Methoden om Cytoplasmatische Foci te classificeren als Mammalian Stress Granules

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Stress Granules (SG's) zijn niet-membraan cytoplasmatische structuren die in cellen vormen die blootstaan ​​aan een verscheidenheid aan stressen. SG's bevatten mRNA's, RNA-bindende eiwitten, kleine ribosomale subeenheden, vertaalgerelateerde factoren en diverse cel signalerende eiwitten. Dit protocol beschrijft een workflow die gebruik maakt van verschillende experimentele benaderingen om bona fide SG's te detecteren, karakteriseren en kwantificeren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellen worden vaak uitgedaagd door plotselinge omgevingsveranderingen. Stress Granules (SG's), cytoplasmatische ribonucleoproteïne complexen die zich vormen in cellen blootgesteld aan stressomstandigheden, zijn betrokken bij diverse aspecten van celmetabolisme en overleving. SG's moduleren cellulaire signalering pathways, post-transcriptie gene expressie en stress response programma's. De vorming van deze mRNA bevattende korrels is direct verbonden met cellulaire vertaling. SG-montage wordt geactiveerd door geïnhibeerde translatie-initiatie, en SG-demontage wordt bevorderd door translatieactivering of door geïnhibeerde translatieverlenging. Deze relatie wordt verder onderstreept door de SG-samenstelling. Core SG componenten zijn vertraagde translation pre-initiation complexes, mRNA en geselecteerde RNA-bindende eiwitten (RBP's). Het doel van SG-assemblage is om cellulaire energie te behouden door translationally stalled housekeeping mRNAs te sequesteren, waardoor de versterkt translatie van stress-responsieve eiwitten mogelijk is. In additiOp de kerncomponenten, zoals vertraagde translation preinitiation complexes, bevatten SG's een overvloed aan andere eiwitten en signaalmoleculen. Defecten in de SG-vorming kunnen de cellulaire aanpassing aan stress verminderen en kunnen dus de celsterfte bevorderen. SG's en soortgelijke RNA bevattende granules zijn gekoppeld aan een aantal humane ziekten, waaronder neurodegeneratieve stoornissen en kanker, wat leidt tot de recente interesse in het classificeren en definiëren van RNA-granulatubtypen. Dit protocol beschrijft analyses om zoogdieren SG's te karakteriseren en te kwantificeren.

Introduction

Cellen hebben veel mechanismen om te reageren op stress. Sommige reacties vinden plaats op het post-transcriptie niveau en betreffen het reguleren van mRNA translatie en / of stabiliteit 1 , 2 . Stress-gemoduleerde mRNA translatie-arrestatie en afbraak worden geassocieerd met de vorming van specifieke niet-membraancellulaire foci, de meest goed gekenmerkte Stress Granules (SGs) 3 . SG's zijn cytoplasmatische foci die nontranslaterende mRNP's concentreren op translationally-arrested cellen die reageren op stress ( bijv. Oxidatie, warmtechok, voedingshongersnood en virale infectie) 4 . Naast niet-translaterende mRNA's bevatten SG's vertaalinitiatieffactoren, RNA-bindende eiwitten en verschillende signalering eiwitten 5 . SG's zijn biomarkers van geremd eiwitvertaling en veranderd RNA-metabolisme en zijn gekoppeld aan celoverleving en apoptose, signaalwegS en nucleaire processen 5 .

SG's zijn dynamische entiteiten, en hun vorming is nauw verbonden met de status van cellulaire vertaling 6 . Ondanks hun schijnbaar solide verschijning, schuiven de meeste SG-eiwitcomponenten snel in en uit, met een verblijftijd van seconden. Terwijl de SG's enkele minuten tot uren volhouden, zijn de meeste componenten in snelle flux. De remming van translatie-initiatie en de daaruit voortvloeiende demontage van translateerbare polysomen bevorderen de vorming van SG's; Dus, SG's zijn in evenwicht met het vertalen van polysomen. Dit polysoom / SG-evenwicht is de sleutel tot het onderscheiden van bona fide SG's van andere stress-geïnduceerde foci 6 , 7 .

Het in stand houden van translatie-initiatie houdt in dat de omzetting van vertaalvaardige pre-initiatiecomplexen die mRNA, translatie-initiatieffactoren (eIF) en 40S ribosomale subeenheden bevatten (s O-genaamde 48S complexen) in translationally stalled complexes (zogenaamde 48S * complexen) die kunnen samenvoegen in SGs 4 , 6 . SG's worden bevorderd door translatoire arrestatie in twee verschillende stappen stroomopwaarts van 48S complexe vorming: interferentie met de functies van het cap-binding eIF4F-complex ( bijv. Gericht op de eIF4A-subeenheid) of fosforylering van de a-subeenheid van translatie-initiatieffactor eIF2, gemedieerd door één Of meer van de vier eIF2 kinasen. De aanwezigheid van opgezette 48S complexen ( dwz 40S ribosomale subeenheden en geselecteerde translation initiatie factoren) is een kenmerk van SGs 8 , 9 .

SG's zijn gekoppeld aan verschillende pathologische toestanden, zoals virale infecties, neurodegeneratie, auto-immuniteit en kanker 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Gemuteerde vormen van verscheidene SG-componenten zijn geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten ( bijv. Amyotrofische laterale sclerose) waarin neuronen intracellulaire pathologische inclusies laten zien die actieve rollen kunnen spelen bij de neuronale dood 13 . Sommige virussen kapen SG-componenten om SG-vorming te remmen en virale replicatie te verbeteren 14 . Recente studies koppelen ook SG's aan kanker 15 en het overleven van kankercel onder chemotherapie en radiotherapiebehandelingen 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Hoewel dergelijke bevindingen grote belangstelling hebben voor de SG-biologie, ontbreken veel van de gepubliceerde rapporten belangrijke controles om de vorming van bona fide SG's van andere stress-geïnduceerde foci te onderscheiden.

SG's werden aanvankelijk beschreven als niet-membraan cytoplasmatische foci samengesteld uit geselecteerde mRNA-bindende eiwitten (RBP's), waaronder T-cel ntracellulaire antigeen 1 (TIA-1) en poly-A-bindend eiwit (PABP); Vertaling initiatief factoren; Polyadenyleerde mRNA; En kleine ribosomale subeenheden 4 , 6 , 21 , 22 . Traditioneel is hun samenstelling bepaald door technieken zoals immunostaining en de ectopische expressie van fluorescent gelabelde eiwitten 23 , 24 . Vanwege hun zeer dynamische aard blijft de immunolocalisatie van SG-eiwitten en / of mRNA's de bepalende methodologie voor het detecteren van SG's 23 , 24 . Tot op heden worden veel RBP's en andere eiwitten (meer dan 120 afzonderlijke eiwitten) beschreven als SG-componenten 11 . Zoveel SG-gelokaliseerde eiwitten veranderen hun lokalisatie op zowel stressafhankelijke als onafhankelijke wijze en kunnen zich ophopen bij andere intracellulaire compartimenten en foci. Het is belangrijk om juiste SG-markers te kiezen en functionele criteria te gebruiken om SG's te onderscheiden van andere soorten stress-geïnduceerde brandpunten. Bona fide SG's bevatten mRNA, translatie initiatief factoren en kleine ribosomale subeenheden en zijn in dynamisch evenwicht met vertaling.

Deze eenvoudige workflow is ontworpen om te bepalen of stress-geïnduceerde foci bona fide SG's zijn. Deze workflow bevat verschillende experimentele benaderingen met behulp van U2OS-cellen, cellen die vaak gebruikt worden om SG's te studeren. Deze cellen zijn ideaal, omdat ze een groot cytoplasma hebben, zijn relatief vlak en hechten sterk aan glazen deklagen. Andere celtypen kunnen gebruikt worden om SG's te studeren, maar het is belangrijk om zich ervan bewust te zijn dat verschillen in timing, drugconcentratie en overvloed van SG-nucleerende eiwitten de kinetiek en het compo kunnen veranderensitie. Daarnaast reageren sommige cellen op paraformaldehydefixatie door het vormen van celoppervlakken te vormen, waardoor er een ruche verschijning is die de punctale lokalisatie van sommige SG markers veroorzaakt; Zonder zorgvuldige analyse kunnen deze worden gemeld als SG's. Dit wijst op de noodzaak om alle criteria die nodig zijn om stress-geïnduceerde foci te identificeren als bona fide SG's te beoordelen. Vinorelbine (VRB), een kankertherapeutisch die SGS 20 bevordert, alsmede Sodium Arsenite (SA), een robuuste en goed gekenmerkte SG-inducer, worden gebruikt als stress voor de experimenten in dit protocol.

Canonische SG's bevatten meerdere SG markers (zowel eiwitten als mRNA's) die zich in cytoplasmatische foci colocaliseren. Dit protocol gebruikt zowel immunofluorescentie als fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de lokalisatie van eiwitmarkers en polyadenyleerde mRNA 22 te detecteren. In het kort gebruikt indirecte immunofluorescentie antilichamen ( i.e. Primaire antilichamen) die specifiek zijn voor een bepaald eiwit om het in de cel te detecteren. Daarna herkennen secundaire antilichamen (meestal speciesspecifieke) die aan fluorochromen zijn gehecht het primaire antilichaam en onthullen de lokalisatie van de target eiwit. Fluorescerende microscopie wordt gebruikt om het gelokaliseerde signaal binnen de cel te detecteren. Door gebruik te maken van antilichamen die in verschillende soorten worden geproduceerd en ze te detecteren met anders gekleurde secundaire antilichamen, kan de detectie van de colocalisatie van meerdere antilichamen worden aangetoond, aangeeft dat hun eiwitdoelstellingen op dezelfde locatie gevonden worden 23 . Het is belangrijk om markers te selecteren die zijn geverifieerd om te colocaliseren bij bona fide SG's.

FISH maakt gebruik van een gelabelde sonde die baseert op een specifieke RNA- of DNA-sequentie 25 . Om mRNA te detecteren, gebruikt dit protocol een biotinyleerde oligo (dT) 40 probe die hybridiseert (of basisparen) aan de polyA-staart van mRNA ( dat wil zeggen polyA FISH). De biotinyleerde probe wordt dan gedetecteerd met behulp van fluorescent geconjugeerde streptavidine, aangezien streptavidine een hoge affiniteit voor biotine heeft. Bij het beoordelen van SG's is het belangrijk om polyA FISH te koppelen aan immunofluorescentie die een SG-marker detecteert, zoals bij bona fide SG's, de twee signalen moeten colocaliseren.

Met behulp van dit protocol wordt colocalisatie op meerdere manieren beoordeeld. In een multi-kanaal ( dwz RGB: rood, groen en blauw), zal colocalisatie de kleur van het overlappende signaal wijzigen ( bijv. Gekolokaliseerd rood en groen verschijnen geel) 23 . Daarnaast wordt colocalisatie grafisch gekwantificeerd met behulp van line scan analyse, waarbij de intensiteit van elke kleur wordt gemeten over een bepaalde lijn 8 , 20 . Dit protocol beschrijft twee line scan analyse procedures met behulp van ImageJ 26 . Eén procedure is handmatig en gaat door het hele procesDe andere maakt gebruik van een macro, of een eenvoudig programma dat de handmatige stappen automatiseert. Het is belangrijk om door de handleiding te gaan om de macroprocedure te begrijpen.

SG's vormen in cellen waar de vertaling wordt onderdrukt; Daarom moeten cellen met SG's verlaagde niveaus van globale vertaling vertonen in vergelijking met onbehandelde cellen. Experimenteel wordt ribopuromycylering gebruikt. Puromycine en emetine worden gedurende een korte duur voorafgaand aan fixatie aan cellen toegevoegd, waardoor de puromycine in actieve vormende polypeptiden kan worden opgenomen, waardoor terminatie 27 , 28 wordt veroorzaakt. Behandeling met emetine is nodig om herinitatie te voorkomen 29 . Puromycine kan dan worden gedetecteerd met anti-puromycine antilichaam, waardoor een momentopname van actieve vertaling wordt gegeven. Deze methode wordt gebruikt omdat het snel is, hoeft niet te verhongeren met een medium dat geen bepaald aminozuur heeft (en mogelijk de cellen voorspannen) en onthult deSubcellulaire lokalisatie van eiwitvertaling. Andere methoden, met name door gebruik te maken van gemodificeerde aminozuuranaloga, zoals het methionine-analoog L-azidohomoalaïne (AHA), gekoppeld aan "click-it" chemie 30 , zijn gebruikt om aan te tonen dat cellen die SG's bevatten, veel lagere vertaling vertonen dan naburige cellen 31 . Deze techniek vereist echter methionine-hongersnood gevolgd door puls-etikettering gedurende 15-30 minuten. Methionine-hongersnood vormt een extra stress, terwijl de lange etiketteringstijd ( dwz 15-30 minuten) resulteert in de meting van cumulatieve in plaats van lopende vertaling, en laat ook de nieuw gesynthetiseerde eiwitten van hun syntheseplaats verplaatsen naar hun uiteindelijke bestemming binnen de cel. Daarentegen is ribopuromycylering veel sneller en is verenigbaar met elk medium, zoals het glucosevrije medium dat wordt gebruikt om SG's te induceren via glucosestoornis.

Canonische SG's zijn in dynamisch evenwichtMet het actief vertalen van polysomen. Dit kan experimenteel worden beoordeeld door monsters te behandelen met de geneesmiddelen die polysomen stabiliseren of destabiliseren, waardoor het evenwicht tussen SG en polysomen 23 wordt afgebroken. Cycloheximide (of emetine, die zich op dezelfde manier gedraagt) blokkeert verlenging door "bevriezing" van ribosomen op mRNA, waardoor het pool van beschikbare niet-polysomale mRNP's die SG's kunnen vormen, verminderen. Experimenteel kan dit op twee manieren worden gebruikt: door het toevoegen van cycloheximide (of emetine) vóór stress om SG-vorming te voorkomen of door cycloheximide (of emetine) toe te voegen nadat de SG's hebben gevormd, zelfs zonder het stressmiddel te verwijderen, waardoor SG-demontage wordt veroorzaakt Preinitiatie complexen worden langzaam toegelaten in de polysoomfractie. In tegenstelling hiermee veroorzaakt puromycine vroegtijdige beëindiging en bevordert polysoom demontage, waardoor het pool van initiërende mRNA's die in staat zijn om in SG's te assembleren, verhogen. Experimenteel verhoogt de behandeling met puromycine het aantal SG's of verlaagt de thresolD waarbij ze vormen in reactie op gegradeerde stress of drugs dosering. Bij het beoordelen van het effect van puromycine is het belangrijk om een ​​submaximaal niveau van het geneesmiddel van belang te gebruiken, aangezien puromycine naar verwachting het effect van het geneesmiddel verhoogt en het percentage cellen dat SG's toont, verhoogt - dit kan niet optreden als het geneesmiddel / Stress veroorzaakt in eerste instantie SG's in 100% van de cellen. Dit komt in tegenstelling tot cycloheximide behandeling, die SG's demontert en het beste werkt wanneer ~ 95% van de cellen SG's eerst laat zien, zodat de grootste mogelijke daling waargenomen en nauwkeurig gekwantificeerd kan worden.

Dit protocol biedt een kader om SG's in zoogdiercellen te bestuderen. Methoden omvatten: (1) immunofluorescente kleuring en ImageJ analyse om de colocalisatie van de klassieke SG-geassocieerde markers eIF4G, eIF3b en Ras GTPase-activerend eiwitbindend eiwit 1 (G3BP1) in vermoedelijke SG's te beoordelen; (2) oligo (dT) fluorescentie in situ hybridisatie (polyA FISH) om polyadenyleerde mRNA te detecteren; (3) cycloheximide en puromycine behandeling om te bepalen of stress-geïnduceerde foci in dynamisch evenwicht met polysomen zijn; En (4) ribopuromycylering om de translatorische status van cellen die putatieve SG's bevatten te beoordelen. Samen kunnen deze analyses bepalen of stress-geïnduceerde foci kan worden ingedeeld als bona fide SG's.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celbereiding

  1. Voeg autoklaafde deklagen toe aan 12 putjes van een 24-putjesplaat, zoals aangegeven in figuur 1A ; Dit kan gedaan worden met behulp van een steriele Pasteur pipette die aan een vacuüm is bevestigd om elke deksel op te halen. Trek de deksel aan de zijkant van de put voorzichtig aan om de zuiging los te laten, zodat de deklaag in de put kan vallen.
  2. Plaat 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarcomacellen per put bij een eindvolume van 500 μl medium. Verplaats de plaat zijkant naar zijkant en omhoog en omlaag om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn.
  3. Druk voorzichtig op de deklaagjes met een schone P1000-tip om ervoor te zorgen dat de deklaag op de bodem van de put staat en dat er geen bellen onder de deklaag liggen.

2. Stressende cellen

  1. De volgende dag, controleer het bord visueel om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verspreid zijn en gelijkmatig samenvloeien over de deklaag, aangezien variaties tussen saMples kan de reproduceerbaarheid van de resultaten nadelig beïnvloeden. Gebruik een 10X-doelstelling op een omgekeerde weefselkweekmicroscoop.
  2. Voorverhit het medium tot 37 ° C. Vermijd koude of hete media op de cellen, aangezien deze respectievelijk koude schok of warmte schokken veroorzaken.
  3. Verdun drugs in voorverwarmde media. Voor elke verschillende geneesmiddelconcentratie bereiden 2 putjes die 500 μl medium bevatten. Bereid nog eens 500 μL voor verlies tijdens pipettering. Aliquot 4 buizen, die elk 1,5 ml bevatten.
    1. Voor natriumarseniet: Voeg bij elke bron die 500 μL bevat 1,5 μL 100 mM natriumarseniet (eindconcentratie: 100 μM) toe of voeg 0,75 μl 100 mM natriumarseniet (eindconcentratie: 50 μM) toe.
    2. Voor vinorelbine: voeg bij elke bron die 500 μL bevat 22,5 μL 10 mM vinorelbine (uiteindelijke concentratie: 150 μM) toe of voeg 18,75 μl 10 mM vinorelbine (eindconcentratie: 100 μM) toe.
      OPMERKING: Natriumarseniet Is een goed gekenmerkt en veelgebruikte stressgranulaatinducer en wordt daarom klassiek gebruikt als een positieve controle.
  4. Verwijder en verwijder het medium uit de putten B1 - 4 en C1 - 4. Voeg de media met drugs en wacht ongeveer 60 minuten (Figuur 1A).
    1. Voeg 500 μl medium met 100 μM natriumarseniet toe aan putten B1 en B2. Voeg 500 μl medium met 50 μM natriumarseniet toe aan putjes B3 en B4.
    2. Voeg 500 μl medium met 150 μM vinorelbine toe aan putten C1 en C2. Voeg 500 μl medium met 125 μM vinorelbine toe aan putjes C3 en C4.
  5. 30 minuten voor fixatie, behandel de putjes in kolom 2 met 5 μl cycloheximide (1 mg / ml voorraad) en de putten in kolom 4 met 2 μl puromycine (1,25 mg / ml voorraad). Steek de plaat voorzichtig om te mengen voordat u de plaat terug in de 37 ° C-incubator plaatst.

3. Cel Fixatie en Immunofluorescentie

Nt "> OPMERKING: Controleer vóór het experiment dat de methanol tot -20 ° C is gekoeld. Maak buffers, inclusief fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 5% normaal paardserum (NHS) in PBS en 4% paraformaldehyde (PFA ) In PBS.

  1. Gooi de media weg en doe de putjes af met dekbedjes met PBS. Afhankelijk van de gebruikte medicijnen, kan het belangrijk zijn om de media die medicijnen bevatten, goed te verwijderen; Neem contact op met het lokale veiligheidsbureau voor specifieke instructies. Om efficiënt te wassen, vul een squeeze fles met PBS, snij de tip om een ​​zachte stroom in plaats van een strakke stroom toe te staan ​​en gebruik dit om PBS toe te voegen aan elke put na het aspireren van de originele PBS.
  2. Bevestig de cellen met ~ 250 μl 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder zachte agitatie. Dek de bovenkant van de deklaag volledig af met PFA; 250 μL moet voldoende zijn, maar indien niet, voeg nog meer toe. Vermijd altijd pipettering direct op de dekglazen, aangezien sommige cellen (of stressbehandelingen van cellen) de bijlage kunnen wijzigen en tHij dwingen van pipettering kan de cellen loslaten.
  3. Verwijder de PFA en verwijder het goed. Neem contact op met het lokale milieucontrole kantoor voor details over het correct verwijderen van paraformaldehyde.
  4. Voeg ~ 250 μL methanol (-20 ° C) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder zacht grijpen; Dit permeabiliseert en platt de cellen.
  5. Verwijder en verwijder de methanol en blokkeer de cellen door ~ 250 μl 5% NHS gedurende 1 uur bij RT O / N bij 4 ° C aan te brengen. Neem contact op met het lokale veiligheidsbureau voor milieubescherming voor meer informatie over het correct verwijderen van methanol.
  6. Voor primaire antilichamen verdund de antilichamen in 5% NHS.
    OPMERKING: Het gebruik van meerdere SG markers is de sleutel om te bevestigen of de waargenomen granules bona fide SG's zijn. Het aantal SG markers dat kan worden gebruikt hangt af van de filters die beschikbaar zijn in de microscoop. Als standaard groene, rode en verre rode filtersets beschikbaar zijn, gebruik G3BP1, eIF4G en eIF3b bij een 1/250 verdunning.
  7. Was de putjes 3x met PBS en incubeer elke was gedurende 5 minuten.
  8. Voor secundaire antilichamen verdund alle secundaire antilichamen (1/250 verdunning) en Hoechst-kleurstof (1 / 1.000 verdunning) in 5% NHS.
    1. Voeg bij dit experiment (12 deklips bij 250 μL elk-Totaal: 3 ml 5% NHS) 12 μL van elk van de volgende: Cy2-Muis, Cy3-Konijn en Cy5-Geit (een 1/250 verdunning van elk ) En voeg 3 μL Hoechst-kleurstof toe.
    2. Incubeer de dekglazen met de secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij RT. Tijdens deze en de volgende stappen beschermt u de monsters van het licht door de plaat te bedekken met een doos of door het plaatsen van folie boven de weefselkweekschotel.
  9. Was de weDriemaal met PBS gedurende 5 minuten elk.
  10. Monteer de dekglazen op gelabelde glazen glijbanen met montagemedium. Verhit het montagemedium in een warmteblok van 37 ° C gedurende 10 minuten; Dit vermindert de viscositeit en maakt het makkelijker om te pipetten. Met een snij P200 tip, pipet 25 μL montagemedium per deklaag op een glazen glijbaan; 4-8 deksels kunnen op één glazen glijbaan passen, mits de microscoopfase dit toelaat. Gebruik de fijne tang om de deklaag van de put naar de glijbaan over te brengen, zorg ervoor dat u de celzijde op het montagemedium plaatst. Met een schone P200-tip drukt u op de deklaag omlaag.
  11. Zodra alle deklagen zijn gemonteerd, gebruik gevouwen laboratoriumweefsel om het overmatige montagemedium op te ruimen door het laboratoriumweefsel zeer stevig op de dia te drukken. Gebruik een squeeze-fles met H 2 O om het overmatige montagemedium af te spoelen en herhaal dan de blotting met gevouwen laboratoriumweefsel om het water te verwijderen.

4. Fluorescentie in situ </ Em> Hybridisatie (FISH)

  1. Plate en behandel de cellen met behulp van stappen 1 en 2.1-4 als een gids; Het is alleen nodig om de cellen in kolom 1 te platen, omdat er in het volgende experiment slechts 3 deklips nodig zijn.
  2. Zorg ervoor dat alle buffers bereid zijn ( dat wil zeggen 4% PFA in PBS, 70% ethanol in water, 2x Zout-Natrium-Citraat (SSC) en 5% NHS), dat de methanol afgekoeld wordt tot -20 ° C en dat De hybridisatieoven wordt opgewarmd tot de juiste temperatuur.
  3. Voer stappen 3.1-3.3 uit om de cellen te wassen en te repareren.
  4. Permeabiliseer cellen gedurende 10 minuten bij -20 ° C methanol.
  5. Verwijder de methanol en incubeer de dekglazen in 70% ethanol. Plaats de plaat bij 4 ° C overnacht. Afdicht de plaat met parafilm om verdamping te voorkomen.
  6. De volgende dag verwijder de ethanol en rehydrateer de cellen door 500 μL 2x SSC toe te voegen. Incubeer de dekglazen gedurende 5 minuten met zachte agitatie bij RT.
  7. Verwijder de 2x SSC en voeg 500 toeΜL 2X SSC. Incubeer gedurende 5 minuten onder zachte agitatie.
  8. Plaats een stuk parafilm plat op de bodem van de hybridisatieoven. Pipetteer 25 μl hybridisatiebuffer op de parafilm voor elke deklaag. Verwijder de deksel van de 24-putjes schotel (op dit punt zijn de dekglazen aan de zijde van de cel) en plaats de deklaagzijde op de hybridisatiebuffer. Doe dit bij 42 ° C of optioneel bij 65 ° C gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: het voltooien van deze stap bij 65 ° C zal cellulaire RNA's denatureren; Dit kan het signaal verbeteren als het polyA gemaskeerd wordt door interacties met eiwitten.
  9. Verdun de Biotin-Oligo (dT) sonde (100 ng / μl) in hybridisatiebuffer tot een concentratie van 2 ng / μL; 25 μL per deklaag is voldoende.
  10. Voor elke deklaag, pipetteer 25 μL hybridisatiebuffer die Biotin-Oligo (dT) op het parafilm bevat. Pak de deklap met tang en pak de rand van de deklap voorzichtig aan op een laboratoriumweefsel om overmaat te verwijderenHybridisatiebuffer. Breng de deklaag over naar de hybridisatiebuffer met Biotin-Oligo (dT); Onthoud de celzijde omlaag te houden.
  11. Plaats de dekglazen in een hybridisatiebox om de verdamping te beperken. Incubeer de deklagen met Biotin-Oligo (dT) in hybridisatiebuffer gedurende 60 minuten bij 42 ° C.
  12. Plaats 2x SSC in de hybridiseringsoven om deze toe te staan ​​tot 42 ° C.
  13. Voeg ~ 500 μL warmte 2x SSC toe aan de putjes in de 24-putschotel en gebruik de pincet om de dekglazen over te brengen naar de put. Incubeer gedurende 10 minuten.
  14. Herhaal de bovenstaande wasstap twee keer bij 42 ° C en daarna tweemaal bij RT.
  15. Voltooi stappen 3.5-3.10, zorg ervoor dat u een streptavidine fluorochroom gebruikt om de Biotin-Oligo (dT) in plaats van een conventioneel antilichaam te detecteren.

5. Ribopuromycylatie Assay om de translatiele status te beoordelen

  1. Plaat U2OS-cellen op de deklijsten, zoals aangegeven in stap 1, maar alleen een deklip per voorwaarde (hierinGeval, 3 deklagen: niet-behandeld, 100 μM natriumarseniet en 150 μM vinorelbine) ( Figuur 1 A).
  2. Strescellen die het protocol gebruiken in stap 2, voltooien stappen 2.1-2.4.
  3. 5 min voor fixatie, voeg 2 μL puromycine (voorraad: 1,25 mg / ml, verdun 2 μL in 500 μl om een ​​uiteindelijke puromycinconcentratie van 5 μg / ml) en 2,9 μl emetine (voorraad: 20 μg / ml; 2,9 μL aan dezelfde oplossing die al het puromycine bevat) aan elke put die 0,5 ml bevat.
  4. Voltooi stap 3.1-3.10 zoals hierboven aangegeven, met behulp van een anti-puromycine antilichaam (1/1000 verdunning) om puromycine te detecteren. Gebruik ideaal twee andere SG markers in de overige kanalen.
  5. Bij het kwantificeren van het puromycinesignaal, neem alle afbeeldingen met dezelfde belichting. Kies deze belichting met behulp van het helderste (onbelaste) voorbeeld en neem een ​​zo helder mogelijk beeld zonder verzadiging.
    OPMERKING: De intensiteit van het anti-puromycine fluorescerende signaal representeertBevat lopende vertaling, als puromycinesubstituten voor een aminozuur, omvat het neusproteïne, en handhaaft de voortijdige beëindiging van het eiwit.

6. Image Acquisition and Analysis

  1. Kwantificering van stress granules
    1. Om SG's te kwantificeren, verwerven 3 tot 5 beelden in totaal> 100 cellen per monster met een 40X-doelstelling. Als alternatief kunt u afbeeldingen verkrijgen met andere doelen, maar zorg ervoor dat> 100 cellen per deklaag worden geteld en dat de vergroting groot genoeg is om de korrels duidelijk te visualiseren. Doe dit door de deklip in vijf ruw gelijke gebieden te verdelen en willekeurig een veld uit elke regio te selecteren ( figuur 1B ); Afbeeldingen van hetzelfde veld moeten alle kanalen bevatten om de colocalisatie van markers te beoordelen.
    2. Zodra alle afbeeldingen zijn verworven, voeg de kanalen samen. Sommige camera software zal dit automatisch doen, terwijl anderen handmatig samenvoegen; Dit kan gedaan worden metImageJ door alle afbeeldingen te openen en vervolgens [Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen].
    3. Tel het totale aantal cellen handmatig door het aantal kernen te tellen, met behulp van Hoechst als de kernmarkering. Tel handmatig het aantal cellen dat meer dan twee SG's per cel bevat.
      OPMERKING: Als u bijvoorbeeld een samengevoegde driekanaalbeeld met G3BP1 (groen), eIF4G (rood) en Hoechst (blauw) gebruikt, telt u de kernen (of het aantal cellen) met behulp van het blauwe kanaal. Tel dan SG-positieve cellen als die met twee of meer gele foci per cel. De korrels zullen geel verschijnen, zoals groen van G3BP1 en rood van eIF4G verschijnen geel als colocalized.
    4. Bepaal het percentage cellen die SG positief zijn door de gegevens uit de 3-5 onafhankelijke gebieden te combineren en bereken vervolgens:
      Aantal SG positief / aantal kernen) * 100 = procent van de SG-positieve cellen
  2. Colocalisatie beoordelen via Line Scan Analysis - Handmatige methode
    1. OpenImageJ. Download het gratis van ()
    2. Open de ROI-manager: [Analyseer | Tools | ROI manager ...].
    3. Open de samengevoegde afbeelding in ImageJ: [File | Open].
    4. Gebruik het regelgereedschap dat in de toolbar ImageJ staat, voeg een regel toe die door een SG gaat, zorg ervoor dat u voor en na de SG opneemt. Voeg deze regel toe aan de ROI manager door op [Add] in het ROI manager venster te klikken.
    5. Verdeel het samengevoegde beeld in afzonderlijke kanalen om de lokalisatie van elke marker aan de korrel te beoordelen: [Afbeelding | Kleur | Split Channel]; Dit zal het samengevoegde beeld splitsen in drie zwart-wit beelden.
    6. Zorg ervoor dat de lijn in het zwart-witbeeld is geselecteerd; De lijn is geselecteerd als het in de afbeelding verschijnt. Zo niet, klik in het venster ROI Manager op de regel in het paneel; Dit zal de lijn in blauw in het ROI-beheervenster markeren en de lijn zichtbaar maken op het zwart-witbeeld. Als de lijn nog steeds niet verschijnt, moet u ervoor zorgen dat "alles weergeven" ch isEcked in de ROI manager en klik vervolgens op de lijn in de afbeelding.
    7. Analyseer de intensiteit van de lijn: [Analyseer | Plot Profiel]; Dit brengt het venster 'Plotprofiel' op, die de intensiteit van het signaal over de lijn afbeeldt.
    8. Klik in het venster 'Plotprofiel' op [Lijst], waarin een venster wordt weergegeven dat de ruwe gegevens van de grafiek bevat. Kopieer alle gegevens in dit venster en plak het in een spreadsheet bestand. Hiertoe selecteert u alle gegevens in het venster: [Bewerken | Selecteer alles]. Kopieer de datum: [Bewerken | Kopiëren]. Open een spreadsheet bestand en plak de gegevens: [Edit | Plakken].
    9. Voltooi stap 6.2.6 - 6.2.8 voor elk kanaal afzonderlijk. Zorg ervoor dat u het kanaal dat wordt beoordeeld, bijhouden.
    10. In een spreadsheet genereren u een lijngrafiek van de resultaten. Selecteer de kolommen die gegevens bevatten door op [control] te drukken en op de letter bovenaan elke kolom te klikken. Selecteer dan de lijngrafiek: [Insert | Lijn grafiek].
    11. Herhaal deze analyse voor multIple stress granules over meerdere onafhankelijke experimenten.
  3. Colocalisatie beoordelen via Line Scan Analysis - ImageJ Plugin
    1. Download en installeer het RGB-profielhulpmiddel van de ImageJ-website (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Als het correct is geïnstalleerd, moet er een rood, groen en blauw (RGB) -pictogram verschijnen in de werkbalk.
    2. Open de afbeelding ( bijv. Tiff, JPG) in ImageJ: [File | Open].
    3. Klik op het RGB-pictogram in de ImageJ-werkbalk.
    4. Klik en sleep om een ​​lijn toe te voegen die zich uitstrekt via een SG, en zorg ervoor dat u aangrenzende gebieden bevat; Een afbeelding van het histogram verschijnt in een pop-upvenster.
    5. Sla de gegevens op als een afbeelding: [Bestand | Opslaan als | Tiff]. Als alternatief exporteer en grafeer dan de gegevens in een ander grafisch programma met stap 6.2.8 hierboven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stress-geïnduceerde foci zijn niet noodzakelijkerwijs SG's. SG's zijn geclassificeerd als cytoplasmatische foci die mRNAs, translatie-initiatieffactoren en RNA-bindende eiwitten bevatten en in evenwicht zijn met actieve vertaling. Bovenstaande protocol kan gebruikt worden als een sjabloon om te karakteriseren of een bepaalde spanning bona fide SG's induceert.

SG's colocaliseren met andere bekende SG markers, inclusief zowel eiwitten als mRNA. SA en VRB induceeren cytoplasmatische foci die G3BP1, eIF4G en eIF3b bevatten ( Figuur 2A ). De colocalisatie van deze markers wordt bevestigd met behulp van lijn scan analyse en single channel beelden met verhoogde vergroting ( Figuur 2A ). Daarnaast bevatten deze foci Mrna, zoals aangegeven door polyA FISH, en het oligo (dT) -signaal colocaliseert met het G3BP1 immunofluorescentie signaal ( Figuur 2B ). Het is cruciaal om aan te tonen dat de polyA-FISHSignaal overlappingen met een bekende SG markering, omdat een stress meerdere typen foci kan bevorderen.

SG's optreden tijdens een translationeel geïnhibeerde toestand. Zowel VRB als SA bevorderen een translationeel onderdrukte staat, zoals experimenteel beoordeeld met ribopuromycylering ( Figuur 3 ). Bona fide SG's zijn in dynamisch evenwicht met het actief vertalen van polysomen. SA- en VRB-geïnduceerde SG's worden opgelost met CHX, die polysomen op mRNA's verplaatst, waardoor polysoom demontage wordt gestaakt en SG's voorkomen ( Figuur 4A, 4B ). Omgekeerd worden meer SA en VRB SG's geïnduceerd na behandeling met puro, aangezien puro polysoom demontage bevordert, waardoor SG-vorming wordt bevorderd ( Figuur 4A, 4C ).

Samenvattend, zoals bij de positieve controle SA, induceert VRB bona fide SG's die: (1) colocaliseren met bekende SG markers, (2) zowel eiwit als mRNA ( Figu Re 2), (3) worden gevonden in cellen waar vertaling wordt onderdrukt ( Figuur 3 ) en (4) zijn in dynamisch evenwicht met actieve vertaling ( Figuur 4A-4C ).

Figuur 1
Figuur 1: Experimentele Diagrammen. ( A ) Zaadcellen op de dekglazen die eerder in een 24-putjesplaat zijn geplaatst, zoals aangegeven. Behandel Rijen A en B gedurende 60 minuten met SA of VRB met behulp van de concentratie in μM zoals aangegeven. Na 60 minuten, voeg CHX (eindconcentratie: 20 μg / ml voor kolom 2) of puro (20 μg / ml puromycine voor kolom 4) toe aan het geneesmiddel bevattende medium. Vervolg gedurende 30 minuten incubatie voorafgaand aan fixatie en kleuring. ( B ) Diagram van een deklaag, waarin de velden worden aangegeven die moeten worden geteld voor het tellen. De deklaag is verdeeld in vijf ruwweg gelijke gebieden; Er wordt in elke regio één afbeelding gemaakt."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 2
Figuur 2: SA en VRB induceert cytoplasmatische Foci die SG Markers anPoly (A) mRNA bevatten. ( A ) U2OS-cellen die immunostained zijn voor G3BP1 (groen), eIF3b (rood) en eIF4G (blauw). Cellen werden behandeld met 100 μM SA of 150 μM VRB gedurende 60 minuten of werden niet behandeld (controle). Gezoomde gebieden worden vergroten (2X) en worden weergegeven als afzonderlijke kanalen in zwart-wit (onder). De grafiek geeft de lijn scan analyse van een regio (witte lijn) korrel aan en toont de mate van overlap of colocalisatie. De schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm. ( B ) PolyA-FISH gekoppeld met immunostaining detecteert polyA mRNA met een oligo (dT) 40 sonde (rood), G3BP1 (groen) wordt gedetecteerd onder toepassing van een anti-G3BP antilichaam en nucleair DNA wordt gedetecteerd met behulp van Hoechst-kleurstof (blauw). Zoomed regions (2X), single-channel beelden, en de lijn scan analyse tonen colocalization. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: SA en VRB Behandeling OorzaakTranslatie Onderdrukking. De immunofluorescentie van U2OS-cellen gedurende 5 minuten pulsgemerkt met puromycine na de aangegeven behandelingen. Puromycine (groen), eIF3b (rood) en nucleair DNA gekleurd met Hoechst (blauw). De cellen werden behandeld met 100 μM SA of 150 μM VRB gedurende 60 minuten of werden niet behandeld (controle). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een ​​groter vers te zienIon van deze figuur.

Figuur 4
Figuur 4: SA en VRB leiden tot cytoplasmatische Foci die in dynamisch evenwicht zijn met polysomen. ( A ) Algemeen schema dat de polysoom / SG-relatie beschrijft. ( BC ) U2OS cellen gekleurd voor G3BP1 (groen), eIF3b (rood) en nucleair DNA met behulp van Hoechst (blauw). Cellen werden behandeld met 100 μM SA of 150 μM VRB gedurende 60 minuten of werden niet behandeld (controle) voorafgaand aan de toevoeging van ( B ) CHX (cycloheximide, 20 μg / ml), ( C ) puro (Puromycine, 10 μg / ml ), Of geen additief voor nog eens 30 minuten incubatie. De getallen komen overeen met het percentage cellen met SG's in een representatief experiment. Schaalbalk = 25 μm, in (BC). Klik hier om een ​​groter te bekijkenVersie van deze figuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zoals blijkt uit immunohistologische studies in meerdere ziekten, leidt chronische stress tot de vorming van verschillende intracellulaire foci. Bijvoorbeeld, de meeste neurodegeneratieve ziekten worden gekenmerkt door intracellulaire aggregaten van onoplosbare eiwitten. De aanwezigheid van SG-geassocieerde eiwitten in dergelijke aggregaten is vaak de basis om te concluderen dat dergelijke foci SG's zijn. Een soortgelijke conclusie wordt ook getekend wanneer SG-markering-positieve cytoplasmatische foci waargenomen worden in cellen behandeld met nieuwe stress-stimuli. Dit protocol biedt een eenvoudige workflow om bona fide SG's te identificeren.

Verschillende criteria moeten worden voldaan voor vermoedelijke SG's als zodanig te bevestigen, met inbegrip van de karakterisering van zowel samenstelling als dynamiek. Ten eerste zijn SG's cytoplasmatische foci die translationally stalled mRNPs bevatten. Zo is de eerste aanpak om hun samenstelling te karakteriseren door gebruik te maken van twee microscopie gebaseerde technieken, namelijk polyA-FISH en IF. FISH is een betrouwbare methode om visueel te makenIze mRNA's die colocaliseren met SG's. Een oligo (dT) 40 sonde wordt gebruikt om polyadenyleerde mRNA's te detecteren die in spanningsomstandigheden in SG's verpakken. Aangezien oligo (dT) geen deadenylated mRNAs detecteert, die kerncomponenten zijn van Processing Bodies (PBs), is de aanwezigheid van een sterk oligo (dT) signaal in cytoplasmatische foci een eerste aanduiding (hoewel niet genoeg voor definitie) dat deze foci zijn SGS. De tweede test is om de colocalisatie van een poly (A) signaal aan te tonen met andere SG markers ( bijv. G3BP1) ( Figuur 2A ). Dit wordt gedaan door het uitvoeren van IF tegen SG markerproteïnen. De SG markers eIF3b, eIF4G en G3BP1 worden routinematig gebruikt omdat eIF3b en eIF4G translatie-initiatief factoren zijn die bekend zijn als componenten van 48S * complexen en G3BP1 is vereist voor SG-vorming ( Figuur 2B ). Het is belangrijk om te benadrukken dat meer dan één SG-marker nodig is, aangezien verschillende stressen verschillende SG-geassocieerde factoren aan SG's aanwerven en sommige spanningen kunnen cAuse proteïne aggregatie die mislukt kan worden voor SG-vorming.

Ten tweede worden SG's gevormd door translation inhibitie. Terwijl de remming van de translatie kan worden gedetecteerd door verschillende benaderingen ( bijv. Door traditionele [ 35 S] Met chase etikettering), verdient ribopuromycylering de voorkeur, aangezien het lopende eiwitvertaling in behandelde cellen detecteert. Deze techniek is ook compatibel met standaard immunofluorescentie tegen SG markers, waardoor het gelijktijdig toezicht op SG's en de mate van translatie remming in individuele cellen mogelijk is. Zoals gezien in figuur 3 , bevorderen SA en VRB beide SG-formatie tot verschillende graden. Terwijl SA SG's in bijna 100% van de cellen veroorzaakt, bevordert VRB SG-vorming in ongeveer 75% van de cellen. Het vermogen om SG's te bevorderen komt overeen met de mate van translation remming: terwijl onbehandelde cellen een hoog basaal niveau van vertaling hebben, SA belemmert de volledige vertaling maar alleen VRB per jaarInhibeert translation translatief ( figuur 3 ).

Ten derde, SG's zijn dynamisch en in evenwicht met het vertalen van polysomen. Behandeling van cellen met cycloheximide voorafgaand aan stress of tegelijkertijd met stress voorkomt polysoom demontage en SG-vorming. Het SG-polysoom-evenwicht is bidirectioneel, aangezien gestrest cellen die SG's vertonen kunnen worden behandeld met cycloheximide om SG-demontage te handhaven door mRNA's in polysomen of monosomen te vangen wanneer ze productief worden geïnitieerd. Een belangrijke controle is het gebruik van puromycine, die de verlenging remt door premature beëindiging te bevorderen, waardoor de hoeveelheid niet-polysomale mRNP's die beschikbaar zijn voor SG-vorming, verhogen. Dramatische veranderingen in SG's worden waargenomen wanneer SA- of VRB-behandeling gekoppeld is aan CHX- of puro-behandeling ( Figuur 4 ). Aldus, om te beoordelen of vermoedelijke SG's zijn opgelost met cycloheximide behandeling maar worden verhoogd of onaangetast door puromycine is een sleutel experimentele parameter om te gebruiken in SG identi fi catiekation. De afscheiding van emetine-afgedankte SG in zeer kleine, niet-aanhechtende, primaire humaan beenmerg CD34 + cellen werd succesvol aangetoond door de cellen in suspensie te behandelen voorafgaand aan cytospinning 32 .

Natriumarseniet wordt wijd gebruikt om SG's te activeren door eIF2-a fosforylering 33 te induceren, maar het moet zorgvuldig getitreerd worden, aangezien het veel eiwitten richt en een aantal signaleringswegen 34 , 35 activeert. Verschillende cellijnen tonen wisselende mate van gevoeligheid voor natriumarseniet. U2OS zijn relatief gevoelig (100 μM), terwijl COS7, MEFs en HeLa 200 μM nodig hebben. DU-145 6 , primaire normale menselijke beenmerg CD34 + cellen 32 , humane lymfoblasten 36 , muiscorticale neuronen 37 en Huh7-cellen 31 vereisen 500-1000 μM.

De hier beschreven experimentele workflow maakt het mogelijk om SG's te detecteren in verschillende cellen en onder verschillende stressen. Het grote voordeel van deze workflow is dat het eenvoudig is en het mogelijk maakt de ondubbelzinnige detectie van bona fide SG's, evenals voor de gelijktijdige detectie van cellulaire translatie in stressbehandelde cellen. Dit protocol maakt gebruik van U2OS-cellen, maar kan worden gewijzigd voor verschillende cellijnen of zelfs voor primaire cellen. Een recente en uitgebreide lijst van cellen die gebruikt worden voor stress granule studies is review 11 . Het aantal cellen moet worden aangepast om 80% confluentie te bereiken op de dag van de geneesmiddelbehandeling. De concentratie en de duur van de medicijnbehandeling moeten eveneens worden aangepast, aangezien cellen anders reageren. Bovendien, terwijl dit protocol is ingesteld voor een 24-brons-indeling, kan deze worden aangepast aan elke maatplaat of -schotel waar de deklagen (van elke grootte) plat kunnen liggen tijdens het plateren en het behandelen van geneesmiddelennt. Cellijnen die SG / PB-markers stabiel uitdrukken, zijn gebruikt in high-throughput, siRNA-gebaseerde schermen 33 en live-imaging 38 . Beeldgebaseerde screening werd gebruikt met behulp van HeLa-cellen gekleurd voor de endogene SG-merker PABP om chemische verbindingen te detecteren die SG-montage 39 blokkeren. Er wordt verwacht dat deze workflow nuttig zal zijn in toekomstige studies en applicaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij bedanken leden van de Ivanov en Anderson labs voor hun nuttige discussie en feedback over dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [GM111700 en CA168872 naar PA, NS094918 naar PI], het Nationaal Wetenschapscentrum in Polen [verleen UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 naar WS]. WS erkent ook het Ministerie van Wetenschappen en Hoger Onderwijs in Polen (Mobility Plus Programma) en de Pools-Amerikaanse Fulbright Commissie voor hun financiële steun van zijn onderzoek in de VS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20, (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11, (8), (2014).
  4. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  5. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38, (10), 494-506 (2013).
  6. Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151, (6), 1257-1268 (2000).
  7. Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43, (4), e26 (2015).
  8. Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212, (7), 845-860 (2016).
  9. Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215, (3), 313-323 (2016).
  10. Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849, (7), 861-870 (2015).
  11. Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).
  12. Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253, (1), 253-272 (2013).
  13. Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17, (91), 47-52 (2014).
  14. Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, (3), 317-331 (2013).
  15. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208, (7), 913-929 (2015).
  16. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. (2015).
  17. Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).
  18. Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18, (7), 2603-2618 (2007).
  19. Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5, (5), 429-441 (2004).
  20. Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7, (21), 30307-30322 (2016).
  21. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15, (12), 5383-5398 (2004).
  22. Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147, (7), 1431-1442 (1999).
  23. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  24. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
  25. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (14), 4381-4385 (1982).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  27. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, (1), 45-57 (2012).
  28. Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
  29. David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139, (3), 501-504 (2013).
  30. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13, (7), 897-905 (2010).
  31. Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12, (1), 71-85 (2012).
  32. Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420, (4), 768-774 (2012).
  33. Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10, (10), 1224-1231 (2008).
  34. Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18, (54), 7794-7802 (1999).
  35. Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113, (10), 7769-7792 (2013).
  36. McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20, (7), 1400-1410 (2011).
  37. Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209, (1), 73-84 (2015).
  38. Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
  39. Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152, (4), 791-805 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics