En metode for å teste effekten av miljøvennlige påkjenningshendelser i
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi demonstrerer en analyse for å analysere de miljømessige og genetiske signaler som påvirker parringsadferd i fruktflugten Drosophila melanogaster .

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gorter, J. A., Billeter, J. C. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En persons seksuelle kjøring påvirkes av genotype, erfaring og miljøforhold. Hvordan disse faktorene samhandler for å modulere seksuell oppførsel forblir dårlig forstått. I Drosophila melanogaster påvirker miljømessige signaler, for eksempel mattilgjengelighet, parring, som tilbyr et tett system for å undersøke mekanismene som modulerer seksuell oppførsel. I D. melanogaster blir miljøsignaler ofte registrert via kjemosensoriske gustatory og olfactory systemer. Her presenterer vi en metode for å teste effekten av miljømessige kjemiske tegn på parringsadferd. Analysen består av en liten parringsarena som inneholder matmedium og parringspar. Parringsfrekvensen for hvert par overvåkes kontinuerlig i 24 timer. Her presenterer vi anvendeligheten av denne analysen for å teste miljøforbindelser fra en ekstern kilde gjennom et trykkluftsystem, samt manipulering av miljøkomponentene direkte i parringsarenaen. Den uSe et trykkluftsystem er spesielt nyttig for å teste effekten av svært flyktige forbindelser, mens manipulering av komponenter direkte i parringsarenaen kan være av betydning for å fastslå en forbindelses nærvær. Denne analysen kan tilpasses for å svare på spørsmål om påvirkning av genetiske og miljømessige tegn på parringsadferd og fecundity samt andre reproduksjonsegenskaper hos mann og kvinne.

Introduction

Reproduktiv oppførsel har vanligvis høye energikostnader, spesielt for kvinner, som produserer større gameter enn menn, og må nøye velge forholdene for å øke deres utviklingsavkom. På grunn av energikostnaden er det ikke overraskende at gjengivelse er knyttet til ernæringsmessige forhold. Dette gjelder i de fleste, om ikke alle, dyr, inkludert pattedyr, hvis pubertet kan forsinkes av underernæring, og hvis seksuell kjøring kan bli negativt påvirket av matbegrensning 1 .

Reproduksjonen av den genetiske modellorganismen Drosophila melanogaster påvirkes også av næringsbetingelsene. Males domstol på høyere nivå i nærvær av matvarer 2 , og kvinner er mer seksuelt mottakelige i nærvær av gjær, et viktig næringsstoff for eggproduksjon og avkom overlevelse 3 , 4 , 5 . DetteEvolusjonær konservert reproduktiv respons på mat gir mulighet til å studere mekanismer som forbinder miljøtilgjengelig mat til seksuell reproduksjon i en genetisk trakettbar og tidseffektiv organisme. Faktisk har arbeidet i D. melanogaster implisert insulinveien som en viktig regulator for sammenhengen mellom mat og parringsadferd 6 . Det har også vist at handlingen med parring selv forandrer matenes preferanse hos kvinner samt de tilhørende kjemosensoriske nevronene 7 , 8 , 9 .

Det er tydelig at matinnretninger påvirker reproduksjonsegenskaper i D. melanogaster . Disse effektene synes hovedsakelig å påvirke kvinner, spesielt de som allerede har parret 5 . Imidlertid, for å teste disse akutte effektene av miljøforholdene, kan analysen som er klassisk brukt for kvinnelig parringsadferdIkke være veldig egnet på grunn av lange avbrudd mellom parringsepisoder. I den klassiske remieringsanalysen mates en jomfru kvinne først med en mann, og blir umiddelbart isolert og presentert med en ny mann 24 til 48 timer senere. Denne klassiske analysen har blitt brukt med stor suksess for å identifisere komponenter av mannlig ejakulat som endrer kvinnelig oppførsel og kvinnelig respons 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Den kontinuerlige parringsanalysen som er vist her, er derfor et tillegg til klassiske parringsanalyser som kan brukes til å studere den akutte effekten av miljøforholdene på reproduksjonsadferd.

Ved hjelp av den kontinuerlige analysen for parringsadferd som forklares her, viste vi tidligere at et par fluer utsatt for gjær vil remate sEveral ganger over en 24 timers observasjonsperiode 5 , 19 , 20 , 21 , mens fluer ikke utsettes for mat, vil det bare bli remittert en gang til 5 . Dette funnet kan være lurende i lys av en stor del av D. melanogaster litteraturen som indikerer at kvinner ikke remitterer i flere dager etter en første parring (omtalt i referanser 10 , 11 ). Denne forskjellen kan imidlertid lett forklares ved analysevilkår, hvor en kvinne er isolert i en til flere dager før en ny parringsmulighet er gitt. Hvis paret ikke møtes i denne times lange observasjonsperioden, er kvinnen karakterisert som ikke mottakelig. Videre bør den høye parringsfrekvensen ikke være overraskende gitt at dataene fra villfangte fluer viser at kvinner inneholder sæd fra 4 til 6 menn i deres lagringsorganer; Dermed iDicatere at kvinner avhenger naturlig flere ganger 22 , 23 .

Her demonstrerer vi bruken av denne kontinuerlige parringsanalysen for å løse hvordan fluene samler og kombinerer informasjon om miljøforhold for å modulere parringsfrekvens. Denne analysen tillater en å teste et relativt stort antall parringpar for genetiske studier og for å teste innflytelsen fra flyktige og ikke-flyktige miljøvennlige tegn. Assayet kjører typisk i 24 timer, men kan forlenges til 48 timer, slik at testingen av syklusmiljøkilder, som lys-mørke (LD) syklusen. Vi demonstrerer denne analysen ved å teste innflytelsen fra flyktige signaler fra en gjærkultur i et trykkluftsystem i kombinasjon med tilgjengeligheten av ikke-flyktig gjærnæringsstoff i mattsubstratet.

Trykkluftsystemet pumper kontinuerlig flyktige signaler inn i en paringsarena som inneholderEt mattsubstrat og et testpar (hvis parringsadferd blir overvåket). For å ytterligere bestemme de spesifikke som gjær påvirker parring, tester vi en stor, flyktig forbindelse av gjær, nemlig eddiksyre 24 , i kombinasjon med et aminosyreinnhold som tilsvarer gjærens i mattsubstratet, i form av pepton (amino Syrer utledet fra enzymatisk fordøyelse av animalske proteiner). Sammen viser disse forsøkene hvordan effekten av miljøsignaler på dermatopførelsen av D. melanogaster kan testes med denne analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Miljøstyrt paringsboks

  1. For å sikre et kontrollert og lett å rengjøre testområdet, sett opp et kjøkkenskap av rustfritt stål på 120 cm x 64 cm x 85 cm som vist på figur 1A.
    1. Bor et hull på baksiden av skapet like under taket og fire sett med fire hull i sidene, hver med en diameter på 2 cm. Bor de to første settene med fire hull, på hver side av esken i en høyde på 7 cm fra bunnen av esken og med 12,5 cm mellom hullene. Bor de to andre settene på hver side av boksen i en høyde på 35 cm fra bunnen.
      MERK: De fire settene med fire hull er brukt til kamerakraftkabler og luftpumpe rør for å gå inn og ut av kabinettet. Hullet på baksiden brukes til strømkabler på et lysbord.
    2. Bygg et lyskort med 18 rader med 40 alternerende hvite og røde lysdioder (LED) med 2,5 cm mellomrom mellom hver lampe. Sett de hvite og røde lysdiodene i en circuiT med strømforsyning. Koble hver LED i serie med en motstand på 560 Ω, 0,25 W og 5% toleranse.
      MERK: Utslippsbølgelengdene til det røde lyset spenner fra 590-661 nm med en skarp topp ved 627 nm. Den resulterende lysintensiteten i forsøksområdet er ca 900 lux med både lys på og 90 lux med bare de røde lysene på; Dette ble målt ved hjelp av en smartphone light meter app.
    3. Fest lysplaten til toppen av kabinettet i rustfritt stål og pass strømkablene gjennom hullet på baksiden.
    4. Koble adapteren til de hvite lysdiodene til en strømstyringstimer for å tillate å slå av den hvite lysdioden under den mørke fasen av eksperimentet. Koble adapteren til det røde lyset, hvilke fluer er blinde til 25 , til en vanlig strømforsyning for å holde dem på for hele eksperimentets varighet.
    5. Fest en 110 cm og to 54 cm lange metallbeslag, hver med en bredde på 0,5 cm, til innsiden av esken i en høyde 50Cm fra bunnen av boksen. Plasser en frostet glassdiffusjonsplate (dimensjoner på 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) på disse parentesene.
    6. Legg tre lag med filterpapir (120 cm x 50 cm) mellom lysplaten og glassplaten for å diffundere lyset og begrense blending på overflaten på parringsarenaene (beskrevet i avsnitt 4). Klem to filterpapir sammen på sin lange kant på 120 cm lange trestenger ved hjelp av magneter (på siden) for å holde dem på innsiden av metallskapet; Utfør denne handlingen 3 ganger.
    7. Fest fire fans på sidene av boksen for å lage en luftstrøm som kontinuerlig venter på parringsboksen. Fest det første settet med 8 cm vifter mellom lysplaten og glassplaten, med luftinntaket på venstre side og eksos på høyre side av boksen, for å minimere oppvarming av varme generert av lysplaten.
    8. Fest det andre settet med 12 cm fans 25 cm over bunnen av kabinettet for å skape en utgående luftstrøm som ventilerer iNside av skapet og avkjøler den til en stabil 26 ° C. Fest fansen på eksossiden til en sugeslange og før luftstrømmen ut av rommet for å forhindre gjencykling av luften i skapet.
  2. Sett opp to stativ (ca 48 cm høy) montert med to klemmer, en på 28 cm og en på 30 cm fra stativets grunn. Fest et webkamera på hver av klemmene. Koble de 4 kameraene til en datamaskin som kjører overvåkingsprogramvaren.
  3. Plasser A4-ark under hvert webkamera. Bruk utrykte hvite ark eller ark med pre-nummerert rutenett på 7 av 5 firkanter med 4 cm akser for å imøtekomme parringsarenaer (beskrevet i avsnitt 4).
    MERK: Et HD-kamera med 78 ° vidvinkel og 5 millioner pixel oppløsning kan dekke et område på 21 cm x 30 cm som tilsvarer et A4-ark og skjerm mellom 20 og 35 parringsarenaer.

2. Flybearbeiding og samling

  1. Plasser 20 hanner og 20 kvinnelige vildtype Canton-SFlyr inn i flyoppdrettsflasker som inneholder 45 ml rike flysmediumsmedium (se avsnitt 3) i tre til fire dager. Overfør de samme voksne tre ganger ved først å trykke dem ned og deretter inn i friske flasker.
    1. Plasser flasker i en inkubator ved 25 ° C og 12 timer: 12 timer lys mørk syklus med lys på kl 09.00 (Zeitgeber tid (ZT) 0). En ny generasjon vil vises omtrent 10 dager senere.
  2. Bedøve de resulterende nylig lukkede fluene på karbondioksidputer i ikke mer enn 5 minutter og samle dem inn i flaskeflasker med en pensel.
    1. Samle jomfruelige (nytilhengte) hunner og jomfruer fra de vanlige Canton-S- lagerflasene i 2,5 cm x 9,5 cm flygebærende hetteglass med 6,5 ml rike flysmedium.
  3. Alder flyr i samme kjønnsgrupper med 20 flyr hver i flueoppdrett hetteglass i 5 til 8 dager ved 25 ° C og 12 timer: 12 timer lys mørk syklus og lyser kl 09:00 (ZT 0).
  4. OverfEr fluene til friske flyoppdrett hetteglass dagen før forsøket.

3. Mat Medium Preparat

  1. Klargjør 1 liter rik flymedium som følger.
    1. Hell 1 L vann fra springen i et 2 L glassbeholder med magnetisk omrøringsbjelke og legg bøkeren på en magnetisk varmeplade. Hold omrøringen av og skru oppvarmingen opp til 300 ° C til kokingstemperaturen er nådd.
      MERK: I løpet av den lange koketiden i de følgende trinnene vil en andel vann fordampe, men sammen med de tilsatte ingrediensene resulterer denne protokollen i 1 liter rik flymedium når det tilberedes ved romtemperatur på ca. 22 ° C.
    2. Slå omrøringen til 500 runder per minutt (o / min) og tilsett kokingvannet med følgende ingredienser: 10 g agar, 30 g glukose, 15 g sukrose, 15 g maisgrøt, 10 g hvetekim, 10 g sojamel, 30 g Melasse, 35 g aktiv tørr gjær. Vent til gjæren skum kraftig, og skru ned temperaturen på varmeplatenEratur til 120 ° C.
    3. Etter 10 minutter setter du kokeplaten ned til 30 ° C og la blandingen røre til den er avkjølt til 48 ° C. Overvåk temperaturen ved å sette et termometer direkte inn i maten.
    4. Oppløs 2 g p-hydroksy-benzosyremetylester (tegosept, 100%) i 10 ml 96% etanol. Tilsett dette og 5 ml 1 M propionsyre til blandingen. Rør i 3 min.
    5. Hell flymidlet til arenaene (beskrevet i avsnitt 4) for å lage et 0,3 cm tykt lag på bunnen av arenaen.
      1. Bruk en 200 ml glassbjelke til å hælde. Når eksakte mengder er viktige, bruk en 10 ml serologisk pipette.
  2. Forbered flymedium minus gjær nøyaktig som beskrevet i trinn 3.1.1 til 3.1.5, men utelat gjæren i trinn 3.1.2.
  3. Klargjør medium med agar med eller uten pepton ved å blande 10 g agar og 35 g pepton i 1 liter kokende vann og utfør trinn 3.1.4 til 3.1.5.

4. MatinG Arena forberedelse

  1. Pierce et hul ca. 0,3 cm i diameter på oversiden av en 3,5 cm x 1,0 cm plast petriskål med en oppvarmet prepareringsnål (oppvarmet til rødhet i en Bunsen-brenner). Alternativt, bruk et loddejern.
  2. Ved tilberedning av matmedium med luktforbindelser, første pipett 30 μL (1% av det endelige matmediet, f.eks. Eddiksyre iskall 100%) av ønsket forbindelse i parabolen for halvparten av eksperimentelle retter. La den andre halvparten av servantene være tom for sammenligning.
    MERK: Med oppsettet som er beskrevet her, kan maksimalt 140 arenaer testes samtidig.
  3. Bruk en 10 ml serologisk pipette, hell 3 ml matmedium på bunnen av fatet på toppen av ønsket forbindelse. Dekk det med en ost klut for å forhindre forurensning, og la mediet stivne i ca. 1 time ved romtemperatur.
  4. Legg et lokket på oppvasken og tape hver stengt på to sider. Forbered små paraffinfilmplugger for å dekke hullene tilOppvasken ved å rulle stykker av paraffinfilm i 0,2 cm tykke ruller og deretter kutte dem i 0,5 cm segmenter.

5. Gjærkultur for lukt

  1. Voks tørre aktive gjær på gjærekstraktpeptondestxtrose (YPD) agar i en 14,0 cm x 2,06 cm petriskål. Bruk hansker for å forhindre forurensning i dette trinnet.
    1. Klargjør YPD-agarplater ved å tilsette 10 g gjærekstrakt, 20 g pepton, 22 g glukose (0 (+) - glukosemonohydrat) og 15 g agar (ren) til 1 liter kokende, ultralyd vann. Lag bunnen av Petri-parabolen når alt er oppløst og oppbevares opp ned i kjøleskapet ved 4 ° C, i opptil 2 måneder.
    2. Dryss noen få korn av tørket gjær på en YPD-mediumplate, la dem oppløse seg. Stri deretter medieplaten ved hjelp av en steril sløyfe. Oppbevar platen i en 30 ° C inkubator over natten. Deretter lagre kulturen i kjøleskapet for ikke mer enn 1 uke.
  2. Forbered YPD flytende medium iN 1 liter flasker ved å tilsette 10 g gjærekstrakt, 20 g pepton, 22 g glukose (0 (+) - glukose monohydrat) og en omrøringsbjelke til 1 1 ultralitt vann.
    1. Autoklav i 25 minutter ved 120 ° C og 1 bar trykk. Deretter oppbevares flasker ved 4 ° C i opptil 2 måneder til bruk.
  3. Monter åpne flaskehettene (4,5 cm) med en 0,32 cm tykk silikonsseptum.
    1. Klipp to små hull i septumet for å passe inn i festehullene. Fest den lille polyvinylklorid (PVC) slangen (diameter: ytre 0,8 cm og innvendig 0,5 cm) til begge utløpene som går ut av flasken og til bare en av innløpene som kommer inn i flasken. Se figur 1B for illustrasjon.
    2. Pak de innvendige kappene og slangene i aluminiumsfolie og autoklav i 25 minutter ved 120 ° C og 1 bar trykk.
  4. Bruk hansker for å beskytte mot forurensning i dette trinnet. Dip en steril 100 μl pipettspiss i en av gjærkoloniene fra YPD agarplaten (dEscribed i 5.1) og slippe den inn i den autoklaverte YPD flytende medium flasken.
    1. Hett denne gjær-inokulerte YPD-væskemediumflasken, samt en YPD-medium kontrollflaske (gjær ikke tilsatt) med autoklaverte caps montert med in- og utløp (beskrevet i trinn 5.3). Sett begge flasker på separate magnetplater og rør ved 100 rpm ved romtemperatur i 24 timer før forsøkets start for å tillate gjærkulturen å vokse.
    2. Koble innløpene til begge flasker for å skille ut akvariumpumper for å gi luft til gjærkulturen. Pass på at du kobler utløpet til den eksperimentelle gjærflasken til et rør som lukker gjæren lukt ut av forsøksrommet for å hindre forstyrrelser i forsøket.

6. Luftpumpeoppsett

  1. Fest den store PVC-slangen (diameter: ytre 1,2 cm og innvendig 0,9 cm) til trykkluftforsyning og før den gjennom to 1 L glass Erlenmeyer-flasker fylt med aktivert trekull til 800 mlLinje for å rense luften. Bruk enten trykkluft som vanligvis leveres i laboratorier som luftforsyning, eller koble rørene til en luftpumpe (trykkluft ble brukt her).
    MERK: Slangematerialet bør velges ut fra de flyktige kjemiske egenskapene, og testes for å hindre at de flyktige stikker seg til foringen av slangen (f.eks. Polytetrafluoretylen, nylon eller rustfritt stål).
  2. Lag to luftklyvere fra 15 ml rør og tre 1000 μL pipettespisser hver.
    1. Lag tre hull med ~ 1 cm diameter. Først brenne to hull, ved hjelp av en oppvarmet prepareringsnål (oppvarmet rød i en Bunsen-brenner), ved siden av hverandre like under lokket på 15 ml rør. Deretter gjør du det tredje hullet ved å fjerne bunnen av røret.
    2. Lim 1000 l pipettespissene inn i hullene med den smale enden som peker utover. Kutt enden av pipettespissene for å gi større luftstrøm.
  3. Koble den store PVC-slangen fra utløpet på cKullfylt Erlenmeyer-kolbe til pipettespissen på bunnen av 15 ml rør. Legg små PVC-røruttak til de to horisontale pipettespissene og før dem mot en kontroll og en eksperimentell flaske.
  4. For å hindre forurensning av YPD-mediet med mikroorganismer, fest det lille slangen til et sterilt sprøytefilter (0,45 μm porestørrelse) med en plastdrykk på skottkontakt som går mot filteret, og en skrue på plastskottkontakt som forlater filteret. Fest deretter slangen til innløpet til YPD-kulturflasken (se figur 1B ).
  5. For å hindre at luftbåren gjær går fra kulturkolven til forsøksarenaen, fest et glassrør (6,5 cm lang, ytre diameter = 0,5 cm og innerdiameter = 0,3 cm) til utløpet av hver YPD-kulturflaske ved hjelp av små rør. Fest PVC-rør til den andre siden av glassrøret og før dette mot de nedre hullene (boret på hver side) av eksperimentboksen.
    1. Fyll røret med glassfiber og autoklaver det før bruk.
  6. Legg til en annen 15 ml rørdeler (beskrevet i avsnitt 6.2) til den lille PVC-slangen på hver side av forsøkskassen for å få to rør som løper inn i esken på begge forsøkssiden (nærmest eksos av luftstrømmen til høyre) Og kontrollsiden (nærmest innløpet til vifterluftstrømmen, venstre).
  7. Forbered 8x 25 ml serologiske pipetter hver med 10 uttak for å teste 80 parringspar på samme tid, dvs. 40 for hver luftkondisjonering.
    1. Brenn 10 hull med 0,8 cm diameter, 2 cm fra hverandre i pipetten.
    2. Klipp den ytre delen av en 1 ml sprøyte i en liten (2,5 cm) og en stor (5 cm) utgang.
    3. Lim disse utløpene i hullene med varmt lim.
    4. Fest et lite bånd av plastparafinfilm rundt enden av utløpene og fest en 1000 μL pipettespiss. Spissåpningens diameter er 0,1 cm. Bruk rene tips for hvert eksperiment.
    5. Fest to serologiske pipetter ved hjelp av en T-splitter med ytre diameter ≥0,5 cm og korte stykker små PVC-rør, til hver av de to uttakene på begge sider. Tør pipettene flatt på hvitpapirarket (under kameraene i stålboksen).
    6. Ved hjelp av en luftstrømmonitor må du stille luftstrømmen slik at lufthastigheten ved utgangen av 1000 μL pipettespissen er 0,5 m / s. Dette tilsvarer en luftstrøm på 0,0017 l / s per spiss.

    7. Overvåking av parringsoppførsel

    1. Bruk en munnpipette (som beskrevet i referanse 26 ) for å plassere en eksperimentell kvinne i en liten petriskål (beskrevet i seksjon 4) klokka 15:00 (ZT 6) og gi henne 1 h for å akklimatisere til parringsarenaen.
    2. Sett opp forsøkskassen (beskrevet i avsnitt 1) ​​som følger:
      1. Slå på lysene, det vil si hvite lysdioder på en 12 h: 12 timers lys mørk syklus koblet til en tidtaker som slår påLys kl 09:00 (ZT0) og kontinuerlig rødt lysdioder for å tillate overvåking av fluene i den mørke fasen av eksperimentet. Slå på vifter for å begrense oppvarming av kabinettet med lyskilde og for å sikre at overflødig lukt utluftes utenfor testområdet.
      2. Koble kamerakameraer til en datamaskin og start dem med overvåkingsprogramvaren for bildeovervåking.
      3. For hvert kamera, still inn fokus, lysstyrke og zoom inn i overvåkingsprogramvaren.
        1. Høyreklikk på kameraskjermen, åpne "kameraegenskaper" og unclick "automatisk fokus." Juster "fokus" for å avklare av rutenettet eller noen skriftlige ord på papirarket. Om nødvendig, endre "lysstyrke" og "zoom".
      4. Sett programmet til overvåkingsprogramvaren for å fange 1 bilde hver 2. minutt. Høyreklikk på hver kameraskjerm og velg "rediger kamera" og deretter "Handlinger" -alternativet. Klikk for å starte handlingene "Ved vanlig intErvals "og endre tiden til" 2 minutter. "Velg" Ta bilde "for å velge utførte handlinger og til slutt klikke på" ok ".
      5. Høyreklikk på hvert kameraskjerm og velg "start overvåking."
    3. Etter 1 time (ved ZT 7), overfør en wildtype-mann til Petri-parabolen ved å bruke munnpipetten, plasser parabolen på A4-arkene under webkameraets kameraer, og klikk på "startovervåkning" i 24 timer. For luftpumpeksperimentet plasserer du parabolen på en slik måte at et pipettuttak er koblet til inngangshullet på parringsarenaen.
    4. For å analysere parrets parreferd, gjør du følgende.
      1. Velg og åpne alle bilder i et bildevisningsprogram og bla gjennom dem i kronologisk rekkefølge.
      2. Skriv ned datoen, eksperimentnummer, tallerkenummer og starttid i et regneark innenfor samme rad. Ta starttidspunktet for hver arena fra det øyeblikket den er plassert under webcaM kamera. Ta opp tidsstempelet fra bildene.
      3. Merk starttidspunktet for hver kopiering i samme rad i regnearket. Telle en parring som en hendelse når hannen har montert kvinnen, og paret forblir moderat stasjonært og i samme stilling i minst fem påfølgende rammer (10 min).
        MERK: Dette kriteriet er basert på den rapporterte lengden av kopiering, fra 12 til 27 minutter i D. melanogaster , og observasjonen at kopuleringer på 10 min og over er friske 27 , 28 .
      4. Telle antall kopuleringer for hver rad i regnearket for å bestemme parringsfrekvensen. Alternativt, trekk starttidspunktet for eksperimentet fra tidspunktet for første parring for hver rad som et mål for parrings latens, eller trekk tiden fra den første parringen fra tidspunktet for den andre parring som et mål for å remittere latens.
        1. For å beregne tilbakevendende ventetid må du sørge forDefiner datoene for den første og den andre paringen som påfølgende dager i regnearkprogramvaren.
      5. Analyser dataene med blandede effekter-modeller, forutsatt normal distribusjon av dataene og inkludert datoen for eksperimentet som en tilfeldig faktor, ved hjelp av en statistisk programvare (se materialetabellen) for å bestemme statistisk signifikans av de uavhengige variablene-matmediet, Lufttype og interaksjon-som tidligere beskrevet 5 .
      6. Velg den beste forklaringsmodellen ved å utføre bakover eliminering av ikke-signifikante uavhengige variabler ved bruk av log-sannsynlighetstest-tester og tilhørende Akaike-informasjon. Etter at du har kjørt modellen, må du undersøke dataresiduene visuelt for å bekrefte normaliteten. Bekreft homogeniteten av avvik ved bruk av Levene testen. I tilfelle ujevn homogenitet transformerer kvadratroten dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved bruk av denne kontinuerlige analysen, parringsadferd og parringsfrekvensen i spesifikk, kan bestemmes under eksperimentelle miljøforhold. For å kontrollere miljøforholdene forvandlet vi et kjøkkenskap i rustfritt stål til et testområde med egen lyskilde og diffusjon, noe som sikrer en høy overflod av lys og en minimal glans fra toppen av parringsarenaene ( Figur 1A ) . Det indre testområdet er helt innkapslet av rustfritt stål og glass, noe som gjør det mulig å rengjøre med organiske løsemidler, som heksan eller etanol. I tillegg er kabinettet utstyrt med hull som fungerer som innløp for slanger, og gir flyktige signaler fra trykkluftsystemet (se figurene 1A og 1B ). Trykket luftanlegg, justert for gjær lukt, består av en luftstrøm styrt gjennom en flytende gjærkultur før du kommer inn i testarenaene gjennom 4 pipettsplittere med10 uttak hver ( figur 1C ). Hele systemet er lufttett og utstyrt med flere partikkelfiltre, både før og etter inngangen av gjærkulturen, for å minimere forurensning med forstyrrende lukt ( figur 1B ).

For å demonstrere bruken av denne analysen, testet vi om volatile signaler fra en gjærkultur kan påvirke parringsadferd. Luft ble boblet gjennom en flytende gjærkultur i 24 timer, og luftutløpene ble plassert i inngangen til hver parringsarena (se figur 2A ). Halvparten av parringsarenaene inneholder fly med gjær (mat + gjær), og den andre halvdelen inneholder flymat uten gjær tilsatt (mat - gjær). En wildtype mann og kvinne ble utsatt for luktene som kommer fra den eksterne gjærkulturen, og deres parringsfrekvens ble registrert. For å finne ut hvilke variabler som er nødvendige for å forklare de grafiske resultatene, kjørte vi blandingseffekter, enten inkludert eller ekskludertDe uavhengige variablene av matmedium, gjærluft og en interaksjon av de to. Dataene i figur 2B er best representert ved en modell som inkluderer de uavhengige variablene av matmedium (p = 0,001) og gjærluft (p = 0,061), men det er ingen forklarende interaksjonseffekt. Selv om gjærluftvariabelen ikke er signifikant i dette fulle datasettet, er det nødvendig å forklare resultatene. Analyse av gjærluft separert for matmedium viser at et paringspar ikke reagerer på gjærlukt når det ikke finnes gjær i matmediet (luft: p = 0,992), men de øker deres parringsfrekvens i gjærluft når gjær er Også lagt til matmediet (luft: p = 0,018). Sammen viser disse resultatene anvendeligheten av trykkluftsystemet for å teste innvirkningen av miljø lukt i kombinasjon med mat medium forhold.

Vi illustrerer også hvordan trykkluftsystemet kan være bypAnse ved å legge miljømessige kjemiske tegn direkte til testarenaen. For å demonstrere hvilke spesifikke gjærforbindelser som påvirker parringsfrekvensen, testet vi hypotesen om at aminosyreinnholdet av gjær er nødvendig for dets virkning på parring ved å plassere en dose av pepton (hydrolyserte proteiner) som tilsvarer aminosyrene som tilføres av gjæren i agar Substrat lining parringsarenaen. Vi testet også nødvendigheten av eddiksyre, en av de store flyktige fermenteringsprodukter av gjær, for å øke parringsfrekvensen. Dette ble gjort ved å tilsette eddiksyre direkte til matmediet. En wildtype mann og kvinne ble testet i arenaer som inneholder agar eller agar med pepton, med eller uten eddiksyre direkte i matmediet ( figur 3B ). Dette gir et veldig enkelt mat medium og et dårlig miljø; Derfor blir den gjennomsnittlige parringsfrekvensen også redusert sammenlignet med figur 2B. Dataene i figur 3B er best representert ved en modell som inkludererUavhengige variabler av matmedium (p = 0,002), eddiksyreluft (p = 0,001), og samspillet mellom de to (p = 0,022). Kvinnelig mottakelse øker ved tilstedeværelse av eddiksyre, men bare i tilstanden der pepton er tilstede i mediet. Dette viser at fluer må samtidig anta aminosyrer og eddiksyre for å øke parringsfrekvensen ( figur 3B ). Dette viser at tilsetning av luktstoffer direkte til testarena kan påvirke parringsadferd, og at disse påvirkninger kan påvises under svært enkle miljøforhold.

Figur 1
Figur 1: Diagram over forsøkskassen og trykkluftsystem med gjær. ( A ) Skjematisk illustrasjon av den miljøstyrte parringsboksen beskrevet i avsnitt 1. Beskrivelse av de merkede tallene og pilene: 1. Lysbord med al Ternating hvite og røde lys; 2. liten fan; 3. 3 lag filterpapir, hvert lag bestående av to filterpapirark; 4. glassdiffusjonsplate hviler på braketter festet til 3 sider av boksen; 5. stor fan; 6. hull for slanger og kabler; 7. eksperimentelt område Stor pil, 50 cm til glassplaten; Midtpil, 35 cm høyde for kabelhullene; Og liten pil, 7 cm høyde for rørhullene. ( B ) Skjematisk illustrasjon av flytende gjærkultur med luftstrøm, som beskrevet i seksjonene 5, 6.4 og 6.5. Beskrivelse av de merkede tallene: 1. Engangsfilterenhet; 2. hette med silikon septum og ut- og innløp; 3. flytende medium; Og 4. glassrør med glassfiber. ( C ) Skjematisk illustrasjon av luftutløpene som beskrevet i seksjon 6.7. Beskrivelse av de merkede tallene: 1. serologisk pipette; 2. slange kuttet fra 1 ml sprøyte og 3. 1000 μL pipettespiss.Target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Gjær lukt øker kvinnelig mottakelighet i nærvær av gjær i mattsubstratet. ( A ) Skjematisk illustrasjon av en parringsarena med en mann og en kvinne og en pipettspiss fra luftutløpet i figur 1C som kommer inn gjennom inngangshullet. ( B ) Grafisk presentasjon av responsen i parringsfrekvensen av et Canton-S parringspar til gjærlukt med og uten gjær i flysmediet (Mat - gjær: medium luft n = 12, gjærluft n = 13 og mat + gjær : Medium luft n = 24, gjærluft n = 23). Linjediagram med SEM-feilstenger og statistisk utgang av blandede effekter modeller med luft som den uavhengige variabelen og datoen som en tilfeldig variabel for hvert matmedium uavhengig. HovedstatistikkenL-modellen inkluderer mat (p = 0,001) og gjærluft (p = 0,061). Tilpasset fra referanse 5 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Eddiksyre i flymattsubstrat øker kvinnelig mottakelighet i nærvær av pepton. ( A ) Skjematisk illustrasjon av en parringsarena, med flymatmedium inneholdende eddiksyre og en plastparafinfilmplugg som lukker inngangshullet. ( B ) En grafisk presentasjon av parringsfrekvensen til et kanton-S parringspar som svar på eddiksyre enten på agar eller peptonmedium (agar: eddiksyre n = 52, + eddiksyre n = 40 og pepton: eddiksyre N = 28, + eddiksyre n = 25). Linjediagram med SEM-feilstenger og statiStisk produksjon av blandingseffektmodellen med matmedium (p = 0,002), eddiksyreluft (p = 0,001) og mat * luft (p = 0,022) som uavhengige variabler og datoen som en tilfeldig variabel. Tilpasset fra referanse 5 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en test for å teste parringsadferd i løpet av 24 timer, mens du kontinuerlig kontrollerer de miljømessige tegnene som et parringpar er hypotetisert til å bestemme parringsfrekvensen. Det er mulig å øke parringsfrekvensen som svar på gjærluft levert gjennom et trykkluftsystem når mediet inneholder gjær også ( figur 2B ). I tillegg kan en lignende respons i parringsfrekvens observert med et forenklet matmedium som bare inneholder agar-, pepton- og eddiksyre lukt direkte i mediet ( figur 3B )

Med forsøkene som er demonstrert her, kan det kun trekkes konklusjoner om parets generelle parringsadferd, siden begge kjønnene er utsatt for de samme miljøforholdene. Imidlertid vet vi fra tidligere undersøkelser at 47% av variasjonen i parringsfrekvensen bestemmes av kvinnen, mens det mannlige bidraget bare utgjør 11% av variasjonen20 . Derfor er de fleste endringene i parringsfrekvens observert sannsynligvis et resultat av kvinnelig seksuell mottakelighet. Økt mannlig domstol stiller fortsatt kvinnen til å akseptere eller avvise parring, da voksne D. melanogaster kvinner kan lykkes med å avlede parringsforsøk 29 . For faste konklusjoner og spesifikt å tildele forskjeller i parringsfrekvens til kvinnelig seksuell mottakelighet, er det nødvendig å teste ytterligere parringspar hvor kvinnens genotype er variert, men den av hannen holdes konstant.

Denne protokollen har vist to måter å levere luktstoffer til parring, enten med trykkluftsystem eller direkte inn i matmediet. Trykkluftsystemet har fordelen at enhver effekt kan tilskrives forbindelsene som blir levert gjennom luften, mens dette ikke kan konkluderes når forbindelsene blir satt direkte inn i matmediet. På den annen side, wHøne ingen effekt er funnet med trykkluftsystemet, betyr det ikke automatisk at køen ikke påvirker oppførselen. Det kan også bety at forbindelsen ikke er effektivt levert gjennom trykkluftsystemet. Luftens sammensetning ved utløpet til lufttilførselssystemet kan analyseres ved å plassere et hydrokarbonfilter og analysere fanget luftinnhold med gaskromatografi koblet med massespektrometri. Trykkluftsystemet er et godt test for å teste forbindelser som lett kan gjøres luftbårne over et lengre område. Mindre flyktige forbindelser må kanskje settes direkte inn i matmediet. En annen ulempe med trykkluftsystemet er effekten lufthastigheten kan ha på flyvirkemåten. Fluer slutter å bevege seg når lufthastigheten er for høy (over 0,7-1,6 m / s) 30 . I tillegg kan trykkluftsystemet gjøre et enkelt miljø av lav kvalitet uutholdelig ved å tørke ut matmediet. I begge tilfeller kan flyene ikke perfeksjonereOrm like bra, og ingen konklusjoner kan da tilskrives de spesifikke testede forbindelsene.

Flere trinn er essensielle under forberedelse for optimal kjøring av disse analysene. Det første trinnet som krever oppmerksomhet er utarbeidelse av mediet. Det er viktig at mediet, inkludert luktede, flyktige forbindelser som eddiksyre, fremstilles på forsøksdagen og ikke før for å unngå fordampning. Også mediumet må herdes på en overflate uten ekstra luftstrøm (unngå å bruke avtrekksvifter for dette), fordi luftstrømmen kan stimulere fordamperen av lukten. Det andre trinnet som krever spesiell omsorg er etableringen av trykkluftsystemet. Luftstrømmen må være høy nok til å forsiktig boble gjærkulturen uten å overføre noe væske til arenaen.

Denne protokollen demonstrerer en atferdsanalyse med gjærluk i kombinasjon med parringsadferd. Dette systemet kan imidlertid brukes til noenType lukt, så vel som andre typer oppførsel. For å bruke dette systemet for andre lukt, er det nødvendig å justere luftstrøm og luktmedium for å optimalisere overføringen av forbindelsene til oppvaskene. Imidlertid kan alle forbindelser som kan overføres med luft generelt testes med dette systemet. I tillegg kan enhver type oppførsel, både hos menn og kvinner, testes, enten ved å bruke samme type retter eller ved å justere slangen for å nå og koble til større eller mindre testområder. I tillegg, når mer detaljerte atferd blir testet, må rammene og resolusjonene til kameraene som brukes, omprøves. I alle fall, hvis begge forsøk med og uten test lukt drives samtidig og med samme luftkilde, kan det oppdages noe respons på miljøet, uavhengig av endringer i trykk eller konsentrasjon fra ett eksperiment til det andre. Til slutt kan analysen vist her bli utvidet i minst en annen LD-syklus (opptil 48 timer), så lenge fOodtilførselen tørker ikke ut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.

Acknowledgements

Vi takker Bloomington Drosophila Stock Center for flybestandene; C. Gahr, JT Alkema og S. van Hasselt for deres tidlige forsøk på å utvikle trykkluftanalysen; Jasper Bosman for råd om dyrking av gjær; Og Rezza Azanchi og Joel Levine for å opprinnelig utvikle tidsavbruddskontrollen av Drosophila parringsadferd. JA Gorter ble støttet av et stipendiat for stipendiat fra Neuroscience Research School BCN / NWO. Dette arbeidet ble delvis støttet av den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO) (referanse: 821.02.020) til JC Billeter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85, (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42, (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23, (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278, (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25, (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14, (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56, (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100, (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3, (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451, (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61, (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61, (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280, (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279, (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79, (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26, (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35, (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011, (2), 5575 (2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155, (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276, (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84, (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457, (7235), 201-205 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics