गोल्गी-कॉक्स विधि का उपयोग करते हुए वृद्ध चूहों में हिप्पोकैम्पल वृक्ष वृत्तीय जटिलता का आकलन

Neuroscience

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Summary

यहां हम व्यापक विस्तार में गोल्गी-कॉक्स प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह विश्वसनीय ऊतक दाग पद्धति हिप्पोकैम्पस में cytoarchitecture के एक उच्च गुणवत्ता वाले मूल्यांकन के लिए, और पूरे दिमाग में, न्यूनतम समस्या निवारण के साथ अनुमति देता है।

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Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

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Abstract

वृक्ष के समान कणिकाएं न्यूरोनल वृक्ष के समान शाफ्ट से उत्तेजित होती हैं जिनमें उत्तेजक संक्रमण होते हैं। हिप्पोकैम्पस के भीतर न्यूरोनल डेंड्राइट की आकृति विज्ञान और शाखाबद्ध रूपांतरों को अनुभूति और स्मृति निर्माण में फंसाया गया है। गोल्गी के धुंधला होने के कई तरीके हैं, जो सभी वृक्ष के समान वृहदों की रूपात्मक विशेषताओं को निर्धारित करने और एक स्पष्ट पृष्ठभूमि का उत्पादन करने के लिए उपयोगी हैं। वर्तमान गोल्गी-कॉक्स विधि, (एक व्यावसायिक गोल्गी स्टाइंग किट के साथ प्रदान की जाने वाली प्रोटोकॉल की थोड़ी भिन्नता), यह मूल्यांकन करने के लिए डिजाइन किया गया था कि कैसेमोथेरेप्यूटिक दवा 5-फ्लूउरासिल (5-फू) की एक अपेक्षाकृत कम खुराक वृक्ष के समान आकारिकी को प्रभावित करेगी , कताई की संख्या, और हिप्पोकैम्पस के भीतर भूगर्भीय की जटिलता 5-फ़ू ने वृक्षसंचार संबंधी जटिलता को काफी व्यवस्थित किया और क्षेत्र-विशिष्ट तरीके से हिप्पोकैम्पस में रीढ़ की घनत्व को कम किया। प्रस्तुत आंकड़े बताते हैं कि गोल्गी धुंधला विधि efसीए 1, सीए 3, और हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गहरेर (डीजी) में परिपक्व न्यूरॉन्स को सख्ती से दाग दिया। यह प्रोटोकॉल प्रत्येक चरण के लिए विवरण की रिपोर्ट करता है ताकि अन्य शोधकर्ता मस्तिष्क में उच्च गुणवत्ता के परिणाम और कम से कम समस्या निवारण वाले टिशू को मज़बूत रूप से दाग सकते हैं।

Introduction

डेंड्रिट्स न्यूरॉन्स का सबसे बड़ा हिस्सा हैं जो प्रीस्कैनेप्टिक इनपुट 1 प्राप्त करते हैं और प्रोसेस करते हैं उनके वृक्ष के समान प्रक्रियाओं में एक जटिल ज्यामिति होती है, जहां समीपस्थ शाखाओं की शाखाएं शाखाओं की तुलना में अधिक व्यास होती हैं। जैसा कि डेन्ड्रैइट विकसित होते हैं, वे अन्य न्यूरॉन्स के साथ कई कनेक्शन बनाते हैं, जिसे एक वृक्ष के वृक्ष arborization कहा जाता है। इस शाखा का हद और पैटर्न एक अन्तर्ग्रथनी इनपुट की मात्रा को निर्धारित करता है जो कि डेन्ड्रैइट पर्याप्त रूप से प्रक्रिया कर सकता है 2

वृक्षारोपण संबंधी गतिविधि, गतिविधि-निर्भरता और न्यूरोनल सर्किटों के उचित विकास के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है। विस्तार, पीछे हटना, शाखाएं, और सिनाप्टोजेनेसिस जटिल प्रक्रियाएं हैं जिनमें आंतरिक आनुवांशिक कार्यक्रम और बाहरी कारकों से प्रभाव शामिल हैं। हिप्पोकैम्पस के भीतर न्यूरोनल डेंड्राइट्स के रूपिकी और शाखाओं में भिन्नता अनुभूति और स्मृति के निर्माण में फंसा होती हैएफ "> 3 , 4। वृक्षसंचार संबंधी जटिलता में परिवर्तन रोगोफिज़ियोलॉजिकल और व्यवहार में बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है 5. असामान्यताएं कई रोग राज्यों से संबंधित हैं, जिनमें फ्रैगेज़ एक्स सिंड्रोम और डाउन सिंड्रोम 6 शामिल हैं

वृक्ष के समान कणें वृक्ष के वृक्ष arbors के विशेष subcellular डिब्बों कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर उत्तेजक इनपुट प्राप्त कर रहे हैं। वृक्ष के समान spines के तीन morphological वर्गों, उनके आकार और आकार के आधार पर प्रत्येक वर्ग के नाम के साथ: 1) मशरूम कताई, जो अन्य spines 7 की तुलना में अधिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के साथ जटिल पोस्टिनेप्टिक घनत्व है; 2) स्टबबी स्पाइन, जो एक स्टेम की कमी है; और 3) पतली कताई, जिसमें एक दीर्घ, संकीर्ण स्टेम और एक गोलाकार सिर 8 होता है । वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी की मात्रा उन्हें परिभाषित करने के लिए भाग में प्रयोग की जाती है, आमतौर पर छोटे (0.01 माइक्रोन 3 3 ) 9 , 10 की तुलना में । स्पाइन परिपक्वता के साथ स्थिर होते हैं। उदाहरण के लिए, पतली कणें कुछ दिनों के बाद वापस ले जाती हैं या मशरूम के कणों में विकसित होती हैं। वैकल्पिक रूप से, मशरूम की कताएं अपेक्षाकृत स्थिर हैं और एक विस्तारित अवधि के लिए जीवित रह सकती हैं। न्यूरोनल कनेक्शन की ताकत स्पाइनों और / या उनकी मात्रा 11 , 12 , 13 की संख्या के आधार पर लगाई जाती है।

क्लासिकल गोल्गी स्टेनाइजिंग विधि और इसके आधुनिक रूपों में वृक्ष के समान रीढ़ की आकृति विज्ञान और घनत्व की जांच के लिए सभी उपयोगी हैं। गोलगी धुंधला के एक अनूठे पहलू यह है कि यह कुल न्यूरॉन्स का लगभग 5% दाग करता है, जो कि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स 14 , 15 के अनुरेखण के लिए अनुमति देता है। हालांकि सटीक तंत्र जिसमें गोल्गी मेथ हैOd stains व्यक्तिगत न्यूरॉन्स अभी भी अज्ञात है, इस विधि का सिद्धांत चांदी क्रोमेट (एजी 2 क्रो 4 ) 16 , 17 के क्रिस्टलीकरण पर आधारित है। गोल्गी पद्धति के तीन मुख्य प्रकार हैं: तेजी से गॉल्गी, गोल्गी-कॉक्स, और गोल्गी-कॉपचा 18 , 1 9 । सभी तीन तरीकों से कई दिनों से महीनों तक क्रोमियम लवण में एक प्रारंभिक ऊष्मायन चरण के साथ शुरू होता है, लेकिन उनके बीच कुछ महत्वपूर्ण अंतर हैं तेज़ी से गोल्गी ने पहले चरण में ओस्मीन टेट्रोक्साइड का उपयोग किया है, जबकि गॉलगी-कॉप्सच में पैराफॉर्मालाइडहाइड शामिल हैं। तेजी से गोल्गी और गोल्गी-कॉप्सच दोनों में धुंधला होने के बाद लगभग 7 दिनों के लिए 1-2% रजत नाइट्रेट समाधान में ऊष्मायन किया जाता है। गोल्गी-कॉक्स विधि रजत नाइट्रेट के बजाय मर्क्यूरिक क्लोराइड और पोटेशियम डिचोमैट का उपयोग करती है और इसमें 2-4 सप्ताह का संसेचन समय होता है। ऊतकों को फिर से वर्गीकृत किया जाता है और जल्दी से एक पतला अमोनिया में रखा जाता हैसमाधान, एक फोटो फिक्सर द्वारा पीछा लवण हटाने के लिए। तीन प्रकारों में से, गोल्गी-कॉक्स विधि को डेन्ड्रिटिक आर्कबर्स को बिना पृष्ठभूमि के हस्तक्षेप के धुंधला होने का सबसे अच्छा माना जाता है, क्योंकि भाग में, क्रिस्टल कलाकृतियों ऊतक की सतह पर नहीं होती हैं (तेजी से गोल्गी पद्धति के विपरीत) 17 , 20 , 21

वर्तमान विधि वाणिज्यिक गोल्गी स्टेनेस किट के साथ प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का एक मामूली बदलाव है, और इसे 5-फू की एक अपेक्षाकृत कम खुराक वृक्ष के समान आकार संबंधी विशेषताओं और रीढ़ घनत्व को प्रभावित करने के लिए कैसे तैयार किया गया था। किसी भी डेटा का अधिग्रहण किया जा सकता है इस बारे में और जानकारी प्रदान कर सकता है कि कैसेमोथेरेप्यूटिक उपचार न्यूरोनल सर्किटरी को प्रभावित करता है।

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Protocol

यूएएमएस में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित नैतिक मानकों के अनुसार प्रयोग किए गए थे

1. पशु और 5-फू इंजेक्शन प्रतिमान

  1. 6 महीने के पुरुष C57Bl6 / J जंगली प्रकार की चूहों की खरीद करें और उन्हें 1 वर्ष की उम्र तक लगातार 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के नीचे रखें।
  2. 5-फू 0.9% बाँझ खारा में पतला। प्रति माउस आवश्यक खुराक के रूप में 60 मिलीग्राम / किग्रा का उपयोग करें
  3. 5-एफयू (तीन हफ्तों के लिए प्रति सप्ताह एक बार) के इंट्राटेरिटाइन इंजेक्शन दें
    1. प्रत्येक दिन एक ही समय के आसपास इंट्राटेरिटीन इंजेक्शन दें। उदाहरण के लिए, 0900-1200 घंटे के बीच
  4. अंतिम इंजेक्शन के 30 दिनों बाद जानवरों को कुचलने और मस्तिष्क निकालने के लिए।

2. इच्छामृत्यु प्रक्रिया और मस्तिष्क निकालना

  1. कृंतक को रोकें और पूंछ के आधार को पकड़ो। दूसरी ओर, अंगूठे या पहली उंगली को वें स्थान पर रखेंकृंतक के गर्दन के ई बेस जल्दी से चूहे की गर्दन पर दबाव डालें और आगे बढ़ें, जबकि दूसरी ओर पूंछ पकड़कर पीछे की ओर खींचती है
  2. एक हाथ से कृंतक को पकड़ो और दूसरे के साथ बड़ी शल्य कैंची पकड़ो। दो ब्लेड के बीच कृंतक की गर्दन को रखें और जल्दी से सिर का सिर काटना।
  3. कटे हुए माउस का सिर लो, और ठीक कैंची का उपयोग करने के लिए खोपड़ी के ऊपर फर ट्रिम, आंखों तक। इसके बाद, प्रत्येक आँख सॉकेट में कैंची की युक्तियाँ रखें और मामूली बल वाली कैंची बंद करें।
  4. स्प्रिंग कैंची का उपयोग करने के लिए खोपड़ी को बाएं और सेरिबैलम के दाईं ओर काटने के लिए।
  5. सेरेबेलम के आसपास सीधे खोपड़ी के हिस्से को ऊपर और बंद करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
  6. खोपड़ी के midsagittal लाइन के साथ कटौती करने के लिए वसंत कैंची का उपयोग करें
  7. मस्तिष्क से खोपड़ी के शेष हिस्से को उठाए जाने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
  8. वांछित कंटेनर में मस्तिष्क को बाहर निकालने के लिए एक स्पॉटुला और एक जांच का प्रयोग करें। एक स्टेनलेस एस का उपयोग करनातिल ब्लेड, प्रत्येक मस्तिष्क को midsagittal विमान के साथ में कटौती दाहिने गोलार्धों पर निम्नलिखित गोल्गी-कॉक्स विधि करें।

3. गोल्गी धुंधला और ऊतक की तैयारी

  1. 10 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 5 एमएल मर्क्यूरिक क्लोराइड-आधारित समाधान (किट से समाधान ए) में ताजा कटा हुआ आधा मस्तिष्क को विसर्जित करें। Mercuric क्लोराइड समाधान प्रकाश-संवेदनशील है; पन्नी के साथ ट्यूब को कवर करें नमूना कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्टोर करें
    नोट: समाधान ए सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किट में प्रदान की गई है। सावधान! समाधान ए (जिसे मर्क्यूरिक क्लोराइड समाधान भी कहा जाता है) में विषाक्त अभिकर्मकों जैसे पोटेशियम डिचोमैट, मर्चुरिक क्लोराइड और पोटेशियम क्रोमैट शामिल हैं। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें और एक धूआं हुड में काम करें।
  2. एक दिन बाद, एक अस्थायी कंटेनर (जैसे बड़ी तौलना नाव) में समाधान को धीरे-धीरे हटा देना, और इसे एक बायोहेज़र्ड अपशिष्ट कंटेनर में निकालना 5 एमएल के साथ दिमाग (मूल 10 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में अभी भी) विसर्जित करेंMercuric क्लोराइड समाधान, और 13 और दिनों के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे को नमूना वापस।
  3. 90 ग्रा। डिस्टिल्ड या विआयनीकृत पानी (डीएच 2 ओ) में 30 ग्राम पोस्ट-संसेचन बफर जोड़ें। पोस्ट-संसेचन बफर के 6.5 एमएल के साथ 6 अच्छी तरह से एक प्लेट के प्रत्येक कुएं भरें, मस्तिष्क के अनुसार एक अच्छा
    नोट: पोस्ट-संसेचन बफर सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किट में प्रदान किया गया है।
    1. Mercuric क्लोराइड समाधान में 14 दिनों (कुल में) के बाद, डीएच 2 ओ के साथ ऊतक को कुल्ला, फिर उन्हें पद संसेचन बफर के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटों में स्थानांतरित करें। प्लेटों को पन्नी के साथ कवर करें और उन्हें अंधेरे में कमरे के तापमान पर रख दें।
  4. विसर्जन के 1 दिन के बाद पोस्ट-संसेचन बफर को पिपेट करें और ताजा पोस्ट संसेचन बफर के साथ नवीनीकृत करें; कमरे के तापमान पर अंधेरे में 1 दिन के लिए स्टोर करें यदि आवश्यक हो, तो इसे 1 महीने 22 तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

4. अनुभागिंग

  1. 12-अच्छी तरह से प्लेट्स को अपने ढक्कन पर लेबल करें, जिसमें बाएं से दाएं और ऊपर-टू-डाउन तक आरोही क्रम में संख्याएं होती हैं।
  2. पूरे मस्तिष्क को व्यवस्थित करते हुए मस्तिष्क के लिए दो या तीन 12-अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें।
    1. मस्तिष्क से जुड़े अनुभाग की पहचान संख्या के साथ प्रत्येक 12-अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन के शीर्ष पर लेबल करें।
    2. पिपेट 2 एमएल 1x पीबीएस में प्रत्येक प्लेट के प्रत्येक कुएं में।
  3. मंच सेट करें और कंपन को चालू करें; सुनिश्चित करें कि ऊतक को कवर करने के लिए कंटेनर में पर्याप्त 1x पीबीएस है
    1. प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के दो टुकड़े को काटें और उन्हें दो बार से अधिक गुना करें। काउंटर पर लीक से 1x पीबीएस को रोकने के लिए नमूना धारक knobs के लिए उन्हें छेद पर रखें।
    2. टेप नीचे नमूना धारक के ऊतक ब्लॉक पर रखो और फिर cyanoacrylate चिपकने वाला गोंद (सामग्री की तालिका देखें) पर डाल दिया।
  4. 6 अच्छी तरह से प्लेट से मस्तिष्क निकालें और इसे प्लास्टिक या ग्लास डिश पर रखें। स्टेनलेस का उपयोग करेंसेरिबैलम के लगभग आधे हिस्से को काटने के लिए स्टील डबल-ब्लेड ब्लेड।
    1. सेनिबैलम को कौडी से काटें सुनिश्चित करें कि शेष सेरिबैल का हिस्सा भी है
  5. तुरंत गोंद पर शेष सेरिबैलम की सपाट सतह को रखें।
    नोट: ऊतक (मस्तिष्क प्रांतस्था) के पृष्ठीय भाग को ब्लेड के बाएं या दाएं रिश्तेदार का सामना करना चाहिए। उभयलिंगी अंत जो पहले घ्राणघड़ी बल्ब संलग्न था, ऊपर की ओर का सामना करना चाहिए
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम कुछ मिनट प्रतीक्षा करें कि गोंद पूरी तरह से सूख जाता है
  6. जबकि जगह में मस्तिष्क पकड़े हुए गोंद सुखाने वाला है, नमूना स्नान में 1x पीबीएस डालना। गोंद सूखने के बाद, नमूना स्नान में ऊतक के साथ नमूना धारक को रखें।
    1. यदि ऊतक का नमूना पूरी तरह से कवर नहीं किया गया है, तो नमूना स्नान में अधिक 1x पीबीएस डालें।
  7. ब्लीड को कंपन के ब्लेड धारक से जोड़ें और धीरे-धीरे एलनमूना स्नान में ब्लेड जब तक 1x पीबीएस में पूरी तरह से डूब नहीं किया जाता है। ब्लेड को कम करना जारी रखें जब तक कि ऊतक के ऊपर से थोड़ा नीचे न हो।
  8. Vibratome गति 7 करने के लिए, आयाम 6 करने के लिए सेट करें, और काटने के कोण 12 ° (vibratome मॉडल के लिए सामग्री की तालिका देखें)। कंपन शुरू करें और 200 माइक्रोग्राम अनुभाग 23 कट करें।
    1. नमूना स्नान से ऊतक वर्गों को 12-अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक नामित कुंड में ले जाने के लिए एक बड़े तूलिका का प्रयोग करें।
  9. जब तक ऊतक वर्गों की वांछित संख्या तक नहीं पहुंच जाती तब तक ऊतक को काटने के लिए जारी रखें।

5. पोस्ट धुंधला हो जाना

  1. निम्नलिखित धुंधला हो जाने वाले कदमों और rinses के प्रत्येक के लिए, संकेत प्रति समाधान के 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से उपयोग करें। कुओं में समाधानों को स्थानांतरित करने के लिए मोटर चालित पिपेट भराव (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। कुओं से बाहर निकालने और उचित कचरे में स्थानांतरण करने के लिए ट्रांसफर पिपेट (सामग्री की सारणी देखें) का उपयोग करेंकंटेनर।
  2. 0.01 एम पीबीएस-टी के एक 30 मिनट के धोने के अनुभागों में धुलाई करें (3.0 एमएल डिटर्जेंट जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें) 1,000 एमएल 0.01 एम पीबीएस)।
  3. अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (सतर्कता) 3: 5 मात्रा के द्वारा डीएच 2 के साथ पतला। 19-21 मिनट के लिए पतला अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान में वर्गों को दाग़ें
    1. पन्नी के साथ हल्के-संवेदनशील अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान को सुरक्षित रखें।
      नोट: समाधान के भीतर अमोनियम हाइड्रोक्साइड ~ 10% की एकाग्रता है और इसे "खतरनाक" के रूप में वर्गीकृत किया गया है। अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान जलने का उत्पादन कर सकता है अगर यह त्वचा को संपर्क करता है साँस ले जाने पर श्वसन तंत्र में जलन हो सकती है। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें और एक धूआं हुड में काम करें।
  4. 1 9-21 मिनट के बाद के बाद धुंधला बफर (500 मिलीलीटर डीएच 2 हे में अभिकर्मक डी के 90 ग्राम जोड़ें) में वर्गों को दाग़ें। पोस्ट धुंधला हो जाना बफर हल्का-संवेदनशील है; पन्नी 22 के साथ इसे सुरक्षित रखें
  5. तीनों में वर्गों को कुल्ला, 0.01 एम पीबीएस-टी की 5-10 मिनट की धुलाई

6. बढ़ते, सफाई, और कवर

  1. बड़ा तूलिका वाले 1% जिलेटिन-लेपित स्लाइड पर वर्गों को माउंट करें उन्हें कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए सूखने दें, और फिर उन्हें रातोंरात कोप्लिन जार में रखें।
  2. कोप्लिन जार से दस्ताने वाले हाथों से स्लाइड निकालें और उन्हें प्लास्टिक रैक में रखें (सामग्रियों की तालिका देखें)। स्टेनिंग डिश (सामग्री की तालिका देखें) में प्लास्टिक रैक रखें 100% इथेनॉल युक्त उन्हें तीन 5 मिनट के साथ धोया गया।
  3. 99% xylene में प्रत्येक 5 मिनट के लिए स्लाइड दो बार धो लें एक ग्लास रैक में स्लाइड्स रखें और रैक को एक गिलास के धुंधला डिब्बे में डालें जिसमें धातु संभाल (सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक्सलीन युक्त है।
    नोट: सावधानी, अगर श्वास और जलन होती है तो ज़ीलीन हानिकारक होती है, अगर यह त्वचा को छूती है। यह तरल और भाप राज्यों में अत्यधिक ज्वलनशील है। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें और एक धूआं हुड में काम करें।
  4. Xyl से स्लाइड निकालेंएक समय में एक और जल्दी से ऊतक को ~ 0.25 एमएल की बढ़ते मीडिया (सामग्री तालिका देखें) के साथ कवर करें। इसके बाद, स्लाइड कवर ले जाएं और उन्हें मीडिया पर रखें।
    1. स्लाइड के नीचे किसी भी फंसे हुए हवा के बुलबुले को धकेलना वस्तु के किनारों को कवर करें, जैसे एक पेंटब्रश के अंत।
  5. किसी क्षेत्र में स्लाइड को सूर्य के प्रकाश से दूर रखें और उन्हें 2-3 दिनों के लिए सूखने दें।
  6. सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करने और उपयुक्त सॉफ़्टवेयर के साथ विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें।

7. छवि स्टैक प्राप्त करें

  1. इमेजिंग प्रोग्राम खोलें ( सामग्री तालिका देखें) स्लाइड को माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें। कार्यक्रम के शीर्ष पर स्थित मेनू पर, "अधिग्रहण" पर क्लिक करें और फिर "लाइव इमेज" पर क्लिक करें।
  2. माइक्रोस्कोप को 10X पर सेट करें वरीयता के न्यूरॉन को पहचानें और फिर कर्सर ले आओ, जो सोडा के केंद्र में लाल एक्स की तरह दिखता है। संदर्भ बिंदु सेट करने के लिए वाम क्लिक करें
  3. माइक्रोस्कोप को 40X पर सेट करें कार्यक्रम के शीर्ष पर स्थित मेनू से "मूव" पर क्लिक करें और फिर "संदर्भ बिंदु" पर क्लिक करें।
  4. ऊतक के ऊपर ठीक उद्देश्य से मैन्युअल रूप से स्क्रॉल करके छवि स्टैक बनाना शुरू करें, जब तक कि यह फ़ोकस से थोड़ी दूर नहीं हो।
    1. शीर्षक "छवि अधिग्रहण" के तहत कार्यक्रम के निचले दाएं कोने में "शीर्ष सेट करें" पर क्लिक करें।
    2. ऊतक के नीचे थोड़ी सी स्क्रॉल करें जब तक कि इसे फ़ोकस से थोड़ा सा नहीं हो और फिर "छवि अधिग्रहण" के तहत "नीचे सेट करें" पर क्लिक करें। इसके बाद, "इमेज स्टैक प्राप्त करें" पर क्लिक करें।
  5. छवि स्टैक प्राप्त होने के बाद, प्रकट होने वाली विंडो में छवि फ़ाइल के लिए वांछित नाम लिखें। "एमबीएफ़ एएससीआई फ़ाइल" के रूप में सहेजें
    1. संकेत दिए जाने पर, फ़ाइल प्रकार "MBF JPEG2000 stack file" चुनें और फिर "सहेजें" पर क्लिक करें।

8. न्यूरॉनल ट्रेसिंग

  1. टूलबा मेंमेनू के नीचे, "कंटूर नाम" नामक बॉक्स पर क्लिक करें। ड्रॉप डाउन मेनू से "सोमा" चुनें
  2. मैन्युअल रूप से सोमा का पता लगाएं फिर सही पर क्लिक करें और "समाप्त सेल बॉडी" चुनें, जब ट्रेसिंग पूर्ण हो जाए।
  3. "AutoNeuron वर्कफ़्लो" शीर्षक वाला एक और टैब लाने के लिए "ऑटो्यूनूरॉन" चुनें।
  4. "कॉन्फ़िगरेशन प्रकार" के अंतर्गत, "नया" चुनें। पैरामीटर सेट करें और फिर "सोमा डिटेक्शन" उपशीर्षक लाने के लिए "अगला चरण" पर क्लिक करें।
    1. मापदंडों को सेट करने के लिए, "ब्राइटफील्ड" चुनें अगला, "अधिकतम प्रक्रिया व्यास" के तहत, "प्रारंभ मापने" पर क्लिक करें कर्सर का उपयोग करना, डेंड्राइट के आधार पर जाएं और व्यास को मैन्युअल रूप से सेट करें।
  5. विंडो में "हां" पर क्लिक करें जो उपयोगकर्ता को पूरी छवि का पता लगाने के लिए अनुरोध करता है। मैन्युअल रूप से सोमा का पता लगाएं Unclick करें और फिर "बीज प्लेसमेंट" उपशीर्षक लाने के लिए "अगला चरण" पर क्लिक करें
  6. क्लिक करें "बीज सत्यापित करेंS "पर क्लिक करें और फिर" न्यूरॉन पुनर्निर्माण "उपशीर्षक लाने के लिए" अगले चरण "पर क्लिक करें।
  7. "न्यूरॉन" के अंतर्गत, "इंटरैक्टिव" पर क्लिक करें। डेंड्राइट्स के कार्यक्रम से दिशा का पालन करके और प्रोग्राम द्वारा पता लगाए गए हाइलाइट क्षेत्र को पूरा करने के लिए राइट-क्लिक करके इंटरैक्टिव ट्रेसिंग करना। सभी dendrites अनुरेखण के बाद, "अगला कदम" पर क्लिक करें।
  8. एक नई विंडो दिखाई देने के बाद, एक इच्छित शीर्षक से नया कॉन्फ़िगरेशन सहेजें। "सहेजें" पर क्लिक करें।

9. विश्लेषण

  1. विश्लेषण कार्यक्रम खोलें (सामग्रियों की तालिका देखें)।
  2. शीर्ष मेनू से "फाइल" पर क्लिक करें और फिर "डेटा फ़ाइल खोलें" पर क्लिक करें। ब्याज की फाइल का चयन करें।
  3. विश्लेषण उप-शीर्षक के तहत, "शॉल विश्लेषण" चुनें।
  4. "शॉल विश्लेषण" विंडो में, प्रारंभिक त्रिज्या को 10 माइक्रोन तक सेट करें "विश्लेषण" के तहत, बॉक्स "डेंड्राइट्स" और "शाखा आदेशों" पर क्लिक करें।
  5. सही सीएलनई खुली खिड़कियों को ick करें और "एक्सेल एक्सपोर्ट" पर क्लिक करें। "सहेजें" पर क्लिक करें।
  6. विश्लेषण के तहत, "ब्रंकेड स्ट्रक्चर एनालिसिस" पर क्लिक करें। "सभी संभावित विश्लेषण" का चयन करें।
  7. हाल ही में खोले गए विंडो पर राइट क्लिक करें और "एक्सेल एक्सपोर्ट" 24 पर क्लिक करें।

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Representative Results

गोल्गी-दाग वाले मस्तिष्क वर्गों के हिप्पोकैम्पस में वृक्ष वृक्षारोपण के आरम्भिकरण और जटिलता पर 5-फू के उपचार का प्रभाव व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया और पता लगाया गया। अनुरेखण के बाद, शेंद विश्लेषण और वृक्षसंचारक जटिलता सूचकांक (डीसीआई) के माध्यम से वृक्ष वृक्षारोपण arborization, रीढ़ की हड्डी घनत्व, और रीढ़ की आकृति विज्ञान का विश्लेषण किया गया। शोल विश्लेषण एक मात्रात्मक विश्लेषणात्मक विधि है जिसका इस्तेमाल वृक्ष के वृक्ष arbor morphology 25 को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। सोमा से शुरू, वृक्ष के समान निशान लगाने वाले एक दूसरे ओवरले के अलावा 10 माइक्रोग्राम के चक्र। डेंड्राइट की लंबाई को मंडलियों की संख्या से निर्धारित किया जाता है जो डेंड्राइट्स को पार करते हैं। शाखा बिंदु विश्लेषण, एक वृक्ष के समान आर्कर की जटिलता का पता लगाने के लिए एक विधि, शाखा अंक की कुल संख्या और क्रम पर आधारित है।

शाखा बिंदु को जब ए के रूप में परिभाषित किया जाता हैशाखा दो उप शाखाओं में विभाजित है शाखा के आदेश की जटिलता का एक आकलन है कि कितनी बार शाखाओं में विभाजित होता है। उदाहरण के लिए, एक प्रथम-ऑर्डर शाखा बिंदु सोमा से विस्तारित मूल डेंड्राइट होगा, जबकि एक दूसरे क्रम वाला शाखा बिंदु वह बिंदु होगा जहां शाखा दो उप-शाखाओं में विभाजित करती है। शाखा के अंक और शाखा के आदेश दोनों की जांच करके, वृक्ष के समान बख़्तरबंद की जटिलता (शाखा अंक की संख्या के आधार पर) और किन शाखाओं को इंगित करता है (एक छोटे शाखा आदेश सोमा के करीब है, जबकि एक बड़ा शाखा आदेश है सोम से आगे) निर्धारित किया जा सकता है। इन मापदंडों को डीसीआई में लागू किया गया था। सीए 1 और सीए 3 को आत्मकेंद्रिक और बेसल भागों में विभाजित किया गया और स्वतंत्र रूप से 26 , 27 का विश्लेषण किया गया।

डीएजी में CA1 और सीए 3 पिरामिड न्यूरॉन्स और ग्रेन्युल न्यूरॉन्स के डेंडाइट्स का विश्लेषण किया गया। सभी न्यूरॉन्स के लिए चयनितप्रत्येक प्रायोगिक समूह ने निम्नलिखित मापदंडों को पूरा किया: 1) डेन्ड्रिटियों के पास अपनी पूरी लंबाई में अंधेरे और सुसंगत गोल्गी धुंधला हो गया था, 2) डेन्ड्रैइट स्पष्ट रूप से व्यवहार करते थे, और 3) विश्लेषण के दौरान हस्तक्षेप को रोकने के लिए प्रत्येक न्यूरॉन में पर्याप्त स्थान था 28 चित्रा 1 न्यूरॉन दर्शाता है जो उपरोक्त मानदंडों को पूरा करता है। डेटा को ± एसईएम मतलब के रूप में व्यक्त किया गया था शाम और 5-फू समूहों के बीच सांख्यिकीय अंतरों को निर्धारित करने के लिए, एक जोड़ा गया दो-पूंछ टी -टेस्ट इस्तेमाल किया गया था। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके किया गया, और पी <0.5 महत्वपूर्ण माना जाता था 5-फू उपचार और शोल त्रिज्या के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए विचरण का एक मिश्रित-कारक विश्लेषण (एनोवा) का उपयोग किया गया था। फिशर एलएसडी पोस्ट-हॉक टेस्ट का उपयोग एओएनओएए के तहत किया गया था जब उचित 29

दोनों सीए में 1 ( टी = 7.68, पी <0.01; चित्रा 2 ) और सीए 3 ( टी = 7.54, पी <0.01; चित्रा 3 ) शिखर पिरामिड डेंड्राइट्स, 5-एफयू उपचार के बाद स्पाइन में एक महत्वपूर्ण समग्र कमी हुई थी। जबकि 5-फू उपचार सीए 1 ( टी = 1.79, पी = 0.15; चित्रा 2 बी ) के बेसल रीढ़ घनत्व को काफी प्रभावित नहीं करता है, लेकिन सीए 3 बेसल पिरामिडल वृक्ष के समान कण ( टी = 5.57, पी <0.05; चित्रा 3 बी )। इसके अलावा, फिशर एलएसडी के पोस्ट-हॉक टेस्ट से सीए 1 एपिकल पिरामिड डेंड्रिट्स के वृक्ष वृक्षारोपण में 40-100 माइक्रोन (फिशर के एलएसडी, पी <0.001; चित्रा 2 सी ) और 130-160 माइक्रोन (फिशर एलएसडी, पी < 0.05;Ig "> चित्रा 2 सी ) खारा उपचार नियंत्रण की तुलना में सोमा से दूर। इसी तरह की घटना सीए 1 बेसल एपेक डेंड्राइट में 30-60 माइक्रोन (फिशर के एलएसडी, पी <0.001; चित्रा 2 डी ) और 70-110 सोमा 29 से दूर माइक्रोन (फिशर का एलएसडी, पी <0.05; चित्रा 2 डी )

सीए 3 एपिकल पिरामिड डेंड्राइट्स के बारे में, खारा इलाज नियंत्रण ( एफ (28,87) = 0.91; पी = 0.5 9, चित्रा 3 सी ) की तुलना में 5-फू उपचार के बाद कमानी वृक्ष के समान लंबाई में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। हालांकि, सीए 3 बेसल पिरामिड डेंड्राइट्स के लिए, 5-फू के उपचार और खंभे के इलाज के बीच कंबल वृक्ष के समान लंबाई ( एफ (25, 78) = के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था।1.85; पी <0.05; चित्रा 3 डी )। फिशर के एलएसडी ने बताया कि 5-एफयू के इलाज ने 90-100 माइक्रोन ( पी <0.01; आकृति 3 डी ), 70-80 माइक्रोन और 110-120 माइक्रोन (फ़िशर के एलएसडी, पी <0.05; चित्रा 3 डी ) में वृक्ष वृक्षारोपण के अर्बिकीकरण को कम किया है। सोमा 29 से दूर

वृक्ष संबंधी जटिलता को निर्धारित करने के लिए, 5-फू के उपचार और खारा उपचार वाले नियंत्रण समूहों की तुलना करने के लिए एक शाखा आदेश विश्लेषण का उपयोग किया गया था। डीजी के भीतर, शाखा के आदेश विश्लेषण ने प्रत्येक उपचार और शाखा आदेश ( एफ (8, 36) = 25.61, पी <0.001; चित्रा 4 ) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। फिशर के एलएसडी का उपयोग करके इसे और विश्लेषण किया गया, जिसमें संकेत मिलता था कि 4 वें और 6 वें की लंबाई कम हो गई थी5-फू उपचार के बाद आदेश ( पी <0.001; चित्रा 4 ) 29

आकृति 1
चित्रा 1 : गोल्गी में न्यूरॉन डाई गई जो इमेजिंग और आगे के विश्लेषण के लिए मानदंड का प्रतिनिधित्व करता है। गोल्गी धुंधला होने के बाद सभी तीन रीढ़ प्रकार आसानी से देखे जा सकते हैं। डेनडाइट की पूरे लम्बाई में धुंधला संगत है और अन्य न्यूरॉन्स से डेंड्राइट अलग है। स्केल बार, 5 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : गोल्गी ने दागदार यूरोन ने 5-फू के बीच स्पाइन घनत्व में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया और खारा सीए 1 में खारा उपचार समूह, लेकिन बेसल सीए 1 नहीं। शिखर और बेसल सीए 1 दोनों में रीढ़ की लंबाई में 5-फू का इलाज और खारा उपचार समूह के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था। ( ) सीए 1 एपिकल पिरामिड डेंड्राइट्स में, 5-फू ने रीढ़ घनत्व में काफी कमी आई है। ( बी ) बेसल डेंड्राइट्स में, कणों के समग्र घनत्व में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं थे। ( सी ) शोल विश्लेषण से पता चला है कि 5-फू उपचार में सीए 1 एपिकल पिरामिड डेंड्राइट्स में सोमा से 40-100 माइक्रोन और 130-160 माइक्रोन दूर वृक्ष के वृक्ष arborization में कमी आई है। ( डी ) बेसल डेन्ड्रैक्ट्स में, 5-फू उपचार ने सोमवार से 30-60 माइक्रोन में वृक्ष वृक्षारोपण को कम किया और 70-110 माइक्रोन दूर किया। औसत ± एसईएम (एन = 6)। * पी <0.05; ** p <0.01, एनोवा 29= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3 : गोल्गी में दाग न्यूरॉन्स ने 5-फू के इलाज और खारा उपचार समूहों के बीच रीढ़ की हड्डी में महत्वपूर्ण अंतर दिखाए, जो दोनों अस्थिर और बेसल CA3 में थे। रीढ़ की हड्डी की लंबाई में 5-फू का इलाज और खारा इलाज समूह के बीच में महत्वपूर्ण अंतर था, लेकिन बेसल सीए 3 नहीं था। ( ) सीए 3 एपिकल पिरामिड डेंड्राइट्स में, 5-फ़ू ने रीढ़ घनत्व में काफी कमी आई है। ( बी ) बेसल डेंड्राइट में, 5-फ़ू ने कणों के समग्र घनत्व को काफी कम किया है। ( सी ) सीए 3 एपिक एरिया में 5-एफयू के उपचार का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था। ( डी ) बेसल डेंड्राइट्स में, 5-फू ट्रेआसोमवार से वृक्ष वृक्षारोपण arborization 70-120 सुक्ष्ममापी गिरावट आई है औसत ± एसईएम (एन = 6)। *, पी <0.05; **, पी <0.01, एनोवा 29 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : डीजी के भीतर गोल्गी के रंगीन न्यूरॉन्स ने खारा उपचार समूह की तुलना में 5-एफयू के उपचार के बाद 4 वें और 6 वें क्रम में लंबाई में कमी दिखाई। सीए 1 हिप्पोकैम्पल क्षेत्र के पिरामिड न्यूरॉन्स में प्रत्येक शाखा आदेश की लंबाई। औसत ± एसईएम (एन = 6)। * पी <0.05; ** p <0.01, एनोवा 29 दलीलसे इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

अधिक आधुनिक तकनीकों की तुलना में, गोल्गी-कॉक्स विधि में कई फायदे हैं, जो रीढ़ की आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए पसंदीदा विधि बनाते हैं: 1) धुंधला हो सकता है अनिवार्य रूप से किसी भी ऊतक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 2) एक बुनियादी प्रकाश माइक्रोस्कोप सेटअप उस सभी के लिए आवश्यक है गोल्गी-आधारित छवियों का अधिग्रहण, 3) गोल्गी-कॉक्स इमेजिंग confocal इमेजिंग की तुलना में तेज है, और 4) Golgi सना हुआ वर्ग fluorescently लेबल वाले नमूनों की तुलना में कई महीनों से अधिक वर्षों के लिए व्यवहार्य हैं। यहां तक ​​कि इन फायदे के साथ, गोल्गी-कॉक्स विधि में अभी भी कुछ सीमाएं हैं सबसे पहले, पूरी प्रक्रिया बहुत समय लगता है, छवियों का विश्लेषण करने के बाद कई हफ्तों की धुंधला होने की आवश्यकता होती है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल के साथ देखा गया है, यह समाधान ए और एक दिन में समाधान बी में 14 दिन लग जाता है इससे पहले कि अनुभागिंग शुरू हो सकती है। इसके अतिरिक्त, सेक्शनिंग, पोस्ट-स्टैनिंग और माउंटिंग करना मस्तिष्क प्रति 2-3 घंटे लगेगा। सफाई और उन्हें कवर करने से पहले प्रत्येक स्लाइड को 1 दिन के लिए सूखा होना चाहिए। उसके बाद, समय की मात्रायह छवि पर ले जाएगा और विश्लेषण करेगा कि वर्गों का व्यक्ति पर निर्भर करेगा। दूसरा, स्पिन 30 को वर्गीकृत करने में मतभेदों के कारण विश्लेषकों के डेटा के बीच स्थिरता के मुद्दे हो सकते हैं। इस कारण से, यह अनुशंसा की जाती है कि एक व्यक्ति प्रत्येक प्रयोग के इमेजिंग और विश्लेषण भाग का प्रदर्शन करता है, जो परियोजना के पूरा होने के लिए समय की मात्रा बढ़ाता है।

गोल्गी-कॉक्स विधि के कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिनमें सटीक समय और ध्यान की आवश्यकता होती है। अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के साथ वर्गों को धुंधला करते समय, यह आवश्यक है कि अनुभाग समाधान में कम से कम 1 9 मिनट के लिए बने रहते हैं, लेकिन 21 मिनट से अधिक नहीं। यदि अनुभाग पर्याप्त समय के लिए अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान में नहीं हैं, तो वे ठीक से दाग नहीं करेंगे, जिसका अर्थ है कि इमेजिंग के दौरान न्यूरॉन्स कम परिभाषित होंगे, जिससे उन्हें विश्लेषण करने में कठिनाई होती है। यदि वर्ग 21 मिनट से अधिक समय के लिए अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान में हैं, तो वे ओव हो सकते हैंएर-स्टेन्ड, जिससे व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पहचान करना मुश्किल हो जाता है। इसलिए, जब समाधान बाहर स्विच करते हैं, तो शोधकर्ता को तेजी से चलना चाहिए एक और महत्वपूर्ण कदम स्लाइड्स पर वर्गों का हस्तांतरण है बड़े पेंटब्रश वाले वर्गों को ले जाने से पहले, स्लाइड पर पीबीएस-टी की एक छोटी राशि पहले जोड़ना सबसे अच्छा है इससे वर्गों को आसानी से स्लाइड पर रखा जा सकता है और संभवतः अलग-अलग को तोड़ने के बिना कूच किया जा सकता है। एक और महत्वपूर्ण कदम एक स्लाइड पर वर्गों को रखा जाने के बाद सुखाने का चरण है। यदि स्लाइड्स कमरे के तापमान पर कम से कम 20 मिनट के लिए सूखे नहीं हैं, तो निश्चित रूप से निर्जलीकरण चरण यदि स्लाइड 30 मिनट से अधिक समय तक सूख जाती है, तो वे सबसे अधिक भंगुर हो जाते हैं और निर्जलीकरण के चरणों के दौरान अलग हो जाते हैं।

इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय, कुछ ऐसे कदम होते हैं जो परेशानी हो सकती हैं उदाहरण के लिए, यदि मस्तिष्क को कल्पना पर रखने से पहले पूरी सेरिबैलम काट दिया जाता हैएमएएन धारक और सेक्शनिंग, डीजी पूरी तरह से विभाजित होने से पहले मस्तिष्क अलग हो सकती है, किसी भी अन्य अनुभाग को अनुपयोगी बनाने के लिए। इसलिए, सेर्ब्रिबैल के लगभग आधे भाग के माध्यम से केवल कपाल रूप से कटौती करना महत्वपूर्ण है। एक और कदम जो नकारात्मक रूप से वर्गों को प्रभावित कर सकता है vibratome गति और आयाम है जबकि अनुशंसित सेटिंग्स क्रमशः 7 और 6 के लिए होती हैं, लेकिन कुछ हिस्सों को पीबीएस में विभाजित किया जा सकता है या असमान दिखाई दे सकता है। इसे ठीक करने के लिए, कंपन के गति या आयाम को एक समय में समायोजित करें, जब तक कि अनुभागों में अंतर न हो और यहां तक ​​कि 6-8 की सेटिंग के बीच भी।

हालांकि गोल्गी धुंधला के लिए व्यावसायिक किट उपलब्ध हैं, लेकिन उन्हें प्रत्येक व्यक्ति के कदम के लिए सटीक विवरण की कमी होती है। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम सभी चरणों को विस्तार से रिपोर्ट करते हैं जो अन्य प्रयोगशालाओं को कम से कम समस्या निवारण वाले उच्च गुणवत्ता वाले टिशू को दागने के लिए इस्तेमाल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रयुक्त सामग्री अधिकांश तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध हैं। डेन्ड्रैइट मोरप में एब्रेसनवृक्ष के वृक्ष spines की संख्या में hology और परिवर्तन न्यूरोलॉजिकल विकारों की एक भीड़ 31 से संबंधित हैं। इसके अलावा, वृक्ष वृक्षारोपण के बावजूद इन विकृतियों ने मस्तिष्क में कीमोथेरेपी प्रेरित चोट की एक महत्वपूर्ण आकृति विज्ञानिक पहचान का प्रतिनिधित्व किया। भविष्य में, हम देखेंगे कि 5-फ़ू द्वारा प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तन व्यवहार, सेलुलर और आणविक परिवर्तनों से संबंधित हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

यह काम एनआईएच पी 20 जीएम 10 9 005 (एआरए) के तहत पायलट अनुदान द्वारा समर्थित था और सेंटर फॉर ट्रांसलेजनल न्यूरोसाइंस आईडीईए कार्यक्रम पुरस्कार पी 30 जीएम 110702

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

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References

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