ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אינטראקציות DNA חלבון חיוניים עבור תהליכים ביולוגיים מרובים. במהלך הערכה של פונקציות הסלולר, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא הכרחי להבנת הרגולציה הגנטית. Chromatin immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות כאלה in vivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תהליכים תאיים מרובים, כולל שכפול דנ"א ותיקונם, recombination DNA, ביטוי גנים, דורשים אינטראקציות בין חלבונים ו- DNA. לכן, אינטראקציות דנ"א חלבונים מסדירים פונקציות פיזיולוגיות, פתופיזיולוגיות וביולוגיות מרובות, כגון התמיינות תאים, התפשטות תאים, בקרת מחזור התא, יציבות כרומוזום, רגולציה של גנים אפיגנטיים ושינוי בתאים. בתאים אאוקריוטיים, ה- DNA מקיים אינטראקציה עם חלבונים היסטוניים ולא היסטוניים ומתעבה לכרומטין. כמה כלים טכניים ניתן להשתמש כדי לנתח אינטראקציות DNA חלבונים, כגון אלקטרופורזה (ג'ל) ניידות Shift Assay (EMSA) ו DNase אני footprinting. עם זאת, טכניקות אלה לנתח את האינטראקציה DNA- חלבון במבחנה , לא בהקשר הסלולר. Chromatin immunoprecipitation (שבב) היא טכניקה לוכדת חלבונים באתרים ספציפיים שלהם DNA מחייב, ובכך מאפשר זיהוי של אינטראקציה DNA חלבוןS בהקשר הכרומטין שלהם. זה נעשה על ידי קיבוע של אינטראקציה DNA- חלבון, ואחריו immunoprecipitation של חלבון של עניין. לאחר מכן, האתר הגנומי שהחלבונים מאופיינים בו מאופיין. כאן, אנו מתארים ולדון צ'יפ ולהפגין את הערך האנליטי שלה לזיהוי של שינוי גורם הצמיחה- β (TGF-β), מחייב המושרה של גורם שעתוק SMAD2 ל SMAD מחייב אלמנטים (SBE) בתוך אזור האמרגן של טירוזין, קינאז חלבון קיט (c-KIT) קולטן ליגנד תא גזע גורם (SCF).

Introduction

בגרעין של eukaryotes, DNA אינטראקציה עם חלבונים היסטון חלבונים nonhistone והוא מרוכז לתוך הכרומטין. בהקשר הביולוגי הפיזיולוגי, הפאתופיסיולוגי והתא, תפקודים תאיים נשלטים באופן מרחבי ומבוקר באופן זמני על ידי ביטוי גנים מתואם הכרומטין. אינטראקציות DNA- חלבון יש תפקיד חיוני ויסות של תהליכים תאיים, כגון שכפול דנ"א, רקומבינציה, ותיקון, כמו גם ביטוי חלבון. לכן, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא כלי הכרחי בהערכת ביטוי גנים ותפקוד התא.

קיימות מספר טכניקות כדי להעריך אינטראקציות DNA חלבונים במבחנה , כגון אלקטרופורזה (ג'ל) ניידות משמרת Assay (EMSA) ו DNase אני footprinting 1 , 2 . עם זאת, טכניקות אלה לא לנתח את האינטראקציה DNA- חלבון בתוך הכרומטין הקשר הסלולר. שבב iטכניקה אשר לוכדת חלבונים קשורה לאתרים ספציפיים שלהם DNA מחייב ובכך מאפשר זיהוי של אינטראקציות DNA חלבונים בהקשר הכרומטין. הטכניקה פותחה במקור על ידי גימור וליס להערכת RNA פולימראז II מחייב גנים ספציפיים Escherichia coli ו תסיסנית melanogaster 3 , 4 . זה נעשה על ידי קיבוע של קומפלקסים DNA- חלבון, ואחריו ביצוע מיצוי הכרומטין וגזיזת DNA לתוך ~ 200 זוג בסיס (bp) שברי. לאחר מכן, חלבון ה- DNA קשור של עניין הוא מבודד על ידי immunoprecipitation. לאחר היפוך של ה- DNA חלבון crosslink, ה- DNA הוא מטוהרים ונותחו. מספר שיטות ניתן להשתמש לניתוח של אתרי מחייב חלבון תלויים ברצף חומצה גרעין של האתר מחייב חלבון בתוך הגן היעד 5 . במקרים שבהם רצף הדנ"א ידוע, תקן PolYmerase תגובות שרשרת (PCR) ניתן ליישם, באמצעות זוגות פריימר ספציפיים צמודים לאתר מחייב ידוע. כמותי Real-Time PCR (qRT-PCR) יכול לשמש גם 6 . במקרים בהם הרצף אינו ידוע, ניתן לשלב את ה- CHIP עם מיקרוא-דנ"א (שבב על שבב), רצף דנ"א (שבב- seq), או טכניקות שיבוט 7 , 8 , 9 .

מסלול TGF-β יש עוצמה דיכוי פונקציות מדכא והוא מסלול מפתח בידול תאים. זה מופעל באמצעות מחייב של ליגנד TGF-β1 לקולטן קולטן קוגנטי שלה, וכתוצאה מכך serine-fosphorylation של גורמי שעתוק SMAD2 / 3. בעקבות הקשר שלהם עם המתווך המשותף, SMAD4, מתרגם ה- SMAD אל הגרעין ונקשר ל- SBE בתוך אזור היזם של גני המטרה, שם הוא מווסת את הגנים השולטים במחזור התא, אפופטוזיס, ותא שונהעַל. תגובת ההעתקה לגירוי TGF-β היא סוג התא והקשר הספציפי 10 . לאחרונה, תיארנו לולאה משוב חיובי בין TGF-β לבין מסלול C-KIT 11 . במודל זה, TGF-β1 מופעל SMAD2 נקשר C-KIT ליגנד האמרגן ומעורר הביטוי שלה הפרשת. לאחר מכן, C-KIT ליגנד מפעיל את קולטן C-KIT באופן אוטומטי ו- para-crinic אופנה. C-KIT הפעלת קולטן תוצאות STAT3 Tyr 705- זרחון דרך JAK1 / 2. בעקבות STAT3- הפעלה טרנסלוקציה גרעינית, STAT3 נקשר לגן ליגנד TGF-β1 ו מסדיר את הביטוי שלה.

כאן, אנו מדגימים את התפקיד המהותי של ניתוח שבב עבור זיהוי של SMAD2 מחייב את C-KIT קולטן ליגנד האמרגן ו עבור זיהוי של אותות מתמר (ו) Activator (של) שעתוק 3 (STAT3 מחייב את TGF-β1- גֵן).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פתרונות

  1. הכן את הפתרונות הבאים טריים עבור כל ניסוי.
    1. לקבלת פתרון קיבעון , להכין פורמלדהיד 37% ולאחסן אותו RT. לדלל אותו 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לריכוז סופי של 1.42%.
      זהירות: פורמלדהיד מסווג כגורם מגרה, קורוזיבי, מוטגני, טרטוגני ומסרטן. לא לבלוע. אין לנשום גז / אדי / אדים / ספריי. במקרה של אוורור לא מספיק, ללבוש ציוד נשימה מתאים. הימנע ממגע עם העור והעיניים. יש להרחיק מפני חומרים בלתי תואמים, כגון חומרים מחמצנים, צמצום סוכנים, חומצות, אלקליות ולחות.
    2. עבור פתרון גליצין לתקן לתקן, להכין 0.125 M גליצין בפתרון 1x PBS ולאחסן אותו RT.
    3. עבור הפתרון שריטות התא, להכין פתרון PBS 1x ב dH 2 O ולאחסן אותו על הקרח. ממש לפני השימוש, להוסיף מעכב proteinase phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) tOa הריכוז הסופי של 0.5 מ"מ.
      זהירות: PMSF מסווגת כקורוזיבית ורעילה; ללבוש בגדים מגן ולהשתמש בו באזור מאוורר.
    4. ישירות לפני השימוש במאגר תמוגה התא (20 מ"מ טריס HCl, pH 8.0, 85 מ"מ KCl, ו 0.5% NP40), להוסיף 1X Protease קוקטייל inhibitor (PIC, פתרון מניות 100X ב dimethyl sulfoxide (DMSO): 104 מ"מ 4- ( 2-aminoethyl) benzenesulfonyl פלואוריד הידרוכלוריד (AEBSF), 80 מיקרומטר aprotinin, 4 מ"מ מ"מטין, 1.4 מ"מ E-64, 2 מ"מ leupeptin, ו 1.5 מ"מ pepstatin A) ו 0.5 מ"מ PMSF.
    5. ישירות לפני השימוש במאגר תמוגה גרעיני (50 מ"מ טריס- Cl, pH 8.0, 10 מ"מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), ו 1% SDS), להוסיף 1X PIC ו 0.5 מ"מ PMSF.

2. תא קיבוע וגז

  1. לגדל את התאים מפגש 70-80% על 10 ס"מ צלחות תרבות רקמה. לעורר את התאים לכל מטרות הניסוי.
  2. הסר את המדיום תרבות רקמה, להוסיף 5 מ"ל של פתרון קיבוע, ו דגירההתאים למשך 10 דקות ב RT על פלטפורמה רועדת.
  3. הסר את פתרון קיבוע לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של 1X קר כקרח PBS.
  4. הסר את 1x PBS, להוסיף 5 מ"ל של פתרון גליצין לתקן לתקן, דגירה התאים במשך 5 דקות ב RT על פלטפורמת רועד.
  5. הסר את הפתרון גליצין לתקן לתקן ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של 1X קר כקרח PBS.
  6. הסר את 1x PBS, להוסיף 2 מ"ל של פתרון שריטות התא, ומסיק את התאים באמצעות מגרד תא. מעבירים את התאים שנקטפו צינור חרוטי על הקרח.
  7. צנטריפוגה דגימות למשך 10 דקות ב 600 xg ו 4 ° C.
  8. הסר את supernatant, resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ תמוגה תא 1X, ו דגירה על קרח במשך 30 דקות. לחלופין, הצמד להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר גלולה resuspended במאגר תמוגה התא, להעביר את ההשעיה התא כדי homogenizer dounce קר dounce ו dounce עבור 10 משיכות באמצעות ב 'סוג ב'E לשיבוש תאים.
  10. מעבירים את ההשעיה תא לצינור microcentrifuge ו צנטריפוגה דגימות במשך 10 דקות ב 2,400 xg ו 4 ° C.
  11. מחק supernatant, resuspend גלולה μL 350 של חיץ עיכול גרעינים, דגירה דגימות 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  12. הוסף micrococcal nuclease (1 U / μL) ומערבבים על ידי vortexing. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-20 דקות; מערבבים את הדגימות כל 2 דקות על ידי היפוך.
    הערה: זמן ריכוז האנזים נבדלים בין שורות תאים עשויים לדרוש אופטימיזציה במקרים של גז אנזימטית תת אופטימלית.
  13. לחלופין, להשיג גז הכרומטין ידי sonication באמצעות sonicators זמין מסחרית.
    הערה: תנאי סוניקציה ידרשו אופטימיזציה. דוגמה פרוטוקול אופטימיזציה מסופק להלן באמצעות נפח מדגם של 300 μL כוח עיבוד מדגם של 25%.
    1. לאחר שלב 2.10, להשליך supernatant ו resuspend nגלולה uclear ב 1.0 מ"ל של חיץ גז מסחרי.
    2. Aliquot 300 μL של גלולה גרעינית resuspended לשלושה צינורות microcentrifuge 1.7 מ"ל. מניחים אותם על הקרח.
    3. גזירה 3 aliquots של הכרומטין קבוע על 25% כוח באמצעות 3 תנאים שונים כדי לקבוע את תנאי sonication אופטימלי:
      5 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק.
      10 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק.
      20 פעימות של 20 שניות כל אחד, עם 30 שניות מנוחה על הקרח בין כל הדופק.
    4. המשך עם שלב 2.15, כמפורט להלן.
  14. בעקבות הדגירה עם nuclease microococcal, להוסיף 7 μL של קר כקרח 0.5 M EDTA להפסיק את התגובה.
  15. צנטריפוגה דגימות עם ה- DNA המלוטש במשך 10 דקות ב XG 16,200 ו 4 ° C.
  16. מעבירים את ה- DNA מכוסה המכיל supernatant לצינור microcentrifuge טרי. Aliquot 50 μL לתוך צינור microcentrifuge נפרד כדי לאשר את suגזיזת הדנ"א (סעיף 3). השתמש נפח הנותרים מיד immunoprecipitation (סעיף 4) או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.

3. אישור יעילות הגז

  1. הוסף 150 μL של nuclease ללא D 2 O ו 10 μL של 5 Na NaCl אל 50 μL aliquot של הכרומטין מלוטש משלב 2.16.
  2. דגירה דגימות על 65 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות כדי להפוך את crosslinks.
  3. הוסף 2 μL של RNase (10 מיקרוגרם / μL) ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. הוסף 10 μL של proteinase K (0.5 מיקרוגרם / μL) ו דגירה דגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
  5. לטיהור של ה- DNA, לבצע פנול / כלורופורם מיצוי 12 .
    1. הוסף מים nuclease ללא לנפח סופי של 200 μL. הוסף 200 μL של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) למדגם ו מערבולת במשך 20 s.
    2. צנטריפוגה בחדר החדרPerature עבור 5 דקות ב 16,000 x גרם. בזהירות להסיר את השלב מימית העליון ולהעביר אותו צינור טרי. הקפד לא לשאת על כל פנול במהלך pipetting.
    3. הוסף 0.1 כרכים של 3 M סודיום אצטט (NH 4 OAc), pH 5.2, ומערבבים על ידי לחיצה על הצינור מספר פעמים עם אצבע. הוסף 2.5 כרכים של אתנול קר כקרח 100% ומערבבים על ידי vortexing עבור 5 s. דגירה המדגם O / N ב -20 מעלות צלזיוס, או לפחות 1 שעות ב -80 מעלות צלזיוס.
    4. צנטריפוגה המדגם במשך 30 דקות ב 4 ° C ו 16,000 XG כדי גלולה cDNA.
    5. הסר בזהירות את supernatant מבלי לשבש את גלולה. הוסף 1 מ"ל של RT, אתנול 70% ו להפוך את הצינור מספר פעמים.
    6. צנטריפוגה המדגם במשך 2 דקות ב 4 ° C ו 16,000 x גרם. הסר בזהירות את supernatant.
    7. יבש את גלולה עבור 5-10 דקות ב RT. Resuspend גלולה ב 30 μL של DH 2 O.
  6. השתמש aliquot 5 ו 10 μL של ה- DNA מטוהרים עבור ג'ל אלקטרופורזה עם TAE 1%Agarose ג'ל.
    הערה: מוצלח תוצאות הכרומטין גז בתבנית DNA 200-1,500 BP. אם הגז אינו מצליח, לקבוע את התנאים הגז אופטימלי עבור תאים ספציפיים על ידי שינוי זמן הדגירה של צעד הגז (צעד 2.12) ל 5, 10, ו 15 דקות.
  7. השתמש במדגם הנותר כדי לנתח את ריכוז ה- DNA של המדגם. הפוך - לחשב את ריכוז ה- DNA במדגם הכרומטין שרוף (שלב 2.16); להשתמש בכמויות DNA זהה עבור כל קבוצת טיפול עבור immunoprecipitation (סעיף 4).

4. Immunoprecipitation

  1. שלב 10-25 מיקרוגרם של הכרומטין crosslinked גזוז (צעד 2.16) עם 25 μL של חלבון שבב כיתה G חרוזים מגנטיים, 10 μL של חיץ דילול immunoprecipitation (פתרון המניה: 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 16.7 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 1.2 מ"מ EDTA, ו 167 mM NaCl), ו 1 μL של PIC.
  2. לאחר 4 שעות הדגירה, מוסיפים 1-10 מיקרוגרם של נוגדנים (ריכוז נוגדןאטיון ישתנה בהתאם לזיקה של הנוגדן; זה צריך בתחילה לשמש כל המלצות היצרן אופטימיזציה אופטימיזציה אם יש צורך) כדי צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולהוסיף dH 2 O לנפח סופי של 100 μL.
    הערה: במקום השיטה המתוארת לעיל immunoprecipitation, שיטת immunoprecipiation עקיף ניתן להשתמש על ידי שילוב הראשון של הכרומטין עם הנוגדנים ולאחר מכן הוספת חלבון G חרוזים מגנטיים.
  3. דגירה דגימות על רוטורטור מקצה לקצה עבור 4-12 שעות ב 4 ° C.

5. אלוטי

  1. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי. לאחר חרוזים מגנטיים צובר בצד של הצינור, להסיר בזהירות להשליך supernatant.
  2. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 800 μL של חיץ לשטוף 1 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 מ"מ EDTA pH 8, 20 מ"מ טריס HCl, pH 8, ו 150 מ"מ NaCl); לערבב על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי אNd להסיר בזהירות להשליך את חיץ לשטוף פעם אחת חרוזים מגנטיים בצד של הצינור.
  3. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם 800 μL של חיץ לשטוף 2 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 מ"מ EDTA, pH 8, 20 מ"מ טריס HCl pH 8, ו 500 מ"מ NaCl); לערבב על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי להסיר בזהירות להשליך את חיץ לשטוף פעם אחת חרוזים מגנטיים בצד בצד של הצינור.
  4. Resuspend את החרוזים μL 50 של חיץ elution (1% SDS ו 100 מ"מ NaHCO 3 ) ו דגירה הדגימות על רוטורטור מקצה לקצה במשך 15 דקות ב RT.
  5. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי, ופעם חרוזים מגנטיים לאסוף בצד הצינור, להעביר את supernatant לצינור טרי.
  6. הוסף 6 μL של 5 Na NaCl, כדי להפוך את crosslinking, ו 2 μL של proteinase K (0.5 מיקרוגרם / μL). לאחר ערבוב דגימות, דגירה דגימות עבור 2 שעות ב 65 מעלות צלזיוס.
  7. לטיהור ה- DNA, לבצע pheNol / כלורופורם מיצוי 12 (שלב 3.5) ולאחר מכן resuspend גלולה ב 30 μL של DH 2 O.
    הערה: דגימות ניתן לנתח ישירות עבור אתרי מחייב חלבון (סעיף 5) או ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

6. אתר מחייב ניתוח

  1. ביצוע ניתוח עבור אתרים מחייב ספציפי בתוך רצף חומצה גרעין ידוע באמצעות PCR או qRT-PCR. עבור עיצוב פריימר, בצע PCR קונבנציונאלי או qRT-PCR פרוטוקולים. עיצוב primers לסנתז amplicon 150-400 bp כי גשרים האתר מחייב חלבון עניין ( איור 1 ).
  2. הגדר את ה- PCR באמצעות ארבע תבניות DNA שונות כדי להבטיח ספציפיות: i) DNA מתוך שבב immunoprecipitated עם הנוגדן של עניין, ii) DNA מ CHIP immunoprecipitated עם נוגדן IgG ספציפי, iii) קלט DNA, ו IV) H 2 O שליטה שלילית עבור PCR לשלול זיהום. במקרה של גירוי מסלול, בחר תבנית החמישית באמצעות קבוצה שונה של primers ספציפיים לאתר מחייב ידוע של החלבון immunoprecipitated.
    הערה: במקרה של C-KIT ליגנד האמרגן ניתוח, להשתמש PCR קונבנציונלי להפגין TGF-β-Induced SMAD מחייב ב SBE בתוך C-KIT ליגנד באזור האמרגן. כבקרה חיובית, לבצע PCR על plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) כיעד ידוע של TGF-β-Induced SMAD מחייב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכריכה של ליגנד TGF-β1 לתרכובת הקולטן המובהקת שלו גורמת לזריחת הזרחן של גורמי שעתוק SMAD2 / 3, ולאחר מכן הקשר שלהם למתווך הפשוט, SMAD4. המתקן SMAD translocates לגרעין. TGF-β יכול להסדיר שעתוק גנים, בין אם ישירות דרך SMAD מחייב SBEs בתוך אזורים רגולטוריים של גנים היעד, או בעקיפין דרך ביטוי SMAD- מוסדר של activators תעתיק או מדחסים כי לאחר מכן לווסת את הביטוי של הגן של עניין 10 . כדי לבדוק אם C-KIT ליגנד SCF הוא מוסדר transcriptionally על ידי ישיר TGF-β1 המושרה מחייב של SMAD2 כדי האמרגן שלה, ניתחנו את SCF מקדם המכיל, 2.4-kb, 5'-flanking אזור של הגן SCF עבור מוטיב מחייב SMAD2, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . זיהינו 7 UPS מכוער UPSקרם של קודון להתחיל SCF ( איור 1 א ). כדי לאשר את מחייב TGF-β1 המושרה של SMAD2 כדי האמרגן SCF, assay שבב המתואר כאן בוצעה. הטיפול TGF-β1 הביא SMAD2 מחייב את האמרגן SCF בקווים אנושיים סרטן הכבד, HepG2 ו hep3B, תאים ( איור 1 ב ). בהעדר גירוי TGF-β1, לא צוין מחייב SMAD. כביקורת חיובית עבור TGF-β1-Induced SMAD ההפעלה, שבב עבור PAI-1 בוצע. PI-1 האמרגן הוא יעד ידוע של TGF-β / SMAD 13 . כדי לאשר את הספציפיות של immunoprecipitation SMAD2, נוגדנים IgG ספציפיים לא היו בשימוש; לא מחייב SMAD2 ל SBE צוין לאחר immunoprecipitation עם IgG.

עבור הדגמה נוספת של טכנולוגיית שבב, ניתחנו את האזור 5'-flanking של הגן TGF-β ליגנד עבור מוטיבים מחייב STAT3 הקונצנזוס 5 '-TT (N4) AA-3 'ו- 5'-TT (N5) AA-3' 15 . זיהינו שני אתרים מחייב STAT3 מחייב במעלה של קודון להתחיל TGFB במיקומים -4384 / -4373 (STB-1) ו -5365 / -5357 (STB-2) ( איור 2 א ). כדי לאשר את מחייב TGF-β1 המושרה של STAT3 לגן ליגנד TGF-β, ביצענו מבחני שבב באמצעות TGF-β1 שטופלו HepG2 ו hep3B תאים. טיפול TGF-β1 הביא לכפיית STAT3 ל- STB-2 השני של גן TGFB, אך לא לשלב הראשון (STB-1) ( איור 2 ב ). בדוגמה זו, החיבור החיובי STAT3 ל- STB-2 משמש כבקרה חיובית פנימית. בדומה לניסוי שבב לעיל, STAT3 מחייב את STB-2 לא נראה לאחר immunoprecipitation באמצעות IgG.

איור 1
איור 1 >> TGF-β-Induced SMAD2 מחייב את האמרגן SCF. ( א ) ייצוג סכמטי של האמרגן SCF , עם SBPs putative כפי שמוצג תיבות (תיבות לבן = AGAC) עם המיקום היחסי שלהם קודון ההתחלה. המיקום Chip תחל מוצג למטה, עם עמדות יחסית לקוד ההתחלה של SCF ואת גודל המוצר PCR. ( B ) שבב עבור SMAD2 מחייב את האמרגן SCF . קומפלקסים של חלבון הכרומטין של TGF-β1 שטופלו ו HepG2 מטופלים ותאי hep3B היו immunoprecipitated עם נוגדן אנטי SMAD2. PCR בוצעה באמצעות פריימרים ספציפיים SCF. בצד שמאל, תוצאות PCR באמצעות דנ"א קלט מוצגים. באמצע, תוצאות PCR לאחר immunoprecipitation עם IgG ספציפיים מוצגים עבור אישור של SMAD2 immunoprecipitation סגוליות. מוצג בלוח התחתון, שבב עבור SMAD2 מחייב PAI-1 שימש שליטה חיובית.Ge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 : TGF-β-Induced STAT3 מחייב את TGF-β הגן. ( א ) סכמטי של הגן TGF-β, עם אתרי הכרחי STAT3 מחייב מוצגים כמו תיבות אפור עם המיקום היחסי שלהם קודון ההתחלה. מיקומי צ 'יפס פריימר מוצגים עם עמדות יחסית שלהם קודון להתחיל TGF-β ואת גודל המוצר PCR המצוין להלן. ( B ) שבב עבור TGF-β1 המושרה STAT3 מחייב את הגן TGF-β. מתחמי הכרומטין-חלבון של TGF-β1 שטופלו ו HepG2 מטופלים ותאי hep3B היו immunoprecipitated עם נוגדן anti-STAT3. PCR בוצעה באמצעות פריימרים ספציפיים TGF-β. בצד שמאל, תוצאות ה- PCR באמצעות DNA קלט מוצגים. באמצע, ה- PCRתוצאות לאחר immunoprecipitation עם IgG unspecific מוצגים לאישור של STAT3 immunoprecipitation סגוליות. הלוח העליון מראה את תוצאות PCR באמצעות primers ספציפי עבור אתר מחייב STAT3 1 (STB-1), ואת הפאנל התחתון מציג את התוצאות עבור מחייב STAT3 לאתר מחייב STAT3 2 (STB-2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדוח זה, אנו מדגימים את TGF-β1 המושרה מחייב של SMAD2 ל SBE בתוך C-KIT ליגנד האמרגן ואת TGF-β1 המושרה מחייב STAT3 לרצף ההכרה שלה בתוך הגן TGF-β1 ליגנד. אנו מראים ציטוקינים- Induced מחייב של שני גורמים שעתוק באמצעות immunoprecipitation הכרומטין.

הכרומטין immunoprecipitation הוא כלי רב עוצמה כדי להדגים את הכריכה הישירה של חלבון של עניין ל- DNA, לאפיין את הגירויים המפעילים חלבון מחייב ל- DNA, ולאפיין את רצף ה- DNA שבו חלבון נקשר. המידע האחרון יכול לסייע בזיהוי גנים מוסדר על ידי חלבון מסוים של עניין מושגת על ידי שימוש שבב על שבב, שבב- seq, או שיבוט אסטרטגיות 7 , 8 , 9 . אחד היתרונות העיקריים של שבב לעומת שיטות אחרות של הוכחת דנ"א מחייב חלבון, כגון EMSA או DNase אני footprinting, היא כי, בטכנולוגיה שבב, מחייב נלכד in vivo , ואילו עם אחרים, הוא מבוצע במבחנה . לפיכך, שבב מספק תובנה מחייב DNA חלבון בתוך הקשר הסלולר, בעוד טכניקות אחרות מייצגות מערכת מבודדת.

עם זאת, ניתוח שבב מורכב, כולל צעדים מרובים שיכולים להשפיע על התוצאות, ודורשת אופטימיזציה וניסיון. אחד הצעדים הראשונים הוא קריטי עבור הצ 'יפ מוצלח הוא צעד crosslink (שלב 2.2). UV crosslinking הוא בלתי הפיך ולכן לא מתאים צ'יפ. פורמלדהיד crosslinking הוא העדיף, אבל ריכוז פורמלדהיד ו crosslinking הזמן יכול להשפיע על היעילות של הגז הכרומטין ו משקעים אנטיגן. באופן כללי, ריכוזי פורמלדהיד נמוך (1% w / v) ו crosslinking פעמים קצר (5-10 דקות) עדיפים, כפי שהם לשפר את יעילות הגז. עם זאת, פורמלדהיד אינו יעילעל חלבון חלבון crosslinking ולכן הוא suboptimal עבור חלבונים שאינם קשורים ישירות DNA 16 . במקרים כאלה, שבב יכול להיעשות בגישה דו-שלבית, שבה crosslinking חלבון חלבון נעשה הראשון באמצעות crosslinkers כגון glutarate disocccinimidyl, ואחריו פורמלדהיד בתיווך DNA- חלבון crosslinking 17 .

השלב הקריטי הבא הוא גז הכרומטין. במחקר שלנו, השתמשנו גז האנזימטית באמצעות noclease microococcal. גז אנזימטי שימושי במיוחד עבור שבב יליד noncrosslinked (N-CHIP), כאשר sonication היה לשבש את מחייב חלבון ה- DNA. N-Chip משמש בעיקר לניתוח היסטונים וממירים היסטון 18 . בעוד micrococcal nuclease נחשב ספציפי לא ספציפי exouclease endouclease, זה הוכח לעורר רצף ספציפי מחשוף 19 . זה יכול לגרום הטיה תלוי רצף של שבירת שהתקבלGments, עם overrepresentation של גן מסוים loci 20 . Sonication יוצר שברי DNA בגודל אקראי, ללא הטיה רצף, והוא העדיף בדרך כלל עבור שבב crosslinked (X-Chip). עם זאת, התנאים sonication יש לקבוע באופן אמפירי עבור כל תא או סוג רקמות מודל sonicator, וכתוצאה מכך שברי דנ"א הם בדרך כלל גדול יותר עם גז אנזימטי 16 . כמו כן, over-sonication או emulsification של המדגם יכול לגרום לאובדן נוגדנים epitopes עקב denaturation חלבון והשפלה.

צעד immunoprecipitation הוא צעד קריטי נוסף שיכול להשפיע מאוד על התוצאות של שבב. Agarose חרוזים לאגד DNA באופן לא ספציפי, וריאציה במספר חרוזים הוסיף יכול להשפיע על יחס אותות ל-רקע ספציפיים. לפיכך, חשוב לשמור על חרוז agarose "slurry" היטב מושעה כאשר הוא הוסיף את דגימות DNA חלבון. לגבי הנוגדן המשמש את iMmunoprecipitation, באופן כללי, נוגדנים שבב כיתה צריך לשמש, ובמקרים שבהם אלה אינם זמינים, לפחות נוגדנים כיתה immunoprecipitation צריך להיות מועדף. כמו epitopes ספציפיים יכול להיות רעולי במהלך crosslinking, נוגדנים polyclonal הם יתרון, כפי שהם מכירים epitopes כמה. כמות נוגדנים הוסיף צריך להיות עודף של גורם זירז ולכן צריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל גורם / נוגדן. כמו כן, כמו קינטיקה להגיע שיווי המשקל של נוגדנים מחייב שונה עבור כל נוגדנים, התנאים הדגירה אופטימלי חייב להיות נקבע עבור כל נוגדנים.

כמה פקדים יכולים וצריכים לכלול את ההגדרה הניסויית. במקרים בהם האינדוקציה של תגובה ספציפית לחלבון דנ"א מוערכת, חשוב לכלול בקרת דנ"א קלט כדי להפגין כמויות דנ"א בתבנית שוות בניתוח הסופי ( כלומר PCR או qRT-PCR). בקרת נוגדנים נדרשתלאשר את הספציפיות של immunoprecipitation של חלבון של עניין. בדרך כלל isotype- מתאימים immunoglobulins מתאימים היטב כמו שולטת שלילית, אבל חרוזים agarose יכול לשמש גם. מדי פעם, פקדים חיוביים משמשים כדי לאשר זרימה ניסיונית פונקציונלית של שבב, נוגדנים נוגדי היסטון משמשים לעתים קרובות למטרה זו. בניסויים גירוי, שליטה חיובית עדיפה היא immunoprecipitation של חלבון של עניין, עם ניתוח רצף הבאים באזור DNA ידוע החלבונים נקשרים לגירוי. בתוצאות נציג שלנו, SBE בתוך האמרגן PAI-1 שימש יעד ידוע TGF-β1-Induced SMAD מחייב. בניסויים ללא מחייב חלבון מגורה, רצף DNA ידוע לא להיות מטרה לחלבון של עניין ניתן להשתמש עבור ניתוח DNA הבאים. לגבי ניתוח ה- DNA, חשוב לכלול תגובה ללא DNA תבנית לשלול זיהום.

שבב הוא טכניקה מצוינת להפגין ישירות את הכריכה של חלבון של עניין לגן. עם זאת, זה לא מחקר פונקציונלי. במקרים בהם חלבון של עניין הוא חשב שיש תפקיד רגולרי, זה הכרחי גם לבצע מבחני תפקודית, כגון מבחני גן מבוסס מבוסס ( למשל, בלוציפראז). בפרוטוקולים אלה, הגן של עניין הוא משובטים בעמדה רגולטורית של גן הכתב. אינדוקציה של הגן של עניין תוצאות הביטוי של הגן הכתב אם יש לו פונקציה רגולטורית. לקבלת אישור נוסף של התפקיד הרגולטורי של חלבון מסוים של עניין, או דפיקה למטה או לדפוק בתאים ניתן להפיק שבו חלבון ה- DNA מחייב מושתקת גנטית. כבקרה נוספת, האתר מחייב חלבון בגן הרגולציה יכול להיות מוטציה כדי למנוע מחייב של חלבון של עניין. בכל אחד משני האחרונים עיצובים ניסיוניים, גירוי התא לא תביא את הביטוי של הסמן gEne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת טקסס MD אנדרסון סרטן המרכז, יוסטון, TX (startup קרנות, BB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81, (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5, (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13, (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3, (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21, (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16, (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19, (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18, (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94, (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92, (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1, (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9, (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5, (12), 15754 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics