Metodi per classificare i foci citoplasmatici come granuli di stress di mammiferi

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Biology

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Summary

Granuli di stress (SG) sono strutture citoplasmatiche non membrane che si formano in cellule esposte a varie sollecitazioni. Gli SG contengono mRNA, proteine ​​legate all'RNA, piccole subunità ribosomali, fattori correlati alla traduzione e varie proteine ​​di segnalazione cellulare. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che utilizza diversi approcci sperimentali per rilevare, caratterizzare e quantificare SG in buona fede .

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Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

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Abstract

Le cellule sono spesso sfidate da improvvisi cambiamenti ambientali. I granuli di stress (SG), i complessi ribonucleoprotein citoplasmatici che si formano nelle cellule esposti a condizioni di stress, sono implicati in vari aspetti del metabolismo cellulare e della sopravvivenza. Gli SG modulano i percorsi di segnalazione cellulare, l'espressione genica post-trascrizionale e programmi di risposta allo stress. La formazione di questi granuli contenenti mRNA è direttamente connessa alla traduzione cellulare. L'assemblea SG viene attivata dall'iniziazione inibita della traduzione e lo smontaggio SG viene promosso tramite l'attivazione della traduzione o l'inibizione dell'allungamento della traduzione. Questa relazione è ulteriormente evidenziata dalla composizione SG. I componenti del core SG sono bloccati da complessi di pre-iniezione di traduzione, mRNA e proteine ​​RNA-binding (RBPs) selezionate. Lo scopo dell'assemblea SG è quello di risparmiare energia cellulare sequestrando i mRNA di manutenzione in fase di transazionalizzazione, permettendo una migliore traduzione delle proteine ​​sensibili allo stress. In additiSui componenti del nucleo, come i complessi di preiniziation della traduzione stallo, gli SG contengono una pletora di altre proteine ​​e molecole di segnalazione. I difetti nella formazione di SG possono compromettere l'adattamento cellulare allo stress e possono quindi promuovere la morte cellulare. SG e simili granuli contenenti RNA sono stati legati a una serie di malattie umane, compresi i disturbi neurodegenerativi e il cancro, portando al recente interesse per la classificazione e la definizione di sottotipi di granuli RNA. Questo protocollo descrive i dosaggi per caratterizzare e quantificare SG di mammiferi.

Introduction

Le cellule impiegano molti meccanismi per rispondere allo stress. Alcune risposte si verificano al livello post-trascrizionale e riguardano la regolazione della traduzione e / o della stabilità del mRNA 1 , 2 . L'arresto e il degrado della traslazione mRNA modulati da stress sono associati alla formazione di focolai cellulari specifici non embrionali, il più caratteristico come Granuli di Stress (SG) 3 . Gli SG sono foci citoplasmatiche che concentrano mRNP non tradizionali in cellule arrestate a traslazione che rispondono allo stress ( ad esempio, ossidazione, shock termico, fame nutrizionale e infezione virale). Oltre ai mRNA non tradizionali, SG contengono fattori di inizio della traduzione, proteine ​​legate all'RNA e varie proteine ​​di segnalazione 5 . Gli SG sono biomarcatori di inibizione della proteina e alterazione del metabolismo RNA e sono stati legati alla sopravvivenza cellulare e all'apoptosi, il percorso di segnalazioneE dei processi nucleari 5 .

SG sono entità dinamica e la loro formazione è strettamente legata allo stato della traduzione cellulare 6 . Nonostante il loro aspetto apparentemente solido, la maggior parte dei componenti della proteina SG rapidamente navetta in e fuori, con un tempo di permanenza di secondi. Mentre SG persistono per minuti ad ore, la maggior parte dei loro componenti sono in flusso rapido. L'inibizione dell'iniziazione di traduzione e il conseguente smontaggio dei polisomi di traduzione favoriscono la formazione di SG; Quindi, gli SG sono in equilibrio con i polisomi di traduzione. Questo equilibrio di polysome / SG è la chiave per distinguere gli SG in buona fede da altri foci indotti da stress 6 , 7 .

L'arresto dell'iniziativa di traduzione comporta la conversione di complessi di pre-iniziazione competenti per la traduzione che contengono mRNA, fattori di inizio della traduzione (eIF) e subunità ribosomali 40S O cosiddetti complessi 48S) in complessi stallati a traslazione (cosiddetti complessi 48S *) che possono coalesciare in SG 4 , 6 . Gli SG vengono promossi con arresto traslazionale a due diverse fasi a monte della formazione di complessi 48S: interferenza con le funzioni del complesso di eIF4F legato al cappuccio ( ad es. Targeting della sua sottosistema eIF4A) o fosforilazione della subunità α del fattore di inizio della traduzione eIF2 mediata da una O più delle quattro chinasi eIF2. La presenza di complessi 48S in stallo ( es. Subunità ribosomali 40S e fattori di inizio di traduzione selezionati) è un segno distintivo di SG 8 , 9 .

Gli SG sono stati collegati a vari stati patologici, quali infezioni virali, neurodegenerazione, autoimmunità e cancro 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Le forme mutate di diversi componenti SG sono associate a malattie neurodegenerative ( es. Sclerosi laterale amyotrofica) in cui i neuroni presentano inclusioni patologiche intracellulari che possono svolgere ruoli attivi nella morte neuronale 13 . Alcuni virus intaccano i componenti SG per inibire la formazione di SG e migliorare la replica virale 14 . Recenti studi anche collegano SG al cancro 15 e alla sopravvivenza delle cellule tumorali in trattamenti chimico e radioterapico 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Mentre tali risultati hanno stimolato grande interesse per la biologia SG, molte delle relazioni pubblicate non dispongono di controlli importanti per distinguere la formazione di SG in buona fede da altri foci indotti da stress.

Le SG sono state inizialmente descritte come foci citoplasmatiche non membrane composte da proteine ​​legate alla mRNA (RBPs), incluse l'antigene ntracellulare 1 T-cellula (TIA-1) e la proteina legante Poly-A (PABP); Fattori di inizio della traduzione; MRNA poliadenilato; E piccole sottopelle ribosomali 4 , 6 , 21 , 22 . Tradizionalmente, la loro composizione è stata determinata da tecniche come l'immunostaining e l'espressione ectopic of protein fluorescently tagged 23 , 24 . A causa della loro natura altamente dinamica, l'immunolocalizzazione di proteine ​​SG e / o mRNA rimane la metodologia di definizione per la rilevazione degli SG 23 , 24 . Ad oggi, molti RBP e altre proteine ​​(oltre 120 proteine ​​distinte) sono descritte come componenti SG 11 . Come molti SLe proteine ​​localizzate da G modificano la loro localizzazione in modo stressato e indipendente e possono accumularsi in altri compartimenti e foci intracellulari, è importante scegliere corretti marcatori SG e utilizzare criteri funzionali per distinguere gli SG da altri tipi di stress indotti foci. Gli SG in buona fede contengono mRNA, fattori di inizio della traduzione e piccole subunità ribosomali e sono in equilibrio dinamico con la traduzione.

Questo semplice flusso di lavoro è progettato per determinare se i foci indotti da stress sono SG in buona fede . Questo flusso di lavoro comprende diversi approcci sperimentali che utilizzano le cellule U2OS, le cellule comunemente utilizzate per studiare SG. Queste cellule sono ideali, in quanto presentano un grande citoplasma, sono relativamente piatti e si attaccano fortemente ai vetrini di vetro. Altri tipi di cellule possono essere utilizzati per studiare SG, ma è importante essere consapevoli che le differenze di temporizzazione, concentrazione di farmaci e abbondanza delle proteine ​​nucleanti SG possono alterare la cinetica e il composizione. Inoltre, alcune cellule rispondono alla fissazione della paraformaldeide, formando delle bolle di superficie delle cellule, dando così un aspetto arruffato che provoca la localizzazione punctata di alcuni marcatori SG; Senza analisi accurata, queste possono essere classificate in modo errato come SG. Ciò evidenzia la necessità di valutare tutti i criteri necessari per identificare i focolai indotti da stress come SG in buona fede . Vinorelbina (VRB), un terapeutico per il cancro che promuove SGs 20 , come pure Sodium Arsenite (SA), un robusto e ben caratterizzato induttore SG, sono utilizzati come sollecitazioni per gli esperimenti in questo protocollo.

Canonical SG contengono più marcatori SG (sia proteine ​​che mRNA) che colocalizzano nei focoli citoplasmatici. Questo protocollo utilizza sia l'immunofluorescenza che l'ibridazione in fluorescenza in situ (FISH) per rilevare la localizzazione di marcatori proteici e rispettivamente di mRNA 22 poliadenilati. In breve, l'immunofluorescenza indiretta usa anticorpi (ad es .e. Anticorpi primari) specifici per una determinata proteina per rilevarla all'interno della cellula. Quindi, gli anticorpi secondari (generalmente specie-specifici) legati ai fluorocromi riconoscono l'anticorpo primario e rivelano la localizzazione della proteina bersaglio. La microscopia fluorescente viene usata per rilevare il segnale localizzato all'interno della cella. Utilizzando anticorpi prodotti in diverse specie e rilevandoli con anticorpi secondari colorati diversamente consentiti, è possibile rilevare la colocalizzazione di anticorpi multipli, indicando che i loro bersagli proteici si trovano nella stessa posizione 23 . È importante selezionare marcatori che sono stati verificati per colocalizzare a SG in buona fede .

FISH utilizza una sonda etichetta che accoppia le basi di una specifica sequenza di RNA o DNA 25 . Per rilevare l'mRNA, questo protocollo utilizza una sonda oligo (dT) 40 biotinilata che ibridizza (o le coppie di base) alla coda poliA di mRNA ( cioè poliA FISH). La sonda biotinilata viene quindi rilevata usando streptavidina fluorescente coniugata, poiché streptavidina ha un'elevata affinità per la biotina. Nel valutare SG, è importante associare poliA FISH con immunofluorescenza che rileva un marker SG, come nelle SG in buona fede , i due segnali dovrebbero essere colocalizzati.

Utilizzando questo protocollo, la colocalizzazione viene valutata in più modi. In un'immagine multi-canale ( ossia RGB: rosso, verde e blu), la colocalizzazione modifica il colore del segnale sovrapposto ( ad esempio, rosso e verde colocalizzati appaiono gialli) 23 . Inoltre, la colocalizzazione viene quantificata graficamente utilizzando l'analisi della linea di scansione, dove l'intensità di ciascuno dei colori viene misurata su una determinata linea 8 , 20 . Questo protocollo descrive due procedure di analisi di scansione linee usando ImageJ 26 . Una procedura è manuale e passa attraverso l'intero processo, whiL'altro utilizza una macro o un semplice programma che automatizza i passaggi manuali. È importante passare attraverso il programma manuale per comprendere la procedura macro.

Le SG si formano in cellule in cui la traduzione viene repressa; Quindi, le cellule con SG dovrebbero visualizzare livelli di traduzione più bassi rispetto alle cellule non trattate. Esperimentalmente, è utilizzata la ribopuromicilazione. La puromicina e l'emetina vengono aggiunti alle cellule per una breve durata prima della fissazione, permettendo alla puromicina di incorporarsi in polipeptidi attivi, causando la terminazione 27 , 28 . Il trattamento con emetina è necessario per impedire la riapertura 29 . Puromicina può essere rilevata usando anticorpi anti-puromicina, fornendo una istantanea di traduzione attiva. Questo metodo viene utilizzato perché è veloce, non richiede pre-affamando con un mezzo privo di un particolare aminoacido (e potenzialmente prevenendo le cellule), e rivela ilLocalizzazione subcellulare della traduzione di proteine. Altri metodi, in particolare utilizzando analoghi aminoacidi modificati, come l'analogica metionina L-azidohomoalaina (AHA), accoppiati con la chimica "click-it" 30 , sono stati utilizzati per dimostrare che le cellule contenenti SG presentano una traduzione molto più bassa delle cellule vicine 31 . Tuttavia, questa tecnica richiede la fame di metionina seguita da un impulso per 15-30 minuti. La fame di metionina costituisce un ulteriore stress, mentre il lungo tempo di etichettatura ( cioè 15-30 minuti) determina la misurazione della traduzione cumulativa piuttosto che continua e consente anche alle proteine ​​appena sintetizzate di passare dal loro sito di sintesi alla loro destinazione finale all'interno della cellula. Al contrario, la ribopuromicilazione è molto più veloce ed è compatibile con qualsiasi mezzo, come il mezzo privo di glucosio usato per indurre gli SG attraverso la fame di glucosio.

Canonical SGs sono in equilibrio dinamicoCon attivamente traducendo polisomi. Questo può essere valutato sperimentalmente trattando campioni con i farmaci che stabilizzano o destabilizzano i polisomi, ribaltando così l'equilibrio tra SG e polisomi 23 . Cycloheximide (o emetina, che si comporta in modo analogo) blocca l'allungamento da ribosomi "congelando" su mRNA, diminuendo così la massa di mRNP non polisomali disponibili in grado di formare SG. Sperimentalmente, questo può essere utilizzato in due modi: aggiungendo cycloheximide (o emetina) prima di stress per prevenire la formazione di SG o aggiungendo cycloheximide (o emetina) dopo gli SGs sono formate, anche senza rimuovere l'agente di sollecitazione, causando lo smontaggio SG, come stallo I complessi di preiniziamento vengono assunti lentamente nella frazione di polisomi. Al contrario, la puromicina provoca terminazioni premature e favorisce il disassemblaggio dei polisomi, aumentando la quantità di mRNA innescante in grado di assemblare in SG. Sperimentalmente, il trattamento con puromicina aumenta il numero di SG o abbassa il thresholD alla quale formano in risposta allo stress o al dosaggio della droga. Nella valutazione dell'effetto della puromicina è importante utilizzare un livello sub-maximal del farmaco interessato, in quanto la puromicina dovrebbe aumentare l'effetto del farmaco e aumentare il percentuale delle cellule che visualizzano SG - questo non può verificarsi se il farmaco / Stress causa SG nel 100% delle cellule inizialmente. Ciò è in contrasto con il trattamento cicloesimide, che smonta SG e funziona meglio quando ~ 95% delle celle visualizzano inizialmente SGs in modo che la più grande diminuzione possibile possa essere osservata e quantificata accuratamente.

Questo protocollo fornisce un quadro per studiare SG in cellule di mammiferi. I metodi comprendono: (1) colorazione immunofluorescenti e analisi ImageJ per valutare la colocalizzazione nei classici SG associati eIF4G, eIF3b e proteina legante proteina-attivante Ras GTPase (G3BP1) nei SG supposti; (2) oligo (dT) fluorescenza in ibridazione in situ (polyA FISH) per rilevare mRNA poliadenilata; (3) cicloesimide e puromicina per determinare se i foci indotti da stress sono in equilibrio dinamico con i polisomi; E (4) la ribopuromicilazione per valutare lo stato di traslazione delle cellule contenenti SG supposti. Insieme, questi dosaggi possono determinare se i foci indotti da stress possono essere classificati come SG in buona fede .

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Protocol

1. Preparazione delle cellule

  1. Aggiungere coperchi autoclavati a 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, come indicato in figura 1A ; Questo può essere fatto usando una pipetta sterile Pasteur attaccata ad un vuoto per raccogliere ciascuna copertina. Toccare delicatamente la copertura sul lato del pozzetto per rilasciare l'aspirazione, lasciando cadere la copertura nel pozzetto.
  2. Piastra 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) le cellule di osteosarcoma per pozzetto ad un volume finale di 500 μL di mezzo. Spostare il lato piastra a lato e su e giù diverse volte per assicurare che le celle siano distribuite uniformemente.
  3. Premere delicatamente le copertine con una punta pulita P1000 per assicurarsi che la copertura sia sul fondo del pozzetto e che non ci siano bolle sotto la copertura.

2. Stressing Cells

  1. Il giorno successivo, controllare visivamente la piastra per assicurare che le celle siano disperse uniformemente e uniformemente confluenti attraverso il coperchio, come varianti tra saI mples possono avere un impatto negativo sulla riproducibilità dei risultati. Utilizzare un obiettivo 10x su un microscopio in tessuto di cultura invertito.
  2. Preriscaldare il mezzo a 37 ° C. Evitare l'applicazione di freddo o caldo nelle cellule, in quanto causano rispettivamente urti di calore o scosse di calore.
  3. Diluire le droghe nei mezzi preriscaldati. Per ogni diversa concentrazione di farmaci, preparare 2 pozzetti contenenti 500 μl di mezzo. Preparare un ulteriore 500 μL per consentire la perdita durante la pipettazione. Aliquot 4 tubi, ciascuno contenente 1,5 mL.
    1. Per l'arsenito di sodio: ad ogni pozzetto contenente 500 μL, aggiungere 1,5 μL di 100 mM sodio arsenito (concentrazione finale: 100 μM) o aggiungere 0,75 μL di 100 mM sodio arsenito (concentrazione finale: 50 μM).
    2. Per vinorelbina: ad ogni pozzetto contenente 500 μL, aggiungere 22,5 μL di 10 mM vinorelbina (concentrazione finale 150 μM) o aggiungere 18,75 μL di 10 mM vinorelbina (concentrazione finale: 100 μM).
      NOTA: Arsenito di sodio È un induttore di granuli di sollecitazione ben caratterizzato e comunemente usato e viene quindi utilizzato classico come un controllo positivo.
  4. Rimuovere e scartare i supporti dai pozzetti B1-4 e C1 - 4. Aggiungere i supporti con i farmaci e attendere 60 minuti (figura 1A).
    1. Aggiungere 500 μl di media con 100 μM di sodio arsenito ai pozzetti B1 e B2. Aggiungere 500 μL di media con 50 μM di sodio arsenito nei pozzetti B3 e B4.
    2. Aggiungere 500 μL di mezzo con 150 μM vinorelbina ai pozzetti C1 e C2. Aggiungere 500 μl di mezzo con 125 μM vinorelbina ai pozzetti C3 e C4.
  5. 30 minuti prima della fissazione, trattate i pozzetti della colonna 2 con 5 μL di cicloesimide (1 mg / ml di scorta) ei pozzetti nella colonna 4 con 2 μL di puromicina (1,25 mg / ml di scorta). Rasatura delicatamente la lastra per mescolare prima di posizionare la piastra nel 37 ° C incubatore.

3. Fissazione cellulare e immunofluorescenza

NOTA: Prima dell'esperimento, accertarsi che il metanolo sia raffreddato a -20 ° C. Fare buchi, compreso il salino fosforato-tamponato (PBS), il 5% di cavallo normale (NHS) in PBS e 4% di paraformaldeide (PFA ) In PBS.

  1. Scartare i supporti e lavare i pozzetti contenenti coverlips con PBS. A seconda dei farmaci utilizzati, potrebbe essere importante scartare correttamente i supporti contenenti farmaci; Contattare l'ufficio locale per la sicurezza ambientale per istruzioni specifiche. Per lavare in modo efficace, riempire una bottiglia di compressione con PBS, tagliare indietro la punta per consentire un flusso leggero piuttosto che un flusso stretto e utilizzare questo per aggiungere PBS a ciascun pozzetto dopo aspirare l'originale PBS.
  2. Fissare le cellule utilizzando ~ 250 μL di PFA al 4% per 15 minuti a RT sotto agitazione leggera. Completamente coprire la parte superiore del coperchio con PFA; Basta avere 250 μL, ma se no, aggiungere di più. Evitare sempre di pipettare direttamente sui coperchietti, poiché alcune cellule (o trattamenti di stress delle cellule) possono alterare l'attaccamento e tForza dalla pipetta può spogliare le cellule.
  3. Rimuovere il PFA e scartare correttamente. Rivolgersi all'ufficio locale per la sicurezza ambientale per dettagli su come eliminare correttamente la paraformaldeide.
  4. Aggiungere ~ 250 μl di metanolo (-20 ° C) e incubare per 5 minuti a RT sotto un leggero dondolo; Questo permeabilizza e appiattisce le cellule.
  5. Rimuovere e scartare il metanolo e bloccare le cellule applicando ~ 250 μL di 5% NHS per 1 h a RT O / N a 4 ° C. Rivolgersi all'ufficio locale per la sicurezza ambientale per dettagli su come eliminare correttamente il metanolo.
  6. Per gli anticorpi primari, diluire gli anticorpi nel 5% NHS.
    NOTA: L'uso di più marcatori SG è fondamentale per confermare se i granuli osservati sono SG in buona fede . Il numero di marcatori SG che possono essere utilizzati dipende dai filtri disponibili nel microscopio. Se sono disponibili standard set di filtri verde, rosso e rosso, utilizzare G3BP1, eIF4G e eIF3b con una diluizione di 1/250.
  7. Lavare i pozzetti 3x con PBS e incubare ogni lavaggio per 5 minuti.
  8. Per gli anticorpi secondari, diluire tutti gli anticorpi secondari (1/250 diluizione) e Hoechst colorante (1/1000 diluizione) nel 5% NHS.
    1. Per questo esperimento (12 coperti a 250 μL ciascuno: 3 ml di NHS 5%), aggiungere 12 μL di ciascuno dei seguenti fattori: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit e Cy5-Goat (una diluizione di 1/250 di ciascuno ) E aggiungere 3 μl di colorante Hoechst.
    2. Incubare le copertine con gli anticorpi secondari per 1 h a RT. Durante questo e nei passaggi seguenti, proteggere i campioni dalla luce coprendo la piastra con una scatola o collocando la pellicola sulla parte superiore del piatto di coltura tissutale.
  9. Lavare noiTre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
  10. Montare le copertine su vetrini etichettati utilizzando il supporto di montaggio. Riscaldare il supporto di montaggio in un blocco termico di 37 ° C per 10 min; Questo riduce la viscosità e rende più facile la pipetta. Con una punta tagliata P200, pipettare 25 μL di supporto di montaggio per coperchio su una lastra di vetro; Le copertine 4-8 possono essere montate su una lastra di vetro, supponendo che lo stadio microscopico lo consente. Utilizzando delle pinze fine, trasferire la copertura dal pozzetto allo scivolo, assicurandosi di mettere il lato della cella sul supporto di montaggio. Utilizzando una punta pulita P200, premere il coperchio verso il basso.
  11. Una volta che tutti i coperchi sono stati montati, utilizzare un tessuto di laboratorio piegato per ripulire il mezzo di montaggio in eccesso premendo in modo molto saldamente il tessuto del laboratorio sullo scivolo. Usare una bottiglia di spremitura contenente H 2 O per sciacquare l'eccesso di supporto di montaggio e ripetere il blotting con un tessuto di laboratorio piegato per rimuovere l'acqua.

4. Fluorescenza in situ </ Em> ibridazione (FISH)

  1. Piastra e trattare le celle, utilizzando i passaggi 1 e 2.1-4 come guida; È necessario solo piegare le celle nella colonna 1, poiché sono necessarie solo 3 copertine nel seguente esperimento.
  2. Assicurarsi che tutti i tamponi siano preparati ( cioè 4% PFA in PBS, 70% etanolo in acqua, 2x Salina-Sodio-Citrato (SSC) e 5% NHS), che il metanolo viene raffreddato a -20 ° C Il forno di ibridazione viene riscaldato fino alla temperatura appropriata.
  3. Eseguire i punti 3.1-3.3 per lavare e fissare le celle.
  4. Permeabilizzare le cellule aggiungendo -20 ° C di metanolo per 10 min.
  5. Rimuovere il metanolo e incubare le copertine in etanolo al 70%. Posizionare la piastra a 4 ° C per una notte. Sigillare la piastra con il parafilm per evitare l'evaporazione.
  6. Il giorno seguente, rimuovere l'etanolo e reidratare le cellule aggiungendo 500 μL di 2x SSC. Incubare le copertine per 5 minuti con agitazione leggera a RT.
  7. Rimuovere il 2x SSC e aggiungere 500ΜL di 2X SSC. Incubare per 5 minuti con agitazione leggera.
  8. Posizionare un pezzo di parafilm sul fondo del forno di ibridazione. Pipettare 25 μl di tampone di ibridazione sul parafilm per ogni copertina. Rimuovere la copertura dal piatto da 24 pozzetti (a questo punto, le copertine sono rivolte verso l'alto a cella) e posizionare il coperchio con il lato della cella sul blocco di ibridazione. Fate questo a 42 ° C o, eventualmente, a 65 ° C per 15 minuti.
    NOTA: Completare questa fase a 65 ° C denota RNA cellulari; Questo può migliorare il segnale se la poliA è mascherata da interazioni con le proteine.
  9. Diluire la sonda Biotin-Oligo (dT) (100 ng / μL) in tampone di ibridazione a una concentrazione di 2 ng / μL; È sufficiente 25 μL per coperchio.
  10. Per ogni coperchio, pipettare 25 μl di tampone di ibridazione contenente Biotin-Oligo (dT) sul parafilm. Sollevare la copertura con le pinze e toccare delicatamente il bordo del coperchio su un tessuto di laboratorio per rimuovere l'eccessoTampone di ibridazione. Trasferire la copertina al buffer di ibridazione con Biotin-Oligo (dT); Ricorda di tenere il lato della cella verso il basso.
  11. Posizionare le copertine in una scatola di ibridazione per limitare l'evaporazione. Incubare le copertine con Biotin-Oligo (dT) in tampone di ibridazione per 60 min a 42 ° C.
  12. Posizionare 2x SSC nel forno di ibridazione per consentirgli di equilibrare a 42 ° C.
  13. Aggiungere ~ 500 μL di 2x SSC riscaldato ai pozzetti nel piatto da 24 pozzetti e usare pinze per trasferire le copertine al pozzetto. Incubare per 10 min.
  14. Ripetere due volte la fase di lavaggio a 42 ° C e poi due volte a RT.
  15. Completare i passaggi 3.5-3.10, assicurandosi di utilizzare uno streptavidina fluorochrome per rilevare la Biotin-Oligo (dT) anziché un anticorpo convenzionale.

5. Analisi della ribopuromicilazione per valutare lo stato di transizione

  1. Le celle U2OS delle piastre sui coperchi, come indicato nel passaggio 1, ma solo una piastra di copertura per condizione (in questoCaso, 3 copertine: non trattato, 100 μM di sodio arsenito e 150 μM di vinorelbina) ( Figura 1 A).
  2. Le cellule di stress utilizzano il protocollo nel passaggio 2, completando i passaggi 2.1-2.4.
  3. 5 minuti prima della fissazione, aggiungere 2 μL di puromicina (azione: 1,25 mg / ml, diluire 2 μL in 500 μl per ottenere una concentrazione finale di puromicina di 5 μg / ml) e 2,9 μl di emetina (azione: 20 μg / ml; 2,9 μL alla stessa soluzione già contenente la puromicina) ad ogni pozzetto contenente 0,5 mL.
  4. Completare i punti 3.1-3.10 come sopra indicato, utilizzando un anticorpo anti-puromicina (1/1000 diluizione) per rilevare puromicina. Idealmente, utilizzare altri due marcatori SG nei rimanenti canali.
  5. Quando si quantifica il segnale puromicina, prendere tutte le immagini usando la stessa esposizione. Scegli questa esposizione usando il campione più luminoso (non stressato) e prendendo un'immagine il più luminosa possibile senza saturazione.
    NOTA: L'intensità del segnale fluorescente anti-puromicina represLa traduzione in corso, come sostituti di puromicina per un aminoacido, incorpora nella proteina nascente e impone la terminazione prematura della proteina.

6. Acquisizione e analisi di immagini

  1. Quantificare i granuli di stress
    1. Per quantificare gli SG, acquisite 3 - 5 immagini in totale> 100 celle per campione utilizzando un obiettivo 40X. In alternativa, acquisite immagini utilizzando altri obiettivi, ma assicurati che> 100 celle vengono contate per copertina e che l'ingrandimento sia abbastanza grande per visualizzare chiaramente i granuli. Fare questo dividendo la copertina in cinque regioni ugualmente uguali e selezionando casualmente un campo da ciascuna regione ( Figura 1B ); Le immagini dello stesso campo dovrebbero includere tutti i canali per valutare la colocalizzazione dei marcatori.
    2. Una volta acquisite tutte le immagini, unire i canali. Alcuni software della fotocamera faranno automaticamente questo, mentre altri richiedono unione manuale; Questo può essere fatto conImageJ aprendo tutte le immagini e selezionando [Immagine | Colore | Merge Channels].
    3. Contare manualmente il numero totale di celle contando il numero di nuclei, utilizzando Hoechst come marcatore del nucleo. Contare manualmente il numero di celle che contengono più di due SG per cella.
      NOTA: Ad esempio, utilizzando un canale sincrono a tre canali visualizzando G3BP1 (verde), eIF4G (rosso) e Hoechst (blu), conteggi i nuclei (o il numero di celle) utilizzando il canale blu. Quindi, contate le cellule SG-positive come quelle con due o più foci gialli per cella. I granuli appariranno gialli, come verdi da G3BP1 e rossi da eIF4G appaiono gialli se colocalizzati.
    4. Determinare la percentuale di cellule che sono SG positivi combinando i dati dalle 3-5 regioni indipendenti e quindi calcolare:
      Numero di SG positivo / numero di nuclei) * 100 = percentuale di cellule SG-positive
  2. Valutazione della colocalizzazione mediante analisi di scansione lineare - Metodo manuale
    1. ApertoImageJ. Scarica gratuitamente da ()
    2. Aprire il gestore ROI: [Analizza | Strumenti | Responsabile ROI ...].
    3. Aprire l'immagine incorporata in ImageJ: [File | Aperto].
    4. Utilizzando lo strumento di linea situato nella barra degli strumenti ImageJ, aggiungere una riga che passa attraverso un SG, assicurandosi di includere prima e dopo l'SG. Aggiungere questa riga al gestore ROI facendo clic su [Aggiungi] nella finestra del gestore ROI.
    5. Distribuire l'immagine fusa in canali separati per valutare la localizzazione di ciascun marcatore al granulo: [Image | Colore | Split Channel]; Questo divide l'immagine fusa in tre immagini in bianco e nero.
    6. Nell'immagine in bianco e nero, assicurarsi che la linea sia selezionata; La riga viene selezionata se appare nell'immagine. In caso contrario, nella finestra di gestione ROI, fare clic sulla riga nel pannello; Questo evidenzia la linea in blu nella finestra del gestore ROI e renderà visibile la riga sull'immagine in bianco e nero. Se la riga non viene ancora visualizzata, assicurarsi che "mostra tutto" sia chEcked nel gestore ROI e quindi clicca sulla riga nell'immagine.
    7. Analizza l'intensità della riga: [Analizza | Profilo di trama]; Questo porterà la finestra "Plot Profile", che traccia l'intensità del segnale in tutta la linea.
    8. All'interno della finestra "Plot Profile", fare clic su [Elenco], che visualizza una finestra contenente i dati grezzi dal grafico. Copia tutti i dati in questa finestra e incollalo in un file di foglio di calcolo. A tale scopo, selezionare tutti i dati nella finestra: [Modifica | Seleziona tutto]. Copiare la data: [Edit | Copia]. Aprire un file di foglio di calcolo e incollare i dati: [Modifica | Incolla].
    9. Completare i passaggi 6.2.6 - 6.2.8 per ciascun canale separatamente. Assicuratevi di tenere traccia del canale da valutare.
    10. In un foglio di calcolo, generare un grafico a linea dei risultati. Selezionare le colonne che includono i dati premendo [control] e facendo clic sulla lettera in alto a ogni colonna. Quindi, selezionare il grafico di linea: [Inserisci | Grafico a linee].
    11. Ripeti questa analisi per il multGranuli di stress su più esperimenti indipendenti.
  3. Valutazione della colocalizzazione mediante analisi di scansione lineare - Plugin ImageJ
    1. Scaricare e installare lo strumento del profilo RGB dal sito Web ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Quando correttamente installato, un'icona rossa, verde e blu (RGB) dovrebbe essere visualizzata sulla barra degli strumenti.
    2. Apri l'immagine ( ad esempio, Tiff, JPG) in ImageJ: [File | Aperto].
    3. Fare clic sull'icona RGB situata nella barra degli strumenti ImageJ.
    4. Fare clic e trascinare per aggiungere una riga che si estende attraverso un SG, assicurandosi di includere regioni adiacenti; Un'immagine dell'istogramma verrà visualizzata in una finestra pop-up.
    5. Salvare i dati come un'immagine: [File | Salva come | Tiff]. In alternativa, esportare e poi tracciare i dati in un altro programma di grafica utilizzando il passo 6.2.8 dall'alto.

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Representative Results

I focolai indotti da stress non sono necessariamente SG. Gli SG sono classificati come foci citoplasmatici che contengono mRNA, fattori di inizio della traduzione e proteine ​​legate all'RNA e sono in equilibrio con la traduzione attiva. Il protocollo di cui sopra può essere utilizzato come un modello per caratterizzare se una determinata tensione induca SG in buona fede .

SGs colocalizzano con altri marcatori SG noti, comprese le proteine ​​e l'mRNA. SA e VRB inducono foci citoplasmatiche che contengono G3BP1, eIF4G e eIF3b ( Figura 2A ). La colocalizzazione di questi marcatori viene confermata mediante analisi di scansione lineare e immagini a canale singolo con ingrandimento aumentato ( Figura 2A ). Inoltre, questi foci contengono la Mrna, come indicato da polyA FISH, e il segnale oligo (dT) colocalizza con il segnale di immunofluorescenza G3BP1 ( Figura 2B ). È fondamentale mostrare che il polyA-FISHIl segnale si sovrappone con un noto marker SG, poiché uno stress potrebbe promuovere più tipi di focolai.

Gli SG si verificano durante uno stato di inibizione della traslazione. Sia VRB che SA promuovono uno stato di repressione traslatorio, valutato sperimentalmente con ribopuromicilazione ( Figura 3 ). SG in buona fede sono in equilibrio dinamico con polisomi attivamente traducenti. Gli SGs indotti da SA e VRB vengono disciolti con CHX, che trapassa i polisomi sugli mRNA, arrestando così il disassemblaggio dei polysomi e prevenendo gli SG ( Figura 4A, 4B ). Al contrario, più SA e VRB SG vengono indotti dopo il trattamento con puro, poiché il puro favorisce lo smontaggio del polisome, favorendo pertanto la formazione di SG ( Figura 4A, 4C ).

In sintesi, come per il controllo positivo SA, VRB indica SG in buona fede che: (1) colocalizzano con noti marcatori SG, (2) includono sia proteine ​​che mRNA ( Figu Re 2), (3) si trovano in cellule in cui la traduzione viene repressa ( Figura 3 ), e (4) sono in equilibrio dinamico con la traduzione attiva ( Figura 4A-4C ).

Figura 1
Figura 1: Schemi sperimentali. ( A ) Le cellule di semi in copertine precedentemente collocate in una piastra a 24 pozzetti, come indicato. Trattare le righe A e B per 60 min con SA o VRB usando la concentrazione in μM come indicato. Dopo 60 minuti, aggiungere il farmaco contenente farmaci CHX (concentrazione finale: 20 μg / mL per la colonna 2) o puro (20 μg / mL puromicina per la colonna 4). Continuare l'incubazione per altri 30 minuti prima della fissazione e della colorazione. ( B ) Diagramma di una copertina, indicante i campi che devono essere rappresentati per il conteggio. La copertina è suddivisa in cinque regioni ugualmente uguali; Un'immagine viene presa in ogni regione."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: SA e VRB Induiscono Foci citoplasmatiche che contengono i marker SG anPoly (A) mRNA. ( A ) le cellule U2OS immunostained per G3BP1 (verde), eIF3b (rosso) e eIF4G (blu). Le cellule sono state trattate con 100 μM SA o 150 μM VRB per 60 minuti o non sono state trattate (controllo). Le aree zoomate vengono ingrandite (2X) e mostrate come canali separati in bianco e nero (sotto). Il grafico indica l'analisi della linea di scansione di un granulo di una regione (linea bianca) e mostra l'entità della sovrapposizione o della colocalizzazione. La barra di scala rappresenta 10 μm. ( B ) PolyA-FISH accoppiato con immunostaining rileva poliA mRNA con una sonda oligo (dT) 40 (rosso), G3BP1 (verde) viene rilevata utilizzando un anti-G3BP e il DNA nucleare viene rilevato usando il colorante Hoechst (blu). Le aree zoomate (2X), le immagini a canale singolo e l'analisi della scansione di linea mostrano la colocalizzazione. Barra di scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: SA e VRB Treatment CauseTranslation Repression. L'immunofluorescenza delle cellule U2OS è stata impulso-etichettata con puromicina per 5 minuti a seguito dei trattamenti indicati. Puromicina (verde), eIF3b (rosso) e DNA nucleare macchiato con Hoechst (blu). Le cellule sono state trattate con 100 μM SA o 150 μM VRB per 60 minuti o non sono state trattate (controllo). Barra di scala = 10 μm. Clicca qui per vedere un versetto più grandeIone di questa figura.

Figura 4
Figura 4: SA e VRB iniziano i foci citoplasmatici che sono in equilibrio dinamico con i polisomi. ( A ) Schema generale che descrive la relazione polysome / SG. ( BC ) le cellule U2OS macchiate per G3BP1 (verde), eIF3b (rosso) e DNA nucleare usando Hoechst (blu). Le cellule sono state trattate con 100 μM SA o 150 μM VRB per 60 minuti o non sono state trattate (controllo) prima dell'aggiunta di ( B ) CHX (cicloesimide, 20 μg / mL), ( C ) puro (puromicina, 10 μg / mL ), O nessun additivo per altri 30 minuti di incubazione. I numeri corrispondono alla percentuale di cellule con SG in un esperimento rappresentativo. Barra di scala = 25 μm, in (BC). Clicca qui per vederlo più grandeVersione di questa figura.

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Discussion

Come evidenziato da studi immunohistologici in molteplici malattie, lo stress cronico porta alla formazione di differenti foci intracellulari. Ad esempio, la maggior parte delle malattie neurodegenerative sono caratterizzate da aggregati intracellulari di proteine ​​insolubili. La presenza di proteine ​​associate a SG in tali aggregati è spesso la base per concludere che tali foci sono SG. Una simile conclusione è anche tracciata quando si osservano foci citoplasmatiche positiva-SG in cellule trattate con nuovi stimoli di stress. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplice per identificare SG in buona fede .

Dovranno essere soddisfatti diversi criteri per la conferma di SG definiti come tali, compresa la caratterizzazione sia della composizione che della dinamica. In primo luogo, gli SG sono foci citoplasmatiche che contengono mRNPs statalizzati in translazione. Pertanto, il primo approccio è quello di caratterizzare la loro composizione utilizzando due tecniche basate su microscopia, vale a dire poliA-FISH e IF. FISH è un metodo affidabile per la visualizzazioneIe mRNA che colocalizzano con SG. Una sonda oligo (dT) 40 viene impiegata per rilevare mRNA poliadenilati che confluiscono in SG in condizioni di stress. Dato che l'oligo (dT) non rileverà mRNA desalinati, che sono componenti essenziali di organismi di trattamento (PB), la presenza di un forte segnale oligo (dT) nei foci citoplasmatici è una prima indicazione (anche se non sufficiente per la definizione) SGS. Il secondo test è quello di dimostrare la colocalizzazione di un segnale poli (A) con altri marcatori SG ( es. G3BP1) ( Figura 2A ). Ciò avviene eseguendo IF contro le proteine ​​del marker SG. I marcatori SG eIF3b, eIF4G e G3BP1 vengono utilizzati in routine perchè eIF3b e eIF4G sono fattori di inizio della traduzione noti per essere componenti dei complessi 48S * e G3BP1 è necessario per la formazione di SG ( Figura 2B ). È importante sottolineare che è richiesto più marcatori SG, in quanto diverse sollecitazioni reclutano diversi fattori associati SG a SG, e alcune sollecitazioni possonoAuse l'aggregazione della proteina che potrebbe essere scambiata per la formazione di SG.

In secondo luogo, gli SG sono formati a causa dell'inhibition di traduzione. Mentre l'inibizione della traduzione può essere rilevata tramite approcci diversi ( ad esempio, con l'etichetta tradizionale di marcatura [ 35 S] Met, è preferibile la ribopuromicilazione, in quanto rileva la continua traduzione di proteine ​​nelle cellule trattate. Questa tecnica è anche compatibile con l'immunofluorescenza standard contro i marcatori SG, consentendo così il monitoraggio simultaneo delle SG e del grado di inibizione della traduzione nelle singole cellule. Come si vede nella figura 3 , SA e VRB promuovono entrambi la formazione SG a diversi gradi. Mentre SA causa SG in quasi il 100% delle cellule, VRB promuove la formazione di SG in circa il 75% delle cellule. La capacità di promuovere SG è correlata al grado di inibizione della traduzione: mentre le cellule non trattate hanno un elevato livello di traduzione basale, SA inibisce completamente la traduzione, ma solo VRBRtially inibisce la traduzione ( Figura 3 ).

In terzo luogo, gli SG sono dinamici e sono in equilibrio con i polisomi di traduzione. Trattare le cellule con cycloheximide prima dello stress o contemporaneamente allo stress impedisce lo smontaggio del polysom ​​e la formazione di SG. L'equilibrio polysomico SG è bidirezionale, poiché le cellule stressate che presentano SGs possono essere trattate con cicloesimide per applicare lo smontaggio SG bloccando mRNA in polisomi o monosomi ogni volta che sono iniziati in modo produttivo. Un importante controllo consiste nell'utilizzare la puromicina, che inibisce l'allungamento promuovendo la terminazione prematura, aumentando così la quantità di mRNP non polisomali disponibili per la formazione di SG. Cambiamenti drammatici nei SG sono osservati quando il trattamento SA o VRB è accoppiato con CHX o puro trattamento ( Figura 4 ). Quindi, valutare se SGs presi sono disciolti al trattamento cicloesimide ma sono aumentati o non influenzati dalla puromicina è un parametro sperimentale chiave da utilizzare in SG identificazione. Il disassemblaggio dello SG di emetina in piccole cellule CD34 + delle cellule umane primarie primarie non aderenti è stato dimostrato con successo trattando le cellule in sospensione prima del citospinning 32 .

L'arsenite di sodio è ampiamente utilizzato per innescare SGs indurre la fosforilazione eIF2-α 33 , ma deve essere attentamente titolato , in quanto target molte proteine ​​e attiva una serie di percorsi di segnalazione 34 , 35 . Diverse linee cellulari presentano gradi di sensibilità all'arsenito di sodio. U2OS sono relativamente sensibili (100 μM), mentre COS7, MEF e HeLa richiedono 200 μM. DU-145 6 , cellule primarie normali del midollo osseo CD34 + 32 , linfoblasti umane 36 , neuroni corticali 37 e Huh7 31 richiedono 500-1000 μM.

Il flusso di lavoro sperimentale qui descritto consente di rilevare gli SG in diverse cellule e sotto differenti sollecitazioni. Il principale vantaggio di questo flusso di lavoro è che è semplice e consente l'individuazione inequivocabile di SG in buona fede , nonché per la sonda simultanea della traduzione cellulare nelle cellule trattate con stress. Questo protocollo utilizza le celle U2OS, ma può essere modificato per diverse linee cellulari o addirittura per le celle primarie. Un elenco recente e completo delle cellule utilizzate per studi di granulo di stress è la revisione 11 . Il numero di cellule dovrebbe essere regolato per raggiungere l'80% confluenza il giorno del trattamento farmacologico. La concentrazione e la durata del trattamento con la droga dovrebbero essere adeguate, in quanto le cellule rispondono in modo diverso. Inoltre, mentre questo protocollo è impostato per un formato a 24 pozzetti, può essere regolato su qualsiasi piastra o piatto di dimensioni in cui le copertine (di qualsiasi dimensione) possano stare piatte durante la placcatura e la droga treatment. Le linee cellulari che esprimono stabili i marcatori SG / PB sono stati utilizzati nelle schermate 33 ad alta velocità e 33 con immagini a cellule vive 38 . La screening basata sull'immagine è stata impiegata usando le cellule HeLa macchiate per il marker SG endogeno PABP per rilevare composti chimici che bloccano l'assemblaggio SG 39 . Si prevede che questo flusso di lavoro sarà utile in futuri studi e applicazioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo i membri dei laboratori Ivanov e Anderson per la loro utile discussione e feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Nazionali di Salute [GM111700 e CA168872 a PA, NS094918 a PI], il National Science Center in Polonia [concedere UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 a WS]. WS riconosce inoltre il Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore in Polonia (Programma Mobility Plus) e la Commissione Polacca-Americana Fulbright per il loro sostegno finanziario alla sua ricerca negli Stati Uniti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

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References

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