Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

DNA-protein etkileşimleri, çoklu biyolojik işlemler için gereklidir. Hücresel işlevlerin değerlendirilmesi sırasında, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen düzenlemesinin anlaşılması için vazgeçilmezdir. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), böyle etkileşimleri in vivo olarak analiz etmek için güçlü bir araçtır .

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA replikasyonu ve onarımı, DNA rekombinasyonu ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere çoklu hücresel süreçler, proteinler ve DNA arasında etkileşim gerektirir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimleri, hücre farklılaşması, hücre proliferasyonu, hücre döngüsü kontrolü, kromozom stabilitesi, epigenetik gen düzenlenmesi ve hücre dönüşümü gibi çoklu fizyolojik, patofizyolojik ve biyolojik fonksiyonları düzenler. Ökaryotik hücrelerde DNA, histon ve histokonsuz proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Deneyi (EMSA) ve DNase I ayak izi gibi DNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için çeşitli teknik araçlar kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler protein-DNA etkileşimini in vitro olarak analiz eder, hücresel bağlam içinde değil. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), proteinleri belirli DNA bağlama bölgelerinde yakalayan ve böylece DNA-protein etkileşimini tanımlayan bir tekniktirOnların kromatin bağlamı içinde. DNA-protein etkileşiminin sabitlenmesiyle, ardından ilgilenilen proteinin immüno çökmesi ile yapılır. Daha sonra, proteinin bağlı olduğu genomik bölge karakterize edilir. Burada, ÇIP'yi tarif eder ve tartışır ve transkripsiyon faktörü SMAD2'nin Transforma Edici Büyüme Faktörü-β (TGF-β) ile indüklenmiş SMAD2'nin tirozin-bağışıklık sisteminin promotör bölgesi içindeki SMAD Bağlama Elemanları'na (SBE) bağlanmasının tanımlanması için analitik değerini gösteririz Protein kinaz Kiti (c-KIT) reseptör ligandı Kök Hücre Faktörü (SCF).

Introduction

Ökaryotların çekirdeğinde DNA, histon proteinleri ve histolojik olmayan proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Fizyolojik, patofizyolojik ve hücre biyolojik bağlamında, hücresel fonksiyonlar mekansal olarak ve geçici olarak kromatin koordine edilmiş gen ifadesi ile kontrol edilir. DNA-protein etkileşimleri, DNA replikasyonu, rekombinasyon ve tamir gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesinde ve protein ekspresyonunda önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen ekspresyonunun ve hücre fonksiyonunun değerlendirilmesinde vazgeçilmez bir araçtır.

Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA) ve DNase I ayak izi 1 , 2 gibi in vitro DNA-protein etkileşimlerini değerlendirmek için çeşitli teknikler mevcuttur. Bununla birlikte, bu teknikler, kromatin ve hücresel bağlamda protein-DNA etkileşimini analiz etmez. ChIP iSa tekniği, spesifik DNA bağlama alanlarına bağlı proteinleri yakalar ve böylece kromatin bağlamında DNA-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu teknik esas olarak Gimour ve Lis tarafından, Escherichia coli ve Drosophila melanogaster 3 , 4'te spesifik genlere RNA polimeraz II'nin bağlanmasının değerlendirilmesi için geliştirildi. DNA-protein komplekslerinin sabitlenmesiyle, bunu takiben kromatin ekstraksiyonu yapılarak DNA'nın ~ 200 baz çifti (bp) parçalara kesilmesi ile yapılır. Daha sonra, ilgili DNA'ya bağlı protein immüno çökeltme ile izole edilir. DNA-protein çapraz bağlantının tersine çevrilmesinden sonra, DNA arıtılır ve analiz edilir. Protein bağlama bölgelerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve hedef gen 5 içindeki protein bağlama alanının nükleik asit dizisine bağlıdır. DNA dizisinin bilinmesi durumunda, standart PolYmeraz Zincir Reaksiyonları (PCR), bilinen bağlama alanına bitişik spesifik primer çiftleri kullanılarak uygulanabilir. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) de kullanılabilir 6 . Dizinin bilinmediği durumlarda, ChIP, DNA mikrodizileri (ChIP-on-chip), DNA dizilimi (ChIP-seq) veya klonlama teknikleri 7 , 8 , 9 ile birleştirilebilir .

TGF-β yolu güçlü tümör baskılayıcı işlevlere sahiptir ve hücre farklılaşmasında önemli bir yol oluşturmaktadır. TGF-β1 ligandının kognat reseptör kompleksine bağlanması yoluyla aktive edilir ve SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonuna neden olur. Ortak mediyatör olan SMAD4 ile olan ilişkisini takiben, SMAD kompleksi çekirdeğe translokasyon yapar ve hedef genlerin promotörü bölgesi içinde SBE'ye bağlanır ve burada hücre döngüsü, apoptoz ve hücre farklılaşmasını kontrol eden genleri düzenlerüzerinde. TGF-β stimülasyonuna transkripsiyonel yanıt hücre tipi ve bağlam-spesifik 10'dur . Son zamanlarda, TGF-β ve c-KIT yolu arasında olumlu bir geri besleme döngüsü tanımladık 11 . Bu modelde, TGF-β1 ile aktive olan SMAD2, c-KIT ligand yükselticisine bağlanır ve ekspresyonunu ve sekresyonunu indükler. Daha sonra, c-KIT ligandı, c-KIT reseptörünü otomatik ve para-kreynik biçimde aktive eder. C-KIT reseptör aktivasyonu, JAK1 / 2 yoluyla STAT3 Tyr 705 fosforilasyonuna neden olur. STAT3-aktivasyonu ve nükleer translokasyonu takiben STAT3, TGF-β1 ligand genine bağlanır ve ekspresyonunu düzenler.

Burada SMAD2'nin c-KIT reseptör ligand yükselticisine bağlanması ve Sinyal Transdüseri (ve) Aktivatörün (Transkripsiyon 3) (STAT3'in TGF-β1'e bağlanması) tanımlanması için ChIP analizinin temel rolünü gösteriyoruz gen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Çözümlerin Hazırlanması

  1. Her bir deney için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın.
    1. Sabitleme çözümü için % 37 formaldehit hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. 1X Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içinde% 1.42'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
      DİKKAT: Formaldehit tahriş edici, aşındırıcı, mutajenik, teratojenik ve kanserojen olarak sınıflandırılmıştır. Beslenmeyin. Gaz / duman / buhar / sprey solumayın. Havalandırmanın yetersiz olduğu durumda solunumla ilgili uygun ekipman giyin. Deri ve gözlerle temasından kaçınınız. Oksitleyici maddeler, indirgeyici maddeler, asitler, alkaliler ve nem gibi bağdaşmayan maddelerden uzak tutun.
    2. Glisin durdurma çözeltisi çözeltisi için, 1x PBS solüsyonunda 0.125 M glisin hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
    3. Hücre sıyırma çözeltisi için, dH20 içerisinde 1x PBS solüsyonu hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Kullanımdan hemen önce, proteinaz inhibitörü fenilmetilsülfonil fluorür (PMSF) t0.5 mM nihai konsantrasyon.
      DİKKAT: PMSF aşındırıcı ve toksik olarak sınıflandırılmıştır; Koruyucu giysiler giyin ve havalandırılan bir alanda kullanın.
    4. Doğrudan hücre liziz tamponunu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 85 mM KCI ve% 0.5 NP40) kullanmadan önce, 1X Proteaz İnhibitörü Kokteyl (PIC; dimetil sülfoksitte 100X stok solüsyonu (DMSO): 104 mM 4- 2-aminoetil) benzensülfonil fluorür hidroklorid (AEBSF), 80 uM aprotinin, 4 mM enzatin, 1.4 mM E-64, 2 mM leupeptin ve 1.5 mM pepstatin A) ve 0.5 mM PMSF.
    5. Çekirdek liziz tamponunu (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve% 1 SDS) kullanmadan önce doğrudan 1X PIC ve 0.5 mM PMSF ilave edin.

2. Hücre Tespiti ve Kesme

  1. 10 cm doku kültürü plakaları üzerinde 70-80% konfluansa hücreleri büyütün. Hücreleri deneysel amaçlar doğrultusunda uyarırlar.
  2. Doku kültürü ortamı çıkarın, 5 mL sabitleme solüsyonu ekleyin ve inkübe edin.Hücreleri titreşimli bir platformda oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
  3. Sabitleme çözeltisini çıkarın ve hücreleri 10 mL buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın.
  4. 1x PBS'yi çıkarın, 5 mL glisin durdurma çözeltisi ilave edin ve hücreleri sallanan bir platformda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Glisin stop-fix çözeltisini çıkarıp hücreleri 10 mL buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın.
  6. 1x PBS'yi çıkarın, 2 mL hücre kazıma çözeltisi ekleyin ve hücreleri bir kazıyıcı kullanarak hasat edin. Hasat edilen hücreleri buz üzerinde konik bir tüpe aktarın.
  7. Örnekleri 600 xg ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatantı çıkarın, pelleti 1 mL'lik 1X hücre liziz tamponunda tekrar süspansiyon haline getirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Alternatif olarak, pelet sıvıyı sıvı nitrojende hızlı bir şekilde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
  9. Pellet hücre liziz tamponunda bir kez yeniden süspansiyon haline getirildiğinde, hücre süspansiyonunu buz gibi dounce homojenleştiriciye aktarın ve bir B tipi böcek kullanarak 10 vuruş boyunca atınE hücre parçalanması için.
  10. Hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2,400 xg ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  11. Süpernatantı atın, 350 uL çekirdek sindirim tamponunda pellatı tekrar süspanse edin ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
  12. Mikrokakal nükleaz (1 U / μL) ekleyin ve vorteksleme ile karıştırın. Numuneleri 37 ° C'de 5-20 dakika inkübe edin; Numuneleri her 2 dakikada bir ters çevirerek karıştırın.
    NOT: Zaman ve enzim konsantrasyonu hücre çizgileri arasında farklıdır ve optimal olmayan enzimatik kesme durumunda optimizasyon gerektirebilir.
  13. Alternatif olarak, piyasada bulunan sonikatörler kullanılarak sonikasyon ile kromatin makaslama elde edin.
    NOT: Sonication koşulları optimizasyon gerektirir. 300 uL'lik bir örnek hacmi ve% 25'lik bir örnek işleme gücü kullanılarak bir optimizasyon örnek protokolü aşağıda sağlanmaktadır.
    1. Adım 2.10'ın ardından süpernatanı atın ve n'yi tekrar süspanse edin1,0 mL ticari yılan tamponunda nükleer pellet.
    2. Üç 1.7 mL mikrosantrifüj tübüne tekrar süspansiyon haline getirilmiş nükleer pelletden 300 uL alikot altına alın. Onları buz koyun.
    3. Optimum sonikasyon koşullarını belirlemek için sabit renk kromatininin 3 kısımlarını% 25'lik bir güçle 3 farklı koşul kullanarak kesilin:
      Her bir darbe arasında buz üzerinde 30 saniye dinlenme ile 20 sn'lik 5 puls.
      Her puls arasında 10 saniye, buzda 30 saniye dinlenme.
      20 puls, her biri 20 s, her nabız arasında buz üzerinde 30 s dinlenme ile.
    4. Aşağıda özetlenen şekilde Adım 2.15 ile devam edin.
  14. Mikrokokal nükleaz ile kuluçkadan sonra reaksiyonu durdurmak için 7 uL buz soğukluğunda 0,5 M EDTA ilave edin.
  15. Numuneleri kesilmiş DNA ile 16,200 xg ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  16. Kesilmiş DNA içeren süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Onaylamak için ayrı bir mikrosantrifüj tüpüne 50 uL'lik kısım ilave edinDNA'nın ccessful makaslama (bölüm 3). İmmünopresipitasyon için hemen geri kalan hacmi kullanın (bölüm 4) veya -80 ° C'de saklayın.

3. Kesme Verimliliğinin Doğrulanması

  1. Adım 2.16'dan kesilmiş kromatin 50 mcL'ye bölünene, 150 uL nükleazsız dH2O ve 10 uL 5 M NaCl ekleyin.
  2. Çapraz bağları tersine çevirmek için numuneleri 65 ° C'de 4 saat inkübe edin.
  3. 2 μL RNase A (10 μg / μL) ekleyin ve numuneleri 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  4. 10 μL proteinaz K (0.5 μg / μL) ekleyin ve numuneleri 42 ° C'de 90 dakika inkübe edin.
  5. DNA'nın saflaştırılması için bir fenol / kloroform ekstraksiyonu yapın 12 .
    1. 200 uL'lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen su ekleyin. 200 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) numuneye ekleyin ve 20 saniye vorteks ekleyin.
    2. Oda sıcaklığında santrifüjleyin16.000 x g'de 5 dakika süreyle kullanılır. Dikkatle üst sulu fazı çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Pipetleme sırasında herhangi bir fenol taşımamaya dikkat edin.
    3. 0.1 hacim 3 M sodyum asetat (NH4OAc), pH 5.2 ilave edin ve tüpü bir parmakla birkaç kez hafifçe vurarak karıştırın. 2.5 hacim buz soğukluğunda% 100 etanol ilave edin ve 5 saniye vorteksleyerek karıştırın. Örnek O / N'yi -20 ° C'de veya en az 1 saat süreyle -80 ° C'de inkübe edin.
    4. CDNA pelet için 4 ° C ve 16.000 xg'de 30 dakika için numune santrifüjleyin.
    5. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. 1 mL RT,% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin.
    6. Numuneyi 4 ° C'de ve 16.000 x g'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    7. Pelleti oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca kurutun. Pelleti 30 uL dH2O içinde tekrar süspanse edin.
  6. % 1 TAE ile jel elektroforezi için saflaştırılmış DNA'nın 5 ve 10 uL'lik kısımlarını kullanınAgaroz jeli.
    NOT: Başarılı bir kromatin makaslama, 200-1,500 bp'lik DNA örüntüsü ile sonuçlanır. Kesme başarısız olursa, kesme aşamasının (aşama 2.12) inkübasyon süresini 5, 10 ve 15 dakika olarak değiştirerek, spesifik hücreler için optimum kesme koşullarını belirleyin.
  7. Numunenin DNA konsantrasyonunu analiz etmek için kalan numuneyi kullanın. Kesilmiş kromatin örneğinde DNA konsantrasyonunu ters hesaplayın (basamak 2.16); Her bir tedavi grubu için immüno çökeltme için aynı DNA miktarlarını kullanın (bölüm 4).

4. İmmunopresipitasyon

  1. 25 μL ChIP dereceli protein G manyetik boncuklar, 10 μL immüno-çöktürme seyreltme tamponu (stok çözeltisi:% 0.01 SDS,% 1.1 Triton X-100, 16.7 mM) ile 10-25 μg kesilmiş, çapraz bağlanmış kromatin birleştirin (adım 2.16) Tris-HC1, pH 8.0, 1.2 mM EDTA ve 167 mM NaCl) ve 1 uL PIC.
  2. 4 saat inkübasyondan sonra, 1-10 μg antikor (antikor konsantratıAntikorun afinitesine bağlı olarak değişecektir; Başlangıçta üretici önerileri uyarınca kullanılmalı ve gerekliyse deneysel olarak optimize edilmelidir) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne uygulandı ve 100 uL'lik bir son hacme dH20 eklendi.
    NOT: Yukarıda tarif edilen direkt immünopresipitasyon yöntemi yerine dolaylı immüno-çöktürme yöntemi, önce kromatin ile antikorları birleştirip daha sonra protein G manyetik boncuk ekleyerek kullanılabilir.
  3. 4-12 saat boyunca 4 ° C'de örnekleri uçtan uca bir rotatöre inkübe edin.

5. Elüsyon

  1. Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikçe, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.
  2. Boncukları üç kez 800 μL yıkama tamponu 1 (% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 ve 150 mM NaCl) ile yıkayın; Tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik aya yerleştirin a.Manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikten sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın ve atın.
  3. Boncukları bir kez 800 μL yıkama tamponu 2 (% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA; pH 8, 20 mM Tris-HCI pH 8 ve 500 mM NaCl) ile yıkayın; Tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikten sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın ve atın.
  4. 50 μL elüsyon tamponu (% 1 SDS ve 100 mM NaHCO 3 ) içindeki boncukları tekrar süspansiyon haline getirin ve örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir uçtan uca rotatörde inkübe edin.
  5. Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yanına bir kere toplandıktan sonra süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
  6. Çapraz bağlanmayı tersine çevirmek için 6 μL 5 M NaCl ve 2 μL proteinaz K (0.5 μg / μL) ekleyin. Numuneleri karıştırdıktan sonra, numuneleri 2 saat 65 ° C'de inkübe edin.
  7. DNA'nın saflaştırılması için bir phe gerçekleştirinNol / kloroform ekstraksiyonu 12 (adım 3,5) ve daha sonra peleti 30 uL dH20 ile tekrar süspanse edin.
    NOT: Numuneler, protein bağlama alanları için doğrudan analiz edilebilir (bölüm 5) veya -20 ° C'de saklanabilir.

6. Bağlanma Sahası Analizi

  1. PCR veya qRT-PCR kullanarak bilinen bir nükleik asit dizisi içindeki spesifik bağlanma alanları için bir analiz yapın. Primer tasarım için, geleneksel PCR veya qRT-PCR protokollerini uygulayın. İlgilenen protein bağlanma sitesini köprüleyen 150-400 bp'lik bir amplifikatı sentezlemek için primerleri tasarlayın ( Şekil 1 ).
  2. Spesifikliği sağlamak için dört farklı DNA şablonu kullanarak PCR ayarlayın: i) ilgilenilen antikor ile immüno-çökeltilen immüno-çökelti ChIP'den DNA, ii) spesifik olmayan bir IgG antikoru ile immüno-çöktürülmüş ChIP'den DNA, iii) giriş DNA'sı ve iv) H20 Kontaminasyonu dışarı atmak için PCR için negatif kontrol. Yol uyarma durumunda, Immüno çökeltilmiş proteinin bilinen bir bağlanma bölgesine özgü farklı primerler seti kullanılarak beşinci bir şablon seçin.
    NOT: c-KIT ligand yükseltici analizi durumunda, c-KIT ligand yükseltici bölgedeki SBE'de TGF-β ile indüklenen SMAD bağlanmasını göstermek için klasik PCR kullanın. Pozitif bir kontrol olarak, TGF-β ile indüklenen SMAD bağlanmasının bilinen bir hedefi olarak plazminojen aktivatör inhibitörü-1 (PAI-1) üzerinde PCR gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TGF-β1 ligandının aynı kökenli reseptör kompleksine bağlanması, SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonunu ve bunun ardından ortak mediatör SMAD4'le birleşmesini sağlar. SMAD kompleksi çekirdeğe taşır. TGF-β gen transkripsiyonunu hedef genlerin düzenleyici bölgelerindeki SBE'lere direkt olarak SMAD ile bağlanarak veya dolaylı olarak ilgilenilen genin ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyonel aktivatörlerin veya baskılayıcıların SMAD tarafından düzenlenen ekspresyonu aracılığıyla gen transkripsiyonunu düzenleyebilir 10 . C-KIT ligandı SCF'nin doğrudan TGF-β1 ile indüklenen SMAD2'nin kendi promotörüne bağlanmasıyla transkripsiyonel olarak düzenlenip regüle edilmediğini test etmek için SCF geninin SCF geninin 2.4 kb'lik 5'-çevreleyen bölgesini analiz ettik. SMAD2 bağlama motifi, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . 7 varsayılan SBE'yi tespit ettikSCF başlangıç ​​kodonunun çikolatası ( Şekil 1A ). SMAD2'nin SCF yükselticisine TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını doğrulamak için, burada tarif edilen ChIP tahlili gerçekleştirildi. TGF-β1 tedavisi, insan karaciğer kanseri çizgileri HepG2 ve Hep3B hücrelerinde SCF yükselticisine SMAD2 bağlanmasına yol açtı ( Şekil 1B ). TGF-β1 uyarımı yokluğunda hiçbir SMAD bağlanma belirtilmedi. TGF-β1 ile indüklenen SMAD aktivasyonu için pozitif bir kontrol olarak PAI-1 için ChIP yapıldı. PAI-1 yükseltici, bilinen bir TGF-β / SMAD 13 hedefidir. SMAD2 immüno çökeltisinin özgüllüğünü teyit etmek için, spesifik olmayan IgG antikorları kullanıldı; IgG ile immüno-çökeltme sonrasında SBE'ye hiçbir SMAD2 bağlanması kaydedilmemiştir.

ChIP teknolojisinin bir başka gösterimi için, STAT3 konsensüs bağlama motifleri için 5 'çevreleyen TGF-β ligand geni bölgesini analiz ettik 5'-TT (N4) AA-3 've 5'-TT (N5) AA-3' 15 . -4384 / -4373 (STB-1) ve -5365 / -5357 (STB-2) pozisyonlarında TGFB başlangıç ​​kodonunun akış yukarıında iki varsayılan STAT3 bağlanma bölgesi tespit ettik ( Şekil 2A ). STAT3'ün TGF-β ligandı genine TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını doğrulamak için, TGF-β1 ile muamele edilmiş HepG2 ve Hep3B hücreleri kullanılarak ChIP tahlillerini gerçekleştirdik. TGF-β1 tedavisi, STAT3'ün, TGFB geninin ikinci varsayılan STAT3 bağlanma alanına (STB-2) bağlandığına, fakat birincisine (STB-1) değil ( Şekil 2B ) bağlandı. Bu örnekte, STB-2'ye bağlanan pozitif STAT3, bir dahili pozitif kontrol görevi görür. Yukarıdaki ChIP deneyine benzer şekilde, STB-2'ye bağlanan STAT3, IgG kullanılarak immüno çöktürme sonrasında görülmedi.

Şekil 1
Şekil 1 Ong>: TGF-β ile indüklenen SMAD2'nin SCF Destekleyicisine Bağlanması. ( A ) Tahmini SBE'ler başlangıç ​​kodonuna göreli konumları ile kutular (beyaz kutular = AGAC) olarak gösterilen SCF destekleyicisinin şematik gösterimi. ChIP primer konumu SCF başlangıç ​​kodonuna göreli konumları ve PCR ürün boyutuyla birlikte aşağıda gösterilmiştir. ( B ) SMAD2'nin SCF yükselticisine bağlanması için çip. TGF-β1 ile muamele edilmiş ve tedavi edilmemiş HepG2 ve Hep3B hücrelerinin kromatin-protein kompleksleri, anti-SMAD2 antikoru ile immüno-çökeltildi. PCR, SCF'ye özgü primerler kullanılarak gerçekleştirildi. Solda, giriş DNA'sını kullanarak PCR sonuçları gösterilmektedir. Ortada, spesifik olmayan IgG ile immüno çöktürme sonrası PCR sonuçları, SMAD2 immüno çökeltme özgünlüğünün doğrulanması için gösterilmektedir. Alt panelde gösterilen, PAI-1'e bağlanan SMAD2 için ChIP, pozitif bir kontrol olarak kullanılmıştır.Ge.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2 : TGF-β ile indüklenen STAT3, TGF-β Gene Bağlanır. ( A ) Tespit STAT3 bağlanma sahaları başlangıç ​​kodonuna göreli konumu ile gri kutular olarak gösterilen TGF-β geninin şeması. ChIP primer konumları, TGF-β başlangıç ​​kodonuna görece pozisyonları ve aşağıda gösterilen PCR ürün boyutlarıyla birlikte gösterilir. ( B ) TGF-β1 ile indüklenen STAT3'ün TGF-β genine bağlanması için çip. TGF-β1 ile muamele edilmiş ve tedavi edilmemiş HepG2 ve Hep3B hücrelerinin kromatin-protein kompleksleri, anti-STAT3 antikoru ile immüno-çökeltildi. PCR, TGF-β-spesifik primerler kullanılarak gerçekleştirildi. Solda, giriş DNA'sını kullanarak PCR sonuçları gösterilmektedir. Ortada, PCRSpesifik olmayan IgG ile imüno-çökelmeden sonra elde edilen sonuçlar, STAT3 immüno çökeltme özgünlüğünün doğrulanması için gösterilir. Üst panel, STAT3 bağlanma bölgesi 1 (STB-1) için spesifik olan primerler kullanılarak PCR sonuçlarını göstermektedir ve alt panel, STAT3 bağlanma bölgesi 2'ye (STB-2) STAT3 bağlanması için sonuçları göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu raporda SMAD2'nin c-KIT ligand yükselticisindeki bir SBE'ye TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını ve STAT3'ün TGF-β1 ligand geni içindeki tanıma dizisine TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz. Kromatin immüno çökeltme yöntemini kullanarak her iki transkripsiyon faktörünün sitokinle indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz.

Kromatin immüno çökeltme, bir proteinin DNA'ya doğrudan bağlanmasını, protein ile DNA'nın bağlanmasını sağlayan uyarıların karakterize edilmesi ve proteinin bağlandığı DNA sekansının karakterize edilmesi için güçlü bir araçtır. Son bilgiler, ilgilenilen belirli bir protein tarafından düzenlenen genlerin tanımlanmasında yardımcı olabilir ve ChIP-on-chip, ChIP-seq veya klonlama stratejileri 7 , 8 , 9 kullanılarak elde edilir . DNA-protein bağlanmasını gösteren diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında ChIP'in en önemli avantajlarından biri, EMSA veya DNase I ayak izi gibi, ChIP teknolojisinde bağlanma in vivo yakalanırken, diğerleri ile in vitro gerçekleştirilir. Dolayısıyla, ChIP, hücresel bağlamda DNA-protein bağlanmasına ilişkin fikir verirken, diğer teknikler izole bir sistemi temsil eder.

Bununla birlikte, ChIP analizi karmaşıktır, sonuçları etkileyebilecek ve optimizasyon ve deneyim gerektiren birden fazla adım içermektedir. Başarılı ChIP için kritik olan ilk adımlardan biri, çapraz bağlama adımıdır (adım 2.2). UV çapraz bağlama işlemi geri döndürülemez ve bu nedenle ChIP için uygun değildir. Formaldehit çapraz bağlanması tercih edilir, ancak formaldehit konsantrasyonu ve çapraz bağlanma süresi hem kromatin kesme ve antijen çökeltme verimliliğini etkileyebilir. Genel olarak, kesme verimliliğini arttırdığı için düşük formaldehit konsantrasyonları (% 1 w / v) ve daha kısa çapraz bağlanma süreleri (5-10 dakika) tercih edilir. Bununla birlikte, formaldehit verimli değildirProtein-protein çapraz bağlamada ve dolayısıyla doğrudan DNA 16'ya bağlanmayan proteinler için optimal değildir. Bu gibi durumlarda, ChIP, iki aşamalı bir yaklaşımla yapılabilir; burada, protein-protein çapraz bağlama ilk olarak disüksinimidil glutarat gibi çapraz bağlayıcılar, bunu takiben formaldehit aracılı DNA-protein çapraz bağlama 17 kullanılarak yapılır .

Bir sonraki kritik adım kromatin kesme işlemidir. Çalışmamızda, mikrokokal nuklez kullanarak enzimatik kesme kullandık. Enzimatik kesme, sonikasyonun DNA-protein bağını bozduğu zaman, çapraz bağlanmamış yerli ChIP (N-ChIP) için özellikle yararlıdır. N-ChIP ağırlıklı olarak histones ve histone modifikatörleri 18 analizi için kullanılır. Mikrokokal nükleaz nispeten spesifik olmayan bir endo-eksonükleaz olarak düşünülürken, dizi-spesifik bölünmeyi 19 ortaya çıkartığı gösterilmiştir. Bu, sonuca ulaşan kesimde sekansa bağımlı bir yanlılığa neden olabilirBazı gen lokuslarının aşırı temsil edilmesiyle birlikte gebelikler 20 . Sonication, dizilim yanlılığı olmaksızın rastgele boyutlu DNA parçaları oluşturur ve genellikle çapraz bağlı ChIP (X-ChIP) için tercih edilir. Bununla birlikte, sonikasyon koşulları, her bir hücre veya doku türü ve sonikatör modeli için ampirik olarak belirlenmelidir ve ortaya çıkan DNA fragmanları genellikle enzimatik kesilme 16'dan daha geniştir. Ayrıca, numunenin aşırı-sonikasyonu veya emülsiyonlaştırılması, protein denatürasyonuna ve bozunmasına bağlı olarak antikor epitoplarının kaybına neden olabilir.

İmmünopresipitasyon aşaması, ÇIP sonuçlarını büyük ölçüde etkileyebilecek bir başka kritik adımdır. Agaroz boncuklar DNA'yı spesifik olmayan bir şekilde bağlar ve ilave boncuk sayısındaki değişim, spesifik sinyal / arka plan oranını etkiler. Bu nedenle, DNA-protein numunelerine eklendiğinde agaroz boncuk "bulamaç" ı iyi askıdaki tutmak önemlidir. I için kullanılan antikor ile ilgili olarakMmuno-çökeltme, genel olarak, ChIP dereceli antikorlar kullanılmalıdır ve bunların bulunmadığı durumlarda en azından immüno-çökeltme dereceli antikorlar tercih edilmelidir. Çapraz bağlama esnasında spesifik epitoplar gizlenebilirken, poliklonal antikorlar, birçok epitopu tanıdıklarından avantajlıdır. Eklenen antikor miktarı, çökelen faktörün üzerinde olmalıdır ve bu nedenle her faktör / antikor için ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, antikor bağlanmasının dengesine ulaşma kinetiği, her bir antikor için farklı olduğundan, optimum antikor koşulları her antikor için belirlenmelidir.

Deney düzeneğinde çeşitli kontroller yapılabilir ve dahil edilmelidir. Belirli bir DNA-protein bağlama reaksiyonunun indüksiyonunun değerlendirildiği durumlarda, nihai analizde (PCR veya qRT-PCR gibi) eşit şablon DNA miktarlarını göstermek için bir giriş DNA kontrolü eklemek önemlidir. Bir antikor kontrolü gereklidir.Ilgilenilen proteinin immüno çökelmesinin özgüllüğünü teyit edin. Genellikle izotip eşleşen immünoglobülinler negatif kontroller olarak uygundur, ancak agaroz boncukları da kullanılabilir. Bazen, pozitif kontroller ChIP'in işlevsel bir deneysel akışını teyit etmek için kullanılır ve bu amaçla anti-histone antikorları sıklıkla kullanılır. Uyarım deneylerinde, tercih edilen bir pozitif kontrol, ilgili proteinin immüno-çökeltilmesi ve proteinlerin uyarılma üzerine bağlanan bilinen bir DNA bölgesi için daha sonra dizi analizi ile ilgilidir. Temsili sonuçlarımızda, PAI-1 yükselticisindeki SBE, TGF-β1 ile indüklenen SMAD bağlanması için bilinen bir hedef olarak kullanılmıştır. Uyarılmış protein bağlaması olmayan deneylerde, ilgi protein için bir hedef olmadığı bilinen bir DNA sekansı sonraki DNA analizi için kullanılabilir. DNA analizi ile ilgili olarak, kirliliği gidermek için şablon DNA içermeyen bir reaksiyonun dahil edilmesi önemlidir.

ChIP, ilgi konusu bir proteinin bir gene bağlanmasını doğrudan göstermek için mükemmel bir tekniktir. Bununla birlikte, bu fonksiyonel bir çalışma değildir. İlgili bir proteinin düzenleyici bir role sahip olduğu düşünülen vakalarda raportör genine dayalı tahliller ( örneğin lusiferaz) gibi işlevsel tahliller yapmak da zorunludur. Bu protokollerde, ilgi geni bir raportör genin düzenleyici bir konumda klonlanır. İlgili genin indüksiyonu, eğer düzenleyici bir işleve sahipse, muhabir geninin ekspresyonuyla sonuçlanır. İlgili spesifik proteinin düzenleyici rolünün daha fazla teyit edilmesi için, DNA bağlayıcı proteinin genetik olarak susturulduğu, ya knock-down ya da knock-in hücreleri üretilebilir. İlave bir kontrol olarak, düzenleyici gen içerisindeki protein bağlama bölgesi, ilgi proteininin bağlanmasını önlemek için mutasyona uğratılabilir. Son iki deneysel tasarımın her ikisinde de, hücre uyarımı işaretçinin ifade edilmesine neden olmaz gene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Texas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi, Houston, TX (başlangıç ​​fonları, BB) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81, (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5, (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13, (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3, (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21, (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16, (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19, (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18, (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94, (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92, (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1, (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9, (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5, (12), 15754 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics