Évaluation de la complexité dendritique de l'hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

Neuroscience

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Summary

Nous présentons ici un protocole Golgi-Cox avec beaucoup de détails. Cette méthode de tache tissulaire fiable permet une évaluation de haute qualité de la cytoarchitecture dans l'hippocampe et dans tout le cerveau, avec un dépannage minimal.

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Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

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Abstract

Les épines dendritiques sont les protubérances des arbres dendritiques neuronaux qui contiennent des synapses excitatrices. Les variations morphologiques et ramifiées des dendrites neuronales dans l'hippocampe sont impliquées dans la cognition et la formation de la mémoire. Il existe plusieurs approches pour la coloration de Golgi, qui ont tous été utiles pour déterminer les caractéristiques morphologiques des arbrisseaux dendritiques et produire un fond clair. La présente méthode de Golgi-Cox (une légère variation du protocole qui est fourni avec un kit de coloration Golgi commercial) a été conçue pour évaluer comment une dose relativement faible du médicament chimiothérapeutique 5-flurouracile (5-Fu) affecterait la morphologie dendritique , Le nombre d'épines et la complexité de l'arborisation dans l'hippocampe. Le 5-Fu modulait de manière significative la complexité dendritique et réduisait la densité de la colonne vertébrale tout au long de l'hippocampe de manière spécifique à une région. Les données présentées montrent que la méthode de coloration de GolgiColoré efficacement les neurones matures dans le CA1, le CA3 et le gyrus denté (DG) de l'hippocampe. Ce protocole rapporte les détails pour chaque étape afin que d'autres chercheurs puissent tacher les tissus de façon fiable dans tout le cerveau avec des résultats de haute qualité et un dépannage minimal.

Introduction

Les dendrites sont la plus grande partie des neurones qui reçoivent et traitent l'entrée présynaptique 1 . Leurs procédés dendritiques ont une géométrie complexe, où les branches proximales ont un diamètre plus grand que les branches distales. À mesure que les dendrites se développent, elles forment plusieurs connexions avec d'autres neurones dans un processus appelé arborisation dendritique. L'étendue et le motif de cette ramification détermine la quantité d'entrées synaptiques qu'un dendrite peut traiter de manière adéquate 2 .

L'arborisation dendritique est un processus nécessaire pour la plasticité dépendant de l'activité et le développement approprié des circuits neuronaux. L'extension, la rétraction, la ramification et la synaptogenèse sont des processus complexes qui incluent des programmes génétiques intrinsèques et des influences de facteurs extrinsèques. Les variations morphologiques et ramifiées des dendrites neuronales dans l'hippocampe sont impliquées dans la cognition et la formation de la mémoireF "> 3 , 4. Les altérations de la complexité dendritique sont associées à des changements physiopathologiques et comportementaux 5. Les anomalies sont liées à plusieurs états pathologiques, y compris le syndrome du X fragile et le syndrome de Down 6 .

Les épines dendritiques sont les compartiments sous-cellulaires spécialisés des arbrisseaux dendritiques qui reçoivent une entrée excitatrice dans le système nerveux central. Il existe trois classes morphologiques d'épines dendritiques, avec le nom de chaque classe en fonction de leur taille et leur forme: 1) épines de champignon, qui ont des densités postsynaptiques complexes avec plus de récepteurs de glutamate que d'autres épines 7 ; 2) épines tronquées, qui n'ont pas de tige; Et 3) épines minces, qui se composent d'une tige longue et prolongée et d'une tête globulaire 8 . Le volume dendritique de la colonne vertébrale est utilisé en partie pour les définir, avec des épines minces généralement plus petites (0,01 μm 3 3 ) 9 , 10 . Les épines se stabilisent avec la maturation. Par exemple, les épines fines se rétractent après quelques jours ou se développent en épines de champignons. Alternativement, les épines des champignons sont relativement stables et peuvent survivre pendant une période prolongée. La force des connexions neuronales est pensée selon le nombre d'épines et / ou leur volume 11 , 12 , 13 .

La méthode classique de coloration de Golgi et ses variations plus modernes ont tous été utiles pour examiner la morphologie et la densité de la colonne vertébrale dendritique. Un aspect unique de la coloration de Golgi est qu'il taches aléatoires d'environ 5% des neurones totaux, ce qui permet le traçage des neurones individuels 14 , 15 . Bien que le mécanisme exact dans lequel la méthamphétamie de GolgiLes tumeurs individuelles sont encore inconnues, le principe de la méthode est basé sur la cristallisation du chromate d'argent (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Il existe trois types principaux de la méthode de Golgi: le Golgi rapide, le Golgi-Cox et le Golgi-Kopsch 18 , 19 . Les trois méthodes commencent par une phase d'incubation initiale dans des sels de chrome pendant plusieurs jours à plusieurs mois, mais il existe certaines différences clés entre elles. Le Golgi rapide utilise du tétroxyde d'osmium dans la première étape, tandis que le Golgi-Kopsch comprend du paraformaldéhyde. La coloration à la fois du Golgi rapide et du Golgi-Kopsch est suivie d'une incubation dans une solution de nitrate d'argent 1-2% pendant environ 7 jours. La méthode de Golgi-Cox utilise du chlorure de mercure et du dichromate de potassium au lieu du nitrate d'argent et a un temps d'imprégnation de 2-4 semaines. Les tissus sont ensuite sectionnés et placés rapidement dans un ammoniac diluéSolution, suivie d'un fixateur photographique pour éliminer les sels. Parmi les trois types, on pense que la méthode de Golgi-Cox est la meilleure pour la coloration des arbrisseaux dendritiques sans beaucoup d'interférences de fond, en partie parce que les artefacts de cristal ne se produisent pas à la surface du tissu (contrairement à la méthode rapide de Golgi) 17 , 20 , 21 .

La présente méthode est une légère variation du protocole fourni avec un kit de coloration Golgi commercial et a été conçue pour évaluer comment une dose relativement basse du 5-Fu affecterait les caractéristiques morphologiques dendritiques et la densité de la colonne vertébrale. Toute donnée acquise pourrait donner une idée plus approfondie de la façon dont le traitement chimiothérapeutique affecte les circuits neuronaux.

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Protocol

Les expériences ont été menées conformément aux normes éthiques approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux à l'UAMS.

1. Animaux et paradigme d'injection 5-Fu

  1. Achetez des souris de type sauvage mâle C57Bl6 / J de 6 mois et les héberger sous un cycle continu clair / clair de 12 h jusqu'à ce qu'elles atteignent l'âge de 1 an.
  2. Diluer le 5-Fu dans une solution saline stérile à 0,9%. Utilisez 60 mg / kg comme dose requise par souris.
  3. Donner les injections intrapéritonéales du 5-Fu (une fois par semaine pendant trois semaines).
    1. Donner les injections intrapéritonéales autour du même temps chaque jour. Par exemple, entre 09h00 et 12h00.
  4. Éuthaniser les animaux et extraire les cerveaux 30 jours après l'injection finale.

2. Procédure d'euthanasie et extraction du cerveau

  1. Rallumez le rongeur et saisissez la base de la queue. D'autre part, placez le pouce ou le premier doigtE base du cou du rongeur. Pressez rapidement le cou du rongeur et enfoncez en même temps que l'autre main tendant la queue vers l'arrière.
  2. Tenir le rongeur d'une main et les gros ciseaux chirurgicaux avec l'autre. Placez le cou du rongeur entre les deux lames et décapitez rapidement la tête.
  3. Prenez la tête de la souris coupée, et utilisez les ciseaux fins pour couper la fourrure au-dessus du crâne, jusqu'à l'oeil. Ensuite, placez les pointes des ciseaux dans chaque douille oculaire et fermez les ciseaux avec une légère force.
  4. Utilisez des ciseaux à ressort pour couper le crâne à gauche et à droite du cervelet.
  5. Utilisez des pinces pour soulever la partie du crâne entourant le cervelet directement de haut en bas.
  6. Utilisez les ciseaux à ressort pour couper le long de la ligne midsagittal du crâne.
  7. Utilisez la pince pour soulever la partie restante du crâne hors du cerveau.
  8. Utilisez une spatule et une sonde pour extraire le cerveau dans le contenant désiré. Utilisation d'un acier inoxydableTaper la lame, couper chaque cerveau le long de l'avion midsagittal. Effectuez la méthode suivante de Golgi-Cox sur les hémisphères droit.

3. Coloration de Golgi et préparation des tissus

  1. Immergez les demi-cerveaux récemment récoltés dans une solution à base de chlorure mercurique de 5 ml (solution A du kit) dans un tube conique de 10 ml. La solution de chlorure de mercure est sensible à la lumière; Recouvrir le tube avec du papier d'aluminium. Rangez l'échantillon dans l'obscurité à température ambiante.
    REMARQUE: la solution A est fournie dans le kit qui figure dans la table des matières. Mise en garde! La solution A (également appelée solution de chlorure mercurique) contient des réactifs toxiques tels que le dichromate de potassium, le chlorure de mercure et le chromate de potassium. Porter des gants de protection et travailler dans une hotte aspirante.
  2. Après 1 jour, décanter lentement la solution dans un récipient provisoire (comme un gros bateau à peser), et la jeter dans un conteneur de déchets biologiques. Immergez le cerveau (encore dans les tubes coniques de 10 ml d'origine) avec 5 mL deLa solution de chlorure de mercure et renvoyer l'échantillon à l'obscurité à température ambiante pendant 13 jours de plus.
  3. Ajouter 30 g de tampon post-imprégnation à 90 ml d'eau distillée ou désionisée (dH 2 O). Remplissez chaque puits d'une plaque à 6 puits avec 6,5 ml du tampon post-imprégnation, un puits par cerveau
    REMARQUE: le tampon après imprégnation est fourni dans le kit figurant dans la table des matières.
    1. Après 14 jours (au total) dans la solution de chlorure mercurique, rincer le tissu avec du dH 2 O, puis les transférer dans des plaques à 6 puits avec un tampon après imprégnation. Couvrez les plaques avec du papier d'aluminium et rangez-les à température ambiante dans l'obscurité.
  4. Pipetter le tampon après imprégnation après 1 jour d'immersion et renouveler avec un tampon de post-imprégnation frais; Conserver pendant 1 jour dans l'obscurité à température ambiante. Si nécessaire, conservez ce à 4 ° C pendant 1 mois maximum 22 .

4. Section

  1. Étiquetez les plaques à 12 puits sur leurs couvercles avec des chiffres en ordre croissant de gauche à droite et vers le haut vers le bas.
  2. Préparez deux ou trois plaques de 12 puits par cerveau si vous sectionnez tout le cerveau.
    1. Étiquetez le haut de chaque couvercle de plaque de 12 puits avec le numéro d'identification du cerveau sectionné.
    2. Pipettez 2 mL de 1x PBS dans chaque puits de chaque assiette.
  3. Mettre en place la scène et allumer le vibratome; Assurez-vous qu'il y a suffisamment de 1x PBS dans le récipient pour couvrir le tissu.
    1. Couper deux morceaux de film de paraffine en plastique et les plier deux fois. Placez-les sur les trous pour les boutons du porte-échantillon pour éviter que PBS ne pèche sur le comptoir.
    2. Mettez le ruban sur le bloc de tissu du porte-échantillon, puis posez-le sur une colle adhésive au cyanoacrylate (voir tableau).
  4. Retirez le cerveau de la plaque à 6 puits et placez-le sur un plat en plastique ou en verre. Utilisez l'acier inoxydableLame à double tranchant en acier pour couper environ la moitié du cervelet.
    1. Couper le cervelet au caudal. Assurez-vous que la partie du cervelet restant est égale.
  5. Placez immédiatement la surface plane du cervelet restant sur la colle.
    NOTE: La partie dorsale du tissu (le cortex cérébral) doit être tournée vers la gauche ou vers la droite par rapport à la lame. L'extrémité rostrale qui contenait précédemment l'ampoule olfactive attachée devrait faire face vers le haut.
    1. Attendez au moins quelques minutes pour vous assurer que la colle sèche complètement.
  6. Alors que la colle qui maintient le cerveau en place est en train de sécher, versez 1x PBS dans le bain d'échantillon. Une fois la colle séchée, placez le porte-échantillon avec le tissu dans le bain d'échantillon.
    1. Si l'échantillon de tissu n'est pas entièrement recouvert, versez plus de 1x PBS dans le bain d'échantillon.
  7. Fixez la lame sur le porte-lame du vibratome et lentement lMettre la lame dans le bain de l'échantillon jusqu'à ce qu'il soit complètement immergé dans 1x PBS. Continuez à abaisser la lame jusqu'à ce qu'elle soit légèrement en dessous du haut du tissu.
  8. Réglez la vitesse du vibratome sur 7, l'amplitude à 6 et l'angle de coupe à 12 ° (voir la table des matériaux pour le modèle vibratome). Démarrez les vibrations et coupez les sections de 200 μm 23 .
    1. Utilisez un grand pinceau pour déplacer les sections de tissu du bain d'échantillon dans chaque puits désigné des plaques à 12 puits.
  9. Continuer à couper le tissu jusqu'à ce que le nombre souhaité de sections de tissu soit atteint.

5. Post-coloration

  1. Pour chacune des étapes de coloration et des rinçages suivants, utiliser 2 ml de la solution indiquée par puits. Utilisez un remplisseur de pipette motorisé (voir le tableau des matériaux) pour transférer les solutions dans les puits. Utilisez une pipette de transfert (voir le tableau des matériaux) pour transférer les solutions des puits et dans les déchets appropriésConteneurs.
  2. Rincer les sections dans un lavage de 30 minutes de PBS-T 0,01 M (ajouter 3,0 ml de détergent (voir tableau de matériaux) à 1 000 ml de PBS 0,01 M).
  3. Diluer la solution d'hydroxyde d'ammonium (Attention) 3: 5 en volume avec dH 2 O immédiatement avant utilisation. Tacher les sections dans la solution diluée d'hydroxyde d'ammonium pendant 19-21 min.
    1. Protégez la solution d'hydroxyde d'ammonium sensible à la lumière avec du papier d'aluminium.
      REMARQUE: L'hydroxyde d'ammonium dans la solution a une concentration de ~ 10% et elle est classée comme "dangereuse". La solution d'hydroxyde d'ammonium peut provoquer des brûlures si elle entre en contact avec la peau. Cela peut provoquer une irritation des voies respiratoires si inhalé. Porter des gants de protection et travailler dans une hotte aspirante.
  4. Tacher les sections dans le tampon post-colorant (ajouter 90 g de réactif D dans 500 ml dH 2 O) pendant 19-21 min. Le tampon de post-coloration est sensible à la lumière; Protégez-le avec du papier d'aluminium 22 .
  5. Rincez les sections en trois, 5-10 minutes de lavage de 0,01 M de PBS-T.

6. Montage, nettoyage et revêtement

  1. Montez les sections sur 1% de glacières revêtues de gélatine avec le grand pinceau. Laissez-les sécher pendant 20-30 min à température ambiante, puis placez-les dans un pot de Coplin pendant la nuit.
  2. Retirez les diapositives avec des mains gantées du pot de Coplin et placez-les dans une grille en plastique (voir la table des matières). Placez le support en plastique dans le plat de coloration (voir le tableau des matières) contenant 100% d'éthanol. Déshydratez-les avec trois lavages de 5 min.
  3. Lavez les diapositives deux fois pendant 5 min chacun dans du xylene à 99%. Placez les diapositives dans une grille en verre et abaissez la crémaillère dans un plat de vitrage contenant du xylène avec une poignée métallique (voir la table des matières).
    REMARQUE: Attention, le Xylène est nocif par inhalation et provoque une irritation s'il touche la peau. Il est très inflammable dans les états liquide et vapeur. Porter des gants de protection et travailler dans une hotte aspirante.
  4. Retirez les diapositives du xylEn un à la fois et couvrez rapidement le tissu avec ~ 0,25 ml de support de montage (voir la table des matériaux). Ensuite, prenez les coulisseaux et placez-les sur les médias.
    1. Poussez toutes les bulles d'air piégées sous les coulisseaux vers le bord avec un objet émoussé, comme la fin d'un pinceau.
  5. Placez les glissières dans une zone à l'abri de la lumière du soleil et laissez-les sécher pendant 2-3 jours.
  6. Procédez à l'acquisition d'images à l'aide d'un microscope et analysez avec le logiciel approprié.

7. Acquérir une pile d'images

  1. Ouvrez le programme d'imagerie (voir Tableau des matériaux ). Placez la glissière sur la scène du microscope. Dans le menu en haut du programme, cliquez sur "Acquisition", puis cliquez sur "Live Image".
  2. Mettre le microscope sur 10X. Identifiez le neurone de préférence, puis amenez le curseur, qui apparaît comme un X rouge, sur le centre du soma. Cliquez à gauche pour définir le point de référence.
  3. Mettre le microscope à 40X. Cliquez sur «Déplacer» dans le menu en haut du programme, puis cliquez sur «Point de référence».
  4. Commencez à créer la pile d'images en défilant manuellement avec l'objectif fin au-dessus du tissu jusqu'à ce qu'il soit légèrement hors de portée.
    1. Cliquez sur "Set Top" dans le coin inférieur droit du programme sous la rubrique "Acquisition d'image".
    2. Faites défiler légèrement sous le tissu jusqu'à ce qu'il soit légèrement hors de portée, puis cliquez sur "Set Bottom" sous "Image Acquisition". Ensuite, cliquez sur "Acquérir la pile d'images".
  5. Une fois la pile d'images acquise, tapez le nom souhaité pour le fichier image dans la fenêtre qui s'affiche. Enregistrer sous "Fichier MBF Ascii".
    1. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez le type de fichier comme "Fichier de pile MB2000 JPEG2000", puis cliquez sur "Enregistrer".

8. Traçage neuronal

  1. Dans la toolbaDessous du menu, cliquez sur la case intitulée «Contour Name». Sélectionnez "Soma" dans le menu déroulant.
  2. Tracer manuellement le soma. Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez "Terminer le corps de la cellule" lorsque le suivi est terminé.
  3. Sélectionnez "AutoNeuron" pour afficher un autre onglet intitulé "AutoNeuron Workflow".
  4. Sous "Type de configuration", sélectionnez "Nouveau". Réglez les paramètres, puis cliquez sur "Prochaine étape" pour afficher la sous-position "Soma Détection".
    1. Pour définir les paramètres, sélectionnez "Brightfield". Ensuite, sous "Max Process Diameter", cliquez sur "Démarrer la mesure". À l'aide du curseur, accédez à la base du dendrite et définissez manuellement le diamètre.
  5. Cliquez sur "Oui" dans la fenêtre qui demande à l'utilisateur de tracer l'image entière. Tracer manuellement le soma. Désinstalle, puis cliquez sur "Prochaine étape" pour afficher la sous-position "Placement de semences".
  6. Cliquez sur "Valider la graine"S ", puis cliquez sur" Prochaine étape "pour afficher la sous-position" Neuron Reconstruction ".
  7. Sous "Neuron", cliquez sur "Interactif". Effectuez un suivi interactif en suivant la direction du programme des dendrites et cliquez avec le bouton droit de la souris pour compléter la zone en surbrillance tracée par le programme. Après avoir tracé toutes les dendrites, cliquez sur "Prochaine étape".
  8. Une fois qu'une nouvelle fenêtre apparaît, enregistrez la nouvelle configuration avec le titre souhaité. Cliquez sur "Enregistrer".

9. Analyse

  1. Ouvrez le programme d'analyse (voir la table des matières).
  2. Cliquez sur "Fichier" dans le menu principal, puis cliquez sur "Ouvrir le fichier de données". Sélectionnez le fichier d'intérêt.
  3. Sous la sous-rubrique d'analyse, sélectionnez "Analyse Sholl".
  4. Dans la fenêtre "Analyse Sholl", définissez le rayon de départ à 10 μm. Sous «Analyse», cliquez sur les cases «Dendrites» et «Branch Orders».
  5. Droit ClIck la fenêtre nouvellement ouverte et cliquez sur "Excel Export". Cliquez sur "Enregistrer".
  6. Sous l'analyse, cliquez sur "Analyses de structure dérivée". Sélectionnez "Toutes les analyses possibles".
  7. Cliquez avec le bouton droit sur la fenêtre nouvellement ouverte et cliquez sur "Exporter Excel" 24 .

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Representative Results

Les effets du traitement 5-Fu sur l'arborisation et la complexité dendritiques dans l'hippocampe des sections cérébrales colorées par Golgi ont été quantifiés et tracés à l'aide d'un logiciel d'imagerie disponible dans le commerce. Après le traçage, l'arborisation dendritique, la densité de la colonne vertébrale et la morphologie de la colonne vertébrale ont été analysées à l'aide de l'analyse Sholl et de l'indice de complexité dendritique (DCI). L'analyse de Sholl est une méthode analytique quantitative qui peut être utilisée pour déterminer la morphologie de l'arbre dendritique 25 . À partir du soma, des cercles de 10 μm l'un de l'autre recouvrent les traces dendritiques. La longueur des dendrites est déterminée par le nombre de cercles que les dendrites traversent. L'analyse du point de branchement, méthode pour déterminer la complexité d'un arbre dendritique, est basée sur le nombre et l'ordre des points de branche.

Un point de branchement est défini commeLa branche se divise en deux sous-branches. L'ordre des branches est une mesure de la complexité en fonction du nombre de fois que les branches se divisent. Par exemple, un point de branche de premier ordre serait la dendrite originale s'étendant à partir du soma, tandis qu'un point de dérivation de second ordre serait le point où la branche se divise en deux sous-branches. En examinant à la fois les points de branchement et l'ordre de branchement, la complexité de l'arête dendritique (en fonction du nombre de points de branchement) et à quel point la ramification se produit (un ordre de branche plus petit est plus proche du soma, alors qu'un ordre de branche plus large est Plus loin du soma) peut être déterminé. Ces paramètres ont été appliqués à l'ICD. Les CA1 et CA3 ont été divisés en portions apicales et basales et analysés indépendamment 26 , 27 .

Les dendrites des neurones pyramidaux CA1 et CA3 et des neurones granulaires dans la DG ont été analysées. Tous les neurones sélectionnés pourChaque groupe expérimental remplissait les critères suivants: 1) les dendrites présentaient une coloration foncée de Golgi sombre et uniforme sur toute leur longueur, 2) les dendrites étaient visiblement intactes, et 3) chaque neurone disposait d'un espace suffisant entre eux pour éviter les interférences pendant l'analyse 28 . La figure 1 démontre un neurone qui répond aux critères ci-dessus. Les données ont été exprimées en moyenne ± SEM. Pour déterminer les différences statistiques entre le simulateur et les groupes 5-Fu, un test t à deux têtes apparié a été utilisé. Toutes les analyses statistiques ont été menées à l'aide d'un logiciel analytique (voir tableau de matériaux) et p <0,5 a été considéré comme significatif. Une analyse de variance des facteurs mixtes (ANOVA) a été utilisée pour évaluer les effets du traitement 5-Fu et du rayon Sholl. Les tests post-hoc de Fisher LSD ont été utilisés après ANOVA lorsque cela était approprié 29 .

Dans les CA 1 ( t = 7,68, p <0,01; Figure 2 A ) et CA3 ( t = 7,54, p <0,01; Figure 3 A ) dendrites pyramidales apicales, il y a eu une réduction globale significative des épines après le traitement 5-Fu. Alors que le traitement 5-Fu n'a pas affecté de manière significative la densité de la colonne vertébrale basale de CA1 ( t = 1.79, p = 0.15; Figure 2 B ), il a considérablement diminué les épines dendritiques pyramidales basiques CA3 ( t = 5.57, p <0.05; Figure 3 B ). En outre, les tests post-hoc de Fisher LSD ont révélé une diminution de l'arborisation dendritique des dendrites pyramidales apicales CA1 à 40-100 μm (LSD de Fisher, p <0,001, Figure 2 C ) et 130-160 μm (Fisher's LSD, p < 0,05;La figure 2 C ) est absente du soma par rapport aux témoins traités par voie saline. Un phénomène similaire a été observé chez les dendrites apicales basiques CA1 à 30-60 μm (LSD de Fisher, p <0,001, Figure 2 D ) et 70-110 Μm (LSD de Fisher, p <0,05; Figure 2 D ) loin du soma 29 .

En ce qui concerne les dendrites pyramidales apicales CA3, il n'y a pas eu de différence significative dans la longueur dendritique segmentaire après le traitement 5-Fu par rapport aux témoins traités par la solution saline ( F (28,87) = 0,91; p = 0,59; Figure 3 C ). Cependant, pour les dendrites pyramidales basiques CA3, il y avait une différence significative entre le traitement 5-Fu et les témoins traités par la solution saline dans la longueur dendritique segmentée ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Figure 3 D ). Le LSD de Fisher a révélé que le traitement 5-Fu a diminué l'arborisation dendritique à 90-100 μm ( p <0,01; Figure 3 D ), 70-80 μm et 110-120 μm (Fisher's LSD, p <0.05; Figure 3 D ) Loin du soma 29 .

Pour déterminer la complexité dendritique, une analyse de l'ordre des branches a été utilisée pour comparer les groupes témoins 5-Fu traités et les groupes témoins traités avec la solution saline. Au sein de la DG, l'analyse de l'ordre des branches a montré une différence significative entre chaque traitement et l'ordre des branches ( F (8, 36) = 25,61, p <0,001; Figure 4 ). Ceci a été analysé plus avant en utilisant le LSD de Fisher, qui a indiqué qu'il y avait une diminution de la longueur au 4ème et 6èmeOrdre suivant le traitement 5-Fu ( p <0,001; Figure 4 ) 29 .

Figure 1
Figure 1 : neurone coloré par Golgi qui représente les critères d'imagerie et d'analyse approfondie. Les trois types de colonne vertébrale peuvent être facilement observés après la coloration de Golgi. La coloration est constante sur toute la longueur de la dendrite et la dendrite est isolée des autres neurones. Barre d'échelle, 5 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Golgi taché n Les eurons ont démontré des différences significatives dans la densité de la colonne vertébrale entre les groupes 5-Fu traités et les groupes traités par voie saline dans le CA1 apical, mais pas le CA1 basal. Il y avait une différence significative dans la longueur de la colonne vertébrale entre les groupes traités par 5-Fu et traités par voie saline dans le CA1 apical et basal. (A) Dans les dendrites pyramidales apicales CA1, 5-Fu a considérablement diminué la densité de la colonne vertébrale. ( B ) Dans les dendrites basales, il n'y a pas eu de changements significatifs dans la densité globale des épines. ( C ) L'analyse Sholl a révélé que le traitement 5-Fu a considérablement diminué l'arborisation dendritique à 40-100 μm et 130-160 μm loin du soma dans les dendrites pyramidales apicales CA1. ( D ) Dans les dendrites basales, le traitement 5-Fu a diminué l'arborisation dendritique à 30-60 μm et à 70-110 μm du soma. Moyenne ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3 : Les neurones colorés à Golgi ont démontré des différences significatives dans la densité de la colonne vertébrale entre les groupes traités par 5-Fu et traités par voie saline dans le CA3 apical et basal. Il y a eu une différence significative dans la longueur de la colonne vertébrale entre les groupes traités par 5-Fu et traités par voie saline dans CA3 apical, mais pas avec CA3 basal. (A) Dans les dendrites pyramidales apicales CA3, 5-Fu a considérablement diminué la densité de la colonne vertébrale. ( B ) Dans les dendrites basales, 5-Fu a considérablement diminué la densité globale des épines. ( C ) Il n'y avait aucun effet significatif du traitement 5-Fu dans la zone apicale CA 3. ( D ) Dans les dendrites basales, 5-Fu treaUne diminution de l'arborisation dendritique à 70-120 μm du soma. Moyenne ± SEM (n = 6). *, P <0,05; **, p <0,01, ANOVA 29 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Les neurones colorés à Golgi au sein de la DG ont montré une diminution de la longueur au 4ème et 6ème ordre suite au traitement par 5-Fu par rapport au groupe traité par voie saline. Longueur par ordre de branche dans les neurones pyramidaux de la région de l'hippocampe CA1. Moyenne ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 . PlaidoyerSe cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Par rapport aux techniques plus modernes, la méthode de Golgi-Cox présente plusieurs avantages qui en font la méthode préférée pour l'examen de la morphologie de la colonne vertébrale: 1) La coloration peut être utilisée pour essentiellement n'importe quel tissu, 2) Une configuration de base du microscope optique est tout ce qui est nécessaire pour Acquérir des images basées sur Golgi, 3) L'imagerie de Golgi-Cox est plus rapide que l'imagerie confocale, et 4) Les sections colorées de Golgi sont viables pendant plusieurs mois à des années plus longtemps que les échantillons marqués par fluorescence. Même avec ces avantages, la méthode de Golgi-Cox a encore certaines limites. Tout d'abord, tout le processus nécessite beaucoup de temps, nécessitant plusieurs semaines de coloration, suivi d'une analyse des images. Comme on l'a vu dans ce protocole, il faut 14 jours en solution A et 1 jour dans la solution B avant que la section ne commence. En outre, effectuer la section, la post-coloration et le montage prendront 2-3 heures par cerveau. Chaque lame doit être séchée pendant 1 jour avant de les nettoyer et de les recouvrir. Après quoi, le tempsIl faudra pour l'image et l'analyse, les sections dépendront de l'individu. Deuxièmement, il peut y avoir des problèmes de cohérence entre les données des analystes en raison des différences dans la classification des épines 30 . Pour cette raison, il est recommandé qu'une personne effectue la partie d'imagerie et d'analyse de chaque expérience, ce qui prolonge le temps de réalisation du projet.

Il existe plusieurs étapes critiques de la méthode de Golgi-Cox qui nécessitent une synchronisation et une attention exactes. Lors de la coloration des sections avec la solution d'hydroxyde d'ammonium, il est impératif que les sections restent dans la solution pendant au moins 19 min, mais pas plus de 21 min. Si les sections ne se trouvent pas dans la solution d'hydroxyde d'ammonium pendant un temps suffisant, elles ne seront pas correctement colorées, ce qui signifie que les neurones auront moins de définition lors de l'imagerie, ce qui rend plus difficile à les analyser. Si les sections se trouvent dans la solution d'hydroxyde d'ammonium pendant plus de 21 min, elles peuvent devenir ovEr-taché, ce qui rend difficile l'identification des neurones individuels. Par conséquent, lors de la substitution des solutions, le chercheur doit se déplacer rapidement. Une autre étape importante est le transfert des sections sur les diapositives. Avant de déplacer les sections avec le gros pinceau, il est préférable d'ajouter d'abord une petite quantité de PBS-T sur la glissière. Cela permet aux sections d'être facilement placées sur la glissière et manoeuvrées sans risque de rupture. Une autre étape critique est l'étape de séchage après que les sections sont placées sur une glissière. Si les lames ne sont pas séchées pendant au moins 20 minutes à température ambiante, certaines sections risquent de tomber pendant les étapes de déshydratation. Si les glissières sont séchées pendant plus de 30 min, elles deviennent probablement fragiles et se brisent pendant les étapes de déshydratation.

Lorsque vous effectuez cette procédure, certaines étapes peuvent être gênantes. Par exemple, si tout le cervelet est coupé avant de placer le cerveau sur les spécificationsLe titulaire et le sectionnement de l'image, le cerveau peut se séparer avant que la DG ne soit complètement sectionnée, rendant inutilisables les autres sections. Par conséquent, il est important de ne couper que caudalement environ environ la moitié du cervelet. Une autre étape qui peut avoir une incidence négative sur les sections est la vitesse vibratoire et l'amplitude. Alors que les paramètres recommandés sont respectivement de 7 et 6, lors de la coupe, certaines sections peuvent se désintégrer dans le PBS ou semblent inégales. Pour corriger cela, ajustez finement la vitesse vibratome ou l'amplitude, une à la fois jusqu'à ce que les sections soient intactes et même, entre les réglages de 6-8.

Bien que des kits commerciaux pour la coloration de Golgi soient disponibles, ils manquent souvent de détails précis pour chaque étape. Avec ce protocole, nous rapportons en détail toutes les étapes qui ont été utilisées pour permettre à d'autres laboratoires de tacher les tissus de façon fiable avec une qualité élevée et un dépannage minimal. Les matériaux utilisés sont disponibles pour la plupart des laboratoires de neurosciences. Aberrations en dendrite morpL'hologie et les altérations du nombre d'épines dendritiques sont liées à une multitude de troubles neurologiques 31 . En outre, ces perturbations de l'arborisation dendritique pourraient représenter une caractéristique morphologique significative de la lésion induite par la chimiothérapie dans le cerveau 32 . À l'avenir, nous examinerons comment les altérations structurelles induites par 5-Fu peuvent se rapporter aux changements comportementaux, cellulaires et moléculaires.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention pilote sous NIH P20 GM109005 (ARA) et par le programme de l'IDeA de Translational Neuroscience P30 GM110702.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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