएं।
  11. एक बार सभी coverslips माउंट किया गया है, स्लाइड पर बहुत दृढ़ता से प्रयोगशाला के ऊतकों दबाने से अतिरिक्त बढ़ते माध्यम को साफ करने के लिए जोड़ लैब ऊतक का उपयोग करें। अधिक बढ़ते माध्यम को बंद करने के लिए एच 2 ओ युक्त निचोड़ वाली बोतल का उपयोग करें और फिर पानी को हटाने के लिए मुड़ी हुई प्रयोगशाला के ऊतकों के साथ ब्लूटिंग को दोहराएं।

4. क्षेत्र में प्रतिदीप्ति </ Em> संकरण (एफआईएसएच)

  1. एक गाइड के रूप में चरण 1 और 2.1-4 का उपयोग करके प्लेटों और कोशिकाओं का इलाज; यह केवल स्तंभ 1 में कोशिकाओं को प्लेट में लेना आवश्यक है, क्योंकि निम्न प्रयोग में केवल 3 coverslips की आवश्यकता होती है।
  2. सुनिश्चित करें कि सभी बफ़र्स तैयार होते हैं ( यानी पीबीएस में 4% पीएफए, पानी में 70% इथेनॉल, 2x खारा-सोडियम-साइटेट (एसएससी), और 5% एनएचएस), कि मेथनॉल को -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है, और संकरण ओवन उपयुक्त तापमान तक गर्म है
  3. कोशिकाओं को धोने और ठीक करने के लिए 3.1-3.3 के कदम उठाएं।
  4. 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल जोड़कर कोशिकाओं को स्थिर करें
  5. मेथनॉल को निकालें और 70% इथेनॉल में कंडोली का सेवन करें। थाली 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिलम का उपयोग कर प्लेट को सील करें।
  6. अगले दिन, 500 μL 2x एसएससी जोड़कर इथेनॉल को हटा दें और कोशिकाओं को पुन: हाइड्रेट करें। आरटी पर कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए कवर लिप्स को सेते।
  7. 2x एसएससी निकालें और 500 जोड़ें2X एसएससी के μL कोमल आंदोलन के तहत 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. संकरण ओवन के नीचे परफिल फ्लैट का एक टुकड़ा रखें। पिपेट प्रत्येक कंसलिप के लिए पैराफिलम पर 25 μL संकरित बफर 24-अच्छी तरह से पकवान से कंसलिप को निकालें (इस बिंदु पर, कतरनीचियां सेल-साइड अप हैं) और संलयन बफर पर कंसलिप सेल-साइड को नीचे रखें। यह 42 डिग्री सेल्सियस या वैकल्पिक रूप से 65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए करें।
    नोट: 65 डिग्री सेल्सियस पर इस चरण को पूरा करने से सेलुलर आरएनए को खारिज करना होगा; यह संकेत को सुधार सकता है अगर पॉलीए प्रोटीन के साथ बातचीत से मुखौटा होता है।
  9. 2 एनजी / μ एल की एकाग्रता के लिए बायबोटिन-ऑलिगो (डीटी) जांच (100 एनजी / μ एल) को संकरित बफर में पतला करें; प्रति कूपल 25 μL पर्याप्त है।
  10. प्रत्येक कंडोलिप के लिए, पैराफिलम पर बायोटिन-ऑलिगो (डीटी) युक्त संकरित बफर के 25 μL पिपेट करें। संदंश के साथ coverslip उठाओ और अतिरिक्त को हटाने के लिए एक प्रयोगशाला के ऊतक पर coverslip के किनारे को धीरे से स्पर्श करेंसंकरण बफर बायोटिन-ऑलिगो (डीटी) के साथ संलयन बफर को कवर कीप को स्थानांतरित करें; सेल पक्ष नीचे रखने के लिए याद रखें।
  11. वाष्पीकरण को सीमित करने के लिए एक संकरण बॉक्स में कसरत को रखें। 42 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए संकरित बफर में बायोटिन-ऑलिगो (डीटी) के साथ कवरलाप सेते हैं।
  12. हाइब्रिडिजेशन ओवन में 2x एसएससी प्लेस करें ताकि यह 42 डिग्री सेल्सियस तक संतुलित हो सके।
  13. 24-अच्छी तरह से पकवान में कुएं के लिए ~ 500 μL गर्म 2x एसएससी जोड़ें और कंसोल को अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें 10 मिनट के लिए सेते
  14. 42 डिग्री सेल्सियस पर दो बार दोहराएं और फिर आरटी पर दो बार दोहराएं।
  15. पूरा चरणों 3.5-3.10, एक पारंपरिक एंटीबॉडी के बजाय बायोटिन-ऑलिगो (डीटी) का पता लगाने के लिए स्ट्रेप्टिविन फ़्लोरोक्रोम का उपयोग करना सुनिश्चित करना

5. ट्रांसपोर्सी स्टेटस को आकलन करने के लिए रिबोप्रोफेसिसेलेशन परख

  1. प्लेट 1 में दिए गए अनुसार, कवर-लिप पर प्लेट U2OS कोशिकाएं, लेकिन केवल एक प्लेट प्रति कंडोप्ल प्रति शर्त (इस मेंमामले, 3 कवरलेट्स: नॉनट्रेटेड, 100 माइक्रोन सोडियम आर्सेनाइट, और 150 माइक्रोन व्हाइनेरेलेबिन) ( चित्रा 1 ए)।
  2. चरण 2 में प्रोटोकॉल का उपयोग कर तनाव कोशिकाओं, चरण 2.1-2.4 को पूरा करना।
  3. फिक्सेशन से पहले 5 मिनट, 2 μL पुरीमोसिकिन (स्टॉक: 1.25 मिलीग्राम / एमएल; 5 μg / एमएल के अंतिम पुरीमोसिन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 500 μL में 2 μL पतला) और 2.9 μL एमिनेटिन (स्टॉक: 20 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। 2.9 μL पहले से ही एक ही समाधान के लिए puromycin युक्त) प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त 0.5 एमएल।
  4. पुरीमोसिकिन का पता लगाने के लिए एंटी-पॉरोमोसीन एंटीबॉडी (1/1000 कमजोर पड़ने) का उपयोग करते हुए ऊपर बताए गए अनुसार, 3.1-3.10 को पूरा करें। आदर्श रूप से, शेष चैनलों में दो अन्य एसजी मार्करों का उपयोग करें।
  5. जब पुरीमोसिइन सिग्नल का अनुमान लगाया जाता है, तो उसी एक्सपोजर का उपयोग करके सभी छवियों को ले लो। प्रतिभाशाली (अनस्ट्रेस) नमूना का उपयोग करके और संभवतः बिना संतृप्ति के रूप में एक छवि को उज्जवल लेते हुए इस एक्सपोज़र को चुनें।
    नोट: विरोधी puromycin फ्लोरोसेंट संकेत repress की तीव्रताप्रचलित अनुवाद, एक एमिनो एसिड के लिए पुरोमोसीन विकल्प के रूप में, नवप्रभावित प्रोटीन में शामिल होता है, और प्रोटीन की समयपूर्व समाप्ति को लागू करता है।

6. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. तनाव ग्रैन्यूल को बढ़ाइए
    1. एसजीओं का प्रमाणन करने के लिए, प्रत्येक 3 -5 चित्रों को एक 40X उद्देश्य का उपयोग करके प्रति नमूना> 100 कोशिकाओं का अधिग्रहण करें। वैकल्पिक रूप से, अन्य उद्देश्यों का उपयोग करते हुए चित्र प्राप्त करें, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि> 100 कोशिकाओं को प्रति कंसलिप में गिना जाता है और यह कि ग्रेन्युल स्पष्ट रूप से विज़ुअलाइज़ करने के लिए आवर्धन बहुत बड़ा है। कवरलिप को पांच समान रूप से समान क्षेत्रों में विभाजित करके और प्रत्येक क्षेत्र ( चित्रा 1 बी ) से बेतरतीब ढंग से एक क्षेत्र का चयन करके इसे करें; उसी क्षेत्र की छवियों में मार्करों के समालोचनाकरण के आकलन के लिए सभी चैनल शामिल होना चाहिए।
    2. एक बार सभी छवियों का अधिग्रहण हो जाने के बाद, चैनलों को मर्ज कर लें। कुछ कैमरा सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से ऐसा करेगा, जबकि अन्य मैनुअल मर्जिंग की आवश्यकता होती है; यह साथ किया जा सकता हैImageJ सभी छवियों को खोलकर और फिर [छवि | रंग | चैनल मर्ज करें]
    3. न्यूक्लिया मार्कर के रूप में होकस्ट का उपयोग करके, नाभिक की संख्या की गणना करते हुए मैन्युअल रूप से कुल कोशिकाओं की गणना करें। प्रति सेल से दो से अधिक एसजीएस वाले कोशिकाओं की संख्या को मैन्युअल रूप से गिना।
      नोट: उदाहरण के लिए, मर्ज किए गए तीन-चैनल छवि का उपयोग करके जी 3 बीपी 1 (हरा), ईआईएफ 4 जी (लाल), और हईचस्ट (नीला) का उपयोग करके नीले चैनल का इस्तेमाल करते हुए नाभिक (या कोशिकाओं की संख्या) की गणना करें। फिर, एसजी पॉजिटिव कोशिकाओं को दो या दो से अधिक पीले रंग की फ़ॉसी प्रति कोशिकाओं के रूप में गिना। ग्रैन्यूल्स पीले दिखाई देंगे, जैसे जी 3 बीपी 1 से हरे और ईआईएफ 4 जी से लाल पीले दिखाई देते हैं अगर कोलकालीकृत।
    4. 3-5 स्वतंत्र क्षेत्रों से डेटा के संयोजन से एसजी पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करें और फिर गणना करें:
      एसजी पॉजिटिव की संख्या / नाभिक की संख्या) * 100 = एसजी पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत
  2. लाइन स्कैन विश्लेषण द्वारा कालन निर्धारण का मूल्यांकन - मैनुअल विधि
    1. खुलाImageJ। इसे मुफ्त में से डाउनलोड करें ()
    2. आरओआई प्रबंधक खोलें: [विश्लेषण करें | उपकरण | आरओआई प्रबंधक ...]
    3. ImageJ में मर्ज किए गए छवि को खोलें: [फ़ाइल | खुला]।
    4. ImageJ टूलबार में स्थित लाइन टूल का उपयोग करके, एक एसजी के माध्यम से चलाए जाने वाली एक पंक्ति जोड़ें, जिससे एसजी के पहले और बाद में शामिल होना सुनिश्चित हो। आरओआई प्रबंधक विंडो में [जोड़] पर क्लिक करके इस पंक्ति को ROI प्रबंधक में जोड़ें।
    5. ग्रेन्युल में प्रत्येक मार्कर के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए मर्ज किए गए छवि को अलग-अलग चैनलों में विभाजित करें: [छवि | रंग | स्प्लिट चैनल]; यह मर्ज किए गए छवि को तीन काले और सफेद चित्रों में विभाजित करेगा
    6. काले और सफेद छवि में, सुनिश्चित करें कि रेखा का चयन किया गया है; लाइन चयनित है अगर यह छवि में दिखाई देता है यदि नहीं, तो आरओआई प्रबंधक विंडो में, पैनल में रेखा पर क्लिक करें; यह आरओआई प्रबंधक विंडो में नीली रंग की रेखा को उजागर करेगा और काले और सफेद छवि पर रेखा दिखाई देगा। यदि लाइन अभी भी प्रकट नहीं होती है, तो सुनिश्चित करें कि "सभी दिखाएँ" ch हैरॉय मैनेजर में सिक्योर और फिर छवि में पंक्ति पर क्लिक करें।
    7. रेखा की तीव्रता का विश्लेषण करें: [विश्लेषण करें | प्लॉट प्रोफाइल]; यह "प्लॉट प्रोफ़ाइल" विंडो को लाएगा, जो लाइन के पार सिग्नल की तीव्रता को भुनाने के लिए है।
    8. "प्लॉट प्रोफ़ाइल" विंडो के अंदर, [सूची] पर क्लिक करें, जो ग्राफ से कच्चे डेटा वाले विंडो को लाता है। इस विंडो में सभी डेटा कॉपी करें और उसे स्प्रैडशीट फ़ाइल में पेस्ट करें। ऐसा करने के लिए, विंडो में सभी डेटा चुनें: [संपादित करें | सभी का चयन करे]। तिथि की प्रतिलिपि बनाएँ: [संपादित करें | प्रतिलिपि]। एक स्प्रैडशीट फ़ाइल खोलें और डेटा पेस्ट करें: [संपादित करें | पेस्ट करें]।
    9. पूरा चरणों 6.2.6 - 6.2.8 प्रत्येक चैनल के लिए अलग से। मूल्यांकन किया जा रहा चैनल का नज़र रखना सुनिश्चित करें
    10. एक स्प्रैडशीट में, परिणामों का एक रेखा ग्राफ़ उत्पन्न करें। उन स्तंभों का चयन करें जिनमें डेटा शामिल है [नियंत्रण] दबाकर और प्रत्येक स्तंभ के शीर्ष पर स्थित पत्र पर क्लिक करें। फिर, लाइन ग्राफ़ चुनें: [सम्मिलित करें | लाइन ग्राफ]।
    11. बहु के लिए इस विश्लेषण को दोहराएंकई अलग-अलग प्रयोगों में तनाव के ग्रैन्यूलल्स।
  3. रेखा स्कैन विश्लेषण द्वारा संकलन का मूल्यांकन - ImageJ प्लगइन
    1. ImageJ वेबसाइट (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt) से आरजीबी प्रोफ़ाइल उपकरण डाउनलोड और स्थापित करें; जब सही ढंग से स्थापित हो, तो टूलबार में एक लाल, हरे, और नीले रंग (आरजीबी) -लाइन आइकन दिखाई देना चाहिए।
    2. ImageJ में छवि को खोलें ( जैसे, झगड़ा, जेपीजी): [फ़ाइल | खुला]।
    3. ImageJ टूलबार में स्थित आरजीबी चिह्न पर क्लिक करें।
    4. एक एसजी के माध्यम से फैली हुई रेखा को जोड़ने के लिए क्लिक करें और खींचें, आसन्न क्षेत्रों को शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें; हिस्टोग्राम की एक छवि एक पॉप-अप विंडो में दिखाई देगी।
    5. एक छवि के रूप में डेटा सहेजें: [फ़ाइल | के रूप में सहेजें | Tiff]। वैकल्पिक रूप से, उपरोक्त चरण 6.2.8 का उपयोग करते हुए दूसरे ग्राफ़िंग प्रोग्राम में डेटा निर्यात करें और फिर ग्राफ़ करें।

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Representative Results

तनाव-प्रेरित foci जरूरी नहीं एसजीएस हैं। एसजीओं को साइटोप्लाज्मिक फॉग्ज के रूप में वर्गीकृत किया जाता है जिसमें एमआरएनए, अनुवाद दीक्षा कारक, और आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन होते हैं और सक्रिय अनुवाद के साथ संतुलन में हैं। उपरोक्त प्रोटोकॉल को एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है, यह दर्शाने के लिए कि क्या दिए गए तनाव वास्तविकता एसजी करता है।

एसजीएस प्रोटीन और एमआरएनए दोनों सहित अन्य ज्ञात एसजी मार्करों के साथ कोलोकैलिस बनाते हैं। एसए और वीआरबी ने सीओस्प्लास्मेनिक फोसा को प्रेरित किया जिसमें जी 3 बीपी 1, ईआईएफ 4 जी, और ईआईएफ 3 बी ( चित्रा 2 ए ) शामिल हैं। इन मार्करों के colocalization लाइन स्कैन विश्लेषण और बढ़ती बढ़ाई ( चित्रा 2 ए ) के साथ एकल चैनल छवियों का उपयोग कर पुष्टि की है। इसके अतिरिक्त, इन फॉइस में मृणा शामिल होती है, जैसा कि पालीए एफआईएसएच द्वारा दर्शाया गया है, और ओलिगो (डीटी) सिग्नल जी 3 बीपी 1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिग्नल ( चित्रा 2 बी ) के साथ कोलोलिकेट करता है। यह दिखाने के लिए महत्वपूर्ण है कि पॉलीए-फिशएक ज्ञात एसजी मार्कर के साथ ओवरलैप संकेत, क्योंकि तनाव कई प्रकार के foci को बढ़ावा दे सकता है।

एसजीएस एक translationally हिचक राज्य के दौरान होते हैं। वीआरबी और एसए दोनों एक अनुवादिक दमनकारी स्थिति को बढ़ावा देते हैं, क्योंकि प्रयोगात्मक रूप से रियोपोरुोमायसीलेशन ( चित्रा 3 ) के साथ मूल्यांकन किया जाता है। सक्रिय रूप से पॉलिसोम्स को अनुवादित करने के साथ वास्तविकता एसजीएस गतिशील संतुलन में हैं एसए- और वीआरबी-प्रेरित एसजीएस सीएचएक्स के साथ भंग कर रहे हैं, जो एमआरएनए पर पॉलिमोम का जाल लगाते हैं, इस तरह से पॉलिसम डिससैप्टिंग रोकते हैं और एसजीएस ( चित्रा 4 ए, 4 बी ) को रोकते हैं। इसके विपरीत, अधिक एसए और वीआरबी एसजीएस पुरो के उपचार के बाद प्रेरित होते हैं, क्योंकि पुरोसेम डिससैम्बमेंट को बढ़ावा देता है, इस प्रकार एसजी फॉर्मेशन ( चित्रा 4 ए, 4 सी ) का पक्ष है।

संक्षेप में, सकारात्मक नियंत्रण एसए के साथ, वीआरबी ने भरोसेमंद एसजी को प्रेरित किया है कि: (1) ज्ञात एसजी मार्करों के साथ कोलोकैलिक बनाना, (2) प्रोटीन और एमआरएनए पुनः 2), (3) कोशिकाओं में पाए जाते हैं जहां अनुवाद दमित है ( चित्रा 3 ), और (4) सक्रिय अनुवाद ( चित्रा 4 ए -4 सी ) के साथ गतिशील संतुलन में हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रायोगिक आरेख। ( ) पूर्व में एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में रखी कवरलीपों पर बीज कोशिका, जैसा कि संकेत दिया गया है। बताए अनुसार माइक्रोन में एकाग्रता का उपयोग करते हुए एसए या वीआरबी के साथ 60 मिनट के लिए ए और बी का इलाज करें। 60 मिनट के बाद, दवा युक्त माध्यम के लिए CHX (अंतिम एकाग्रता: 20 μg / एमएल स्तंभ 2) या पुरो (20 माइक्रोग्राम / एमएल पुरामोसीन के लिए स्तंभ 4) जोड़ें। निर्धारण और धुंधला होने से पहले एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए ऊष्मायन जारी रखें। ( बी ) एक कवरलाप का आरेख, जो कि गिनती के लिए इमेजेज किए जाने वाले फ़ील्ड का संकेत देता है। Coverslip पांच मोटे तौर पर बराबर क्षेत्रों में बांटा गया है; एक छवि प्रत्येक क्षेत्र में ली गई है"Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एसए और वीआरबी इन्सटस साइकोप्लास्मेनिक फॉजिक जिसमें एसजी मार्करों एपोली (ए) एमआरएनए शामिल हैं ( ) जी 3 बीपी 1 (हरा), ईआईएफ 3 बी (लाल), और ईआईएफ 4 जी (नीला) के लिए यू 2ओएस कोशिकाओं को निशाना बनाया गया। सेल का इलाज 100 माइक्रोन एसए या 150 माइक्रोन वीआरबी के साथ 60 मिनट के लिए किया गया था या उपचार नहीं किया गया था (नियंत्रण)। ज़ूम वाले क्षेत्र बढ़े (2X) और काले और सफेद (नीचे) में अलग चैनल के रूप में दिखाए गए हैं। ग्राफ एक क्षेत्र (सफेद रेखा) के ग्रेन्युल के रेखा स्कैन विश्लेषण को दर्शाता है और ओवरलैप या क्लोकलाइजेशन की सीमा को दर्शाता है। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है ( बी ) पॉलीए-फिश के साथ मिलकर एक ओलिगो (डीटी) 40 प्रोब (लाल) के साथ पॉलीए एमआरएनए का पता लगाता है, जी 3 बीपी 1 (हरा) एक एंटी-जी3 बीपी एंटीबॉडी, और परमाणु डीएनए का पता लगाया जा रहा है। ज़ूम किए गए क्षेत्रों (2 एक्स), सिंगल-चैनल छवियां, और लाइन स्कैन विश्लेषण शोकेलाइजेशन। स्केल बार = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: एसए और वीआरबी उपचार कारण कारण अनुवाद दमन। सूचित उपचार के बाद 5 मिनट के लिए यूरोफ्लोरेसेंस, 5 मिनट के लिए पॉरोमासिकिन के साथ पल्स-लेबल की गई। प्योरोमासिकिन (हरा), ईआईएफ 3 बी (लाल), और परमाणु डीएनए एचईचस्ट (नीला) के साथ दाग गया। कोशिकाओं को 100 माइक्रोन एसए या 150 माइक्रोन वीआरबी के साथ 60 मिनट के लिए इलाज किया गया था या इलाज नहीं किया गया था (नियंत्रण)। स्केल बार = 10 माइक्रोन कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा vers देखने के लिएइस आकृति का आयन

चित्रा 4
चित्रा 4: एसए और वीआरबी इन्सटस साइोप्लास्मेनिक फॉजिक जो पॉलीसिमस के साथ डायनेमिक समतुल्य है। ( ) पॉलिमोम / एसजी रिश्ते का वर्णन करने वाली सामान्य योजना ( बीसी ) जी 3 बीपी 1 (हरा), ईआईएफ 3 बी (लाल), और होक्स्ट (नीला) का उपयोग करके परमाणु डीएनए के लिए दाग गया यू 2 ओएस कोशिकाएं। सेल का इलाज 100 माइक्रोन एसए या 150 माइक्रोन वीआरबी के साथ 60 मिनट के लिए किया गया था या ( बी ) सीएचएक्स (साइक्लोहेक्सिमइड, 20 माइक्रोग्राम / एमएल), ( सी ) पुरो (प्योरोमाइसीन, 10 माइक्रोग्राम / एमएल) से पहले इलाज (नियंत्रण) नहीं किया गया था। ), या ऊष्मायन के एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए कोई additive नहीं है। यह संख्या एक प्रतिनिधि प्रयोग में एसजीएस के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत के अनुरूप है। स्केल बार = 25 माइक्रोन, (बीसी) में। कृपया एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का संस्करण

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Discussion

जैसा कि कई रोगों में immunohistological अध्ययनों से इसका सबूत है, पुरानी तनाव अलग-अलग इंट्रासेल्युलर फॉॉजिक के गठन की ओर जाता है। उदाहरण के लिए, अधिकांश न्यूरोडेनेरेटिव रोगों को अघुलनशील प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर समुच्चय के आधार पर वर्गीकृत किया गया है। ऐसे समुच्चय में एसजी-संबंधित प्रोटीन की मौजूदगी अक्सर यह समापन करने का आधार है कि इस तरह के पोषण एसजीएस हैं। एक समान निष्कर्ष भी तैयार किया जाता है, जब एसजी मार्कर-पॉजिटिव साइटोप्लाज्मिक फोऑस को नए तनाव उत्तेजनाओं के साथ पेश किए गए कोशिकाओं में देखा जाता है। इस प्रोटोकॉल को वास्तविकता दिखाने के लिए सरल वर्कफ़्लो प्रदान करता है।

कथित एसजीओं की पुष्टि के लिए कई मानदंडों को पूरा किया जाना चाहिए, जिसमें संरचना और गतिशीलता दोनों के लक्षण वर्णन शामिल हैं। सबसे पहले, एसजीएस कोशिका-कोशिकाय फॉसी हैं जिनमें अनुवादित रूप से स्थगित एमआरएनपी होते हैं। इस प्रकार, पहला दृष्टिकोण दो सूक्ष्मदर्शी-आधारित तकनीकों का उपयोग करके उनकी संरचना को चिह्नित करना है, अर्थात पॉलीए-फिश और IF मछली दृश्य के लिए एक विश्वसनीय तरीका हैएसजीएस के साथ colocalize कि आईसीएआर एमआरएनए एक ओलिगो (डीटी) 40 जांच को पॉलिडेनइलेटेड एमआरएनए का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है जो तनाव स्थितियों के तहत एसजीएस में पैक करते हैं। चूंकि ओलोगो (डीटी) मृतसंयोजित एमआरएनए का पता नहीं लगाएगा, जो प्रोसेसिंग बॉडीज़ (पीबीएस) के मुख्य घटक हैं, साइोट्लैस्मैमिक एफओसी में एक मजबूत ऑलगोगो (डीटी) सिग्नल की उपस्थिति एक पहला संकेत है (हालांकि परिभाषा के लिए पर्याप्त नहीं है) कि ये फोसिक एसजीएस। दूसरा परीक्षण अन्य एसजी मार्करों ( जैसे, जी 3 बीपी 1) ( चित्रा 2 ए ) के साथ एक पॉली (ए) सिग्नल के क्लोकलालिजेशन को प्रदर्शित करना है। यह एसजी मार्कर प्रोटीन के जरिए किया जाता है। एसजी मार्कर ईआईएफ 3 बी, ईआईएफ 4 जी और जी 3 बीपी 1 नियमित रूप से इस्तेमाल किया जाता है क्योंकि ईआईएफ 3 बी और ईआईएफ 4 जी अनुवाद दीक्षा कारक होते हैं जिन्हें 48 एस * कॉम्प्लेक्स के घटक और जी 3 बीपी 1 एसजी फॉर्मेशन ( चित्रा 2 बी ) के लिए आवश्यक हैं। यह ज़रूरी है कि एक से अधिक एसजी मार्कर की आवश्यकता है, क्योंकि अलग-अलग एसजी से जुड़े विभिन्न एसजी-जुड़े कारकों की भर्ती है, और कुछ तनाव सीएसयू गठन के लिए गलत तरीके से प्रोसेस एग्रीगेशन

दूसरा, एसजीएस अनुवाद अवरोधन के कारण बनते हैं। हालांकि अनुवाद के अवरोध को विभिन्न तरीकों से पता लगाया जा सकता है ( उदाहरण के लिए, पारंपरिक [ 35 एस] मेट चेस लेबलिंग द्वारा), रिबोप्रोफेक्साइसेलेशन पसंदीदा है, क्योंकि यह इलाज कोशिकाओं में चल रहे प्रोटीन अनुवाद का पता लगाता है। यह तकनीक एसजी मार्करों के खिलाफ मानक इम्युनोफ्लोरेसेंस के साथ भी संगत है, इस प्रकार एसजीएस की एक साथ निगरानी और व्यक्तिगत कोशिकाओं में अनुवाद अवरोध की डिग्री के लिए अनुमति देता है। जैसा कि चित्रा 3 में देखा गया है, एसए और वीआरबी दोनों एसजी फॉर्मेशन को विभिन्न डिग्री में बढ़ावा देते हैं। जबकि SA एसजी के करीब 100% कोशिकाओं में पैदा होता है, वीआरबी लगभग 75% कोशिकाओं में एसजी के गठन को बढ़ावा देता है। एसजीएस को बढ़ावा देने की क्षमता अनुवाद अवरोध की डिग्री से संबंधित है: जबकि अनुपचारित कोशिकाओं का अनुवाद का एक उच्च बेसल स्तर होता है, एसए पूरी तरह से अनुवाद को रोकता है, लेकिन वीआरबी केवल पाअनुवाद से रोकता है ( चित्रा 3 )।

तीसरा, एसजीएस गतिशील हैं और पॉलिओसमों के अनुवाद के साथ संतुलन में हैं। तनाव के साथ या समवर्ती तनाव से पहले cycloheximide के साथ कोशिकाओं का इलाज करना पॉलिसम disassembly और एसजी गठन रोकता है। एसजी-पॉलिसोम संतुलन द्विदिश है, क्योंकि एसजीओं का प्रदर्शन करने वाले कोशिकाओं का प्रदर्शन साइक्लोहेक्सिमइड के साथ किया जा सकता है ताकि वे पॉलिसीम या मोनोसोम में एमआरएनए को फंसाने से एसजी डिससेमेंट लागू कर सकें, जब भी वे उत्पादक रूप से शुरू हों। एक महत्वपूर्ण नियंत्रण पोरोमासिकिन का उपयोग करना है, जो समयपूर्व समापन को बढ़ावा देने के द्वारा बढ़ाव को रोकता है, इस प्रकार एसजी के गठन के लिए गैर-पॉलिसोमनल एमआरएनपी की मात्रा बढ़ रही है। एसजी या एसआर या वीआरबी उपचार CHX या पुरो उपचार ( चित्रा 4 ) के साथ युग्मित होने पर एसजीएस में नाटकीय परिवर्तन मनाया जाता है। इस प्रकार, यह आकलन करना कि क्या कृत्रिम एसजीओं को साइक्लोहेक्सिमइड उपचार पर भंग किया जाता है, लेकिन पुरीमोसिन द्वारा संवर्धित या अप्रभावित एसजी पहचान में उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक पैरामीटर हैकटियन। बहुत कम, गैर-अनुयायी, प्राथमिक मानव अस्थिमज्जा सीडी 34 + कोशिकाओं में एमिटीन-लागू एसजी डिससैप्पिंग को साइटोस्पिनिंग 32 से पहले निलंबन में कोशिकाओं के इलाज के द्वारा सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया था।

सोडियम आर्सेनाइट का इस्तेमाल व्यापक रूप से एसआईजी को ईआईएफ 2 -एए फोस्फोरायलेशन 33 से प्रेरित करने के लिए किया जाता है, लेकिन इसे सावधानी से टाइटेट किया जाना चाहिए, क्योंकि यह कई प्रोटीनों को लक्षित करता है और 34 , 35 को कई सिग्नलिंग पथ सक्रिय करता है। विभिन्न सेल लाइनों सोडियम आर्सेनाइट के प्रति संवेदनशीलता की अलग-अलग डिग्री दर्शाती हैं। U2OS अपेक्षाकृत संवेदनशील होते हैं (100 माइक्रोन), जबकि COS7, MEF और हेला को 200 माइक्रोन की आवश्यकता होती है। डीयू-145 6 , प्राथमिक सामान्य मानव अस्थि मज्जा सीडी 34 + कोशिका 32 , मानव लिम्फोब्लास्ट 36 , माउस कॉर्टिकल न्यूरॉन्स 37 , और हू 7 कोशिकाओं 31 को 500-1,000 माइक्रोन की आवश्यकता होती है।

यहां वर्णित प्रायोगिक कार्यप्रवाह अलग-अलग कोशिकाओं में एसजीओं का पता लगाने और विभिन्न तनावों के तहत अनुमति प्रदान करते हैं। इस वर्कफ़्लो का प्रमुख लाभ यह है कि यह सरल है और सदाबहार एसजीएस के स्पष्ट पता लगाने के साथ-साथ तनाव-उपचार वाले सेल में सेलुलर अनुवाद की एक साथ जांच के लिए अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल U2OS कोशिकाओं का उपयोग करता है, लेकिन इसे विभिन्न सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। तनाव ग्रेन्युल अध्ययन के लिए इस्तेमाल की जाने वाली कोशिकाओं की एक हालिया और व्यापक सूची समीक्षा 11 है । नशीली दवाओं के उपचार के दिन कोशिकाओं की संख्या को 80% तक पहुंचने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। एकाग्रता और नशीली दवाओं के उपचार की अवधि भी समायोजित की जानी चाहिए, क्योंकि कोशिका अलग-अलग प्रतिक्रिया देती हैं। इसके अतिरिक्त, जब इस प्रोटोकॉल को 24-अच्छी तरह प्रारूप में सेट किया जाता है, तो इसे किसी भी आकार प्लेट या डिश में समायोजित किया जा सकता है, जहां प्लेटिंग और ड्रग ट्रीटमेंट के दौरान कवरलाप (किसी भी आकार का)NT। एसजी / पीबी मार्करों को व्यक्त करने वाली सेल लाइनों को उच्च-थ्रुपुट, सीआरएनए-आधारित स्क्रीन 33 और लाइव-सेल इमेजिंग 38 में इस्तेमाल किया गया है। एसजी असेंबली 39 अवरुद्ध रासायनिक यौगिकों का पता लगाने के लिए अंतर्जात एसजी मार्कर पीएपीपी के लिए दागली हेला कोशिकाओं का उपयोग करके छवि-आधारित स्क्रीनिंग का इस्तेमाल किया गया था। यह अनुमान लगाया गया है कि भविष्य में अध्ययन और अनुप्रयोगों में यह कार्यप्रवाह उपयोगी होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि पर इवानोव और एंडरसन प्रयोगशालाओं के सदस्यों को उनकी सहायक चर्चा और प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद करते हैं। पोलैंड में नेशनल साइंस सेंटर [एनएमओ -2012 / 06 / एम / एनजेड 3/00054 को डब्लूएस] अनुमोदित] यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [जीएम111700 और सीए 168872 से पीए, एन 0 9 9 4 9 8 पीआई को] द्वारा समर्थित था। डब्ल्यूएस ने पोलैंड (मोबिलिटी प्लस प्रोग्राम) में विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय और संयुक्त राज्य अमेरिका में अपने शोध के वित्तीय सहायता के लिए पोलिश-अमेरिकी फ़ुलब्राइट कमीशन को भी स्वीकार किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

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References

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