Vurdering av hippocampal dendritisk kompleksitet hos gamle mus ved bruk av Golgi-Cox-metoden

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en Golgi-Cox-protokoll i omfattende detalj. Denne pålitelige vevfargemetoden muliggjør en høyverdig vurdering av cytoarkitekturen i hippocampus, og gjennom hele hjernen, med minimal feilsøking.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dendritiske spines er fremspringene fra de nevonale dendritiske akslene som inneholder eksitatoriske synapser. De morfologiske og forgreningsvarianter av nevronedenditene i hippocampus er implisert i kognisjon og minneformasjon. Det er flere tilnærminger til Golgi-farging, som alle har vært nyttige for å bestemme de morfologiske egenskapene til dendritiske arbors og gi en klar bakgrunn. Den nåværende Golgi-Cox-metoden, (en liten variasjon av protokollen som er forsynt med et kommersielt Golgi-fargekit), ble utformet for å vurdere hvordan en relativt lav dose av det kjemoterapeutiske legemidlet 5-flurouracil (5-Fu) ville påvirke dendritisk morfologi , Antall spines, og kompleksiteten av arborization i hippocampus. 5-Fu-modulen signifikant modulerte den dendritiske kompleksiteten og reduserte ryggradens tetthet gjennom hippocampuset på en regionspesifikk måte. Dataene som presenteres viser at Golgi-fargemetoden efFektively farget de modne nevronene i CA1, CA3, og dentate gyrus (DG) i hippocampus. Denne protokollen rapporterer detaljene for hvert trinn, slik at andre forskere på en pålitelig måte kan flekke vev gjennom hele hjernen med høye kvalitetsresultater og minimal feilsøking.

Introduction

Dendriter er den største delen av nevroner som mottar og behandler presynaptisk inngang 1 . Deres dendritiske prosesser har en kompleks geometri, der de proximale grener har en større diameter enn de distale grener. Som dendriter utvikler, danner de flere forbindelser med andre nevroner i en prosess kalt dendritisk arborisering. Omfanget og mønsteret av denne forgreningen bestemmer mengden synaptiske innganger som en dendrit kan tilstrekkelig behandle 2 .

Dendritisk arborisering er en nødvendig prosess for aktivitetsavhengig plastisitet og riktig utvikling av nevronkretsene. Forlengelse, tilbaketrekking, forgrening og synaptogenese er intrikate prosesser som inkluderer inneboende genetiske programmer og påvirkninger fra ekstrinsiske faktorer. De morfologiske og forgreningsvarianter av nevronedenditene i hippocampus er implisert i kognisjon og minneformasjonF "> 3 , 4. Endringene i dendritisk kompleksitet er forbundet med patofysiologiske og atferdsendringer 5. Abnormaliteter er relatert til flere sykdomstilstander, inkludert Fragile X Syndrome og Down Syndrome 6 .

Dendritiske spines er de spesialiserte subcellulære delene av dendritiske arbors som mottar excitatorisk inngang i sentralnervesystemet. Det er tre morfologiske klasser av dendritiske spines, med navnet på hver klasse basert på deres størrelse og form: 1) sopphudder, som har komplekse postsynaptiske tettheter med mer glutamatreseptorer enn andre spines 7 ; 2) stubbe spines, som mangler en stamme; Og 3) tynne spines, som består av en langstrakt, smal stamme og et kuleformet hode 8 . Dendritisk ryggradsvolum brukes delvis til å definere dem, med tynnpinne generelt mindre (0,01 μm 3 3 ) 9 , 10 . Spines stabiliseres med modning. For eksempel trekker de tynne pigene seg enten etter noen dager eller utvikler seg til sopphudder. Alternativt er sopphvirvelene relativt stabile og kan overleve i en lengre periode. Styrken til nevronforbindelsene antas å være basert på antall spines og / eller deres volum 11 , 12 , 13 .

Den klassiske Golgi-fargemetoden og dens mer moderne variasjoner har alle vært nyttige for å undersøke dendritisk ryggradsmorfologi og tetthet. Et unikt aspekt ved Golgi-fargingen er at det tilfeldigvis flekker ca. 5% av de totale nevronene, noe som muliggjør sporing av individuelle neuroner 14 , 15 . Selv om den nøyaktige mekanismen som Golgi methOd flekker individuelle nevroner er fortsatt ukjente, prinsippet for metoden er basert på krystallisering av sølvkromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Det er tre hovedtyper av Golgi-metoden: den raske Golgi, Golgi-Cox og Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle tre metodene starter med en første inkubasjonsfase i kromsalter i flere dager til måneder, men det er visse viktige forskjeller mellom dem. Den raske Golgi bruker osmiumtetroksid i første trinn, mens Golgi-Kopsch inkluderer paraformaldehyd. Fargingen i både raske Golgi og Golgi-Kopsch følges av en inkubasjon i en 1-2% sølvnitratløsning i ca. 7 dager. Golgi-Cox-metoden bruker merkuriklorid og kaliumdikromat i stedet for sølvnitrat og har en impregneringstid på 2-4 uker. Vevene blir så snittet og raskt plassert i en fortynnet ammoniakkLøsning, etterfulgt av en fotografisk fikseringsenhet for å fjerne salter. Av de tre typene anses Golgi-Cox-metoden å være den beste til å fargelegge dendritiske arbors uten mye bakgrunnsinterferens, delvis fordi krystallartefakter ikke forekommer på overflaten av vevet (i motsetning til den raske Golgi-metoden) 17 , 20 , 21 .

Den nåværende metoden er en liten variasjon av protokollen forsynt med et kommersielt Golgi-fargekit, og ble utformet for å vurdere hvordan en relativt lav dose av 5-Fu ville påvirke de dendritiske morfologiske egenskapene og ryggradens tetthet. Eventuelle data som er oppnådd, kan gi ytterligere innsikt i hvordan kjemoterapeutisk behandling påvirker nevronkredsløpet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter ble utført i samsvar med de etiske standarder som ble godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk ved UAMS.

1. Dyr og 5-Fu-injeksjonsparadigm

  1. Kjøp 6 måneder gamle mannlige C57Bl6 / J villtype mus og hus dem under en konstant 12-timers lys / mørk syklus til de når 1 år.
  2. Fortynn 5-Fu i 0,9% steril saltløsning. Bruk 60 mg / kg som ønsket dose per mus.
  3. Gi intraperitoneale injeksjoner av 5-Fu (en gang i uken i tre uker).
    1. Gi intraperitoneale injeksjoner rundt samme tid hver dag. For eksempel mellom 0900-1200 timer.
  4. Euthanize dyrene og trekk hjernen 30 dager etter den endelige injeksjonen.

2. Eutanasi Prosedyre og Brain Extraction

  1. Hold taket på gnageren og ta tak i halen. På den andre siden legger du tommelen eller fingerfingeren til denE basen av gnagerenes nakke. Trykk raskt på gnagerenes nakke og skyv fremover mens den andre hånden holder halen trukket bakover.
  2. Hold gnaven med en hånd og den store kirurgiske saks med den andre. Plasser gnagerenes nakke mellom de to bladene og raskt halshodet på hodet.
  3. Ta det avskårne musen hodet, og bruk den fine saks for å trimme pelsen over skallen, opp til øynene. Sett deretter saksens tips inn i hver øyekontakt og lukk saksene med liten kraft.
  4. Bruk vårsaks til å kutte skallen til venstre og høyre for hjernen.
  5. Bruk tanger for å løfte den delen av skallen som omgir cerebellum direkte opp og av.
  6. Bruk vårsaksene til å kutte langs den midsagittale linjen i skallen.
  7. Bruk tangen til å løfte resten av skallen av hjernen.
  8. Bruk en spatel og en sonde for å skape ut hjernen i ønsket beholder. Bruke en rustfri sTeelblad, kutt hver hjerne langs midsagittalplanet. Utfør følgende Golgi-Cox-metode på høyre halvkule.

3. Golgi-farging og vævspreparasjon

  1. Dyp de nyhøstede halvhjernene inn i 5 ml karbonkloridbasert oppløsning (løsning A fra settet) i et 10 ml konisk rør. Mercurikloridoppløsningen er lysfølsom; Dekk røret med folie. Oppbevar prøven i mørket ved romtemperatur.
    MERK: Løsning A leveres i settet som er oppført i materialetabellen. Forsiktighet! Løsning A (også kalt kvikksølvkloridoppløsning) inneholder giftige reagenser som kaliumdikromat, kvikksølvklorid og kaliumkromat. Bruk vernehansker og arbeid i avtrekksdeksel.
  2. Etter 1 dag, dekanter løsningen langsomt i en midlertidig beholder (som en stor veibåt), og kast den i en biobasert avfallsbeholder. Dyp hjernen (fortsatt i de originale 10 ml koniske rørene) med 5 mlKvikksølvkloridoppløsningen, og returner prøven til mørket ved romtemperatur i ytterligere 13 dager.
  3. Tilsett 30 g etter impregneringsbuffer til 90 ml destillert eller avionisert vann (dH 2 O). Fyll hver brønn i en 6-brønnplate med 6,5 ml av impregneringsbufferen, en brønn per hjerne
    MERK: Postimpregneringsbufferen er gitt i settet som er oppført i materialetabellen.
    1. Etter 14 dager (totalt) i kvikksølvkloridoppløsningen, skyll vevet med dH 2 O, og overfør dem deretter til 6-brønnsplater med postimpregneringsbuffer. Dekk platene med folie og lagre dem ved romtemperatur i mørket.
  4. Pipetter ut postimpregneringsbufferen etter 1 dag med nedsenkning og forny med fersk etterimpregneringsbuffer; Lagre i 1 dag i mørket ved romtemperatur. Oppbevar ved behov 4 ° C i opptil 1 måned 22 .

4. Seksjonering

  1. Merk de 12 brønnplatene på dekslene med tall i stigende rekkefølge fra venstre til høyre og opp-ned.
  2. Klargjør to eller tre brønner med 12 brønner per hjerne dersom de deler hele hjernen.
    1. Merk toppen av hvert 12-brønn platedeksel med identifikasjonsnummeret til hjernen.
    2. Pipetter 2 ml 1x PBS i hver brønn på hver plate.
  3. Sett opp scenen og slå på vibratomet; Sørg for at det er nok 1x PBS i beholderen for å dekke vevet.
    1. Klipp to stykker plastparafinfilm og brett dem over to ganger. Plasser dem over hullene for prøveholderens knapper for å hindre at 1x PBS lekker ut på disken.
    2. Legg båndet ned på vevblokken i prøveholderen og sett deretter lim på limet av cyanoakrylat (se tabell over materialer) på den.
  4. Fjern hjernen fra 6-brønnsplaten og legg den på en plast- eller glassfat. Bruk rustfrittStål dobbeltkantet blad for å kutte ut omtrent halvparten av cerebellum.
    1. Kut cerebellumet caudalt. Pass på at delen av cerebellum som er igjen er jevn.
  5. Plasser straks den flate overflaten av det resterende hjernebuketten på limen.
    MERK: Den dorsale delen av vevet (hjernebarken) skal vender mot venstre eller høyre i forhold til bladet. Den rostral-enden som tidligere inneholdt olfaktorisk pære festet, skal vende oppover.
    1. Vent minst et par minutter for å sikre at limet tørker fullt.
  6. Mens limet som holder hjernen på plass, tørker, hell 1x PBS i prøvebadet. Etter at limet er tørt, plasser prøveholderen med vevet i prøvebadet.
    1. Hvis vevsprøven ikke er fullstendig dekket, hell mer 1x PBS i prøvebadet.
  7. Fest bladet til bladholderen til vibratomet og sakte lSkru bladet inn i prøvebadet til det er helt nedsenket i 1x PBS. Fortsett å senke bladet til det ligger litt under toppen av vevet.
  8. Still vibratomhastigheten til 7, amplituden til 6, og skjærevinkelen til 12 ° (se tabell over materialer for vibratomodellen). Start vibrasjonen og kutt 200 μm seksjoner 23 .
    1. Bruk en stor pensel for å flytte vevseksjonene fra prøvebadet til hver utpekt brønn på 12-brønnplatene.
  9. Fortsett å kutte vevet til ønsket antall vevseksjoner er nådd.

5. Etterfarging

  1. For hver av de følgende fargestegene og skyllene, bruk 2 ml av den angitte løsningen per brønn. Bruk en motorisert pipettfyller (se tabell over materialer) for å overføre løsningene inn i brønnene. Bruk en overføringspipett (se tabell over materialer) for å overføre løsninger ut av brønnene og til riktig avfallbeholdere.
  2. Skyll delene i en 30 min vask av 0,01 M PBS-T (tilsett 3,0 ml vaskemiddel (se tabell over materialer) til 1000 ml 0,01 M PBS).
  3. Fortynn ammoniumhydroksydoppløsning (Forsiktig) 3: 5 volum med dH 2 O umiddelbart før bruk. Farg seksjonene i den fortynnede ammoniumhydroksydoppløsningen i 19-21 min.
    1. Beskytt den lysfølsomme ammoniumhydroksydoppløsningen med folie.
      MERK: Ammoniumhydroksid i løsningen har en konsentrasjon på ~ 10% og er klassifisert som "farlig". Ammoniumhydroksidoppløsning kan forårsake brannskader hvis den kommer i kontakt med huden. Det kan forårsake irritasjon av luftveiene ved innånding. Bruk vernehansker og arbeid i avtrekksdeksel.
  4. Farg seksjonene i etterfargingsbufferen (tilsett 90 g reagens D i 500 ml dH 2 O) i 19-21 min. Etterfargingsbufferen er lysfølsom; Beskytt den med folie 22 .
  5. Skyl seksjonene i tre, 5-10 minutter vasker på 0,01 M PBS-T.

6. Montering, rengjøring og dekning

  1. Monter delene på 1% gelatinebelagte lysbilder med den store penselen. La dem tørke i 20-30 minutter ved romtemperatur, og legg dem deretter i en Coplin-krukke over natten.
  2. Ta av lysbildene med hanskede hender fra Coplin-krukken og legg dem i en plasthylle (se tabell over materialer). Plasser plaststativet i fargeskålen (se tabell over materialer) som inneholder 100% etanol. Dehydrere dem med tre 5 min vasker.
  3. Vask lysbildene to ganger i 5 minutter hver i 99% xylen. Plasser lysbildene i et glassstativ og senk stativet inn i en glassfargeskål som inneholder xylen med metallhåndtak (se tabell over materialer).
    MERK: Forsiktig Xylene er skadelig ved innånding og forårsaker irritasjon hvis det berører huden. Det er svært brannfarlig i væske og damptilstander. Bruk vernehansker og arbeid i avtrekksdeksel.
  4. Fjern lysbildene fra xylenEne en om gangen og raskt dekke vevet med ~ 0,25 ml monteringsmedier (se Materialebord). Deretter tar du dekselet og legger dem over media.
    1. Skyv noen fanger luftbobler under glidelåsen til kanten med en stump gjenstand, for eksempel en pensel på enden.
  5. Plasser lysbildene i et område borte fra sollys og la dem tørke i 2-3 dager.
  6. Fortsett å skaffe bilder ved hjelp av et mikroskop og analysere med riktig programvare.

7. Få bildestack

  1. Åpne bildeprogrammet (se Materialebord ). Legg lysbildet på mikroskopets stadium. Klikk på "Oppkjøp" på menyen øverst i programmet, og klikk deretter "Live Image."
  2. Sett mikroskopet til 10X. Identifiser nevronen av preferanse og ta deretter markøren, som ser ut som en rød X, på midten av somaen. Venstre klikk for å angi referansepunktet.
  3. Sett mikroskopet til 40X. Klikk "Flytt" fra menyen øverst i programmet, og klikk deretter "Til referansepunkt".
  4. Begynn å lage bildestakken ved å bla manuelt med det fine målet over vevet til det er litt ute av fokus.
    1. Klikk på "Set Top" nederst i høyre hjørne av programmet under overskriften "Image Acquisition."
    2. Rull litt under vevet til det er litt ute av fokus, og klikk deretter "Set Bottom" under "Image Acquisition." Deretter klikker du på "Acquire Image Stack."
  5. Etter at bildetabellen er anskaffet, skriv inn ønsket navn for bildefil i vinduet som vises. Lagre som "MBF Ascii-fil."
    1. Når du blir bedt om det, velg filtypen som "MBF JPEG2000 stabelfil" og klikk deretter "Lagre".

8. Neuronal sporing

  1. I verktøylinjenR under menyen, klikk på boksen med tittelen "Konturnavn". Velg "Soma" fra rullegardinmenyen.
  2. Manuell spore somaen. Høyreklikk deretter og velg "Fullfør Cell Body" når sporing er fullført.
  3. Velg "AutoNeuron" for å hente en annen fane med tittelen "AutoNeuron Workflow."
  4. Under "Konfigurasjonstype" velger du "Ny". Still inn parametrene og klikk deretter "Next Step" for å hente opp "Soma Detection" underposisjon.
    1. For å angi parametrene, velg "Brightfield". Deretter klikker du på "Start måling" under "Maks prosessdiameter". Bruk markøren, gå til dendritets basis og sett inn diameteren manuelt.
  5. Klikk "Ja" i vinduet som ber brukeren om å spore hele bildet. Manuell spore somaen. Unclick og klikk deretter "Next step" for å hente opp "Seed Placement" underposisjon.
  6. Klikk på "Bekreft SeedS ", og klikk deretter" Next Step "for å få opp" Neuron Reconstruction "underposisjon.
  7. Under "Neuron", klikk "Interaktiv". Utfør interaktiv sporing ved å følge retningen fra programmet til dendritene og høyreklikk for å fullføre det uthevede området sporet av programmet. Etter å ha sporet alle dendritene, klikk "Neste trinn".
  8. Når et nytt vindu vises, lagrer du den nye konfigurasjonen med ønsket tittel. Klikk på "Lagre".

9. Analyse

  1. Åpne analyseprogrammet (se materialetabellen).
  2. Klikk "Fil" fra toppmenyen og klikk deretter "Åpne datafil". Velg filen av interesse.
  3. Under analysens underposisjon, velg "Sholl Analysis."
  4. I vinduet "Sholl Analyse" settes startradiusen til 10 μm. Under "Analyse" klikker du på boksene "Dendrites" og "Branch Orders".
  5. Høyre klIkke åpne de nye vinduene og klikk "Excel Export." Klikk på "Lagre".
  6. Under analysen klikker du på "Forgrenet strukturanalyser". Velg "Alle mulige analyser".
  7. Høyreklikk på det nylig åpnede vinduet og klikk "Excel Export" 24 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effektene av 5-Fu behandling på dendritisk arborisering og kompleksitet i hippocampus av Golgi-fargede hjerneseksjoner ble kvantifisert og sporet ved bruk av en kommersielt tilgjengelig bildebehandling programvare. Etter sporing ble den dendritiske arboriseringen, ryggradens tetthet og ryggradsmorfologien analysert ved hjelp av Sholl-analyse og det dendritiske kompleksitetsindekset (DCI). Sholl analyse er en kvantitativ analytisk metode som kan brukes til å bestemme dendritisk arbor morfologi 25 . Fra sverdet overgår sirkler 10 μm fra hverandre de dendritiske tracings. Lengden på dendritene bestemmes av antall sirkler som dendritene krysser over. Avgrensepunktanalysen, en metode for å fastslå kompleksiteten til en dendritisk arbor, er basert på totalt antall og rekkefølge av grenpunkter.

Et grenpunkt er definert som når aGren splittes i to delgrener. Grenbestillingen er et mål på kompleksiteten basert på hvor mange ganger grenene deler seg. For eksempel vil et førstegangsgrenpunkt være det opprinnelige dendritet som strekker seg fra summen, mens et andrepunktsgrenpunkt vil være det punktet ved hvilket avdelingen deler seg i to delgrener. Ved å undersøke både grenpunktene og grenbestillingen, er kompleksiteten til den dendritiske arboret (basert på antall grener) og på hvilke punkter forgreningen skjer (en mindre grenordre er nærmere summen, mens en større grenordre er Lenger fra soma) kan bestemmes. Disse parametrene ble påført DCI. CA1 og CA3 ble delt inn i apikale og basale deler og analysert uavhengig 26 , 27 .

Dendriter av CA1- og CA3-pyramidale nevroner og granuleneuroner i generaldirektoratet ble analysert. Alle neuroner valgt foR hver eksperimentell gruppe oppfylte følgende kriterier: 1) dendriter hadde mørk og konsistent Golgi-fargetone over hele lengden, 2) dendritene var synlig i takt, og 3) hver neuron hadde nok plass mellom dem for å hindre interferens under analysen 28 . Figur 1 viser en nevron som oppfyller de ovennevnte kriteriene. Data ble uttrykt som middel ± SEM. For å bestemme de statistiske forskjellene mellom sham og 5-Fu-gruppene ble det brukt en paret to-tailed t- test. Alle statistiske analysene ble utført ved hjelp av analytisk programvare (se tabell over materialer), og p <0,5 ble ansett som signifikant. En blandingsfaktoranalyse av varians (ANOVA) ble brukt til å evaluere effektene av 5-Fu-behandlingen og Sholl-radiusen. Fisher LSD post-hoc tester ble brukt etter ANOVA når det var passende 29 .

I begge CA 1 ( t = 7,68, p <0,01, figur 2A) og CA3 ( t = 7,54, p <0,01, figur 3A) apikale pyramidaldendrites, var det en betydelig samlet reduksjon i spines etter 5-Fu behandling. Mens 5-Fu-behandlingen ikke signifikant påvirket den basale ryggradens tetthet av CA1 ( t = 1,79, p = 0,15, Figur 2B), reduserte det signifikant CA3-basale pyramidale dendritiske spines ( t = 5,57, p <0,05; Figur 3 B ). Videre viste Fisher LSD post-hoc-testene en reduksjon i den dendritiske arboriseringen av CA1 apikale pyramidale dendritene ved 40-100 μm (Fisher's LSD, p <0.001, Figur 2C) og 130-160 μm (Fisher's LSD, p < 0,05;Figur 2 C ) vekk fra summen sammenlignet med saltbehandlede kontroller. Et lignende fenomen ble sett i CA1 basale apikale dendritter ved 30-60 μm (Fisher's LSD, p <0,001, Figur 2 D ) og 70-110 Μm (Fisher's LSD, p <0,05; Figur 2 D ) vekk fra summen 29 .

Når det gjelder CA3 apikale pyramidale dendriter, var det ikke en signifikant forskjell i den segmentale dendritiske lengden etter 5-Fu-behandlingen sammenlignet med de saltbehandlede kontrollene ( F (28,87) = 0,91; p = 0,59; Figur 3C ). For de CA3 basale pyramidale dendrittene var imidlertid en signifikant forskjell mellom 5-Fu behandling og saltbehandlede kontroller i segmentdendritisk lengde ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Figur 3 D ). Fiskerens LSD viste at 5-Fu behandling reduserte dendritisk arborisering ved 90-100 μm ( p <0,01, Figur 3 D ), 70-80 μm og 110-120 μm (Fisher's LSD, p <0,05; Figur 3 D ) Bort fra sommeren 29 .

For å bestemme den dendritiske kompleksiteten ble en grenordreanalyse anvendt for å sammenligne de 5-Fu behandlede og saltvannbehandlede kontrollgruppene. Innenfor generaldirektoratet viste grenordreanalysen en signifikant forskjell mellom hver behandlings- og grenordre ( F (8, 36) = 25,61, p <0,001; Figur 4 ). Dette ble ytterligere analysert ved bruk av Fisher's LSD, som indikerte at det var redusert lengde på 4. og 6. steBestill etter 5-Fu behandling ( p <0.001; Figur 4 ) 29 .

Figur 1
Figur 1 : Golgi-farget nevron som representerer kriteriene for avbildning og videre analyse. Alle tre ryggsorter kan lett ses etter Golgi-fargingen. Farging er konsistent over hele lengden av dendritet, og dendritet er isolert fra andre nevroner. Skalbjelke, 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : Golgi farget n Euroner viste signifikante forskjeller i ryggradens tetthet mellom de 5-Fu behandlede og saltvannbehandlede grupper i apikal CA1, men ikke basal CA1. Det var en signifikant forskjell i ryggradslengden mellom 5-Fu behandlede og saltvannsbehandlede grupper i både apikal og basal CA1. ( A ) I CA1-apikale pyramidale dendriter, reduserte 5-Fu signifikant ryggradens tetthet. ( B ) I de basale dendrittene var det ingen signifikante endringer i den totale tettheten av spines. ( C ) Sholl analyse viste at 5-Fu behandling signifikant reduserte dendritisk arborisering ved 40-100 μm og 130-160 μm vekk fra soma i CA1 apikale pyramidale dendriter. ( D ) I basal dendriter reduserte 5-Fu behandling dendritisk arborisering ved 30-60 μm og 70-110 μm vekk fra summen. Gjennomsnitt ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3 : Golgi-fargete nevroner viste signifikante forskjeller i ryggradens tetthet mellom 5-Fu-behandlede og saltvannbehandlede grupper i både apikal og basal CA3. Det var en signifikant forskjell i ryggradslengde mellom 5-Fu behandlede og saltvannsbehandlede grupper i apical CA3, men ikke basal CA3. ( A ) I CA3 apikale pyramidale dendriter, reduserte 5-Fu signifikant ryggradens tetthet. ( B ) I de basale dendrittene, reduserte 5-Fu signifikant den totale tettheten av spines. ( C ) Det var ingen signifikant effekt av 5-Fu behandling i CA 3 apikale området. ( D ) I de basale dendrittene, 5-Fu treaTment redusert dendritisk arborization 70-120 μm vekk fra soma. Gjennomsnitt ± SEM (n = 6). *, P <0,05; **, p <0,01, ANOVA 29 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4 : Golgi-fargete nevroner i generaldirektoratet viste redusert lengde ved 4. og 6. rekkefølge etter 5-Fu behandling sammenlignet med saltbehandlet gruppe. Lengde per grenrekke i pyramidale nevroner i CA1 hippocampal regionen. Gjennomsnitt ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 . PleaSe klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med mer moderne teknikker, har Golgi-Cox-metoden flere fordeler som gjør det til den foretrukne metoden for å undersøke ryggradsmorfologi: 1) Fargingen kan brukes til stort sett hvilket som helst vev, 2) Et grunnleggende lysmikroskopoppsett er alt som trengs for å Oppnå Golgi-baserte bilder, 3) Golgi-Cox-bildebehandlingen er raskere enn konfokal avbildning, og 4) Golgi-fargede seksjoner er levedyktige i flere måneder til år lenger enn prøver som er fluorescensmerkede. Selv med disse fordelene har Golgi-Cox-metoden fortsatt visse begrensninger. For det første er hele prosessen svært tidkrevende, og krever flere uker med flekker etterfulgt av analyse av bildene. Som vist med denne protokollen, tar det 14 dager i løsning A og 1 dag i løsning B før seksjonen kan begynne. I tillegg vil det utføres 2-3 timer per hjerne ved å utføre snitting, etterfarging og montering. Hvert lysbilde må tørke i 1 dag før rengjøring og dekker dem. Etter som, hvor mye tidDet vil ta å bilde og analysere delene vil avhenge av den enkelte. For det andre kan det være problemer med sammenheng mellom dataene fra analytikere på grunn av forskjeller i kategorisering av spines 30 . Av denne grunn anbefales det at en person utfører bilde- og analyse-delen av hvert eksperiment, noe som ytterligere utvider tiden for ferdigstillelse av prosjektet.

Det er flere kritiske trinn i Golgi-Cox-metoden som krever nøyaktig timing og oppmerksomhet. Ved farging av seksjonene med ammoniumhydroxidløsningen er det avgjørende at delene forblir i løsningen i minst 19 minutter, men ikke over 21 minutter. Hvis seksjonene ikke er i ammoniumhydroxidoppløsningen i nok tid, vil de ikke bli ordentlig farget, noe som betyr at nevronene vil se mindre definert når bildene blir, og dermed gjøre det vanskeligere å analysere dem. Hvis seksjonene er i ammoniumhydroksydoppløsningen i over 21 minutter, kan de bli ovEr-farget, noe som gjør det vanskelig å identifisere de enkelte nevronene. Derfor, når du bytter ut løsningene, må forskeren bevege seg raskt. Et annet viktig skritt er overføringen av delene på lysbilder. Før du beveger delene med den store penselen, er det best å først legge til en liten mengde PBS-T på lysbildet. Dette gjør at delene lett kan plasseres på glidebanen og manøvreres uten å bryte fra hverandre. Et mer kritisk trinn er tørketrinnet etter at delene er plassert på et lysbilde. Hvis lysbildene ikke tørker i minst 20 minutter ved romtemperatur, vil visse deler trolig falle av under dehydreringstrinnene. Hvis lysbildene tørker i lengre tid enn 30 minutter, vil de mest sannsynlig bli sprø og brytes fra hverandre under dehydreringstrinnene.

Når du utfører denne prosedyren, er det visse trinn som kan være plagsomme. For eksempel, hvis hele cerebellum er kuttet av før du legger hjernen på spesifikasjonenImen-holderen og snittet, kan hjernen knekke fra hverandre før generaldirektoratet er fullt seksjonert, noe som gjør det ubrukelig for andre seksjoner. Derfor er det viktig å bare kutte caudalt gjennom omtrent halvparten av cerebellumet. Et annet trinn som kan påvirke seksjonene negativt, er vibratomhastigheten og amplituden. Mens de anbefalte innstillingene er for henholdsvis 7 og 6, kan det hende at enkelte deler oppløses i PBS ved å kutte eller vises ujevnt. For å rette opp dette, finjuster du enten vibratomehastigheten eller amplituden, en om gangen til delene er in-takt og til og med mellom innstillingene på 6-8.

Selv om kommersielle kits for Golgi-farging er tilgjengelige, mangler de ofte nøyaktige detaljer for hvert enkelt trinn. Med denne protokollen rapporterer vi i detalj alle trinnene som ble brukt til å tillate andre laboratorier å pålidelig flekke vev av høy kvalitet med minimal feilsøking. Materialene som brukes er tilgjengelige for de fleste nevrovitenskapslaboratorier. Aberrations i dendrit morpHologi og endringer i antall dendritiske spines er relatert til en rekke neurologiske lidelser 31 . Videre kan disse forstyrrelsene i den dendritiske arboriseringen utgjøre et signifikant morfologisk kjennetegn ved den kjemoterapiinducerte skaden i hjernen 32 . I fremtiden vil vi undersøke hvordan de strukturelle endringer som induseres av 5-Fu, kan forholde seg til atferdsmessige, cellulære og molekylære endringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et pilotstipendium under NIH P20 GM109005 (ARA) og ved Center for Translational Neuroscience IDeA-programprisen P30 GM110702.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18, (12), 1713-1721 (2015).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 316-328 (2010).
  3. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50, (1), 10-20 (2012).
  4. Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33, (3), 121-129 (2010).
  5. von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191, (6), 518-531 (2009).
  6. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50, (6), 897-909 (2006).
  7. Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
  8. Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832, (12), 2257-2263 (2013).
  9. Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9, (3), 343-348 (1999).
  10. Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
  11. Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
  12. Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, (1432), 745-748 (2003).
  13. Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26, (7), 360-368 (2003).
  14. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  15. Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1, (3), 24 (2013).
  16. Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160, (3), 307-312 (1975).
  17. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150, (1), 90-95 (2006).
  18. Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131, (1-2), 1-7 (2003).
  19. de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55, (2), 481-489 (2007).
  20. Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11, (4), 221-230 (1984).
  21. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10, (38), (2016).
  22. superGolgi Kit. Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
  23. Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
  24. Neurolucida 11.03. MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
  25. Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87, (4), 387-406 (1953).
  26. Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7, (6), (2012).
  27. Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
  28. Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145, (1), 265-278 (2007).
  29. Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
  30. Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9, (9), (2014).
  31. Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10, (10), 981-991 (2000).
  32. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50, (1), 10-20 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics