Glycoproteomics av ​​den extracellulära matrisen: En metod för intakt glykopeptiden analys med masspektrometri

Biochemistry
 

Summary

Detta dokument beskriver en metod för att förbereda kardiovaskulära vävnadsprover för MS-analys som gör det möjligt för (1) analys av ECM proteinkomposition, (2) Identifiering av glykosyleringsställen, och (3) sammansättnings karakterisering av glycan former. Denna metod kan tillämpas, med smärre ändringar, till studiet av ECM i andra vävnader.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Barallobre-Barreiro, J., Baig, F., Fava, M., Yin, X., Mayr, M. Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (122), e55674, doi:10.3791/55674 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fibros är ett kännetecken för många kardiovaskulära sjukdomar och är associerad med den förvärras sekretion och deponering av den extracellulära matrisen (ECM). Använder proteomik, har vi tidigare identifierat mer än 150 ECM och ECM-associerade proteiner i kardiovaskulära vävnader. Anmärkningsvärt många ECM-proteiner glykosylerade. Denna post-translationell modifiering påverkar proteinveckning, löslighet, bindning och nedbrytning. Vi har utvecklat en sekventiell extraktion och anrikning metod för ECM-proteiner, som är kompatibel med den efterföljande vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) analys av intakta glykopeptider. Strategin är baserad på sekventiella inkubationer med NaCl, SDS för vävnads decellularisering, och guanidinhydroklorid för solubilisering av ECM-proteiner. Senaste framstegen inom LC-MS / MS inkluderar fragmenteringsmetoder, såsom kombinationer av högre energi kollision dissociation (HCD) och elektronöverförings dissociation (ETD), som möjliggörden direkta analysen av sammansättningen av glykopeptider av ECM-proteiner. I föreliggande papper, beskriver vi en metod för att framställa ECM från vävnadsprover. Metoden medger inte bara för proteinprofilering utan även bedömning och karakterisering av glykosylering genom MS-analys.

Introduction

Fibros är ett kännetecken för många sjukdomar. Fibroblaster proliferera och differentiera mot höggradigt syntetiska fenotyper, som är associerade med den förvärras sekretion och avsättning av extracellulär matris (ECM) 1. Överdriven ECM nedfall kan fortsätta även efter den ursprungliga skadan har avtagit, vilket leder till funktionsnedsättning. Använder proteomik, har vi tidigare identifierat mer än 150 ECM och ECM-associerade proteiner i hjärtvävnad 2, 3. De är inte bara strukturproteiner, men också matricellular proteiner och proteaser som bidrar till kontinuerlig ombyggnad och dynamisk anpassning av hjärtat. Anmärkningsvärt många ECM-proteiner glykosylerade 4. Denna post-translationell modifiering (PTM) innefattar tillsats av sockerrester till vissa aminosyrapositioner, och det påverkar proteinveckning, löslighet, bindning och nedbrytning 5

Det finns två huvudtyper glykosylering som inträffar i däggdjur. (1) N-glykosylering inträffar vid karboxamido kvävet i asparaginrester (Asn) inom konsensussekvensen Asn-Xaa-Thr / Ser, där Xaa är vilken aminosyra som helst med undantag för prolin. (2) I O-glykosylering, sockerrester fäster vid serin- och treoninrester (Ser, Thr) eller, i en mycket mindre utsträckning, att hydroxiprolin och hydroxilysin. Medan O-glykosylering kan förekomma i en mängd olika proteingrupper, är N-glykosylering begränsad till utsöndrade proteiner eller extracellulära domäner av membranproteiner 5. Detta gör N-glykosylering ett attraktivt mål när man studerar ECM.

Proteomics sätter en ny standard för analys av proteinförändringar sjukdom. Hittills har de flesta proteomik studier varit inriktade på intracellulära proteiner 6. Detta beror främst på grund av följande skäl. Först, rikliga intracellulära proteiner hämmar identifiering av knappa ECM-komponenter. Detta är särskilt viktigt i hjärtvävnad, i vilken mitokondriella och myofilament proteiner svarar för en stor del av den proteinhalt 7. För det andra, integrerade ECM-proteiner är starkt tvärbunden och svår att lösa. Slutligen förekomsten av rikliga PTMs (dvs. glykosylering) förändrar molekylmassa, laddning, och elektroforetiska egenskaper hos peptider, som påverkar både separation och identifiering genom vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS / MS). Under de senaste åren har vi utvecklat och förbättrat en sekventiell extraktion och anrikning metod för ECM proteiner som är kompatibel med efterföljande masspektrometri (MS) analys. Strategin bygger på sekventiella inkubationer.

Det första steget utförs med NaCl, en jonisk buffert som underlättar extraktion av ECM-associerad och löst bundet ECM-proteiner, såväl som nyligen syntetiserade ECM-proteiner. Det jags tvättmedel fri, icke-denaturerande, icke-störande av cellmembran, och lämpade för ytterligare biokemiska analyser 8. Därefter decellularisering uppnås med natriumdodecylsulfat (SDS). I detta steg, säkerställer en låg SDS-koncentration membran destabilisering och frisättningen av intracellulära proteiner samtidigt förhindra avbrott av de mer lösliga icke-integrala ECM-komponenter. Slutligen, är ECM-proteiner extraheras med en guanidin-hydrokloridbuffert (GuHCl). GuHCl är effektiv vid extraktion av kraftigt tvärbundna proteiner och proteoglykaner från vävnader såsom senor 9, brosk 10, kärl 11, 12, 13 och hjärtat 2, 3. Vi tillämpade denna biokemiska fraktionering, i kombination med LC-MS / MS, för att utforska ECM remodellering i hjärt-kärlsjukdom 2 3, 11, 12, 13, 14. Senaste framstegen inom MS inkluderar nya fragmenteringsmetoder, såsom kombinationer av högre energi kollision dissociation (HCD) och elektronöverförings dissociation (ETD), som möjliggör direkt analys av intakta glykopeptider 3, 15.

Här beskriver vi en metod för att förbereda ECM för MS-analys som gör det möjligt för analys av proteinkompositionen, identifiering av glykosyleringsställen och karakteriseringen av glycan former. Jämfört med tidigare analyser av ECM glykosylering 16 medger denna metod för direkt bedömning av förändringar av sammansättningen i glykosylering profiler i ett sätesspecifikt sätt med användning av MS. Vi har tillämpat denna metod för att kardiovaskulära vävnader. Det kan dock alså tillämpas, med mindre modifieringar, till studiet av ECM i andra vävnadsprover och kan ge oöverträffade insikter i ECM biologi.

Protocol

Studien godkändes av Wandsworth lokala forskningsetiska kommittén (referensnummer: 06 / Q0803 / 37) och fick institutionella godkännande från forskning och utvecklingskontor. Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke.

1. Extraktion av extracellulära matrisproteiner

OBS: det mänskliga förmaks vävnader som används för dessa experiment erhölls från förmaks bihang under kardiopulmonell bypass, strax efter kardioplegiska gripandet av hjärtat. Alla prover samlades in vid St George sjukhus, London, Storbritannien. Alla vävnadsprover skall frysas vid -80 ° C. Använd inte prover bevarade med fixativ, såsom paraformaldehyd, att tvärbinda proteiner.

  1. Förbereda alla extraktionsbuffertar i förväg av experiment, enligt tabell 1, för att minimera tiden mellan extraktionssteg. Utföra alla inkubationer vid rumstemperatur (RT) i en temperaturkontrollerad miljö(Dvs, ~ 20 ° C) för att säkerställa överensstämmelse mellan extraktioner.
  2. Väg upp 20-50 mg vävnad. Om flera prover ska tas ut, klippa och väga dem en efter en för att undvika fullständig upptining av vävnaderna. Med användning av en skalpell, tärna vävnaden i 3-4 mindre bitar (dvs 2-3 mm) och placera dem tillsammans i 1,5 ml rör.
  3. Tillsätt 500 | il iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS, se tabell 1 och tabell of Materials) och utför fem tvättningar för att minimera blodsmitta.
  4. Extraktion Steg 1: Inkubation med NaCl Buffert
    1. Efter tvättning med PBS, placera proverna i 1,5 ml rör med skruvlock. Lägg NaCl buffert (se tabell 1) på 10 gånger (v: w) vävnadsvikten. Vortex rören vid RT för 1 h vid lägsta hastighet (dvs 600 varv per minut).
      OBS: En låg virvelhastighet är kritisk för att undvika mekanisk sönderdelning av vävnaden under detta steg.Använd en skum adapter för att placera alla rören under extraktion.
    2. Överföra extrakten till nya rör och centrifugera vid 16 tusen xg under 10 min vid 4 ° C. Lagra extrakten vid -20 ° C fram till användning. Tvätta snabbt de återstående vävnads pellets med färsk NaCl-buffert. Använda samma typ av buffert (dvs 100 | il av NaCl-buffert) för tvättning för att förhindra extraktion av andra proteiner med olika lösligheter (dvs proteiner inte extraherbara med NaCl).
    3. Efter tvätt, säkerställa fullständigt avlägsnande av bufferten för att minimera överlappning i proteinhalt med efterföljande extraktionssteg. Kassera NaCl-buffert som används för tvätt.
      OBS: Förhållandet mellan buffertvolymen och vävnadsvikt är viktig för en reproducerbar extraktion. A 10: 1-förhållande (volym: vikt) för NaCl och SDS extraktioner och 5: 1 för GuHCl steget ge tillräckliga mängder av protein utan att mätta bufferten. Proteinkoncentrationer är ungefär 1-2 pg / pL efter extraction.
  5. Extraktion Steg 2: Decellularisering med SDS-buffert
    1. Lägga SDS-buffert (Tabell 1) vid tio gånger (v: w) vävnadsvikt; användning av låga SDS-koncentrationer (dvs. 0,1%) är avgörande för att undvika förlust av ECM-proteiner under decellularisering. Vortex rören vid RT under 16 h vid minimal hastighet (dvs 600 varv per minut).
      OBS: En låg virvelhastighet minimerar mekanisk sönderdelning av ECM.
    2. Överför extrakten till nya rör. Centrifugera vid 16 tusen xg under 10 min vid 4 ° C; lagra vid -20 ° C fram till användning. Tvätta snabbt de återstående vävnadspellets med dd H 2 O för att avlägsna SDS. Se till att fullständigt avlägsnande av vätskan efter tvätt.
  6. Extraktion Steg 3: Inkubation med GuHCl Buffert
    1. Lägga GuHCl-buffert (Tabell 1) vid fem gånger (v: w) vävnadsvikten. Vortex rören vid RT under 72 h vid maximal hastighet (dvs.,
    2. Överför extrakten till nya rör. Centrifugera vid 16 tusen xg under 10 min vid 4 ° C och förvara vid -20 ° C fram till användning.

2. Protein Kvantifiering och nederbörd

OBS: På grund av närvaron av detergenter, är oförenlig med direkt protein kvantifiering av SDS-buffert baserad på mätningar av absorbansen vid 280 nm. För att säkerställa reproducerbar kvantifiering använder kolorimetriska analyser för alla proteinextrakt 17.

  1. Kvantifiering.
    1. Förbereda standarder för en kalibreringskurva med användning av bovint serumalbumin (BSA) seriespäddes i den lämpliga extraktionsbuffert (dvs NaCl, SDS, eller GuHCl) 17. Under denna tid, tina provextrakt.
    2. Späd proverna i extraktionsbuffert för att erhålla koncentrationer inomdet linjära området för absorbans; en 1:10 utspädning (volym: volym) ger tillfredsställande resultat. Späda GuHCl proverna med en lika stor mängd av DDH 2 O för kvantifiering, eftersom den kolorimetriska analysen är inte kompatibel med koncentrationer av> 4 M GuHCl.
    3. Använda en bicinkoninsyra (BCA) -baserade kolorimetrisk analys 17 (se tabell of Materials), enligt tillverkarens instruktioner för analyser in 96-brunnsplattor; Det rekommenderas att utföra åtminstone dubbla mätningar.
    4. Efter inkubation under 30 min, ta absorbansavläsningar vid en våglängd av 570 nm för att beräkna proteinkoncentrationen med användning av standardkalibreringskurva 17 BSA.
  2. protein Utfällning
    1. Tina GuHCl extrakt vid RT. Alikvot 10 pg protein för varje prov till nya rör. För en direkt glykopeptid analys delmängd 50 mikrogram. Tillsätt 10 gånger volymen av etanol och incubate över natten vid -20 ° C.
      OBS: GuHCl är inte kompatibel med ytterligare enzymatiska reaktioner och de flesta elektroforesapplikationer. Borttagandet av GuHCl krävs innan deglykosylering och trypsin matsmältningen. Lösligheten av GuHCl i etanol och, omvänt, den låga lösligheten av proteiner möjliggöra effektivt avlägsnande av GuHCl samtidigt ger approximativt en återhämtning 98% av proteiner 18.
    2. Centrifugera proverna vid 16 tusen xg under 30 min vid 4 ° C och aspirera supernatanten. Se till att inte störa utfällda pelleten. Torka pellets för 15 min med användning av en vakuumkoncentrator (se tabell of Materials) vid RT.
      OBS: Protokollet kan stoppas här och de torkade pellet lagrades vid -20 ° C fram till användning.
    3. Eventuellt, kör en gelelektrofores såsom kvalitetskontroll (QC, se Kompletterings Metoder).

3. Sekventiell Deglykosylering förBedömning av N-glykosyleringsställe Beläggning

  1. Under provtorkning (se steg 2.2.2), förbereda deglykosylering buffert innehållande avgrening avglykosylerings enzymer, enligt tabell 1. Se tabell av material för produktinformation.
  2. Tillsätt 10 mikroliter av deglykosylering buffert innehållande enzymer till varje prov. Se till att rätt pellets resuspension genom att utföra en snabb virvel och spin-ner av prover.
    OBS: avlägsnande av socker monomerer med användning av avgrenande enzymer är viktigt för den efterföljande och fullständigt avlägsnande av O-kopplade komplexa sackarider och underlättar senare klyvningen av N-kopplade sockerarter genom PNGas-F.
  3. Inkubera i 2 h vid 25 ° C för att tillåta avlägsnande av heparansulfat genom heparinas II.Increase temperaturen till 37 ° C och inkubera i 36 h med försiktig omrörning.
    OBS: Med tanke på de låga volymer reaktions och förlängda inkubationstider, användning inkubatorskakanordningar och tätt packa flera 1,5 ml tubes inuti en 50-ml koniskt rör lutar inuti inkubator vid ca 45 °.
  4. Efter 36 h, centrifugera prover för 1 min vid 16 tusen xg och indunsta H 2 O från proverna genom användning av en vakuum koncentrator vid RT under cirka 45 min.
  5. Resuspendera de torkade proverna med 10 mikroliter av H 2 18 O innehållande 50 U / ml PNGas-F, som klyver alla asparaginbundna glykaner i en deamidering reaktion.
    OBS: Den resulterande asparaginsyra uppbär ett överskott massa av 2,98 Da, en indikation på närvaron av N-glykosylering under MS-analys.
  6. Inkubera under 36 h vid 37 ° C under konstant omrörning i skakinkubator.

4. I-lösning Trypsin Digestion

OBS: Detta steg bör utföras för både icke-deglykosylerad (dvs, som används för direkt glykopeptider analys) och deglykosylerade prover (dvs, som används för bedömning av glykanen occupancy).

  1. Använda 10 | ig av totalt protein för bedömning av N-glykosyleringsställe beläggning (såsom anges i föregående steg). För prover avsedda för direkt glykopeptid analys, använder 50 ug protein som utgångsbelopp.
    OBS: Följande steg beskrivs för 10 pg protein. Skala upp th evolumes (dvs. 5 gånger för 50 | j, g) efter behov.
  2. Denaturera proteinerna på varje prov alikvot med användning av 9 M urea och 3 M tiourea, med slutkoncentrationer av 6 M urea och 2 M tiourea, respektive (t.ex. för en 10 mikroliter prov, 20 | il av karbamid / tiokarbamid).
  3. Minska proteinerna genom tillsats av 100 mM ditiotreitol (DTT, 3,33 | il, slutlig koncentration: 10 mM). Inkubera vid 37 ° C under 1 h med omröring vid 240 rpm.
  4. Svalna proverna till RT innan utförande av alkyleringen genom tillsats av 0,5 M jodacetamid (3,7 | il, slutlig koncentration: 50 mM). Inkubera i mörker i en timme.
  5. Använd pre-kyld (-20° C) aceton (6 gånger volymen av provet) att inkubera proverna över natten vid -20 ° C. Utfällning genom centrifugering vid 14 tusen xg under 25 min vid 4 ° C.
  6. Aspirera supernatanten. Se till att inte störa utfällda pelleten. Torka protein pellets med användning en vakuum koncentrator för 30 min vid RT.
  7. Återsuspendera i 20 mikroliter av 0,1 M trietylammoniumbikarbonat (TEAB), pH 8,2, innehållande trypsin (0,01 pg / pL) och smälta över natten vid 37 ° C och 240 rpm.
  8. Stoppa digereringen genom surgöring proverna med 10% trifluorättiksyra (TFA, 2 mikroliter för en slutkoncentration av 1% TFA).

5. Peptid Cleanup Använda C18 Kolumner

OBS: avlägsnande av störande kontaminanter från peptidblandningen efter spjälkning minskar jon undertryckande och förbättrar signal-till-brusförhållanden och sekvenstäckning. Detta steg bör utföras för både icke-deglykosylerad och deglykosylerad samples.

  1. Aktivera hartset på C18 spinnplattan (se tabell of Materials) med användning av 200 mikroliter av metanol per brunn och centrifugera vid 1000 xg under 1 min.
  2. Tvätta genom tillsats av 200 mikroliter per brunn av 80% acetonitril (ACN) och 0,1% TFA i H2O Centrifugera vid 1000 xg under 1 min.
  3. Jämvikta genom tillsats av 200 mikroliter per brunn av 1% ACN och 0,1% TFA i H2O Centrifugera vid 1000 xg under 1 min. Upprepa detta steg två gånger.
  4. Ladda proverna (hela volym) från steg 4 in i brunnarna innehållande hartset och centrifugera vid 1500 xg under 1 min. Ladda om genomflödes en andra gång och upprepa centrifugering.
  5. Tvätta genom tillsats av 200 mikroliter per brunn av 1% ACN och 0,1% TFA i H2O Centrifugera vid 1500 xg under 1 min. Upprepa detta steg två gånger.
  6. Eluera proverna med 170 ul per brunn av 50% ACN, 0,1% TFA i H2O Centrifugera vid 1500 xg under 1 min. Upprepa föregående stegoch kombinera det uppsamlade eluatet.
  7. Torka eluatet med användning av en vakuum koncentrator för 2 h vid RT. Om den inte används omedelbart, hålla de torkade proverna vid -80 ° C fram till användning.
    OBS: deglykosylerad Proven för proteinidentifiering endast är klar att använda för LC-MS / MS efter detta steg. Steg 6 och 7 krävs inte för dessa prover.
  8. Tina och resuspendera deglykosylerade proverna i 2% ACN och 0,05% TFA i H2O till en slutlig proteinkoncentration av 0,5 pg / pL. Fortsätt med steg 6 för direkt glykopeptiden analys av icke-deglykosylerade prover.
  9. Eventuellt, filtrera peptiderna före märkning med tandemmassapåhäng (TMT); se Kompletterings Metoder för peptid fitration.

6. Märkning med TMT (för Direct glykopeptid Analysis Only)

  1. Tö och återsuspendera de torkade pelletsen i 50 mikroliter av 50 mM TEAB att erhålla en koncentration av 1 pg / pl.
  2. Resusped det 0,8-mg injektionsflaska med TMT Noll (TMT 0, se Tabell över Materials) reagens i 41 mikroliter av ACN. Följ tillverkarens recommendantions för resuspension.
  3. Märka peptidproverna i ett förhållande av 50 ug peptider till 0,4 mg TMT 0 (dvs 50 ul av peptider till 20,5 mikroliter av TMT 0). Inkubera vid RT i 1 h.
  4. Släcka märkningsreaktionen genom tillsats av 5% hydroxylamin i ett förhållande 6: 100 (dvs 4,23 mikroliter av 5% hydroxylamin). Inkubera vid RT i 15 min.
  5. Torka TMT 0 -märkta peptidprover under 1 h vid RT med användning av en vakuum koncentrator. Återsuspendera i 10 mikroliter av DDH 2 O.
    OBS: På grund av de glykan rester, glykopeptider uppvisar en högre molekylvikt än icke-glykosylerade peptider. TMT 0 ökar laddningstillstånd glykopeptider. Detta reducerar deras relativa massa till laddning (m / z) -förhållanden och underlättar ETD fragmentering.

7. glykopeptiden Anrikning

  1. Använda reaktionsbuffertar som tillhandahålls i kitet (se tabell of Materials).
  2. Tillsätt 50 pl bindningsbuffert till varje 10 mikroliter prov från steg 6,5. Vortex glycocapture hartslösningen tills den blir homogen. Använda en zwitterjonisk hydrofil interaktion vätskekromatografi (zic-HILIC) -baserade fånga 15.
  3. Alikvot 50 mikroliter av hartssuspension till nya 1,5 ml rör. Snurra under 1 min vid 2500 X g och avlägsna supernatanten. Tillsätt 60 pl av provet (dvs provet med bindningsbuffert) till rören innehållande de hartspellets. Blanda med användning av en pipett och inkubera vid RT i 20 min i omrörning vid 1200 rpm.
  4. Centrifugera i 2 min vid 2000 xg och överför supernatanten till nya rör. Håll rören. Tillsätt 150 pl tvättbuffert till hartsrören. Blanda med användning av en pipett och inkubera vid RT i 10 min i omrörning vid 1200 rpm.
  5. Snurra i 2 min vid 2500 x g. Överförasupernatanten till samma rör (från steg 7,4). Upprepa tvättsteg två gånger.
  6. Lägg 75 mikroliter elueringsbuffert och blanda med hjälp av en pipett. Agitera vid 1200 rpm under 5 min vid RT och sedan centrifugera rören för 2 min vid 2500 x g. Överföra supernatanterna till nya 1,5 ml rör. Upprepa tvättsteg och sedan överföra eluatet supernatanten till samma rör.
  7. Centrifugera rören som innehåller eluatet (dvs glykopeptider) under 2 min vid 2500 x g. Överför supernatanten till nya rör för att säkerställa avlägsnandet av eventuellt kvarvarande harts från de föregående stegen.
  8. Torka de totala 150 | il av eluat med användning av en vakuum koncentrator under ca 2 h vid RT. Resuspendera torkade-down glykopeptider i 15 mikroliter av 2% ACN och 0,05% TFA i DDH 2 O.
  9. Fortsätta att utföra LC-MS / MS med användning av HCD fragmentering för att analysera ECM proteinkompositionen, och LC-MS / MS med användning av HCD och ETD fragmentering för glykopeptid karakterisering. Se avsnitt 8.
  10. 8. masspektrometri Analys

    1. Utföra LC-MS / MS med användning av HCD fragmentering för att analysera ECM proteinkomposition; se tilläggs Metoder för mer information.
    2. Utföra LC-MS / MS med användning av HCD och ETD fragmentering för glykopeptid karakterisering (se Kompletterings Metoder för detaljer); den anrikade provet bör jämföras med den icke-anrikade ingångsmaterialet 15.
      OBS! Detaljerade beskrivningar av LC-MS / MS-metoder för indirekt glykopeptid analys, direkt glykopeptider analys och databassökning finns i Tilläggs metoder. Forskare som är intresserade vid karakterisering ECM-protein och glykan komposition med användning av masspektrometri uppmuntras att hänvisa till tidigare publikationer 3, 11, 15.

Representative Results

En schematisk arbetsflöde av protokollet ges i figur 1.

ECM extraktion protokoll

Effektiviteten av extraktionen kan övervakas genom att köra alikvoter bilda varje extrakt på Bis-Tris-akrylamidgeler och med användning av silverfärgning för visualisering. Figur 2A visar komplementaritet av NaCl, SDS och GuHCl extrakt efter sekventiell extraktion. Denna QC möjliggör identifiering av potentiella problem med prov kvalitet som överdriven proteinnedbrytning. Efter extraktion, ECM glykoproteiner finns rikligt i de GuHCl extrakt (Fig 2B).

deglykosylering

För att bedöma effektiviteten i deglykosylering bör en icke-deglykosylerad kontroll köras i parallel. Deglykosylering tider måste vara lämpliga för att uppnå en fullständig och homogen avlägsnande av sockerrester, såsom exemplifieras i figur 3A. Figur 3B visar ett representativt exempel på prover effektivt deglykosylerade genom tillsats av enzymer för GAG borttagning och avglykosylerings enzymer som riktar mindre N- och O-kopplade oligosackarider.

Glycoproteomics

Protokollet för bedömning av beläggning av NXT / S sequons förbättrar proteinsekvenstäckning för ECM glykoproteiner efter MS (figur 3C) och möjliggör för en inledande screening av närvaron av glykoproteiner. Detta bidrar till att minska söktiden för glykopeptider, databaser kan anpassas för att innehålla tidigare identifierade glykoproteiner. HCD-ETD fragmentering används för identifiering och kompositions karakterisering av oligosackarider fäst till ECM g lycoproteins. Figur 4A visar ett representativt spektrum som erhållits för en peptid märkt med 18 O efter deglykosylering (glykopeptid analys indirekt). Figur 4B är ett representativt exempel på ett spektrum som erhållits efter analys av intakta glykopeptider från ECM extrakt (direkt glykopeptid analys).

Figur 1
Figur 1: Metod Översikt. (A) Efter sekventiell anrikning för ECM-proteiner, är LC-MS / MS-analyser utfördes på de deglykosylerade extrakt. (B) Alternativt kan icke deglykosylerade ECM extrakten ytterligare berikade för glykopeptider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2" src = "/ filer / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg" />
Figur 2: Extraktion av ECM-proteiner. (A) De 3 olika extrakt från den sekventiella extraktionsproceduren ( "English Quickstep") är komplementära i deras proteininnehåll. Medan SDS extrakt anrikas i intracellulära proteiner, GuHCl extrakt innehåller majoriteten av ECM-proteiner. Framgångsrik fraktione visualiseras genom olika silverfärgningsmönstret. (B) ECM-proteiner, såsom den lilla leucinrika proteoglykaner dekorin, biglykan och mimecan är till övervägande del detekteras i GuHCl extrakt, med lite närvaro i SDS och NaCl-extrakt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
Figur 3. Analys av Glycosylation. (A) Lämpliga inkubationstider krävs för fullständig deglykosylering. Exemplet visar effekten av inkubationstiden under avlägsnande av glykosaminoglykankedjor från glykoprotein dekorin. (B) ECM glykoproteiner är dekorerade med stora och repetitiva glykosaminoglykan-kedjor och korta och varierande N- och O-kopplade oligosackarider. Lane en på vardera av de immunoblottar representerar obehandlade hjärtextrakt. Bana 2 innehåller extrakt som behandlats med enzymer som smälta glykosaminoglykaner. Prover i spår 3 innehåller, dessutom, enzymer för avlägsnande av N- och O-kopplade oligossacharides. Galektin-1 är inte glykosylerat, därför finns det ingen förändring i proteinstorlek. Anpassad från Lynch M, et al. 4 (C) I LC-MS / MS-analys, prov behandlade med PNGas-F i närvaro av H 2 18 O uppnå bättre sekvenstäckning (%, på den högra sidan) jämfört med icke-deglykosylerade prover. Dark gröna områden representerar sekvenstäckning genom LC-MS / MS. De röda, streckade linjer representerar glycosites, med siffror som anger deras aminosyraposition. Detektering av glykosylering av dekorin i position Asn 211 (N, markeras med fet stil) visas i detalj som ett exempel i figur 4. Klicka här för en större version av denna figur.

figur 4
Figur 4. glykopeptid Analys med MS. (A) Med användning av ett hagelgevär proteomik tillvägagångssätt på ECM anrikade extrakt, kan glykopeptider identifieras genom närvaron av deamiderade asparaginer inom NXT / S sequons och märktes med 18 O. Exemplet visar en HCD MS / MS-spektrum för en peptid av dekorin innehållande den tidigare glykosylerat Asn 211. Erhållna data kan användasatt skapa en anpassad databas av ECM glykoproteiner. (B) HCD-ETD fragmentering används för att analysera glykopeptiden anrikat ECM extrakt. Den ETD MS / MS-spektrum möjliggör karakteriseringen av glykanen komposition. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

A. Stamlösningar
DTT (ditiotreitol, C 4 H 10 O 2 S 2) 100 mM DTT i ddHaO 2 O. 1
EDTA (etylendiamintetraättiksyra, C 10 H 16 N 2 O 8) 250 mM EDTA i DDH 2 O, pH 8,0.
GuHCl (guanidinhydroklorid, CH 6 ClN 3) 8 M GuHCl iDDH 2 O.
LAA (jodacetamid, C 2 H 4 INO) 500 mM IAA i ddHaO 2 O. 1,2
Na-acetat (Natriumacetat, C 2 H 3 NaO 2) 1 M Na-acetat i DDH 2 O, pH 5,8.
NaCl (Natriumklorid, NaCl) 1 M NaCl i DDH 2 O.
Na fosfat dibasisk (Dinatriumfosfat, na 2 H 2 PO 4) 1 M Na-fosfat tvåbasiskt i dd H2O, pH 6,8.
SDS (natriumdodecylsulfat, NaCl 12 H 25 SO 4) 1% SDS (35 mM) i DDH 2 O. 3
TFA (trifluorättiksyra, C 2 HF 3 O 2) 10% TFA (1,2 M) i DDH 2 O.
TEAB (trietylammoniumbikarbonat, C 7 H 17 3) 1M TEAB i i ddH2O, pH 8,5
Tiokarbamid (tiourea, CH 4 N 2 S) 3 M tiokarbamid i DDH 2 O.
Tris-HCl (tris-hydroklorid (NH 11 C 4 O 3 [HCl]) 100 mM Tris-HCl i DDH 2 O, pH 7,5.
Urea (karbamid, CH 4 N 2 O) 9 M urea i DDH 2 O.
B. Reaktion buffertar
C18 sanering ekvilibreringsbuffert 1% ACN, 0,1% TFA i DDH 2 O
C18 sanering kolonntvättbuffert 80% ACN, 0,1% TFA i H2O
C18 sanering elueringsbufferten 50% acetonitril, 0,1% TFA i DDH 2 O
Deglykosylering Buffer (4x) 600 mM NaCl och 200 mM Na-fosfat i DDH 2 O, pH 6,8.
GuHCl-buffert 4 4 M guanidinhydroklorid, 50 mM Na-acetat och 25 mM EDTA i DDH 2 O, pH 5,8. Lägg 1: 100 (volym: volym) av cocktail av proteinasinhibitorer före användning.
NaCl-buffert 4 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl och 25 mM EDTA i DDH 2 O, pH 7,5. Lägg 1: 100 (volym: volym) av cocktail av proteinasinhibitorer före användning.
PBS (1 x) 1,7 mM KH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 150 mM NaCl, pH 7,4. Lägg 25 mM EDTA och 1: 100 (volym: volym) av cocktail av proteinasinhibitorer före användning.
Provbuffert (4x) 100 mM Tris, 2% SDS, 40% glycerol, 0,02% bromfenolblått i DDH 2 O, pH 6,8. Tillsätt 10% SS-merkaptoetanol före användning.
SDS-buffert 4 0,1% SDS och 25 mM EDTA i DDH 2 O. Lägg 1: 100 (volym: volym) av cocktail av proteinasinhibitorer befmalm användning.
C. Enzymer
Kondroitinas ABC 5 0,5 U / ml i deglykosylering buffert (1 x)
keratanas 5 0,1 U / ml i deglykosylering buffert (1 x)
Heparinas II 5 0,1 U / ml i deglykosylering buffert (1 x)
α2-3,6,8,9-Neuraminidas (sialidas) 5 0,025 U / ml i deglykosylering buffert (1 x)
β1,4-galaktosidas 5 0,015 U / ml i deglykosylering buffert (1 x)
P-N-acetylglukosaminidas 5 0,25 U / ml i deglykosylering buffert (1 x)
Endo-α-N-acetylgalaktosaminidas (O-glykosidas) 5 0,013 U / ml i deglykosylering buffert (1 x)
PNGas-F (N-glykosidas-F) 6 50 U / ml i H 2 18 O
trypsin 0,01 pg / pL i TEAB-buffert
Bords ANMÄRKNINGAR.
1 Håll stamlösning fryst vid -20 ° C.
2 lAA bör hållas skyddad från ljus.
3 SDS kristalliserar lätt vid <20 ° C. För att underlätta solubilisering av 1% SDS (stamlösning), värma bufferten under varmt kranvatten.
4 Extraktion buffertar kan förvaras vid RT. Lägg brett spektrum cocktail av proteinasinhibitorer som visas före användning.
5 Dessa enzymer bör tillsättas under det första deglykosylering steget.
6 PNGas-F bör endast läggas under det andra deglykosylering steget.

Tabell 1: Aktie Solutions, reaktionsbuffertar och enzymer. Denna tabell visar sammansättningen av varje stamlösning och reaktionsbuffert som krävs för extraktion och efterföljande behandling (inklusive enzymatiska spjälkningar) av hjärt ECM-proteiner före MS-analys.

Discussion

Denna proteomik protokoll har optimerats under de senaste åren i vårt laboratorium. Här har vi använt hjärtvävnad, men endast mindre justeringar kan krävas för dess tillämpning till andra vävnader. Till exempel behöver utvinning protokollet för att ta cellularitet av vävnaden i beaktande. Hjärtvävnad är mycket cellulära jämfört med vaskulär vävnad. Vid användning av kärlvävnad, kan SDS-koncentrationen vara lägre (dvs 0,08%) och decellularisering tiden är kortare (dvs 4 h) 11, 12, 13. Användningen av avglykosylerings enzymer är avgörande för LC-MS / MS-analys av ECM sammansättning. Men inkubationstider behöva justeras för olika vävnadstyper. Till exempel, heparinas II som krävs förlängda inkubationstider vid 25 ° C vid användning av prover, såsom hud, som är rika på basalmembranproteiner (t.ex. agrin, perlekan) (data visas ej). Direkt glykopeptid-analys kan utföras på konditionerade medier från celler i kultur 15. Anriknings steg kan inte krävas för analys av denna förenklade subproteome. I likhet med GuHCl extrakt NaCl extrakt är också mottaglig för glycoproteomics analys med smärre modifieringar. Andra extraktionsmetoder protokoll för anrikning av ECM-proteiner kan anpassas för att karaktärisera ECM glykopeptider 19, 20.

Glykosylering är den mest komplexa PTM 5. Indirekt identifiering av glykopeptider uppnås genom detektion av deamiderat Asn med införlivad 18 O vid en NXT / S sequon. Deamiderade Asn vid andra positioner kan representera falska positiva. Likaså måste N-glykosylering övervägas i samband med protein ontologier: intracellulära proteiner innehållande en NXT / S sequon kommer inte vara glykosylerad men kan ge upphov till falska positiva. Som aktuell search algoritmer tillåter inte för screening av PTMs vid förutbestämda sekvenser endast (dvs. Asn vid NXT / S), erfordras manuell filtrering av data. Identifiering av närvaro / frånvaro av glykosylering vid dessa positioner kan jämföras mellan sjukdom och kontrollprover. Det finns inget enzym ekvivalent med PNGas F för O-deglykosylering (dvs. införande av en massförskjutning på treonin eller serin). Därför är identifieringen av O-glykosylering begränsad till direkt glykopeptid analys. Direkt glykopeptid analys används för att erhålla kompositions information socker kopplade till proteiner, men ger inte strukturell information av glykanen. Dessutom är glykanen kompositionen resultatet av glykanen syntes och bearbetning efter utsöndring.

Vår 3-stegs-extraktionsmetod för ECM-proteiner ( "English Quickstep") 6 har gjort det möjligt att karakterisera ECM i en mängd olika kardiovaskulära vävnader. Fraktionering av vävnadeni flera extrakt krävs för att erhålla en förenklad ECM proteom såsom diskuteras på annan plats 6. Intracellulära proteiner annars skulle bidra till en alltför stor dynamiskt område av protein abundances inom de extrakt som skulle hindra identifieringen av mindre rikligt förekommande ECM-proteiner. Dessutom intracellulära proteiner bär O-glykosyleringar 5 som skulle komplicera ECM glykopeptid anrikning och efterföljande MS-analys. Andra författare appliceras liknande extraktions- metoder för att karakterisera t.ex. lunga 21 och broskvävnader 10, men de inte fullfölja analysen av glykosylering. Tidigare analys av glykosylering inriktning på identifiering av endast glycosites, kräver avlägsnande av glykanen från proteinkärnan, och kan inte bedöma O-glykosylering 22, 23. Lektin matriser och kemisk anrikning är tillgängliga för bedömning av glykan types på biologiska prover baserat på deras bindningsspecificitet, men dessa tekniker kan inte tilldela glykan typer till specifika proteiner 24 inte heller kan de bedöma glykosyleringsställen.

Initialt använde vi gelelektrofores före LC-MS / MS av ECM-proteiner. Även om gel-separation är användbara för att erhålla förenklade proteinfraktioner mottagliga för LC-MS / MS-analys, som fått instrument erbjuda snabbare avsökningshastigheter. Sålunda kan den elektroforetiska separationssteget utelämnas. Detta ger en ytterligare fördel som stora ECM-proteiner, som kvarhålles på toppen av gelén, analyseras mer effektivt. Dock är information om Mw av intakta proteiner förlorade. Avdunstningssteg före PNGas F deglykosylering säkerställer fullständigt avlägsnande av regelbunden H 2 O för att minimera falska negativa. Rester socker (dvs variabla glykan massorna) interferera med separationen med LC och äventyra efterföljande peptididentifiering genom MS / MS. Ett pen-deglykosylering protokoll rekommenderas också för proteomik analys av ECM-proteiner inte inriktade på glykosylering.

Proteomik kan ge oanade insikter i ECM. Bortom strukturellt stöd, glykaner bundna till ECM är essentiella för värd-patogen-interaktion, cell-cellkommunikation och immunsvaret 25, dvs transplantatavstötning efter organtransplantation. Glycoproteomics kommer att vara ett viktigt verktyg i glykobiologi.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

JBB är en karriär Establishment Fellow i kungens British Heart Foundation Center. MM är en hög kamrat av den brittiska hjärtagrunden (FS / 13/2/29892). Studien stöddes av en spetskompetens initiativ (Kompetenscenter för utmärkt Technologies - Comet) i den österrikiska Research Promotion Agency FFG: "Research Center of Excellence i Vascular Aging - Tyrol, VASCage" (K-Projekt nummer 843.536) och NIHR Biomedical Research Center baserat på Guy s och St Thomas' National Health service Foundation Trust och Kings College London i samarbete med Kings College Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Chemicals
Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) Thermo Scientific 51101 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4
Cocktail of proteinase inhibitors Sigma-Aldrich P8340 1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Disodium phosphate (Na2H2PO4) Sigma-Aldrich S7907 3.1
Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) Sigma-Aldrich D0632 4.3
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) Sigma-Aldrich E9884 1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Ethanol (C2H6O) VWR 437433T 2.2.1
Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) Sigma-Aldrich G3272 1.6.1
Glycerol (C3H8O3) Acros organics 158920025 Suppl 1.1
H2O LC-MS Cromasolv Sigma-Aldrich 39253-1L-R Throughout the protocol
H218O Taiyo Nippon Sanso FO3-0027 3.5
Hydroxylamine (HA, H3NO) Sigma-Aldrich 467804 6.4
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) Sigma-Aldrich A3221 4.4
Phosphate-buffered Saline (PBS), 10x Lonza 51226 1.3
Sodium acetate (C2H3NaO2) Sigma-Aldrich S7545 1.6.1
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 1.4.1, 3.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) Sigma-Aldrich 466143 1.5.1
Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) Sigma-Aldrich 11268 4.7, 6.1
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) Sigma-Aldrich T62200 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3
Thiourea (CH4N2S) Sigma-Aldrich T8656 4.2
Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) Sigma-Aldrich T3253 1.4.1, Suppl 1.
Urea (CH4N2O) Sigma-Aldrich U1250 4.2
Name Company Catalog Number Comments
B. Enzymes
α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) EDM Millipore 362280 (KP0012) 3.1
β1,4-Galactosidase EDM Millipore 362280 (KP0004) 3.1
β-N-Acetylglucosaminidase EDM Millipore 362280 (KP0013) 3.1
Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C3667 3.1
Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) EDM Millipore 362280 (KP0011) 3.1
Heparinase II Sigma-Aldrich H6512 3.1
Keratanase Sigma-Aldrich G6920 3.1
PNGase-F (N-Glycosidase F) EDM Millipore 362280 (KP0001) 3.5
Trypsin Thermo Scientific 90057 4.7
Name Company Catalog Number Comments
C. Reagent kits
30 kDa MWCO spin filters  Amicon, Millipore 10256744 5.9, Suppl 2
Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate Harvard Apparatus 74-5657 5.1
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels Thermo-Scientific NP0322PK2 Suppl 1
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 2.1.3
ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit Merk Millipore 72103 7
Tandem mass tag 0 (TMT0) Thermo Scientific 900067 6.2, 6.3
Name Company Catalog Number Comments
D. Equipment and software
Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5 mm x 300 µm, 5 µm, 100 Å Thermo Scientific 160454 Suppl 3, 4
Acclaim PepMap100 C18, 50 cm x 75 µm, 3 µm, 100 Å Thermo Scientific 164570 Suppl 3
Byonic Search Engine Protein Metrics Version 2.9.30 Suppl 5
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano Thermo Scientific n/a Suppl 3, 4
EASY-Spray Ion Source  Thermo Scientific ES081 Suppl 4
EASY-Spray PepMap RSLC C18,  50 cm x 75 µm, 2 μm, 100 Å Thermo Scientific ES803 Suppl 4
Mascot Search Engine Matrix Science Version 2.3.01 Suppl 3
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ Suppl 4
Proteome Discoverer Software Thermo Scientific Version 2.1.1.21 Suppl 3, 5
Picoview Nanospray Source New Objective 550 Suppl 3
Q Exactive HF Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFALGMBFZ Suppl 3
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11
Scaffold Software Proteome Software  Version 4.3.2 Suppl 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, K. E., Turner, N. A. Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling. Pharmacol. Ther. 123, (2), 255-278 (2009).
  2. Barallobre-Barreiro, J., et al. Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury. Circulation. 125, (6), 789-802 (2012).
  3. Barallobre-Barreiro, J., et al. Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation. Circulation. 134, (11), 817-832 (2016).
  4. Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases. J. Intern. Med. 280, (4), 325-338 (2016).
  5. Varki, A., Lowe, J. B., et al. Biological Roles of Glycans. Essentials of glycobiology. 2nd ed. Varki, A., et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor NY. (2009).
  6. Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. Systems biology - opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix. Cardiovasc. Res. (2016).
  7. Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure. Circ. Res. 108, (4), 512-526 (2011).
  8. Mason, R. M., Mayes, R. W. Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions. Biochem. J. 131, (13), 535-540 (1973).
  9. Vogel, K. G., Peters, J. A. Isolation of proteoglycans from tendon. Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).
  10. Wilson, R., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9, (6), 1296-1313 (2010).
  11. Barallobre-Barreiro, J., et al. Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins. Cardiovasc. Res. 110, (3), 419-430 (2016).
  12. Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell. Proteomics. 9, (9), 2048-2062 (2010).
  13. Didangelos, A., et al. Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 10, (8), (2011).
  14. Grandoch, M., et al. Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36, (5), e41-e50 (2016).
  15. Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells. Mol. Cell. Proteomics. 12, (4), 956-978 (2013).
  16. Parker, B. L., et al. Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment. Mol. Cell. Proteomics. 10, (8), (2011).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, (1), 76-85 (1985).
  18. Pepinsky, R. B. Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol. Anal. Biochem. 195, (1), 177-181 (1991).
  19. de Castro-Brás, L. E., et al. Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix. J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).
  20. Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis. J Vis Exp. (101), e53057 (2015).
  21. Decaris, M. L., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell. Proteomics. 13, (7), 1741-1752 (2014).
  22. Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat. Biotechnol. 21, (6), 660-666 (2003).
  23. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J. Proteome Res. 12, (12), 5791-5800 (2013).
  24. Li, Y., et al. Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues. Anal. Chem. 83, (1), 240-245 (2011).
  25. Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity. Circ. Res. 114, (5), 872-888 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics