تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

التفاعلات البروتين الحمض النووي ضرورية لعمليات بيولوجية متعددة. خلال تقييم الوظائف الخلوية، وتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين لا غنى عنه لفهم تنظيم الجينات. الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة قوية لتحليل هذه التفاعلات في الجسم الحي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العمليات الخلوية متعددة، بما في ذلك تكرار الحمض النووي وإصلاح، وإعادة التركيب الحمض النووي، والتعبير الجيني، تتطلب التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي. لذلك، الحمض النووي البروتين التفاعلات تنظيم وظائف فسيولوجية متعددة، الفيزيولوجية المرضية، والبيولوجية، مثل تمايز الخلايا، تكاثر الخلايا، ومراقبة دورة الخلية، واستقرار الكروموسوم، وتنظيم الجينات الوراثية، وتحول الخلايا. في خلايا حقيقيات النواة، يتفاعل الحمض النووي مع بروتينات هيستون و نونهيستون ويكثف إلى لونين. العديد من الأدوات التقنية يمكن استخدامها لتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين، مثل الكهربائي (هلام) التنقل التحول الفحص (إمزا) و دناز I البصمة. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات تحليل التفاعل البروتين الحمض النووي في المختبر ، وليس ضمن السياق الخلوي. الكروماتين مناعي (رقاقة) هو الأسلوب الذي يلتقط البروتينات في مواقع محددة الحمض النووي ملزمة لها، مما يسمح لتحديد التفاعل الحمض النووي البروتينs داخل سياق الكروماتين. ويتم ذلك عن طريق تثبيت التفاعل الحمض النووي البروتين، تليها مناعي من البروتين من الفائدة. في وقت لاحق، والموقع الجيني الذي كان ملزما البروتين إلى يتميز. هنا، نحن تصف ومناقشة رقاقة وإظهار قيمته التحليلية لتحديد عامل النمو تحويل β (تغف-β) التي يسببها ملزمة لعامل النسخ SMAD2 إلى عناصر ملزمة سماد (سب) داخل منطقة المروج من التيروزين- بروتين كيناز كيت (c-كيت) مستقبلات يجند عامل الخلايا الجذعية (سف).

Introduction

في نواة حقيقيات النوى، يتفاعل الحمض النووي مع بروتينات هيستون والبروتينات غير المهيأة ويتم تكثيفها في لونين. في السياق الفسيولوجي، الفيزيولوجي المرضي، والخلية البيولوجية، يتم التحكم في الوظائف الخلوية مكانيا وبشكل مؤقت بواسطة التعبير الجيني المنسق بالكروماتين. التفاعلات الحمض النووي البروتين لها دور أساسي في تنظيم العمليات الخلوية، مثل تكرار الحمض النووي، وإعادة التركيب، والإصلاح، فضلا عن التعبير البروتين. ولذلك، فإن تحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين هو أداة لا غنى عنها في تقييم التعبير الجيني ووظيفة الخلية.

هناك العديد من التقنيات لتقييم التفاعلات الحمض النووي البروتين في المختبر ، مثل الكهربائي (هلام) التنقل التحول الفحص (إمزا) و دناز I البصمة 1 ، 2 . ومع ذلك، فإن هذه التقنيات لا تحليل التفاعل الحمض النووي للبروتين داخل لون الكروماتين والسياق الخلوي. تشيب iسا الذي يلتقط البروتينات ملزمة إلى مواقع محددة الحمض النووي ملزمة وبالتالي يسهل تحديد التفاعلات الحمض النووي البروتين داخل سياق لونين. وقد تم تطوير هذه التقنية في الأصل من قبل جيمور وليس لتقييم الحمض النووي الريبي بوليميراز إي ملزمة لجينات محددة في القولونية و دروسوفيلا ميلانوغاستر 3 ، 4 . ويتم ذلك عن طريق تثبيت المجمعات الحمض النووي البروتين، تليها أداء استخراج الكروماتين وقص الحمض النووي في ~ 200 زوج قاعدة (شظايا) شظايا. وفي وقت لاحق، يتم عزل البروتين المرتبط الحمض النووي من الفائدة التي كتبها إمونوبرسيبيتاتيون. بعد عكس الارتباط الحمض النووي البروتين، يتم تنقية الحمض النووي وتحليلها. ويمكن استخدام عدة طرق لتحليل مواقع ارتباط البروتين وتعتمد على تسلسل الحمض النووي من موقع ربط البروتين داخل الجين الهدف 5 . في الحالات التي يعرف فيها تسلسل الحمض النووي، بول القياسيةيمراس سلسلة ردود الفعل (ير) يمكن تطبيقها، وذلك باستخدام أزواج التمهيدي محددة يحيط موقع ملزمة معروفة. الكمي في الوقت الحقيقي ير (كرت-ير) ويمكن أيضا أن تستخدم 6 . في الحالات التي يكون فيها التسلسل غير معروف، يمكن دمج رقاقة مع ميكروأرس الحمض النووي (رقاقة على رقاقة)، ​​تسلسل الحمض النووي (تشيب-سيق)، أو تقنيات الاستنساخ 7 ، 8 ، 9 .

مسار تغف-has لديه وظائف قوية قمع الورم وهو المسار الرئيسي في تمايز الخلايا. يتم تفعيلها من خلال ربط يجند-β1 يجند إلى مجمع مستقبلات مماثلة لها، مما أدى إلى سيرين فسفرة من عوامل النسخ SMAD2 / 3. بعد ارتباطها مع الوسيط المشترك، SMAD4، ترانزموكتس سماد معقدة إلى النواة ويربط سب في منطقة المروج من الجينات المستهدفة، حيث ينظم الجينات التي تسيطر على دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، و ديفيرنتياتي الخليةعلى. الاستجابة النسخي للتحفيز تغف-is هو نوع الخلية والسياق محددة 10 . في الآونة الأخيرة، وصفنا حلقة ردود فعل إيجابية بين تغف-β ومسار C-كيت 11 . في هذا النموذج، تغف-β1 المنشط SMAD2 يربط إلى ج- كيت يجند المروج ويحفز التعبير عنها وإفرازها. في وقت لاحق، يجند C-كيت ينشط مستقبلات C-كيت بطريقة السيارات و شبه كرينيك. ج-كيت تنشيط مستقبلات النتائج في STAT3 تير 705- الفسفرة عبر JAK1 / 2. بعد STAT3 التنشيط والترجمة النووية، STAT3 يربط الجين يجف-β1 يجند وينظم التعبير عنها.

هنا، علينا أن نبرهن على الدور الأساسي لتحليل رقاقة لتحديد SMAD2 ملزمة إلى ج-كيت مستقبلات يجند المروج وتحديد محول إشارة (و) المنشط (من) النسخ 3 (STAT3 ملزمة ل تغف-β1- الجينات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحلول

  1. إعداد الحلول التالية جديدة لكل تجربة.
    1. للحصول على حل التثبيت ، وإعداد 37٪ الفورمالديهايد وتخزينه في رت. تمييع في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) إلى تركيز النهائي من 1.42٪.
      تنبيه: يتم تصنيف الفورمالديهايد على أنها مهيجة، تآكل، الطفرات، مسخ، ومسببة للسرطان. لا يبتلع. لا تتنفس الغاز / الأبخرة / بخار / رذاذ. في حالة عدم كفاية التهوية، ارتدي معدات ملائمة للتنفس. تجنب ملامسة الجلد والعينين. الابتعاد عن غير متوافقة، مثل العوامل المؤكسدة، عوامل الحد، الأحماض، القلويات، والرطوبة.
    2. لالجليسين حل حل الإصلاح، وإعداد 0.125 M الجلايسين في حل برنامج تلفزيوني 1X وتخزينه في رت.
    3. للحصول على حل كشط الخلية، وإعداد حل برنامج تلفزيوني 1X في د 2 O وتخزينه على الجليد. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة بروتيناز مثبط فينيلميثيلسولفونيل فلوريد (بمسف) رأوا تركيز النهائي من 0.5 ملم.
      تنبيه: يتم تصنيف بمسف على أنها تآكل وسامة. وارتداء الملابس الواقية واستخدامها في منطقة التهوية.
    4. مباشرة قبل استخدام العازلة تحلل الخلية (20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 85 ملي بوكل، و 0.5٪ NP40)، إضافة 1X بروتياز المانع كوكتيل (بيك، حل المخزون 100X في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو): 104 ملم 4- 2-أمينو إيثيل) البنزين سلفونيل فلوريد هيدروكلوريد (أبسف)، 80 ميكرومتر أبروتينين، 4 مم بيستاتين، 1.4 ملم E-64، 2 ملي ليوبتين، و 1.5 ملي بيبستاتين A) و 0.5 ملي بمسف.
    5. مباشرة قبل استخدام العازلة تحلل النوى (50 ملي تريس كل، ودرجة الحموضة 8.0، 10 ملي إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا)، و 1٪ سدز)، إضافة 1X الموافقة المسبقة عن علم و 0.5 ملي بمسف.

2. تثبيت الخلية والقص

  1. تنمو الخلايا إلى التقاء 70-80٪ على 10 سم لوحات زراعة الأنسجة. تحفيز الخلايا في الأهداف التجريبية.
  2. إزالة المتوسطة زراعة الأنسجة، إضافة 5 مل من حل التثبيت، واحتضانالخلايا لمدة 10 دقيقة في رت على منصة الهز.
  3. إزالة الحل التثبيت وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل من الجليد الباردة 1X بس.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 5 مل من الجلايسين حل حل الإصلاح، واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في رت على منصة الهز.
  5. إزالة الحل إصلاح وقف الجلايسين وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل من الجليد الباردة 1X بس.
  6. إزالة برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 2 مل من محلول كشط الخلية، وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. نقل الخلايا المحصودة إلى أنبوب مخروطي على الجليد.
  7. الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 600 x ج و 4 درجة مئوية.
  8. إزالة طاف، ريسوسبيند بيليه في 1 مل من 1X خلية تحلل العازلة، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. بدلا من ذلك، المفاجئة تجميد بيليه في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  9. مرة واحدة يتم معلق بيليه في العازلة تحلل الخلية، ونقل تعليق الخلية إلى الخالط دونس الجليد الباردة و دونس لمدة 10 السكتات الدماغية باستخدام بيستل من نوع Be لتعطيل الخلية.
  10. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب ميكروسنتريفوج وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 2400 x ج و 4 درجات مئوية.
  11. تجاهل طاف، ريسوسبيند بيليه في 350 ميكرولتر من نوى الهضم العازلة، واحتضان العينات لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  12. إضافة نوكلياز الميكروية (1 U / ميكرولتر) ومزيج من فورتيكسينغ. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 5-20 دقيقة. مزيج من عينات كل 2 دقيقة عن طريق انعكاس.
    ملاحظة: الوقت وتركيز انزيم تختلف بين خطوط الخلايا، وربما تتطلب التحسين في حالات القص الأنزيمي دون الأمثل.
  13. بدلا من ذلك، تحقيق الكروماتين القص بواسطة سونيكاتيون باستخدام سونيكاتورس المتاحة تجاريا.
    ملاحظة: سوف تتطلب ظروف سونيكيشن الأمثل. يتم توفير بروتوكول المثال الأمثل أدناه باستخدام حجم عينة من 300 ميكرولتر وقوة معالجة العينة من 25٪.
    1. بعد الخطوة 2.10، تجاهل طاف و ريسوسبيند nبيليه النووي في 1.0 مل من العازلة القص التجاري.
    2. قسامة 300 ميكرولتر من بيليه النووي معلق في ثلاثة 1.7 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. وضعها على الجليد.
    3. القص 3 أليكوتس من لونين ثابت في 25٪ الطاقة باستخدام 3 ظروف مختلفة لتحديد ظروف سونيكيشن الأمثل:
      5 نبضات قدرها 20 ثانية لكل منها، مع 30 ثانية على الجليد بين كل نبضة.
      10 نبضات من كل 20 ثانية، مع 30 ثانية على الجليد بين كل نبضة.
      20 نبضة من كل 20 ثانية، مع 30 ثانية على الجليد بين كل نبضة.
    4. تابع الخطوة 2.15، كما هو موضح أدناه.
  14. بعد الحضانة مع نوكلياز ميكروكوكال، إضافة 7 ميكرولتر من الجليد الباردة 0.5 M إدتا لوقف رد الفعل.
  15. الطرد المركزي العينات مع الحمض النووي قص لمدة 10 دقيقة في 16،200 x ج و 4 درجة مئوية.
  16. نقل طاف التي تحتوي على الحمض النووي التي تم إنشاؤها إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديدة. قسامة 50 ميكرولتر في أنبوب ميكروسنتريفوج منفصلة لتأكيد سوالقص المتقطع من الحمض النووي (القسم 3). استخدام حجم المتبقية على الفور ل إمونوبريسيانتاتيون (القسم 4) أو تخزينه في -80 درجة مئوية.

3. تأكيد كفاءة القص

  1. إضافة 150 ميكرولتر من نوكليس خالية من د 2 O و 10 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم إلى قسامة 50 ميكرولتر من لونين قص من الخطوة 2.16.
  2. احتضان العينات في 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لعكس كروسلينكس.
  3. إضافة 2 ميكرولتر من ريبونوكلياز A (10 ميكروغرام / ميكرولتر) واحتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من بروتين K (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) واحتضان العينات في 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  5. لتنقية الحمض النووي، إجراء استخراج الفينول / الكلوروفورم 12 .
    1. إضافة نوكليس خالية من المياه إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. إضافة 200 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) لعينة ودوامة لمدة 20 ثانية.
    2. الطرد المركزي، إلى، الغرفة، تيمبيراتور لمدة 5 دقائق في 16،000 x ز. إزالة بعناية المرحلة المائية العليا ونقله إلى أنبوب جديد. تأكد من عدم حمل أي الفينول خلال بيبتينغ.
    3. إضافة 0.1 مجلدات من 3 M خلات الصوديوم (نه 4 أواك)، ودرجة الحموضة 5.2، وتخلط عن طريق عبها أنبوب عدة مرات مع إصبع. إضافة 2.5 مجلدات من الايثانول الجليد البارد 100٪ ومزيج من فورتيكسينغ لمدة 5 ثوان. احتضان العينة O / N عند -20 درجة مئوية، أو لمدة 1 ساعة على الأقل في -80 درجة مئوية.
    4. الطرد المركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية و 16،000 x ج بيليه كدنا.
    5. إزالة بعناية طاف دون تعطيل بيليه. إضافة 1 مل من رت، 70٪ من الإيثانول وعكس الأنبوب عدة مرات.
    6. الطرد المركزي العينة لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية و 16،000 x ز. إزالة بعناية طاف.
    7. تجفيف بيليه لمدة 5-10 دقيقة في رت. ريسوسبيند بيليه في 30 ميكرولتر من د 2 O.
  6. استخدام قسامة 5 و 10 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى للهلام الكهربائي مع 1٪ تايهلام الاغاروز.
    ملاحظة: نتائج القص الكروماتين الناجحة في نمط الحمض النووي 200-1500 بب. إذا كان القص غير ناجحة، وتحديد ظروف القص الأمثل للخلايا محددة عن طريق تعديل وقت حضانة الخطوة القص (الخطوة 2.12) إلى 5 و 10 و 15 دقيقة.
  7. استخدام العينة المتبقية لتحليل تركيز الحمض النووي للعينة. عكس حساب تركيز الحمض النووي في عينة الكروماتين القص (الخطوة 2.16). استخدام كميات الحمض النووي نفسه لكل مجموعة علاج لمناعي (القسم 4).

4. مناعي

  1. الجمع بين 10-25 ميكروغرام من كروسينلينك كروسلينكد (الخطوة 2.16) مع 25 ميكرولتر من البروتين الصف رقاقة G الخرز المغناطيسي، 10 ميكرولتر من العازلة التخفيف مناعي (حل المخزون: 0.01٪ سدز، 1.1٪ تريتون X-100، 16.7 ملم تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1.2 ملي إدتا، و 167 ملي مول كلوريد الصوديوم)، و 1 ميكرولتر من الموافقة المسبقة عن علم.
  2. بعد 4 ساعات من الحضانة، إضافة 1-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة (كونسنتر الأجسام المضادةسوف تختلف أفيون على أساس تقارب الأجسام المضادة. فإنه ينبغي في البداية أن تستخدم في توصيات الشركة المصنعة وتحسينها تجريبيا إذا لزم الأمر) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل وإضافة د 2 O إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
    ملاحظة: بدلا من الأسلوب المذكور أعلاه مناعية مباشرة، ويمكن استخدام طريقة إمونوبريسيبياتيون غير المباشرة عن طريق الجمع بين لونين أولا مع الأجسام المضادة، وبعد ذلك إضافة بروتين الخرز المغناطيسي G.
  3. احتضان العينات على نهاية إلى نهاية المدورة لمدة 4-12 ساعة في 4 درجات مئوية.

5. شطف

  1. وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي. وبمجرد أن الخرز المغناطيسي المجاميع على جانب الأنبوب، وإزالة بعناية وتجاهل طاف.
  2. غسل الخرز ثلاث مرات مع 800 ميكرولتر من غسل العازلة 1 (0.1٪ سدز، 1٪ تريتون X-100، 2 ملي إدتا درجة الحموضة 8، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8، و 150 ملي كلوريد الصوديوم). مزيج عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. وضع أنبوب على موقف المغناطيسي aند إزالة بعناية وتجاهل العازلة غسل مرة واحدة في الخرز المغناطيسي المجاميع على جانب الأنبوب.
  3. غسل حبات مرة واحدة مع 800 ميكرولتر من غسل العازلة 2 (0.1٪ سدز، 1٪ تريتون X-100، 2 ملي إدتا؛ الرقم الهيدروجيني 8، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، و 500 ملي كلوريد الصوديوم). مزيج عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. وضع أنبوب على موقف المغناطيسي وإزالة بعناية وتجاهل العازلة غسل مرة واحدة في الخرز المغناطيسي المجاميع على جانب الأنبوب.
  4. ريسوسبيند الخرز في 50 ميكرولتر من شطف العازلة (1٪ سدز و 100 ملي ناهكو 3 ) واحتضان العينات على نهاية إلى نهاية المدورة لمدة 15 دقيقة في رت.
  5. وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي، وبمجرد أن الخرز المغناطيسي جمع على جانب الأنبوب، ونقل طاف إلى أنبوب جديد.
  6. إضافة 6 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم، لعكس تشابك، و 2 ميكرولتر من بروتين K (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر). بعد خلط العينات، احتضان العينات لمدة 2 ساعة عند 65 درجة مئوية.
  7. لتنقية الحمض النووي، إجراء فنول / كلوروفورم استخراج 12 (الخطوة 3.5)، ثم ريسوسبيند بيليه في 30 ميكرولتر من د 2 O.
    ملاحظة: العينات يمكن تحليلها مباشرة لمواقع البروتين ملزمة (القسم 5) أو يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.

6. تحليل الموقع الملزم

  1. إجراء تحليل لمواقع ملزمة محددة داخل تسلسل الحمض النووي المعروفة باستخدام ير أو كرت-ير. لتصميم التمهيدي، اتبع ير أو بروتينات ير-ير التقليدية. تصميم الاشعال لتجميع 150-400 بب أمبليكون أن جسور البروتين ملزم موقع الفائدة ( الشكل 1 ).
  2. إعداد ير باستخدام أربعة قوالب الحمض النووي مختلفة لضمان خصوصية: ط) الحمض النووي من إمبونوبريسيبيتاتد رقاقة مع الأجسام المضادة من الفائدة، إي) الحمض النووي من إمبونوبريسيبيتاتد رقاقة مع الأجسام المضادة مفتش غير محددة، إي) دنا المدخلات، و 4) H 2 O ك السيطرة السلبية ل ير لاستبعاد التلوث. في حالة تحفيز المسار، واختيار قالب الخامس باستخدام مجموعة مختلفة من الاشعال محددة لموقع ملزمة معروفة من البروتين إمونوبريسيبيتاتد.
    ملاحظة: في حالة C- كيت يجند تحليل المروج، واستخدام ير التقليدية لإثبات تغف-β التي يسببها سماد ملزمة في سب داخل C- كيت المروج يجند المنطقة. كسيطرة إيجابية، أداء ير على المنشط بلاسمينوجين المانع -1 (باي-1) كهدف معروف من تغف-β الناجم عن سماد ملزمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ربط يجف-β1 يجند إلى مستقبلات المعقدة مماثلة ينتج في سيرين فسفرة من عوامل النسخ SMAD2 / 3، تليها ارتباطها مع الوسيط المشترك، SMAD4. ترانزوكاتس مجمع سماد إلى النواة. يمكن تغف-β تنظيم النسخ الجيني، إما مباشرة عن طريق سماد ملزمة ل سبس داخل المناطق التنظيمية من الجينات المستهدفة، أو بشكل غير مباشر من خلال التعبير سمد بتنظيم المنشطات النسخي أو المكثفات التي تنظم في وقت لاحق التعبير عن الجين من الفائدة 10 . لاختبار ما إذا كان يجند C-كيت سف ينظم ترانسكريبتيونالي من قبل تجف-β1 ملزمة مباشرة من SMAD2 إلى المروج لها، قمنا بتحليل المروج التي تحتوي على سف، 2.4 كيلوبايت، 5'- منطقة يحيط بها من الجينات سف ل SMAD2 عزر ملزم، 5'-أغاك-3 '(سب) 13 ، 14 . حددنا 7 أوبس المفترض أوبستريم من سف بدء كودون ( الشكل 1A ). لتأكيد تغف-β1 التي يسببها ملزمة من SMAD2 إلى المروج سف، تم تنفيذ فحص رقاقة وصفها هنا. أدى العلاج تغف-β1 في SMAD2 ملزمة للمروج سك في خطوط سرطان الكبد البشري، HepG2 و Hep3B، والخلايا ( الشكل 1B ). في غياب تغف-β1-التحفيز، لوحظ عدم ملزم سماد. كسيطرة إيجابية ل تغف-β1 التي يسببها سمد التنشيط، تم تنفيذ رقاقة ل باي-1. المروج باي-1 هو هدف معروف من تغف-β / سماد 13 . للتأكد من خصوصية مناعة SMAD2، تم استخدام الأجسام المضادة مفتش غير محددة؛ لم يلاحظ SMAD2 ملزمة ل سب بعد مناعي مع مفتش.

لمظاهرة أخرى من التكنولوجيا رقاقة، قمنا بتحليل المنطقة 5-المرافقة من الجين يجند-β يجند لإجماع STAT3 زخارف ملزمة 5 '-TT (N4) آ-3 'و 5'-ت (N5) آ-3' 15 . حددنا اثنين من مواقع ملزمة St3 ملزمة المنبع من كودون تغف بدء في مواقف -4384 / -4373 (ستب-1) و -5365 / -5357 (ستب-2) ( الشكل 2A ). لتأكيد تغف-β1 التي يسببها ملزمة STAT3 إلى الجين يجند-β يجند، أجرينا المقايسات رقاقة باستخدام تغف-β1 المعالجة HepG2 وخلايا Hep3B. أدى العلاج تغف-β1 في STAT3 ملزمة للموقع الافتراضي ST3 المفترض الثاني (ستب-2) من الجينات تغف، ولكن ليس إلى أول واحد (ستب-1) ( الشكل 2B ). في هذا المثال، الإيجابي STAT3 ملزمة ل ستب-2 بمثابة السيطرة الإيجابية الداخلية. على غرار التجربة رقاقة أعلاه، لم ينظر STAT3 إلى ستب-2 بعد إمونوبريسيبيتاتيون باستخدام مفتش.

شكل 1
شكل 1 أونغ>: تغف-β التي يسببها SMAD2 ملزمة إلى المروج سف. ( A ) تمثيل تخطيطي من المروج سف ، مع سبس المفترض كما يظهر صناديق (مربعات بيضاء = أغاك) مع موقفهم النسبي إلى كودون البداية. يتم عرض موقع التمهيدي رقاقة أدناه، مع المواقف النسبية إلى كود بدء سف وحجم المنتج ير. ( B ) رقاقة ل SMAD2 ملزمة إلى المروج سف . كروماتين البروتين المجمعات من تغف-β1 المعالجة وغير المعالجة HepG2 وخلايا Hep3B كانت إمونوبريسيبيتاتد مع الأجسام المضادة لمكافحة SMAD2. تم تنفيذ ير باستخدام الاشعال محددة سف. على اليسار، وتظهر نتائج ير باستخدام الحمض النووي المدخلات. في الوسط، وتظهر نتائج ير بعد مناعي مع مفتش غير محددة لتأكيد SMAD2 خصوصية مناعي. تظهر في اللوحة السفلية، تم استخدام رقاقة ل SMAD2 ملزم ل باي-1 كسيطرة إيجابية.ge.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : تغف-β الناجم عن STAT3 ملزمة لجين تغف-.. ( A ) تخطيطي للجين تغف-،، مع مواقع ملزمة STAT3 المفترض كما هو موضح صناديق رمادية مع موقفهم النسبي لبدء كودون. يتم عرض مواقع التمهيدي رقاقة مع مواقفها النسبية إلى كودون تغف-β بدء وأحجام المنتج ير المبينة أدناه. ( B ) رقاقة ل تغف-β1 التي يسببها STAT3 ملزمة للجين تغف-.. كروماتين البروتين المجمعات من تغف-β1 المعالجة وغير المعالجة HepG2 وخلايا Hep3B كانت إمونوبريسيبيتاتد مع الأجسام المضادة المضادة STAT3. تم تنفيذ ير باستخدام الاشعال تغف-β محددة. على اليسار، يتم عرض نتائج ير باستخدام الحمض النووي المدخلات. في الوسط، يروتظهر النتائج بعد مناعي مع مفتش غير محددة لتأكيد خصوصية المناعة المناعة STAT3. تظهر اللوحة العلوية نتائج ير باستخدام الاشعال المحددة لموقع ارتباطات STAT3 1 (ستب-1)، وتظهر اللوحة السفلى نتائج ربط STAT3 لموقع الربط STAT3 2 (ستب-2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا التقرير، ونحن نبرهن على تغف-β1 ملزمة من SMAD2 إلى سب داخل المروج يج-كيت و TGF- β1 التي يسببها ملزمة STAT3 إلى تسلسل الاعتراف بها داخل الجين يجند-β1 يجند. علينا أن نظهر السيتوكين الناجم عن ملزمة كل من عوامل النسخ باستخدام لونين مناعي.

الكروماتين مناعي هو أداة قوية لإثبات ملزمة مباشرة من البروتين من الاهتمام إلى الحمض النووي، لتوصيف المحفزات التي تحفز البروتين ملزم الحمض النووي، وتوصيف تسلسل الحمض النووي الذي يربط البروتين. هذه المعلومات الأخيرة يمكن أن تساعد في تحديد الجينات التي ينظمها بروتين معين من الفائدة ويتحقق من خلال استخدام رقاقة على رقاقة، رقاقة-سيق، أو استنساخ استراتيجيات 7 ، 8 ، 9 . واحدة من المزايا الرئيسية من رقاقة مقابل طرق أخرى لإظهار الحمض النووي البروتين ملزمة، مثل إمزا أو الدناز I البصمة، هو أنه في التكنولوجيا رقاقة، يتم التقاط الربط في الجسم الحي ، في حين مع الآخرين، يتم تنفيذها في المختبر . وبالتالي، يوفر رقاقة نظرة ثاقبة البروتين الحمض النووي ملزمة داخل السياق الخلوي، في حين أن التقنيات الأخرى تمثل نظاما معزولا.

ومع ذلك، تحليل رقاقة معقدة، ينطوي على خطوات متعددة التي يمكن أن تؤثر على النتائج، ويتطلب التحسين والخبرة. واحدة من الخطوات الأولى التي تعتبر حاسمة لنجاح رقاقة هو خطوة الربط (الخطوة 2.2). الأشعة فوق البنفسجية يشابك لا رجعة فيه، وبالتالي غير مناسبة ل رقاقة. ويفضل الفورمالديهايد تشابك، ولكن تركيز الفورمالديهايد والوقت يشابك يمكن أن تؤثر على حد سواء كفاءة الكروماتين القص ومستضد هطول الأمطار. بشكل عام، يفضل تركيزات الفورمالدهيد أقل (1٪ ث / ت) وأقصر يشابك مرات (5-10 دقيقة)، لأنها تحسن كفاءة القص. ومع ذلك، الفورمالديهايد ليست فعالةفي البروتين البروتين يشابك وبالتالي هو دون المستوى الأمثل للبروتينات التي لا ترتبط مباشرة إلى الحمض النووي 16 . لمثل هذه الحالات، يمكن أن يتم رقاقة في نهج من خطوتين، حيث البروتين البروتين يشابك يتم أولا باستخدام كروسلينكرز مثل غلوتارات ديسوتشينيميديل، تليها الفورمالديهايد بوساطة الحمض النووي بروتين يشابك 17 .

الخطوة الحرجة التالية هي قص الكروماتين. في دراستنا، استخدمنا القص الأنزيمي باستخدام نوكلياز ميكروكوكال. إنزيماتيك القص مفيد بشكل خاص ل نونروسلينكد رقاقة الأصلي (N- رقاقة)، ​​عندما سونيكاتيون من شأنه أن يعطل الحمض النووي البروتين ملزمة. N-تشيب يستخدم في الغالب لتحليل هيستونيس ومعدلات هيستون 18 . في حين نوكلياز الميكروكوكال يعتبر غير إندو-نوكلياز نسبيا غير محددة نسبيا، وقد تبين أن يثير انشقاق تسلسل محددة 19 . وهذا يمكن أن يؤدي إلى تحيز تعتمد على تسلسل في فرا الناتجة، مع زيادة تمثيل بعض الجينات الموضعية 20 . سونيكاتيون يخلق شظايا الحمض النووي بشكل عشوائي الحجم، دون التحيز تسلسل، ويفضل عموما ل رقاقة كروسلينكد (X- رقاقة). ومع ذلك، يجب أن تحدد الظروف سونيكيشن تجريبيا لكل خلية أو نوع الأنسجة ونموذج سونيكاتور، وشظايا الحمض النووي الناتجة هي عموما أكبر من مع القص الأنزيمية 16 . أيضا، الإفراط في سونيكاتيون أو استحلاب العينة يمكن أن يؤدي إلى فقدان الحواتم الأجسام المضادة بسبب تمسخ البروتين وتدهور.

خطوة إمونوبريسيانتاتيون خطوة حاسمة أخرى يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج رقاقة. الخرز أغاروس ربط الحمض النووي غير محدد، والاختلاف في عدد الخرز المضافة يمكن أن تؤثر على نسبة إشارة إلى نسبة محددة. وبالتالي، فمن المهم للحفاظ على حبة الاغاروز "الطين" بشكل جيد مع وقف التنفيذ عندما يضاف إلى عينات الحمض النووي البروتين. فيما يتعلق بالجسم المضاد المستخدم في iيجب أن تستخدم على الأقل، الأجسام المضادة الصف رقاقة، وفي الحالات التي تكون فيها هذه غير متوفرة، ينبغي تفضيل على الأقل الأجسام المضادة من الدرجة الصف. كما يمكن أن تكون ملثمين محددة إبيتوبيس خلال كروسلينكينغ، الأجسام المضادة بوليكلونل هي مفيدة، لأنها تعترف عدة الحواتم. يجب أن يكون مقدار الأجسام المضادة المضافة أكثر من العامل الذي عجل، وبالتالي ينبغي تحديد تجريبيا لكل عامل / الأجسام المضادة. أيضا، كما حركية للوصول إلى التوازن من الأجسام المضادة ملزمة تختلف عن كل الأجسام المضادة، يجب تحديد ظروف الحضانة الأمثل لكل الأجسام المضادة.

العديد من الضوابط يمكن وينبغي إدراجها في الإعداد التجريبي. في الحالات التي يتم فيها تقييم تحريض رد فعل ملزم للبروتين الحمض النووي محددة، فمن المهم أن تشمل عنصر تحكم الحمض النووي المدخلات لإثبات كميات الحمض النووي القالب متساوية في التحليل النهائي ( أي ير أو كرت-ير). مطلوب مراقبة الأجسام المضادة لتأكيد خصوصية مناعي من البروتين من الفائدة. عادة إيزوتيب المتطابقة المناعية هي مناسبة تماما كما الضوابط السلبية، ولكن الخرز الاغاروز ويمكن أيضا أن تستخدم. في بعض الأحيان، وتستخدم ضوابط إيجابية لتأكيد تدفق التجريبية وظيفية من رقاقة، وكثيرا ما تستخدم الأجسام المضادة المضادة هيستون لهذا الغرض. في التجارب التحفيز، والسيطرة الإيجابية الأفضل هو إمونوبريسيريتاتيون من البروتين من الفائدة، مع تحليل تسلسل لاحقة لمنطقة الحمض النووي المعروفة والبروتينات ربط على التحفيز. في نتائج ممثل لدينا، تم استخدام سب داخل المروج باي-1 كهدف معروف ل تغف-β1 التي يسببها سماد ملزمة. في التجارب دون البروتين المحفزة ملزمة، تسلسل الحمض النووي المعروف أن لا يكون هدفا للبروتين من الفائدة يمكن استخدامها لتحليل الحمض النووي اللاحقة. فيما يتعلق بتحليل الحمض النووي، فمن المهم أن تشمل رد فعل دون قالب الحمض النووي لاستبعاد التلوث.

رقاقة هو تقنية ممتازة للتدليل مباشرة على ارتباط بروتين من الفائدة إلى الجين. ومع ذلك، فإنه ليس دراسة وظيفية. في الحالات التي يعتقد أن بروتين من الفائدة من وجود دور تنظيمي، فمن الضروري أيضا إجراء فحوصات وظيفية، مثل المقايسات القائم على الجينات مراسل (على سبيل المثال، لوسيفيراس). في هذه البروتوكولات، يتم استنساخ الجين من الفائدة في وضع تنظيمي من الجينات مراسل. تحريض الجين من الفائدة ينتج في التعبير عن الجين مراسل إذا كان لديه وظيفة تنظيمية. لمزيد من التأكيد على الدور التنظيمي للبروتين المحدد من الفائدة، إما تدق أو تدق في الخلايا يمكن أن تتولد فيها يتم إبطال البروتين الحمض النووي ملزم وراثيا. كعنصر تحكم إضافي، يمكن تحور موقع البروتين ملزمة في الجينات التنظيمية لمنع ربط البروتين من الفائدة. في أي من التصميمين التجريبيين الأخيرين، لن يؤدي تنشيط الخلية إلى التعبير عن العلامة gإيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جامعة تكساس مركز مد أندرسون للسرطان، هيوستن، تكس (صناديق بدء التشغيل، بب).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81, (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5, (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13, (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3, (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21, (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16, (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19, (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18, (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94, (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92, (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1, (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9, (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5, (12), 15754 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics