Un metodo per testare l 'effetto dei segnali ambientali sul comportamento di accoppiamento in

Behavior

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Summary

Noi dimostriamo un dosaggio per analizzare i suggerimenti ambientali e genetici che influenzano il comportamento di accoppiamento nella mosca di frutta Drosophila melanogaster .

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Gorter, J. A., Billeter, J. C. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

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Abstract

L'azionamento sessuale di un individuo è influenzato dal genotipo, dall'esperienza e dalle condizioni ambientali. Come questi fattori interagiscono per modulare i comportamenti sessuali rimane poco compreso. In Drosophila melanogaster , i segnali ambientali, come la disponibilità di cibo, influenzano l'attività di accoppiamento che offre un sistema tracciato per indagare i meccanismi che modulano il comportamento sessuale. In D. melanogaster , i segnali ambientali vengono spesso rilevati attraverso i sistemi gassosi e olfattivi chemosensoriali. Qui espostiamo un metodo per testare l'effetto dei segnali chimici ambientali sul comportamento dell'accoppiamento. Il dosaggio è costituito da una piccola arena di accoppiamento contenente un mezzo alimentare e una coppia di accoppiamenti. La frequenza di accoppiamento per ogni coppia viene monitorata continuamente per 24 ore. Qui esprimiamo l'applicabilità di questo test per testare i composti ambientali da una sorgente esterna attraverso un sistema di aria compressa e la manipolazione dei componenti ambientali direttamente nell'arena di accoppiamento. L'uSe di un sistema di aria compressa è particolarmente utile per testare l'effetto di composti molto volatili, mentre manipolazione di componenti direttamente nell'arena di accoppiamento può essere utile per accertare la presenza di un composto. Questo saggio può essere adattato per rispondere a domande sull'influenza delle indicazioni genetiche e ambientali sul comportamento e sulla fecondità di accoppiamento e su altri comportamenti riproduttivi maschi e femmine.

Introduction

I comportamenti riproduttivi hanno generalmente elevati costi energetici, soprattutto per le femmine, che producono gameti più grandi rispetto ai maschi e devono scegliere con cura le condizioni per aumentare la loro prole in via di sviluppo. A causa del costo energetico, non sorprende che la riproduzione sia connessa alle condizioni nutrizionali. Questo è vero nella maggior parte, se non in tutti, animali compresi i mammiferi, la cui pubertà può essere ritardata dalla malnutrizione e il cui comportamento sessuale può essere influenzato negativamente dalla restrizione alimentare 1 .

La riproduzione dell'organismo del modello genetico Drosophila melanogaster è anche influenzata da condizioni nutrizionali. La corte dei maschi a livello più elevato in presenza di volatili alimentari 2 e le femmine sono più ricettive sessualmente in presenza di lieviti, un importante nutrimento per la produzione di uova e la sopravvivenza dei figli 3 , 4 , 5 . QuestoLa risposta riproduttiva evoluzionistica riposta all'alimentazione offre l'opportunità di studiare meccanismi che connettono la disponibilità di cibo ambientale alla riproduzione sessuale in un organismo geneticamente tractable e time-efficient. Infatti, il lavoro in D. melanogaster ha implicato il percorso dell'insulina come un importante regolatore della connessione tra il comportamento alimentare e l'accoppiamento 6 . Ha anche dimostrato che l'atto di accoppiamento modifica la preferenza alimentare delle femmine nonché i neuroni chemiosensori associati 7 , 8 , 9 .

È chiaro che le indicazioni alimentari influenzano i comportamenti riproduttivi in D. melanogaster . Questi effetti sembrano interessare principalmente le femmine, in particolare quelle che hanno già maturato 5 . Tuttavia, per testare questi effetti acuti delle condizioni ambientali, il dosaggio classico utilizzato per il comportamento femminile di accoppiamento potrebbeNon essere molto adatto a causa delle lunghe interruzioni tra gli episodi di accoppiamento. Nel classico test di rimozione, una femmina vergine prima si collega con un maschio e viene immediatamente isolata e presentata con un nuovo maschio 24-48 h più tardi. Questo saggio classico è stato usato con grande successo per identificare componenti dell'eiaculato maschile che modificano il comportamento femminile e la risposta femminile 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Il test di accoppiamento continuo dimostrato qui è quindi un'aggiunta a saggi classici di accoppiamento che possono essere utilizzati per studiare l'effetto acuto delle condizioni ambientali sui comportamenti riproduttivi.

Utilizzando il dosaggio continuo per il comportamento di accoppiamento che viene spiegato qui, abbiamo precedentemente mostrato che una coppia di mosche esposte al lievito rimateràSempre in un periodo di osservazione di 24 ore 5 , 19 , 20 , 21 , mentre mosche non esposte al cibo rimarrà solo una volta 5 . Questa scoperta può essere sconcertante alla luce di una grande parte della letteratura D. melanogaster che indica che le femmine non si ritraggono per diversi giorni dopo un accoppiamento iniziale (riveduto nei riferimenti 10 , 11 ). Tuttavia, questa discrepanza può essere facilmente spiegata da condizioni di analisi, in cui una femmina è isolata per uno a diversi giorni prima di fornire una nuova opportunità di accoppiamento. Se la coppia non si accoppia in questo periodo di osservazione, la donna è caratterizzata come non ricettivo. Inoltre, la frequenza di accoppiamento elevato non dovrebbe sorprendere, dato che i dati provenienti da mosche selvatiche mostrano che le femmine contengono spermatozoi da 4 a 6 maschi nei loro organi di stoccaggio; Così inDicating che le femmine naturalmente rimane diverse volte 22 , 23 .

Qui dimostriamo l'uso di questo saggio di accoppiamento continuo per scoprire come le mosche raccolgono e combinano informazioni sulle condizioni ambientali per modulare la frequenza di accoppiamento. Questo test consente di testare un numero relativamente elevato di coppie di maternità per studi genetici e di verificare l'influenza dei segnali ambientali volatili e non volatili. Il dosaggio viene tipicamente eseguito per 24 h, ma può essere esteso a 48 h, consentendo la sperimentazione di segnali ambientali di ciclo come il ciclo scuro (LD). Ci dimostriamo questo test verificando l'influenza dei segnali volatili da una coltura di lieviti all'interno di un sistema di aria pressurata in combinazione con la disponibilità di nutrienti di lievito non volatili nel substrato alimentare.

L'impianto a pressione pressurizzata pompava continuamente segnali volatili in un'arena di accoppiamento che contengonoSubstrato alimentare e una coppia di test (il cui comportamento di accoppiamento è monitorato). Per determinare ulteriormente le specificità attraverso le quali il lievito influenza l'accoppiamento, si prova un importante composto volatile di lievito, cioè acido acetico 24 , in combinazione con un contenuto di amminoacidi che corrisponde a quello del lievito nel substrato alimentare, sotto forma di peptone (amino Acidi derivati ​​dalla digestione enzimatica delle proteine ​​animali). Insieme questi esperimenti dimostrano come l'effetto dei segnali ambientali sul comportamento di accoppiamento di D. melanogaster possa essere testato con questo saggio.

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Protocol

1. Contenitore di accoppiamento controllato dall'ambiente

  1. Per garantire un'area di prova controllata e facile da pulire, installare un mobile da cucina in acciaio inox di 120 cm x 64 cm x 85 cm come illustrato nella figura 1A.
    1. Praticare un foro sul retro dell'armadio appena sotto il soffitto e quattro set di quattro fori nei lati, ognuno con un diametro di 2 cm. Praticare i primi due set di quattro fori, su ciascun lato della scatola ad un'altezza di 7 cm dal fondo della scatola e con 12,5 cm tra i fori. Praticare gli altri due set su ciascun lato della scatola ad un'altezza di 35 cm dal fondo.
      NOTA: i quattro gruppi di quattro fori vengono utilizzati per i cavi di alimentazione della fotocamera e per la tubazione della pompa dell'aria per entrare e uscire dall'armadio. Il foro sul retro è utilizzato per i cavi di alimentazione di una scheda di luce.
    2. Costruisci una tavola luminosa con 18 righe di 40 diodi auricolari bianchi e rossi alternati (LED) con spazio di 2,5 cm tra ciascuna luce. Misurare i LED bianchi e rossi in un circuiT con alimentazione. Collegare ciascun LED in serie con una resistenza di tolleranza da 560 Ω, 0,25W e 5%.
      NOTA: Le lunghezze d'onda di emissione della luce rossa si estendevano da 590 a 661 nm con un picco acuto a 627 nm. L'intensità luminosa risultante nell'area sperimentale è di circa 900 lux con entrambe le luci accese e 90 lux con solo le luci rosse accese; Questo è stato misurato usando un app.
    3. Fissare la scheda di luce alla parte superiore dell'armadio in acciaio inox e passare i cavi di alimentazione attraverso il foro sul retro.
    4. Collegare l'adattatore dei LED bianchi a un timer di controllo della potenza per consentire l'interruzione del LED bianco durante la fase scura dell'esperimento. Collegare l'adattatore della luce rossa, che vola ciechi a 25 , ad un normale alimentatore per mantenerli in funzione per tutta la durata dell'esperimento.
    5. Fissare una staffa di 110 cm e due staffe di metallo di 54 cm ciascuna con una larghezza di 0,5 cm ai lati interni della scatola ad un'altezza di 50Cm dal fondo della scatola. Posizionare una piastra di diffusione in vetro satinato (dimensioni 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) su queste staffe.
    6. Aggiungere tre strati di carta filtrante (120 cm x 50 cm) tra la lastra di luce e la lastra di vetro per diffondere la luce e il limite di limite sulla superficie delle arene di accoppiamento (descritto nella sezione 4). Applicare due fogli di carta filtranti lungo il loro bordo lungo su aste di legno di 120 cm, utilizzando magneti (laterali), per incollarli verso l'interno del mobile metallico; Eseguire questa azione 3 volte.
    7. Attaccare quattro ventole ai lati della scatola per creare un flusso d'aria che sfiora continuamente la scatola di accoppiamento. Fissare il primo set di ventole da 8 cm tra la piastra luminosa e la lastra di vetro, con l'ingresso d'aria a sinistra e lo scarico sul lato destro della scatola, per ridurre al minimo l'accumulo di calore generato dal pannello luminoso.
    8. Fissare il secondo set di ventole da 12 cm al di sopra del fondo dell'armadio per creare un flusso d'aria esteriore che sfiora l'iAll'interno dell'armadio e raffredda ad una stabile 26 ° C. Fissare i ventilatori sul lato di scarico ad un tubo di aspirazione e portare la corrente di aria fuori dalla stanza per impedire il riciclaggio dell'aria nell'armadio.
  2. Montare due stand (circa 48 cm di altezza) montati con due morsetti, uno a 28 cm e uno a 30 cm dalla base dello stand. Fissare una webcam su ciascuno dei morsetti. Collegare le 4 telecamere a un computer che esegue il software di monitoraggio.
  3. Posizionare fogli A4 sotto ogni webcam. Utilizzare fogli o fogli bianchi non stampati con griglia pre-numerata di 7 da 5 quadrati con assi da 4 cm per ospitare le arene di accoppiamento (descritto nella sezione 4).
    NOTA: Una fotocamera webcam HD con una visuale grandangolare a 78 ° e una risoluzione di 5 milioni di pixel può coprire un'area di 21 cm x 30 cm corrispondente a un foglio A4 e un monitor tra 20 e 35 arene di accoppiamento.

2. Lascia la presa e la raccolta

  1. Inserire 20 maschi e 20 femmine Wild-type Canton-SVola in bottiglie di allevamento a volo che contengono 45 ml di alimenti a base di volatili ricchi (vedi sezione 3) per tre o quattro giorni. Trasferite gli stessi adulti tre volte prima di toccarli e poi in bottiglie fresche.
    1. Posizionare le bottiglie in un incubatore a 25 ° C e 12 h: 12 ore di ciclo chiaro e scuro con le luci in ore 09:00 (Zeitgeber time (ZT) 0). Una nuova generazione apparirà circa 10 giorni dopo.
  2. Anestetizzare le nuove mosche che sono state ritagliate su pastiglie di biossido di carbonio per non più di 5 minuti e li raccolgono in flaconi alimentari a mosca usando un pennello.
    1. Raccogli le femmine vergini e le maschere vergini dalle bottiglie di Canton-S di tipo selvatico in flaconi di allevamento di 2,5 cm x 9,5 cm con 6,5 ml di mezzo di alimenti di volatili ricchi.
  3. Età le mosche in gruppi di stessi rapporti di 20 mosche ciascuno in flaconi di allevamento di mosca per 5 a 8 giorni a 25 ° C e 12 h: 12 h ciclo chiaro e scuro e si accende alle ore 09:00 (ZT 0).
  4. TrasfLe mosche alle fiale di allevamento di mosche fresche il giorno prima dell'esperimento.

3. Alimentazione media preparazione

  1. Preparare 1 L di mezzo di mosca ricco come segue.
    1. Versare 1 L di acqua di rubinetto in un bicchiere di vetro da 2 L con una barra magnetica di agitazione e mettere il bicchiere su una piastra calda magnetica. Tenere l 'agitazione e girare il riscaldamento fino a 300 ° C fino a raggiungere la temperatura di ebollizione.
      NOTA: Durante il lungo periodo di ebollizione nei passaggi successivi una percentuale di acqua evapora, ma insieme agli ingredienti aggiunti questo protocollo si traduce in 1 l di mezzo medio di mosca quando viene preparato a temperatura ambiente di circa 22 ° C.
    2. Accendere l'agitazione a 500 rotoli per minuto (giri / min) e aggiungere all'acqua bollente i seguenti ingredienti: 10 g di agar, 30 g di glucosio, 15 g di saccarosio, 15 g di farina di granturco, 10 g di germe di grano, 10 g di farina di soia, 30 g Melassa, 35 g lievito secco attivo. Attendere che il lievito si schiuma vigorosamente, quindi abbassare la temperatura del piatto caldoTemperatura di 120 ° C.
    3. Dopo 10 minuti girare la piastra calda fino a 30 ° C e lasciare agitare la miscela fino a raffreddare a 48 ° C. Monitorare la temperatura inserendo un termometro direttamente nel cibo.
    4. Sciogliere 2 g di estere metilico dell'acido p-idrossibenzoico (tegosept, 100%) in 10 ml di etanolo al 96%. Aggiungere questo e 5 mL di acido propionico 1 M alla miscela. Mescolare per 3 min.
    5. Versare il supporto alimentare al volo nelle arene (descritto nella sezione 4) per creare uno strato di spessore di 0,3 cm in fondo all'arena.
      1. Utilizzare un bicchiere da 200 ml per versare. Quando le quantità esatte sono importanti, utilizzare una pipetta serologica da 10 ml.
  2. Preparare il mezzo di mosca meno il lievito esattamente come descritto nel punto 3.1.1 fino a 3.1.5, ma lasciare fuori il lievito nel punto 3.1.2.
  3. Preparare il mezzo con agar con o senza peptone mescolando 10 g di agar e 35 g di pepton in 1 L di acqua bollente e eseguire le fasi da 3.1.4 a 3.1.5.

4. MatinG Preparazione all'arena

  1. Piegare un foro di circa 0,3 cm di diametro sul lato superiore di un piatto di Petri da 3,5 cm x 1,0 cm utilizzando un ago preparato a caldo (riscaldato a rossore in un bruciatore di Bunsen). In alternativa, utilizzare un saldatore.
  2. Quando si prepara il cibo con composti odori, prima pipetta 30 μL (1% del mezzo finale di alimento, ad es. Acido Acido glaciale 100%) del composto desiderato nel piatto per metà dei piatti sperimentali. Lasciare l'altra metà dei piatti vuoti per il confronto.
    NOTA: con il set-up qui descritto, un massimo di 140 arene può essere testato contemporaneamente.
  3. Usando una pipetta serologica da 10 ml versare 3 ml di alimento in fondo al piatto sulla parte superiore del composto desiderato. Coprire con un panno di formaggio per prevenire la contaminazione e lasciare che il mezzo si solidifichi per circa 1 h a temperatura ambiente.
  4. Posizionare un coperchio sui piatti e nastro adesivo chiuso a due lati. Preparare piccole spine di pellicola paraffina per coprire i fori diI piatti da rotolando pezzi di pellicola paraffina in rotoli di spessore di 0,2 cm e poi tagliati in segmenti di 0,5 cm.

5. Cultura del lievito per l'odore

  1. Crescere il lievito attivo secco sull'estratto del lievito estratto di peptone dextrose (YPD) in un piatto di Petri da 14,0 cm x 2,06 cm. Indossare guanti per evitare la contaminazione in questa fase.
    1. Preparare le piastre agar YPD aggiungendo 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 22 g di glucosio (0 (+) - glucosio monohidrato) e 15 g di agar (puro) fino a 1 litro di acqua ultrapure bollente. Posizionare il fondo del piatto di Petri una volta sciolto e conservarlo a testa in giù in frigorifero a 4 ° C, fino a 2 mesi.
    2. Spruzzare qualche granello di lievito secco su una piastra media YPD, lasciarli sciogliere. Poi striate la piastra media utilizzando un ciclo sterile. Conservare la lastra in un incubatore a 30 ° C durante la notte. Successivamente, conservare la coltura in frigorifero per non più di una settimana.
  2. Preparare il mezzo liquido YPD iN 1 l di bottiglie con l'aggiunta di 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 22 g di glucosio (0 (+) - glucosio monohidrato) e una barra di stirata fino a 1 L di ultrapure acqua.
    1. Autoclave per 25 min a 120 ° C e pressione di 1 bar. Successivamente, conservare le bottiglie a 4 ° C per un massimo di 2 mesi fino all'uso.
  3. Montare i tappi a bottone aperti (4,5 cm) con un setto in silicone di 0,32 cm.
    1. Tagliare due piccoli fori nel setto per adattarsi perfettamente ai raccordi a paratia. Fissare il tubo di polivinilcloruro (PVC) piccolo (diametro esterno 0,8 cm e interno 0,5 cm) a entrambe le uscite che usciranno dalla bottiglia e ad una sola entrata che entra nella bottiglia. Vedi figura 1B per illustrazione.
    2. Avvolgere i tappi e le tubazioni in foglio di alluminio e autoclave per 25 min a 120 ° C e pressione di 1 bar.
  4. Indossare guanti per proteggere la contaminazione in questa fase. Immergere una punta pipetta sterile da 100 μL in una delle colonie di lievito dalla piastra agar YPD (dDescritto in 5.1) e farlo cadere nella bottiglia media liquida YPD autoclavata.
    1. Cappare questa bottiglia di liquido YPD iniettabile con lievito così come una bottiglia di controllo YPD medio (lievito non aggiunto) con tappi autoclavati montati con entrata e uscita (descritti nel punto 5.3). Mettere entrambe le bottiglie su piastre magnetiche separate e mescolare a 100 giri / min a temperatura ambiente per 24 h prima dell'inizio dell'esperimento per consentire la crescita della coltura del lievito.
    2. Collegare le prese di entrambe le bottiglie a separare le pompe dell'acquario per fornire aria alla coltura del lievito. Assicurarsi di collegare l'uscita della bottiglia di lievito sperimentale ad un tubo che sfoglia l'odore di lievito dalla sala sperimentale per evitare interferenze con l'esperimento.

6. Impostazione della pompa dell'aria

  1. Fissare il grande tubo in PVC (diametro esterno 1.2 cm e interno 0.9 cm) ad un'apparecchiatura d'aria sotto pressione e condurlo attraverso due fiasette Erlenmeyer di vetro da 1 L, riempite di carbone attivo fino a 800 mLLinea per purificare l'aria. Usare aria compressa fornita in laboratorio come alimentazione aria o collegare i tubi ad una pompa d'aria (qui è stato utilizzato l'aria sotto pressione).
    NOTA: il materiale della tubazione deve essere selezionato in base alle proprietà chimiche del volatile e testato per impedire che il volatile si attacchi alla fodera del tubo (ad esempio politetrafluoroetilene, nylon o acciaio inossidabile).
  2. Realizzare due distributori d'aria da tubi da 15 ml e tre da 1000 μL di pipetta ciascuno.
    1. Realizzare tre fori di diametro di 1 cm. Prima bruciare due fori, utilizzando un ago preparato a caldo (riscaldato rosso in un bruciatore di Bunsen), adiacenti l'uno all'altro appena sotto il coperchio del tubo da 15 ml. Quindi fare il terzo foro rimuovendo la parte inferiore del tubo.
    2. Colla le punte delle pipette da 1000 μL nei fori con la fine stretta rivolta verso l'esterno. Tagliare l'estremità delle punte della pipetta per consentire un maggiore flusso d'aria.
  3. Collegare il grande tubo in PVC dalla presa del cIl pallone Erlenmeyer riempito con la bocca al puntale della pipetta alla base del tubo da 15 ml. Aggiungere piccole prese di tubi in PVC ai due puntali orizzontali della pipetta e portarli verso un controllo e una bottiglia sperimentale.
  4. Per prevenire la contaminazione del mezzo YPD con microorganismi, collegare il tubo piccolo a un filtro sterile della siringa (dimensione dei pori da 0,45 μm) con una spinta di plastica sul connettore del tubo di paratia verso il filtro e una vite sul connettore della paratia di plastica lasciando il filtro. Quindi, fissare il tubo all'entrata della bottiglia di coltura YPD (vedere la Figura 1B ).
  5. Per impedire che il lievito in aria si sposti dal pallone di coltura nell'arena sperimentale, collegare un tubo di vetro (6,5 cm di lunghezza, diametro esterno = 0,5 cm e diametro interno = 0,3 cm) all'uscita di ogni bottiglia di coltura YPD usando piccoli tubi. Fissare il tubo in PVC all'altro lato del tubo di vetro e portarlo verso i fori inferiori (perforati ad ogni lato) della scatola di esperimento.
    1. Riempire il tubo con fibra di vetro e autoclave prima dell'uso.
  6. Aggiungere un altro filtro a tubo da 15 ml (descritto nella sezione 6.2) alla piccola tubazione in PVC, su ogni lato della scatola sperimentale, per ottenere due tubi che entrano nella scatola sia sul lato sperimentale (più vicino allo scarico del flusso d'aria del ventilatore, a destra) E il lato di comando (più vicino all'entrata del flusso dell'aria del ventilatore, a sinistra).
  7. Preparare pipette serologiche 8x 25 ml ciascuna con 10 prese per testare 80 coppie di accoppiamenti contemporaneamente, ovvero 40 per ogni condizione d'aria.
    1. Masterizzare 10 fori di diametro di 0,8 cm, distanziati da 2 cm nella pipetta.
    2. Tagliare la parte esterna di una siringa da 1 ml in una presa piccola (2,5 cm) e una grande (5 cm).
    3. Incollare queste uscite nei fori con colla a caldo.
    4. Avvolgere una piccola fascia di paraffina di plastica intorno alla estremità delle prese e fissare una punta da pipetta da 1000 μL. Il diametro dell'apertura della punta è di 0,1 cm. Utilizzare suggerimenti puliti per ogni esperimento.
    5. Attaccare due pipette sierologiche, utilizzando uno splitter T con diametro esterno ≥0,5 cm e piccoli pezzi di tubo in PVC piccolo, ad ognuna delle due uscite da entrambi i lati. Nastri le pipette piatte sul foglio bianco della carta (sotto le telecamere nella scatola d'acciaio).
    6. Usando un monitor di flusso d'aria impostare il flusso d'aria in modo che la velocità dell'aria all'uscita della punta pipetta da 1000 μL sia di 0,5 m / s. Questo corrisponde ad un flusso d'aria di 0,0017 L / s per punta.

    7. Monitoraggio del comportamento di accoppiamento

    1. Utilizzare una pipetta a bocca (come descritto nel riferimento 26 ) per mettere una femmina sperimentale in un piccolo piatto di Petri (descritto nella sezione 4) alle 15:00 (ZT 6) e dare a lei 1 h di acclimatarsi all'arena di accoppiamento.
    2. Impostare la casella sperimentale (descritta nella sezione 1) come segue:
      1. Accendere le luci, cioè i LED a luce bianca su un ciclo chiaro e scuro di 12h: 12 h collegato ad un timer che accende ilLuce a 09:00 (ZT0) e LED continua a luce rossa per consentire il monitoraggio delle mosche durante la fase scura dell'esperimento. Accendere i ventilatori per limitare il riscaldamento dell'armadio dalla sorgente luminosa e per assicurare che gli odori in eccesso vengano sfiati all'esterno dell'area di prova.
      2. Collegare le telecamere webcam a un computer e avviarle con il software di monitoraggio per il monitoraggio delle immagini.
      3. Per ogni fotocamera, impostare il fuoco, la luminosità e lo zoom del software di monitoraggio.
        1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla schermata della fotocamera, aprire le "proprietà della fotocamera" e ignorare "la messa a fuoco automatica". Regolare la "messa a fuoco" per chiarire la griglia o le parole scritte sul foglio. Se necessario, modificare la "luminosità" e "zoom".
      4. Impostare il programma del software di monitoraggio per catturare 1 immagine ogni 2 min. Fare clic con il pulsante destro del mouse su ciascuna schermata della fotocamera e scegliere "modifica della fotocamera" e quindi l'opzione "Azioni". Fare clic per avviare le azioni "A intErvals "e cambiare il tempo su" 2 minuti ". Scegli" Take Photo "per selezionare azioni da eseguire e infine cliccare su" ok ".
      5. Fare clic con il pulsante destro del mouse su ciascuna schermata della videocamera e selezionare "avvio controllo".
    3. Dopo 1 ora (a ZT 7), trasferire un maschio di tipo selvaggio al piatto di Petri usando la pipetta della bocca, posizionare il piatto sui fogli di carta A4 all'interno delle telecamere webcam e fare clic su "start monitoring" per 24 h. Per l'esperimento della pompa dell'aria, posizionare il piatto in modo che una presa di pipetta sia collegata al foro di ingresso dell'arena di accoppiamento.
    4. Per analizzare il comportamento dell'accoppiamento della coppia, procedere come segue.
      1. Selezionare e aprire tutte le immagini in un software di visualizzazione delle immagini e visualizzare la pagina in ordine cronologico.
      2. Scrivi la data, il numero di esperimento, il numero del piatto e l'ora di inizio in un foglio di calcolo nella stessa riga. Prendi l'ora di inizio di ogni arena dal momento in cui è posta sotto la webcaM telecamera. Registrare il timbro delle immagini dalle immagini.
      3. Segna l'ora di inizio di ogni copulazione nella stessa riga nel foglio di calcolo. Conte un accoppiamento come un incidente quando il maschio ha montato la femmina e la coppia rimane moderatamente fissa e nella stessa posizione per almeno cinque fotogrammi consecutivi (10 min).
        NOTA: Questo criterio si basa sulla lunghezza di copulazione riportata, che varia da 12 a 27 min in D. melanogaster e l'osservazione che le copulazioni di 10 minuti e oltre sono fertili 27 , 28 .
      4. Conta il numero di copulazioni per ogni riga nel foglio di calcolo per determinare la frequenza di accoppiamento. In alternativa, sottrarre l'ora di inizio dell'esperimento dall'ora del primo accoppiamento per ogni riga come misura della latenza di accoppiamento o sottrarre il tempo della prima accoppiamento dall'ora del secondo accoppiamento come misura della rimozione della latenza.
        1. Per calcolare la latenza di rimozione, assicuratevi diDefinire le date del primo e del secondo accoppiamento come giorni consecutivi nel software del foglio di calcolo.
      5. Analizzare i dati con modelli di effetti misti, assumendo una distribuzione normale dei dati e includendo la data dell'esperimento come fattore casuale utilizzando un software statistico (vedere la tabella dei materiali) per determinare la significatività statistica del mezzo indipendente di variabili-cibo, Tipo di aria e interazione - come descritto in precedenza 5 .
      6. Selezionare il modello migliore spiegando eseguendo l'eliminazione all'indietro di variabili indipendenti non significative utilizzando i test del rapporto di probabilità di probabilità e le informazioni Akaike associate. Dopo aver eseguito il modello, controllare visivamente i residui di dati per confermare la normalità. Confermare l'omogeneità delle varianze usando il test di Levene. Nel caso di disparità di omogeneità, radice quadrata trasformare i dati.

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Representative Results

Utilizzando questo test continuo, il comportamento di accoppiamento e la frequenza di accoppiamento in specifiche possono essere determinati in condizioni ambientali sperimentali. Per controllare le condizioni ambientali, abbiamo trasformato un armadio in acciaio inox in una zona di prova, con una propria sorgente luminosa e diffusione che assicura un'elevata abbondanza di luce e una minima quantità di riflessi dalla parte superiore delle arene di accoppiamento ( figura 1A ) . L'area di prova interna è completamente incassata in acciaio inossidabile e vetro, che consente la pulizia con solventi organici, come ad esano o etanolo. Inoltre, l'armadietto è dotato di fori che fungono da bocchettoni per il tubo, portando volute dal sistema di aria compressa (vedi figure 1A e 1B ). Il sistema dell'aria pressurizzata, regolato per gli odori di lievito, è costituito da un flusso d'aria guidato attraverso una coltura di lievito liquido prima di entrare nelle arene di prova attraverso 4 distributori di pipette con10 prese ciascuna ( figura 1C ). L'intero sistema è ermetico e dotato di diversi filtri di particelle, sia prima che dopo la penetrazione nella coltura del lievito, per ridurre al minimo la contaminazione con odori confusi ( Figura 1B ).

Per dimostrare l'uso di questo saggio, abbiamo testato se i segnali volatili di una coltura di lieviti possono influenzare il comportamento di accoppiamento. L'aria fu bubbled attraverso una coltura di lievito liquido per 24 h, e le prese d'aria sono state collocate all'ingresso di ogni arena di accoppiamento (vedi figura 2A ). La metà delle arene di accoppiamento conteneva alimenti a vola con lievito (Food + lievito) e l'altra metà conteneva alimenti mossi senza aggiunta di lievito (Alimento - lievito). Un maschio e una femmina selvatici sono stati esposti agli odori provenienti dalla cultura del lievito esterno e la loro frequenza di accoppiamento è stata registrata. Per determinare quali variabili sono necessarie per spiegare i risultati grafici, abbiamo eseguito modelli di effetti misti, inclusi o esclusiLe variabili indipendenti del mezzo alimentare, l'aria del lievito e un'interazione dei due. I dati della Figura 2B sono meglio rappresentati da un modello che comprende le variabili indipendenti del cibo medio (p = 0.001) e l'aria del lievito (p = 0.061), ma non esiste alcun effetto di interazione spiegante. Anche se la variabile d'aria del lievito non è significativa in questo insieme di dati completo, è necessario spiegare i risultati. L'analisi dell'aria di lievito separata per il mezzo alimentare mostra che una coppia di accoppiamenti non risponde agli odori di lievito quando non esiste un lievito nel mezzo alimentare (aria: p = 0,992), ma aumenta la loro frequenza di accoppiamento nell'aria di lievito quando il lievito è Aggiunto anche al supporto alimentare (aria: p = 0.018). Insieme, questi risultati dimostrano l'applicabilità del sistema dell'aria pressurizzata per testare l'influenza degli odori ambientali in combinazione con le condizioni medie del cibo.

Illustriamo anche come il sistema dell'aria pressurizzata può essere bypAssediando l'aggiunta di indizi chimici ambientali direttamente all'arena di prova. Per dimostrare quali composti di lievito specifici influenzano la frequenza di accoppiamento, abbiamo provato l'ipotesi che il contenuto di amminoacidi del lievito sia necessario per il suo effetto sull'accoppiamento mettendo una dose di peptone (proteine ​​idrolizzate) corrispondenti agli aminoacidi fornite dal lievito nell'agar Substrato che fodera l'arena di accoppiamento. Abbiamo anche testato la necessità di acido acetico, uno dei principali prodotti fermentativi volatili del lievito, per aumentare la frequenza di accoppiamento. Questo è stato fatto aggiungendo acido acetico direttamente al cibo. Un maschio e una femmina selvatici sono stati testati in arene contenenti agar o agar con peptone, con o senza acido acetico direttamente nel mezzo alimentare ( Figura 3B ). Questo rende per un mezzo alimentare molto semplice e un ambiente povero; Quindi, anche la frequenza di accoppiamento medio diminuisce rispetto alla Figura 2B. I dati nella Figura 3B sono meglio rappresentati da un modello compreso ilVariabili indipendenti di sostanze alimentari (p = 0,002), aria dell'acido acetico (p = 0,001) e interazione dei due (p = 0,022). La ricettività femminile aumenta sulla presenza di acido acetico, ma solo nella condizione in cui il peptone è presente nel mezzo. Ciò dimostra che le mosche devono simultaneamente sentire gli aminoacidi e l'acido acetico per aumentare la loro frequenza di accoppiamento ( Figura 3B ). Ciò dimostra che l'aggiunta di composti odorosi direttamente all'area di prova può influenzare il comportamento dell'accoppiamento e che tali influenze possono essere rilevate in condizioni ambientali molto semplici.

Figura 1
Figura 1: Diagramma della scatola sperimentale e sistema di aria compressa con lievito. ( A ) Schema illustrativo della scatola di accoppiamento controllata sotto il profilo ecologico descritta nella sezione 1. Descrizione dei numeri e delle frecce annotate: 1. scheda di illuminazione con Ternando le luci bianche e rosse; 2. ventilatore piccolo; 3. 3 strati di carta filtrante, ciascuno strato composto da due fogli di carta filtro; 4. piastra di diffusione in vetro appoggiata su staffe fissate su 3 lati della scatola; 5. ventilatore grande; 6. fori per tubi e cavi; 7. area sperimentale; Grande freccia, 50 cm alla lastra di vetro; Freccia centrale, 35 cm di altezza per i fori del cavo; E piccola freccia, 7 cm di altezza per i fori dei tubi. ( B ) Schema illustrativo della coltura del lievito liquido con flusso d'aria, come descritto nelle sezioni 5, 6.4 e 6.5. Descrizione dei numeri annotati: 1. unità filtrante usa e getta; Cappello con setto in silicone e fuoriuscite; 3. liquido liquido; E 4. tubo di vetro con fibra di vetro. ( C ) Schema illustrato delle prese d'aria come descritto nel punto 6.7. Descrizione dei numeri annotati: 1. pipetta serologica; 2. tubo tagliato da una siringa da 1 ml e 3. 1000 μL punta pipetta.Target = "_ blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Odore di lievito aumenta la ricettività femminile in presenza di lieviti nel substrato alimentare. ( A ) Illustrazione schematica di un'arena di accoppiamento con un maschio e una femmina e una punta pipetta dalla presa d'aria di figura 1C che penetra attraverso il foro di entrata. ( B ) Presentazione grafica della risposta in frequenza di accoppiamento di una coppia di accoppiamento Canton-S con l'odore di lievito con e senza lievito nel mezzo alimentare di alimento (Alimento - lievito: aria media n = 12, aria lievito n = 13 e cibo + lievito : Aria media n = 24, aria lievitata n = 23). Grafico a linee con barre di errore SEM e produzione statistica di modelli di effetti misti con aria come variabile indipendente e data come variabile casuale per ogni mezzo alimentare in modo indipendente. La statistica principaleIl modello include il cibo (p = 0.001) e l'aria del lievito (p = 0.061). Adattato dal riferimento 5 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: L'acido acetico nel substrato alimentare a mosca aumenta la ricettività femminile in presenza di peptone. ( A ) Illustrazione schematica di un'arena di accoppiamento, con alimento di alimento moscata contenente acido acetico e una spina in plastica di paraffina che chiude il foro di entrata. ( B ) Una presentazione grafica della frequenza di accoppiamento di una coppia di accoppiamenti Canton-S in risposta all'acido acetico sia sul mezzo agarico che sul peptone (agar: - acido acetico n = 52, + acido acetico n = 40 e peptone: - acido acetico N = 28, + acido acetico n = 25). Grafico a linee con barre di errore SEM e statistiche(P = 0,002), l'aria dell'acido acetico (p = 0,001) e l'alimento * aria (p = 0,022) come variabili indipendenti e la data come variabile casuale. Adattato dal riferimento 5 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive un test per verificare il comportamento di accoppiamento per 24 ore mentre controlla continuamente i segnali ambientali che una coppia di accoppiamenti è ipotizzata per utilizzare per determinare la frequenza di accoppiamento. È possibile aumentare la frequenza di accoppiamento in risposta all'aria del lievito erogata attraverso un sistema di aria compressa quando il mezzo contiene anche il lievito ( Figura 2B ). Inoltre, una risposta simile in frequenza di accoppiamento può essere osservata con un mezzo di alimentazione semplificato contenente solo agar, peptone e odore di acido acetico direttamente nel mezzo ( Figura 3B )

Con gli esperimenti qui dimostrati, si possono trarre conclusioni solo sul comportamento di accoppiamento generale della coppia, in quanto entrambi i sessi sono esposti alle stesse condizioni ambientali. Tuttavia, da ricerche precedenti, sappiamo che il 47% della variazione della frequenza di accoppiamento è determinato dalla femmina, mentre il contributo maschile rappresenta solo l'11% della variazione20 . Pertanto, la maggior parte delle modifiche nella frequenza di accoppiamento osservate sono probabilmente il risultato della ricezione sessuale femminile. L'aumento dei corteggiamenti dei maschi lascia ancora la femmina ad accettare o rifiutare l'accoppiamento, dato che le femmine di D. melanogaster adulte possono abbattere con successo i tentativi di accoppiamento 29 . Per le conclusioni ferme e per attribuire in modo specifico le differenze nella frequenza di accoppiamento alla ricettività sessuale femminile, è necessario testare ulteriori coppie di accoppiamenti dove il genotipo della femmina è varia, ma quello del maschio è mantenuto costante.

Questo protocollo ha dimostrato due modi per fornire composti odorosi a una coppia di accoppiamenti, sia con un sistema di aria compressa che direttamente nel mezzo alimentare. Il sistema dell'aria sotto pressione ha il vantaggio che qualsiasi effetto può essere attribuito ai composti che vengono trasportati attraverso l'aria, mentre ciò non può essere concluso quando i composti vengono messi direttamente nel supporto alimentare. D'altra parte, wNon è possibile individuare alcun effetto con il sistema dell'aria sotto pressione, ma non significa automaticamente che la cue non influenza il comportamento. Potrebbe anche significare che il composto non viene erogato in modo efficiente attraverso il sistema di aria compressa. La composizione dell'aria all'uscita del sistema di erogazione dell'aria può essere analizzata posizionando un filtro idrocarburico e analizzando il contenuto dell'aria bloccata con la gascromatografia accoppiata con spettrometria di massa. Il sistema dell'aria pressurizzata è un buon test per testare composti che possono essere facilmente resi in aria per un intervallo più lungo. Miti composti volatili potrebbero essere messi direttamente nel supporto alimentare. Un altro svantaggio del sistema dell'aria pressurizzata è la velocità dell'aria che può avere sul comportamento del volo. Le mosche si fermano in movimento quando la velocità dell'aria è troppo alta (sopra 0,7-1,6 m / s) 30 . Inoltre, il sistema ad aria compressa può rendere intollerabile un ambiente semplice e di bassa qualità asciugando il mezzo alimentare. In entrambi i casi, le mosche potrebbero non essere perfUgualmente bene, e nessuna conclusione può quindi essere attribuita ai composti specifici testati.

Molti passaggi sono essenziali durante la preparazione per il funzionamento ottimale di questi dosaggi. Il primo passo che richiede attenzione è la preparazione del mezzo. È importante che il mezzo, compresi composti volatili odorosi come l'acido acetico, sia preparato al giorno dell'esperimento e non prima per evitare l'evaporazione. Inoltre, il mezzo ha bisogno di indurire su una superficie senza flusso di aria supplementare (evitare di utilizzare delle cappe di fumi) perché il flusso d'aria può stimolare l'evaporazione dell'odore. Il secondo passo che richiede una cura particolare è la creazione del sistema di aria compressa. Il flusso d'aria deve essere abbastanza alto per bolle la bolla del lievito senza trasferire alcun fluido all'arena.

Questo protocollo dimostra un comportamento composto da odori di lievito in combinazione con comportamenti di accoppiamento. Tuttavia, questo sistema può essere applicato a qualsiasiTipo di odore, così come altri tipi di comportamenti. Per utilizzare questo sistema per altri odori, è necessario regolare il flusso d'aria e l'odore medio per ottimizzare il trasferimento dei composti ai piatti. Tuttavia, in generale, qualsiasi composto che può essere trasferito dall'aria può essere testato con questo sistema. Inoltre, è possibile testare qualsiasi tipo di comportamento, sia in maschi che in femmine, utilizzando lo stesso tipo di piatti o regolando il tubo per raggiungere e connettersi a aree di prova più grandi o minori. Inoltre, quando vengono testati comportamenti più dettagliati, è necessario riconsiderare le velocità e le risoluzioni delle telecamere utilizzate. In ogni caso, se entrambi gli esperimenti con e senza l'odore di prova vengono eseguiti contemporaneamente e con la stessa fonte d'aria, è possibile rilevare qualsiasi risposta alla cue ambientale, indipendentemente dalle variazioni di pressione o di concentrazione da un esperimento all'altro. Infine, il dosaggio qui dimostrato può essere esteso per almeno un altro ciclo LD (fino a 48 ore), fintanto che i fL'alimentazione di ood non si asciuga.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi concorrenti per rivelare.

Acknowledgements

Ringraziamo il Bloomington Drosophila Stock Center per gli stock fly; C. Gahr, JT Alkema e S. van Hasselt per il loro primo tentativo di sviluppare il dosaggio dell'aria sotto pressione; Jasper Bosman per il consiglio sulla coltivazione del lievito; E Rezza Azanchi e Joel Levine per sviluppare in origine il monitoraggio del comportamento di accoppiamento Drosophila . JA Gorter è stato sostenuto da una borsa di studio della Neuroscience Research School di BCN / NWO. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) (riferimento: 821.02.020) a JC Billeter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

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References

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