Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

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Biology

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Summary

Os grânulos de estresse (SGs) são estruturas citoplasmáticas não-membranosas que se formam em células expostas a uma variedade de tensões. As SGs contêm mRNAs, proteínas de ligação a RNA, subunidades ribossómicas pequenas, factores relacionados com a tradução e várias proteínas de sinalização celular. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que utiliza várias abordagens experimentais para detectar, caracterizar e quantificar SGs de boa-fé .

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Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

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Abstract

As células são muitas vezes desafiadas por mudanças ambientais súbitas. Os gr�ulos de stress (SGs), complexos de ribonucleoprote�a citoplasm�icos que se formam em c�ulas expostas a condi�es de stress, est� implicados em v�ios aspectos do metabolismo celular e sobreviv�cia. As SGs modulam as vias de sinalização celular, expressão de genes pós-transcricionais e programas de resposta ao estresse. A formação destes grânulos contendo mRNA está directamente ligada à tradução celular. SG é desencadeada por inibição da iniciação da tradução e a desmontagem SG é promovida por ativação da tradução ou por alongamento da tradução inibida. Esta relação é ainda mais realçada pela composição da SG. Os componentes Core SG são complexos de pré-iniciação de tradução paralisados, ARNm e proteínas de ligação a RNA seleccionadas (RBPs). A finalidade da montagem do SG é conservar a energia celular sequestrando mRNAs arranjados da manutenção da tradução, permitindo a tradução realçada de proteínas stress-responsivas. Em additiSobre os constituintes do núcleo, tais como complexos de pré-iniciação de tradução paralisada, as SGs contêm uma multiplicidade de outras proteínas e moléculas de sinalização. Defeitos na formação de SG podem prejudicar a adaptação celular ao estresse e, assim, podem promover a morte celular. SGs e gr�ulos contendo ARN semelhantes foram ligados a v�ias doen�s humanas, incluindo dist�bios neurodegenerativos e cancro, levando ao interesse recente na classifica�o e defini�o de subtipos de gr�ulos de ARN. Este protocolo descreve ensaios para caracterizar e quantificar SGs de mamíferos.

Introduction

As células empregam muitos mecanismos para responder ao estresse. Algumas respostas ocorrem no nível pós-transcricional e envolvem a regulação da tradução e / ou estabilidade do mRNA 1 , 2 . A detenção e degradação da tradução do mRNA modulado pelo estresse estão associados com a formação de focos celulares não-membranares específicos, sendo os mais bem caracterizados os Stress Granules (SGs) 3 . As SGs são focos citoplasmáticos que concentram mRNPs não-traduzidos em células arrancadas pela tradução que respondem ao estresse ( por exemplo, oxidação, choque térmico, inanição de nutrientes e infecção viral) 4 . Para além dos mRNAs não traduzidos, os SGs contêm factores de iniciação de tradução, proteínas de ligação a RNA e várias proteínas de sinalização 5 . As SGs são biomarcadores da tradução de proteínas inibidas e do metabolismo do ARN alterado e têm sido associadas à sobrevivência celular e à apoptose, via de sinalizaçãoS e processos nucleares 5 .

SGs são entidades dinâmicas, e sua formação está firmemente conectado ao status de tradução celular 6 . Apesar da sua aparência aparentemente sólida, a maioria dos componentes da proteína SG transite rapidamente para dentro e para fora, com um tempo de residência de segundos. Enquanto SGs persistem por minutos a horas, a maioria dos seus componentes estão em fluxo rápido. A inibição da iniciação da tradução ea conseqüente desmontagem dos polissomos de translação promovem a formação de SGs; Assim, as SGs estão em equilíbrio com os polissomas de translação. Este equilíbrio polissômico / SG é fundamental para distinguir SGs bona fide de outros focos induzidos pelo estresse 6,7.

A interrupção da iniciação da tradução implica a conversão de complexos de pré-iniciação competentes para a tradução que contêm mRNA, factores de iniciação de tradução (eIF) e subunidades ribossómicas 40S O-chamado 48S complexos) em translacionalmente stalled complexos (chamados 48S * complexos) que podem coalescer em SGs 4 , 6 . As SGs são promovidas por paragem translacional em dois passos diferentes a montante da formação do complexo 48S: interferência com as funções do complexo eIF4F de ligação de tampão ( por exemplo, direccionando a sua subunidade eIF4A) ou fosforilação da subunidade a do factor de iniciação da tradução eIF2, mediada por uma Ou mais das quatro cinases eIF2. A presença de complexos 48S bloqueados ( isto é, subunidades ribossómicas 40S e factores de iniciação de tradução seleccionados) é uma característica dos SG 8 , 9 .

SGs foram ligados a vários estados patológicos, tais como infecções virais, neurodegeneração, auto-imunidade e câncer 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . As formas mutadas de vários componentes SG estão associadas a doenças neurodegenerativas ( por exemplo, esclerose lateral amiotrófica) nas quais os neurônios exibem inclusões patológicas intracelulares que podem desempenhar papéis ativos na morte neuronal 13 . Alguns vírus sequestrar SG componentes para inibir SG formação e para reforçar a replicação viral [ 14] . Estudos recentes também ligam SGs ao cancro 15 e à sobrevivência das células cancerígenas nos tratamentos de quimioterapia e radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Embora tais descobertas tenham estimulado grande interesse na biologia da SG, muitos dos relatórios publicados não têm controles importantes para distinguir a formação de SGs de boa-fé de outros focos induzidos pelo estresse.

As SGs foram inicialmente descritas como focos citoplasm�icos n� membranosos compostos de prote�as de liga�o a mRNA seleccionadas (RBPs), incluindo o antig�io ntracelular de c�ulas T 1 (TIA-1) e Prote�a de Liga�o a Poli-A (PABP); Factores de iniciação de tradução; MARN poliadenilado; E pequenas subunidades ribossómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, a sua composição foi determinada por técnicas como a imunocoloração e a expressão ectópica de proteínas com marcação fluorescente 23 , 24 . Devido à sua natureza altamente dinâmica, a imunolocalização de proteínas SG e / ou mRNAs continua a ser a metodologia de definição para a detecção de SGs 23 , 24 . Até à data, muitas RBP e outras proteínas (mais de 120 proteínas distintas) são descritas como SG componentes [ 11] . QuantasAs proteínas G-localizadas alteram a sua localização tanto de uma forma dependente de stress como de uma forma independente e podem acumular-se em outros compartimentos intracelulares e focos, é importante escolher marcadores SG correctos e empregar critérios funcionais para distinguir SGs de outros tipos de stress induzido Focos Bona fide SGs contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e pequenas subunidades ribossômicas e estão em equilíbrio dinâmico com a tradução.

Esse fluxo de trabalho simples é projetado para determinar se os focos induzidos pelo estresse são SGs de boa-fé . Este fluxo de trabalho inclui várias abordagens experimentais usando células U2OS, células comumente usadas para estudar SGs. Estas células são ideais, porque têm um citoplasma grande, são relativamente lisas, e atribuem fortemente aos lamínulas de vidro. Outros tipos de células podem ser usados ​​para estudar SGs, mas é importante estar ciente de que as diferenças no tempo, na concentração de fármacos e na abundância de proteínas nucleantes de SG podem alterar a cinética e a composiçãoPosição. Al� disso, algumas c�ulas respondem �fixa de paraformalde�o formando ves�ulas de superf�ie celular, dando, ent�, uma apar�cia abaulada que provoca a localiza�o puncata de alguns marcadores SG; Sem uma análise cuidadosa, estes podem ser classificados erroneamente como SGs. Isso destaca a necessidade de avaliar todos os critérios necessários para identificar focos induzidos pelo estresse como SGs de boa-fé . Vinorelbina (VRB), um cancro terapêutico que promove SGs 20 , bem como Sodium Arsenite (SA), um robusto e bem caracterizado SG indutor, são utilizados como stress para as experiências neste protocolo.

As SGs canônicas contêm múltiplos marcadores SG (proteínas e mRNAs) que se colocalizam em focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto a imunofluorescência como a hibridização in situ fluorescente (FISH) para detectar a localização de marcadores de proteína e ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Resumidamente, a imunofluorescência indirecta utiliza anticorpos ( i.E. Anticorpos prim�ios) espec�icos para uma determinada prote�a para a detectar dentro da c�ula. Em seguida, os anticorpos secundários (geralmente específicos de espécies) ligados a fluorocromos reconhecem o anticorpo primário e revelam a localização da proteína alvo. A microscopia fluorescente é utilizada para detectar o sinal localizado dentro da célula. Utilizar anticorpos produzidos em diferentes espécies e detectá-los com anticorpos secundários de cor diferente permite a detecção da colocalização de múltiplos anticorpos, indicando que os alvos proteicos são encontrados no mesmo local 23 . É importante selecionar marcadores que foram verificados para co-localizar em SGs de boa-fé .

FISH usa uma sonda marcada que base-pares para uma determinada RNA ou DNA seqüência [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza uma sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (ou pares de bases) com a cauda poliA de mRNA ( isto é, poliA FISH). A sonda biotinilada é então detectada utilizando estreptavidina conjugada com fluorescência, uma vez que a estreptavidina tem uma elevada afinidade para a biotina. Ao avaliar SGs, é importante acoplar poliA FISH com imunofluorescência detectando um marcador SG, como em SGs bona fide , os dois sinais devem colocalize.

Usando este protocolo, colocalização é avaliada de várias maneiras. Em uma imagem multicanal ( ou seja, RGB: vermelho, verde e azul), a colocalização alterará a cor do sinal sobreposto ( por exemplo, colocalized vermelho e verde aparecem amarelo) 23 . Adicionalmente, a colocalização é quantificada graficamente usando análise de varredura de linha, onde a intensidade de cada cor é medida através de uma dada linha 8 , 20 . Este protocolo descreve dois procedimentos de análise de varredura de linha usando o ImageJ 26 . Um procedimento é manual e passa por todo o processo,O outro usa uma macro, ou um programa simples que automatiza as etapas manuais. É importante passar pelo programa manual para entender o procedimento macro.

SGs formam-se em células onde a tradução é reprimida; Portanto, as células com SGs devem exibir níveis diminuídos de tradução global em comparação com células não tratadas. Experimentalmente, utiliza-se ribopuromicilação. A puromicina e a emetina são adicionadas às células durante um curto período de tempo antes da fixação, permitindo que a puromicina se incorpore aos polipéptidos que formam activamente, causando a terminação 27 , 28 . O tratamento com emetina é necessário para prevenir o re-início 29 . A puromicina pode então ser detectada utilizando anticorpo anti-puromicina, dando um instantâneo de tradução activa. Este método é usado porque é rápido, não requer pré-fome com um meio que não tem um aminoácido particular (e potencialmente pretensão das células), e revela aLocalização subcelular de tradução de proteínas. Outros m�odos, nomeadamente utilizando an�ogos de amino�idos modificados, tais como o an�ogo de metionina L-azidohomoalaina (AHA), acoplados com a qu�ica "click-it" 30 , foram utilizados para mostrar que as c�ulas contendo SG apresentam uma tradu�o muito mais baixa do que as c�ulas vizinhas 31 . No entanto, esta técnica requer inanição de metionina seguida de marcação por impulsos durante 15-30 min. A privação de metionina constitui um estresse adicional, enquanto que o longo tempo de marcação ( isto é, 15-30 min) resulta na medição de tradução cumulativa em vez de contínua e também permite que as proteínas recém-sintetizadas se movam do seu local de síntese para o seu destino final dentro do célula. Em contraste, a ribopuromicilação é muito mais rápida e é compatível com qualquer meio, tal como o meio isento de glucose utilizado para induzir SGs através de inanição de glucose.

As SGs canônicas estão em equilíbrio dinâmicoCom tradução activa de polissomas. Isto pode ser avaliado experimentalmente por tratamento de amostras com os fármacos que estabilizam ou desestabilizam polissomas, inclinando assim o equilíbrio entre SGs e polissomas 23 . A ciclo-heximida (ou emetina, que se comporta de modo semelhante) bloqueia o alongamento por "congelamento" de ribossomas no mRNA, diminuindo assim o conjunto de mRNPs não polissómicos disponíveis capazes de formar SGs. Experimentalmente, isto pode ser usado de duas maneiras: pela adição de cicloheximida (ou emetina) antes da tensão para prevenir a formação de SG ou pela adição de cicloheximida (ou emetina) após a formação das SGs, mesmo sem remover o agente estressante, causando a desmontagem da SG Os complexos de pré-iniciação são lentamente admitidos na fracção de polissomo. Em contraste, a puromicina provoca a terminação prematura e promove a desmontagem do polissomo, aumentando o conjunto de mRNAs iniciadores capazes de se reunirem em SGs. Experimentalmente, o tratamento com puromicina aumenta o número de SGs ou reduz oD em que se formam em resposta ao stress graduado ou dose de fármaco. Ao avaliar o efeito da puromicina, é importante utilizar um nível sub-máximo do fármaco de interesse, uma vez que se espera que a puromicina aumente o efeito do fármaco e aumente a percentagem de células apresentando SGs - isto não pode ocorrer se o fármaco / Estresse provoca SGs em 100% das células inicialmente. Isto contrasta com o tratamento com cicloheximida, que desmonta as SGs e funciona melhor quando ~ 95% das células inicialmente exibem SGs de modo que a maior diminuição possível pode ser observada e quantificada com precisão.

Este protocolo proporciona uma estrutura para estudar SGs em células de mamíferos. Os métodos incluem: (1) colora�o imunofluorescente e an�ise de ImageJ para avaliar a colocaliza�o dos marcadores SG-associados eIF4G, eIF3b e prote�a de liga�o de prote�a 1 activadora de Ras GTPase (G3BP1) em SGs putativas; (2) hibridação in situ de fluorescência de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamento com ciclo-heximida e puromicina para determinar se os focos induzidos pelo estresse estão em equilíbrio dinâmico com polissomos; E (4) ribopuromicilação para avaliar o estado de translação de células contendo SGs putativas. Juntos, estes ensaios podem determinar se os focos induzidos pelo stress podem ser classificados como SGs de boa-fé .

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Protocol

1. Preparação da Célula

  1. Adicionar lamínulas autoclavadas a 12 poços de uma placa de 24 poços, como indicado na Figura 1A ; Isso pode ser feito usando uma pipeta estéril Pasteur anexado a um vácuo para pegar cada lamínula. Toque suavemente a lamela no lado do poço para liberar a sucção, permitindo que a lamela para cair no poço.
  2. Placa 1 x 10 5 células de osteosarcoma U-2 OS (U2OS) por poço a um volume final de 500 μL de meio. Mova a placa lado a lado e para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células são distribuídas uniformemente.
  3. Suavemente pressione os lamínulas para baixo com uma ponta P1000 limpa para garantir que a lamela está no fundo do poço e que não há bolhas sob a lamela.

2. Estressando as Células

  1. No dia seguinte, verifique visualmente a placa para assegurar que as células estejam uniformemente dispersas e uniformemente confluentes através da lamela, uma vez que variações entre saPodem afetar adversamente a reprodutibilidade dos resultados. Use um objetivo 10X em um microscópio de cultura de tecido invertido.
  2. Pré-aqueça o meio a 37 ° C. Evite aplicar meios frios ou quentes nas células, pois estas causam choque frio ou choque térmico, respectivamente.
  3. Diluir drogas em meios pré-aquecidos. Para cada concentração de fármaco diferente, preparar 2 poços contendo 500 μL de meio. Prepare um adicional de 500 μL para permitir a perda durante a pipetagem. Alíquota 4 tubos, contendo cada um 1,5 mL.
    1. Para o arsenito de sódio: para cada poço contendo 500 μL, adicionar 1,5 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 100 μM) ou adicionar 0,75 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 50 μM).
    2. Para vinorelbina: a cada poço contendo 500 μL, adicionar 22,5 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 150 μM) ou adicionar 18,75 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 100 μM).
      NOTA: Arsenito de sódio É um indutor de grânulos de stress bem caracterizado e vulgarmente utilizado e é portanto classicamente utilizado como controlo positivo.
  4. Remova e descarte a mídia dos poços B1 - 4 e C1 - 4. Adicione o meio com drogas e espere 60 min (Figura 1A).
    1. Adicionar 500 μL de meio com 100 μM de arsenito de sódio aos poços B1 e B2. Adicionar 500 μL de meio com 50 μM de arsenito de sódio aos poços B3 e B4.
    2. Adicionar 500 μL de meio com 150 μM de vinorelbina aos poços C1 e C2. Adicionar 500 μL de meio com 125 μM de vinorelbina aos poços C3 e C4.
  5. 30 min antes da fixa�o, tratar os po�s na coluna 2 com 5 � de cicloheximida (1 mg / mL de stock) e os po�s na coluna 4 com 2 � de puromicina (pasta de 1,25 mg / mL). Agite suavemente a placa para misturar antes de colocar a placa de volta na incubadora a 37 ° C.

3. Fixação Celular e Imunofluorescência

Nt "> NOTA: Antes do experimento, assegure-se de que o metanol é arrefecido até -20 ° C. Faça buffers, incluindo solução salina tamponada com fosfato (PBS), 5% de soro de cavalo normal (NHS) em PBS e paraformaldeído a 4% ) Em PBS.

  1. Descarte a mídia e lave os poços contendo lamínulas com PBS. Dependendo dos fármacos utilizados, pode ser importante descartar adequadamente os meios contendo drogas; Entre em contato com o escritório local de segurança ambiental para obter instruções específicas. Para lavar eficientemente, encha uma garrafa de espremer com PBS, corte a ponta de modo a permitir um fluxo suave ao invés de um fluxo apertado e use isso para adicionar PBS a cada poço após a aspiração do PBS original.
  2. Fixar as células utilizando ~ 250 μL de PFA a 4% durante 15 min à RT sob agitação suave. Cubra completamente a parte superior da lamela com PFA; 250 μL deve ser suficiente, mas se não, adicione mais. Sempre evite pipetar diretamente nos lamínulas, pois algumas células (ou tratamentos de tensão de células) podem alterar o apego, e tA força de pipetagem pode desalojar as células.
  3. Remova o PFA e descarte adequadamente. Entre em contato com o escritório local de segurança ambiental para obter detalhes sobre como descartar adequadamente paraformaldeído.
  4. Adicionar ~ 250 μL de metanol (-20 ° C) e incubar durante 5 min à RT sob agitação suave; Isto permeabiliza e aplana as células.
  5. Remover e descartar o metanol e bloquear as células, aplicando ~ 250 μL de NHS a 5% durante 1 h a RT O / N a 4 ° C. Entre em contato com o escritório de segurança ambiental local para obter detalhes sobre como descartar adequadamente metanol.
  6. Para anticorpos primários, diluir os anticorpos em NHS a 5%.
    NOTA: A utilização de múltiplos marcadores SG é fundamental para confirmar se os grânulos observados são SGs de boa-fé . O número de marcadores SG que podem ser usados ​​depende dos filtros disponíveis no microscópio. Se estiverem disponíveis conjuntos de filtros verde, vermelho e far-vermelho padrão, utilize G3BP1, eIF4G e eIF3b a uma diluição de 1/250.
  7. Lavar os poços 3x com PBS, e incubar cada lavagem durante 5 min.
  8. Para anticorpos secundários, diluir todos os anticorpos secundários (diluição 1/250) e corante Hoechst (diluição 1/1000) em NHS a 5%.
    1. Para esta experiência (12 lamelas a 250 μL de cada um - Total: 3 mL de NHS a 5%), adicionar 12 μL de cada um dos seguintes: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit e Cy5-Goat (uma diluição 1/250 de cada ) E adicionar 3 μL de corante Hoechst.
    2. Incubar os lamínulas com os anticorpos secundários durante 1 h à RT. Durante este e os seguintes passos, proteger as amostras de luz, cobrindo a placa com uma caixa ou colocando folha sobre o topo do prato de cultura de tecidos.
  9. Lave oLls três vezes com PBS durante 5 min cada.
  10. Monte os lamínulas em lâminas de vidro etiquetado usando meio de montagem. Aquecer o meio de montagem num bloco de calor a 37 ° C durante 10 min; Isto diminui a viscosidade e facilita a pipetagem. Com uma ponta de corte P200, pipetar 25 μL de meio de montagem por lamela em uma lâmina de vidro; 4-8 lamínulas podem caber em uma lâmina de vidro, assumindo que o estágio do microscópio permite isso. Usando fórceps finos, transferir a lamela do poço para o slide, certificando-se de colocar o lado da célula para baixo sobre o meio de montagem. Usando uma ponta P200 limpa, pressione o lamínula para baixo.
  11. Uma vez que todos os lamínulas foram montados, use tecido de laboratório dobrado para limpar o excesso de mídia de montagem, pressionando o tecido de laboratório muito firmemente sobre o slide. Use um frasco de compressão contendo H 2 O para enxaguar o excesso de meio de montagem e, em seguida, repita o blotting com tecido de laboratório dobrado para remover a água.

4. Fluorescência In Situ </ Em> Hybridization (FISH)

  1. Placa e tratar as células, usando os passos 1 e 2.1-4 como um guia; Só é necessário plaquear as células na coluna 1, uma vez que são necessários apenas 3 lamelas na experiência seguinte.
  2. Certifique-se de que todos os tampões são preparados ( isto é, PFA a 4% em PBS, etanol a 70% em água, 2x Citrato de sódio salino (SSC) e NHS a 5%), que o metanol seja arrefecido até -20 ° C e que O forno de hibridação é aquecido até à temperatura apropriada.
  3. Execute os passos 3.1-3.3 para lavar e fixar as células.
  4. Permeabilizar as células por adição de -20 ° C de metanol durante 10 min.
  5. Remover o metanol e incubar as lamelas em etanol a 70%. Colocar a placa a 4 ° C durante a noite. Selar a placa usando parafilme para evitar a evaporação.
  6. No dia seguinte, remover o etanol e re-hidratar as células adicionando 500 μL de SSC 2x. Incubar os lamínulas durante 5 min com agitação suave à temperatura ambiente.
  7. Remova o SSC 2x e adicione 500ΜL de SSC 2X. Incubar durante 5 minutos sob agitação suave.
  8. Coloque um pedaço de parafilme na parte de baixo do forno de hibridação. Pipetar 25 μL de tampão de hibridização sobre o parafilme para cada lamínula. Remova a lamela do prato de 24 poços (neste ponto, os lamínulas estão lado da célula para cima) e coloque a lamela lado da célula para baixo sobre o buffer de hibridização. Faça-o a 42 ° C ou opcionalmente a 65 ° C durante 15 min.
    NOTA: Completar esta etapa a 65 ° C desnaturalizará RNAs celulares; Isto pode melhorar o sinal se o poliA é mascarado por interações com proteínas.
  9. Diluir a sonda de Biotina-Oligo (dT) (100 ng / μL) em tampão de hibridação para uma concentração de 2 ng / μL; 25 μL por lamínula é suficiente.
  10. Para cada lamela, pipetar 25 μL de tampão de hibridação contendo Biotina-Oligo (dT) sobre o parafilme. Pegue a lamela com fórceps e toque suavemente a borda da lamela em um tecido de laboratório para remover o excessoTampão de hibridação. Transferir a lamela para o tampão de hibridação com Biotin-Oligo (dT); Lembre-se de manter o lado da célula para baixo.
  11. Coloque os lamínulas em uma caixa de hibridização para limitar a evaporação. Incubar os lamínulas com Biotina-Oligo (dT) em tampão de hibridação por 60 min a 42 ° C.
  12. Colocar 2x SSC no forno de hibridação para permitir que ele se equilibre a 42 ° C.
  13. Adicionar ~ 500 μL de 2 x SSC aquecido para os poços na placa de 24 poços e usar pinças para transferir os lamínulas para o poço. Incubar durante 10 min.
  14. Repetir o passo de lavagem acima duas vezes a 42 ° C e depois duas vezes à TA.
  15. Complete os passos 3.5-3.10, certificando-se de usar um fluorocromo de estreptavidina para detectar o Biotin-Oligo (dT) em vez de um anticorpo convencional.

5. Ensaio de ribopuromicilação para avaliar o estado translacional

  1. Placa de células U2OS em lamínulas, como indicado no passo 1, mas apenas chapa um lamínula por condição (nesteCaso, 3 lamínulas: não tratadas, arsenito de sódio 100 μM e vinorelbina 150 μM) ( Figura 1 A).
  2. Células de estresse usando o protocolo na etapa 2, completando as etapas 2.1-2.4.
  3. 5 min antes da fixação, adicionar 2 μL de puromicina (estoque: 1,25 mg / mL, diluir 2 μL em 500 μL para obter uma concentração final de puromicina de 5 μg / mL) e 2,9 μL de emetina (estoque: 20 μg / mL; 2,9 μL à mesma solução contendo já a puromicina) para cada poço contendo 0,5 mL.
  4. Completar os passos 3.1-3.10 como indicado acima, utilizando um anticorpo anti-puromicina (diluição 1/1000) para detectar puromicina. Idealmente, use outros dois marcadores SG nos canais restantes.
  5. Ao quantificar o sinal de puromicina, tome todas as imagens usando a mesma exposição. Escolha esta exposição usando a amostra mais brilhante (sem tensão) e tirando uma imagem tão brilhante quanto possível sem saturação.
    NOTA: A intensidade do sinal fluorescente anti-puromicina represA tradução contínua, como substitutos de puromicina para um aminoácido, incorpora na proteína nascente, e impõe a terminação prematura da proteína.

6. Aquisição e Análise de Imagens

  1. Quantificação de grânulos de estresse
    1. Para quantificar SGs, adquira 3 - 5 imagens totalizando> 100 células por amostra usando um objetivo 40X. Em alternativa, adquira imagens utilizando outros objectivos, mas certifique-se de que> 100 células são contadas por lamínula e que a ampliação é suficientemente grande para visualizar claramente os grânulos. Faça isso dividindo a lamela em cinco regiões aproximadamente iguais e selecionando aleatoriamente um campo de cada região ( Figura 1B ); Imagens do mesmo campo devem incluir todos os canais para avaliar a colocalização de marcadores.
    2. Uma vez que todas as imagens foram adquiridas, mesclar os canais. Algum software da câmera fará automaticamente isto, enquanto outros requerem a fusão manual; Isso pode ser feito comImageJ abrindo todas as imagens e selecionando [Image | Cor | Mesclar Canais].
    3. Contagem manual do número total de células, contando o número de núcleos, usando Hoechst como o marcador de núcleos. Contagem manualmente o número de células que contêm mais de dois SGs por célula.
      NOTA: Por exemplo, usando uma imagem de três canais combinada exibindo G3BP1 (verde), eIF4G (vermelho) e Hoechst (azul), conte os núcleos (ou número de células) usando o canal azul. Em seguida, considere as células SG-positivas como aquelas com dois ou mais focos amarelos por célula. Os grânulos aparecerão amarelos, como verde de G3BP1 e vermelho de eIF4G aparecem amarelos se colocalized.
    4. Determine a percentagem de células que são SG positivo, combinando os dados das 3-5 regiões independentes e, em seguida, calcular:
      Número de SG positivo / número de núcleos) * 100 = percentagem de células SG-positivas
  2. Avaliação da Colocalização por Análise de Varredura de Linha - Método Manual
    1. AbertoImageJ. Faça o download gratuitamente de ()
    2. Abra o gerenciador de ROI: [Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI ...].
    3. Abra a imagem mesclada no ImageJ: [File | Aberto].
    4. Usando a ferramenta de linha localizada na barra de ferramentas ImageJ, adicione uma linha que passa por um SG, certificando-se de incluir antes e depois do SG. Adicione esta linha ao gerenciador de ROI clicando em [Adicionar] na janela do gerenciador de ROI.
    5. Dividir a imagem mesclada em canais separados para avaliar a localização de cada marcador para o grânulo: [Image | Cor | Split Channel]; Isso dividirá a imagem mesclada em três imagens em preto e branco.
    6. Na imagem em preto-e-branco, certifique-se de que a linha está selecionada; A linha é selecionada se aparecer na imagem. Caso contrário, na janela do gestor de ROI, clique na linha no painel; Isto irá realçar a linha em azul na janela do gestor de ROI e tornará a linha visível na imagem em preto e branco. Se a linha ainda não aparecer, certifique-se de que "mostrar tudo" é chEcked no gerente de ROI e, em seguida, clique na linha na imagem.
    7. Analisar a intensidade da linha: [Analisar | Plot Profile]; Isto irá abrir a janela "Plot Profile", que traça a intensidade do sinal através da linha.
    8. Na janela "Plot Profile", clique em [List], que abre uma janela contendo os dados brutos do gráfico. Copie todos os dados nesta janela e cole-os em um arquivo de planilha. Para fazer isso, selecione todos os dados na janela: [Editar | Selecionar tudo]. Copie a data: [Editar | Cópia de]. Abra um arquivo de planilha e cole os dados: [Editar | Colar].
    9. Complete os passos 6.2.6 a 6.2.8 para cada canal separadamente. Certifique-se de acompanhar o canal que está sendo avaliado.
    10. Em uma planilha, gere um gráfico de linha dos resultados. Selecione as colunas que incluem dados pressionando [controle] e clicando na letra na parte superior de cada coluna. Em seguida, selecione o gráfico de linha: [Inserir | Gráfico de linha].
    11. Repita essa análise para multGranulados de estresse em várias experiências independentes.
  3. Avaliando Colocalização por Análise de Varredura de Linha - Plugin ImageJ
    1. Faça o download e instale a ferramenta de perfil RGB no site da ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Quando instalado corretamente, um ícone vermelho, verde e azul (RGB) -lineado deve aparecer na barra de ferramentas.
    2. Abra a imagem ( por exemplo, Tiff, JPG) em ImageJ: [File | Aberto].
    3. Clique no ícone RGB localizado na barra de ferramentas ImageJ.
    4. Clique e arraste para adicionar uma linha que se estende através de um SG, certificando-se de incluir regiões adjacentes; Uma imagem do histograma aparecerá em uma janela pop-up.
    5. Salvar os dados como uma imagem: [Arquivo | Guardar como | Tiff]. Como alternativa, exporte e, em seguida, grafique os dados em outro programa gráfico usando a etapa 6.2.8 acima.

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Representative Results

Os focos induzidos pelo estresse não são necessariamente SGs. As SGs são classificadas como focos citoplasmáticos que contêm mRNAs, factores de iniciação de tradução e proteínas de ligação ao ARN e estão em equilíbrio com a tradução activa. O protocolo acima pode ser usado como um modelo para caracterizar se um determinado estresse induz SGs bona fide .

SGs colocalize com outros marcadores SG conhecidos, incluindo proteínas e mRNA. SA e VRB induzem focos citoplasm�icos que cont� G3BP1, eIF4G e eIF3b ( Figura 2A ). A colocalização destes marcadores é confirmada por análise de varredura de linha e imagens de canal único com ampliação aumentada ( Figura 2A ). Adicionalmente, estes focos contêm Mrna, tal como indicado por poliA FISH, e o sinal oligo (dT) co-localiza-se com o sinal de imunofluorescência G3BP1 ( Figura 2B ). É crítico mostrar que o poliA-FISHSobreposições de sinal com um marcador SG conhecido, como um estresse pode promover vários tipos de focos.

SGs ocorrem durante um estado de inibição translacional. Tanto VRB como SA promovem um estado translacionalmente reprimido, tal como avaliado experimentalmente com ribopuromicilação ( Figura 3 ). Bona fide SGs estão em equilíbrio dinâmico com ativamente traduzindo polissomos. As SGs induzidas por SA e VRB são dissolvidas com CHX, que prende polissomas em mRNAs, interrompendo assim a desmontagem do polissomo e evitando SGs ( Figura 4A, 4B ). Por outro lado, mais SA e VRB SGs são induzidos após o tratamento com puro, como puro promove polissomo desmontagem, favorecendo assim SG formação ( Figura 4A, 4C ).

Em resumo, como com o SA de controle positivo, o VRB induz SGs de boa-fé que: (1) colocalize com marcadores SG conhecidos, (2) incluem tanto proteína quanto mRNA ( Figu Re 2), (3) são encontradas em células onde a translação é reprimida ( Figura 3 ), e (4) estão em equilíbrio dinâmico com tradução ativa ( Figura 4A-4C ).

figura 1
Figura 1: Diagramas Experimentais. ( A ) Semear células em lamínulas previamente colocadas em uma placa de 24 poços, como indicado. Tratar as linhas A e B durante 60 minutos com SA ou VRB utilizando a concentração em μM conforme indicado. Após 60 min, adicionar CHX (concentração final: 20 μg / mL para a coluna 2) ou puro (20 μg / mL de puromicina para a coluna 4) ao meio contendo fármaco. Continuar a incuba�o durante 30 min adicionais antes da fixa�o e colora�o. ( B ) Diagrama de uma lamela, indicando os campos que devem ser visualizados para contagem. A lamela é dividida em cinco regiões aproximadamente iguais; Uma imagem é recolhida em cada região."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2
Figura 2: SA e VRB induzem focos citoplasmáticos que contêm marcadores SG anPoly (A) mRNA. ( A ) células U2OS imunocoradas para G3BP1 (verde), eIF3b (vermelho) e eIF4G (azul). As células foram tratadas com SA 100 μM ou VRB 150 μM durante 60 min ou não foram tratadas (controlo). As regiões com zoom são ampliadas (2X) e mostradas como canais separados em preto e branco (abaixo). O gráfico indica a análise de varredura de linha de um grânulo de região (linha branca) e mostra a extensão de sobreposição ou colocalização. A barra de escala representa 10 μm. ( B ) PolyA-FISH acoplado com imunomarcação detecta ARNm de poliA com uma sonda oligo (dT) 40 (vermelha), G3BP1 (verde) é detectado utilizando um anticorpo anti-G3BP, e o ADN nuclear é detectado utilizando corante Hoechst (azul). As regiões com zoom (2X), imagens de canal único ea análise de varredura de linha mostram colocalização. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: SA e VRB Tratamento Causa Repressão da Translação. A imunofluorescência de células U2OS foi marcada com puromicina durante 5 min após os tratamentos indicados. Puromicina (verde), eIF3b (vermelho) e ADN nuclear corado com Hoechst (azul). As células foram tratadas com SA 100 μM ou VRB 150 μM durante 60 min ou não foram tratadas (controlo). Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver um versÇão dessa figura.

Figura 4
Figura 4: SA e VRB induzem focos citoplasmáticos que estão em equilíbrio dinâmico com polissomos. ( A ) Esquema geral descrevendo a relação polissomo / SG. ( BC ) células U2OS coradas para G3BP1 (verde), eIF3b (vermelho) e DNA nuclear usando Hoechst (azul). As células foram tratadas com SA 100 μM ou VRB 150 μM durante 60 minutos ou não foram tratadas (controlo) antes da adição de ( B ) CHX (cicloheximida, 20 μg / mL), ( C ) puro (Puromicina, 10 μg / mL ), Ou nenhum aditivo durante 30 min adicionais de incubação. Os números correspondem à percentagem de células com SGs numa experiência representativa. Barra de escala = 25 μm, em (BC). Clique aqui para ver umaVersão desta figura.

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Discussion

Conforme evidenciado por estudos imuno-histológicos em múltiplas doenças, o estresse crônico leva à formação de diferentes focos intracelulares. Por exemplo, a maioria das doenças neurodegenerativas é caracterizada por agregados intracelulares de proteínas insolúveis. A presença de proteínas associadas a SG nesses agregados é frequentemente a base para concluir que tais focos são SGs. Uma conclusão semelhante é também tirada quando os focos citoplasmáticos positivos para o marcador SG são observados em células tratadas com novos estímulos de estresse. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simples para identificar SGs de boa-fé .

Devem ser cumpridos vários critérios para que as SG putativas possam ser confirmadas como tal, incluindo a caracterização da composição e da dinâmica. Em primeiro lugar, SGs são focos citoplasmáticos que contêm mRNPs translacionalmente paralisados. Assim, a primeira abordagem é caracterizar a sua composição utilizando duas técnicas baseadas em microscopia, nomeadamente poliA-FISH e IF. O FISH é um método confiável paraMRNAs que colocalize com SGs. Uma sonda oligo (dT) 40 é utilizada para detectar mRNAs poliadenilados que se encaixam em SGs sob condições de stress. Como o oligo (dT) não detectará mRNAs mortinados, que são componentes centrais dos Corpos de Processamento (PBs), a presença de um sinal forte de oligo (dT) em focos citoplasmáticos é uma primeira indicação (embora não suficiente para a definição) de que esses focos são SGs. O segundo teste é demonstrar a colocalização de um sinal poli (A) com outros marcadores SG ( eg, G3BP1) ( Figura 2A ). Isto é feito através da realização IF contra proteínas marcador SG. Os marcadores SG eIF3b, eIF4G e G3BP1 são rotineiramente utilizados porque eIF3b e eIF4G são factores de iniciação de tradução conhecidos por serem componentes de complexos 48S * e G3BP1 é necessário para formação de SG ( Figura 2B ). É importante ressaltar que é necessário mais do que um marcador SG, uma vez que diferentes tensões recrutam diferentes fatores SG associados aos SGs, e algumas tensões podem cUma agregação de proteínas que poderia ser confundida com a formação de SG.

Em segundo lugar, SGs são formados por causa da inibição da tradução. Embora a inibição da tradução possa ser detectada por diferentes abordagens ( por exemplo, através da marcação tradicional de [35S] Met Chase), a ribopuromicilação é preferida, uma vez que detecta a tradução de proteínas em curso nas células tratadas. Esta técnica é também compatível com imunofluorescência padrão contra marcadores SG, permitindo assim a monitorização simultânea de SGs e do grau de inibição da tradução em células individuais. Como visto na Figura 3 , SA e VRB promovem a formação de SG em diferentes graus. Enquanto SA provoca SGs em quase 100% das células, VRB promove a formação de SG em aproximadamente 75% das células. A capacidade de promover SGs correlaciona-se com o grau de inibição da tradução: enquanto as células não tratadas têm um nível basal de tradução alto, SA inibe a tradução completamente, mas VRB apenas paInibe a tradução ( Figura 3 ).

Terceiro, as SGs são dinâmicas e estão em equilíbrio com os polissomos de tradução. O tratamento de células com cicloheximida antes da tensão ou concomitantemente com o stress evita a desmontagem do polissomo e a formação de SG. O equilíbrio SG-polissomo é bidirecional, uma vez que as células tensionadas exibindo SGs podem ser tratadas com ciclo-heximida para reforçar a desmontagem da SG por meio da captura de mRNAs em polissomas ou monossomas sempre que forem iniciados de forma produtiva. Um controlo importante consiste em utilizar a puromicina, que inibe o alongamento promovendo a terminação prematura, aumentando assim a quantidade de mRNP não polissómicos disponíveis para formação de SG. Mudanças dramáticas nas SGs são observadas quando o tratamento de SA ou VRB é acoplado com CHX ou tratamento puro ( Figura 4 ). Assim, avaliar se as SG putativas são dissolvidas durante o tratamento com ciclo-heximida mas são aumentadas ou não afectadas pela puromicina é um parâmetro experimental chave para utilização na SG identifiCação. A desmontagem da SG com aplicação de emetina em células CD34 + de medula óssea humanas primárias muito pequenas não aderentes foi demonstrada com sucesso tratando as células em suspensão antes do citospineamento 32 .

Arsenito de sódio é amplamente utilizado para desencadear SGs induzindo eIF2-α fosforilação 33 , mas deve ser cuidadosamente titulados , uma vez que metas muitas proteínas e ativa um número de sinalização vias 34 , 35 . Diferentes linhas celulares exibem diferentes graus de sensibilidade ao arsenito de sódio. U2OS são relativamente sensíveis (100 μM), enquanto que COS7, MEFs e HeLa requerem 200 μM. DU-145 6 , células CD34 + de medula óssea humana primária 32 , linfoblastos humanos 36 , neurónios corticais de murganho 37 e células Huh7 31 requerem 500-1 000 μM.

O fluxo de trabalho experimental aqui descrito permite a detecção de SGs em diferentes células e sob diferentes tensões. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é que ele é simples e permite a detecção inequívoca de SGs de boa-fé , bem como para a sondagem simultânea de tradução celular em células tratadas com stress. Este protocolo usa células U2OS, mas pode ser alterado para diferentes linhas celulares ou mesmo para células primárias. Uma lista recente e abrangente de células utilizadas para estudos de grânulos de estresse é revisada 11 . O número de células deve ser ajustado para atingir 80% de confluência no dia do tratamento com fármaco. A concentração e a duração do tratamento medicamentoso devem ser ajustadas também, uma vez que as células respondem de forma diferente. Além disso, enquanto este protocolo é configurado para um formato de 24 poços, ele pode ser ajustado para qualquer placa de tamanho ou prato onde lamínulas (de qualquer tamanho) pode ficar plana durante o chapeamento e droga treatmeNt. As linhas celulares que expressam de forma estável marcadores SG / PB foram utilizadas em ecrãs com base em siRNA de elevado rendimento 33 e imagens de células vivas 38 . O rastreio baseado em imagem foi empreendido utilizando células HeLa coradas para o marcador SG endógeno PABP para detectar compostos químicos bloqueando a montagem SG 39 . Prevê-se que este fluxo de trabalho será útil em futuros estudos e aplicações.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos aos membros dos laboratórios Ivanov e Anderson por sua útil discussão e feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [GM111700 e CA168872 para PA, NS094918 para PI], o National Science Centre na Polônia [concessão UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 para WS]. WS também reconhece o Ministério da Ciência e Educação Superior na Polônia (Programa Mobility Plus) ea Comissão Fulbright polonesa-americana por seu apoio financeiro de sua pesquisa nos EUA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

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