Перезапуск нейронных цепей: новый метод быстрого наращивания нейритов и функционального нейронного соединения

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Эта процедура описывает, как быстро инициировать, расширять и связывать нейриты, организованные в микрожидкостных камерах, с использованием покрытых поли-D-лизином гранул, закрепленных на микропипетках, которые направляют удлинение нейритов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Magdesian, M. H., Anthonisen, M., Lopez-Ayon, G. M., Chua, X. Y., Rigby, M., Grütter, P. Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection. J. Vis. Exp. (124), e55697, doi:10.3791/55697 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мозг и повреждение спинного мозга могут привести к постоянной нетрудоспособности и смерти, поскольку еще невозможно восстановить нейроны на большие расстояния и точно восстановить их с подходящей целью. Здесь описывается процедура быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на большие расстояния. Достигнутые скорости распространения достигают более 1,2 мм / ч, в 30-60 раз быстрее, чем скорости in vivo наиболее быстро растущих аксонов из периферической нервной системы (0,02-0,04 мм / ч) 28 и в 10 раз быстрее, чем сообщалось ранее для того же Нейронного типа на ранней стадии развития 4 . Во-первых, выделенные популяции нейронов гиппокампа крысы выращиваются в течение 2-3 недель в микрожидкостных устройствах для точного позиционирования клеток, что позволяет легко микроманипулировать и экспериментальную воспроизводимость. Затем бисер, покрытый поли-D-лизином (PDL), помещают на нейриты для образования адгезивного продолженияАкты и микроманипуляция пипеткой используются для перемещения полученного в результате комплекса шариков-нейритов. Когда шарик перемещается, он вытягивает новый нейрит, который может быть увеличен на сотни микрометров и функционально связан с клеткой-мишенью менее чем за 1 час. Этот процесс позволяет экспериментальную воспроизводимость и легкость манипулирования, минуя более медленные химические стратегии для индуцирования роста нейритов. Предварительные измерения, представленные здесь, демонстрируют темпы роста нейронов, значительно превышающие физиологические. Объединение этих нововведений позволяет точно установить нейронные сети в культуре с беспрецедентной степенью контроля. Это новый метод, который открывает дверь для множества информации и информации о передаче сигналов и коммуникации в нейронной сети, а также является игровой площадкой, в которой можно исследовать пределы роста нейронов. Потенциальные применения и эксперименты широко распространены с прямыми последствиями для терапии, целью которой является воссоединение нейроныЛ после травмы или при нейродегенеративных заболеваниях.

Introduction

Повреждения центральной центральной нервной системы (ЦНС) взрослых могут привести к постоянной нетрудоспособности из-за множественных механизмов, которые ограничивают рост аксонов 1 . После травмы многие аксоны ЦНС не образуют новый конус роста и не могут установить эффективный регенеративный ответ 2 . Кроме того, повреждение и рубцовая ткань, окружающие поражения ЦНС, значительно ингибируют рост аксонов 1 , 2 , 3 . Современные методы лечения регенерации ЦНС после травмы были сосредоточены на усилении собственного потенциала роста поврежденного нейрона и на маскировке ингибиторов аксонального расширения, связанных с мусором миелина и глиальным рубцом 1 , 3 . Несмотря на это, способность регенерировать длинные аксоны к отдаленным объектам и формировать соответствующие функциональные синапсы по-прежнему сильно ограничена 4 , 5 , 6 , 7 .

В настоящей работе микробазы, микроманипуляция пипеткой и микрожидкостные устройства используются для быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на большие расстояния. Предыдущие работы показали, что гранулы с поли-D-лизином (PDL-шарики) индуцируют мембранную адгезию, за которыми следует кластеризация комплексов синаптических везикул и образование функциональных пресинаптических бутонов 8 . Было также показано, что когда PDL-шарик механически оттягивается после пресинаптической дифференциации, синаптический белковый кластер следует за бортом, инициируя новый нейрит 9 . Следующая процедура использует этот факт наряду с возможностью культивирования эмбриональных нейронов гиппокампа крыс в организованные области на покровное стекло с использованием микрожидкостных устройств с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) для точной перемотки нейронацепи.

Эти микрофлюидные устройства PDMS нетоксичны, оптически прозрачны и состоят из двух камер, соединенных системой микроканалов. После сборки на покровное стекло каждое устройство служит в качестве формы для направления роста нейронов и поддержания здоровых нейронных культур на точных рисунках более 4 недель in vitro .

Здесь представлена ​​структура, в которой исследуются пределы расширения и функциональности нового нейрита. Новые, функциональные нейриты создаются и позиционируются для управления (re) проволочными нейронными сетями. Достигнутые скорости расширения превышают 20 мкм / мин на расстояниях в миллиметрах и устанавливаются функциональные соединения. Эти результаты неожиданно показывают, что внутренняя способность этих нейритов к удлинению намного быстрее, чем считалось ранее. Этот предлагаемый механический подход обходит медленные химические стратегии и обеспечивает контролируемое соединение с конкретной мишенью. ThЭто технология открывает новые возможности для исследования in vitro новых методов лечения для восстановления связи нейронов после травмы. Он также позволяет манипулировать и перестраивать нейронные сети для исследования фундаментальных аспектов обработки сигналов нейронов и нейронной функции in vitro .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Макгилла и соответствовали руководящим принципам Канадского совета по уходу за животными.

1. Стандартизация нейронных культур с использованием микрожидкостных устройств: сборка устройства

  1. Выберите подходящее микрожидкостное устройство для желаемого эксперимента. Чтобы подключить нейроны к одной и той же популяции, используйте Neuro Devices ( рис. 1 ), и для подключения нейронов в разных популяциях используйте Co-Culture Devices ( рис. 6 ).
  2. Очистите и подготовьте необходимое количество стерильных покровных или стеклянных донных блюд. Для достижения наилучших результатов на пластиковых поверхностях используйте 35-миллиметровые блюда, на стекле можно использовать покровные по 25 мм или 35-миллиметровые стеклянные донные блюда. Выберите толщину стекла на основе системы формирования изображения, например 0,15 мм.
  3. Покройте посуду или покровные стекла 0,5-1 мл 100 мкг / мл PDL в течение 2 ч или в течение ночи при комнатной температуреature.
    Примечание. Протокол можно приостановить здесь и при необходимости возобновить на следующий день. Кроме того, посуда может быть покрыта боратным буферным разбавленным PDL, поли-L-лизином (PLL), ламинином или любой другой молекулой адгезии клеток.
  4. Вымойте посуду дважды водой (не используйте фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), так как кристаллы соли могут блокировать каналы), удалите всю жидкость и дайте ей высохнуть в стерильной среде, такой как шкаф для биобезопасности, в течение 5-10 мин или до Поверхность полностью сухая.
    Примечание. Будьте осторожны, чтобы покровные стекла были абсолютно сухими, так как любая оставшаяся жидкость будет мешать прилипанию микрожидкостных систем.
  5. Поместите микрожидкостные устройства с рисунками, направленными вверх под УФ-светом, в стерильную среду (шкаф для биобезопасности) в течение 10 мин. Обязательно соблюдайте стерильные процедуры при работе в шкафу 10 биобезопасности.
  6. Используя пинцеты, поместите микрожидкостное устройство с рисунком, направленным вниз, в контакт с чистой крышкойф / блюдо. Используйте пинцет, чтобы мягко нажать на устройство так, чтобы оно прилипало к стеклу.
    Примечание: прозрачность прилипшей области будет видна при взгляде на свет. Убедитесь, что все углы контактируют с стеклом. Сделайте это на всех микрожидкостных устройствах. См . Рис. 1a .
  7. Чтобы заполнить однополярное устройство средой, наведите пипетку на каналы и добавьте 50 мкл полной клеточной среды, дополненной бессывороточной В-27 (объемное соотношение 1:50) и 500 мкг / мл пенициллина / стрептомицина / глутамина (в совокупности Называемый НБМ) в правую верхнюю лунку, а затем добавить еще 50 мкл в лунку, расположенную по диагонали к ней. Сделайте это для всех устройств, убедившись, что среда течет между скважинами. Затем добавьте 50 мкл среды к оставшимся 2 лункам. См . Рисунок 2a .
    1. Чтобы заполнить множественное популяционное устройство со средой, наведите пипетку на каналы и добавьте 30 мклОт полного NBM до нужных скважин, см . Рис. 6a . Сделайте это для всех устройств, убедившись, что среда течет между скважинами. Затем добавьте 50 мкл среды в остальные 4 лунки.
  8. Поместите устройства в большую пластину с открытой посудой с автоклавной водой (влажная камера) и поместите в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 и 95% влажность) в течение 1-2 часов при приготовлении культуры клеток. См . Рисунок 2b .

2. Нейроны покрытия в микрофлюидных системах

  1. Следуя протоколу, указанному в [ 8 , получают диссоциированные гиппокампы или корковые нейроны из эмбрионов крыс Sprague Dawley (по полу).
  2. Ресуспендируют эмбриональные нейроны в НБМ при концентрации 1-2 млн. Нейронов / мл. Проверьте концентрации клеток в микроскопе с помощью гемоцитометра и следующей ссылки 8 . Отрегулируйте концентрацию клетокГ до желаемой плотности клеток. Чтобы увеличить шансы получения одного аксона аксонов гиппокампа на канал, пластина 10 000 нейронов на устройство. Чтобы иметь несколько аксонов в одном и том же канале, наберите 60 000 нейронов на устройство.
    Примечание. Эти цифры варьируются в зависимости от используемого типа нейронов.
  3. Удалите среду из микрожидкостных устройств без опорожнения колодцев. Оставьте примерно по 5 мкл в каждом.
  4. Для пластинчатых клеток в едином популяционном устройстве добавьте 50 мкл NBM в нижнюю правую лунку. В этот момент среда течет сама по себе, чтобы заполнить другую нижнюю яму. Добавьте 20 мкл раствора ячейки концентрата в верхнюю правую лунку микрожидкостного устройства, как показано на рисунке 1b .
    1. Для пластинчатых клеток в множественном популяционном устройстве добавьте 20 мкл раствора раствора концентрата в каждую из правых лунок на фиг. 6а .
  5. Проверьте микроскоп, если ячейкиНаходятся внутри камер и помещают устройства в инкубатор в течение 15-30 минут для содействия прикреплению клеток к подложке.
  6. Проверьте микроскоп, если в камерах достаточно клеток. Если требуется больше, повторите шаги 2.4 и 2.5.
  7. Добавьте 50 мкл NBM в 2 верхние лунки одного попутного устройства и 20 мкл NBM в ту же самую лунку, в которую клетки были введены в устройство множественного населения. Средства массовой информации слегка выступают, образуя положительный мениск, придавая лункам верхний аспект булочки. Опять же, см . Рисунок 2a .
  8. Поддерживайте ячейки при 37 ° C, влажности 5% CO 2 и 95%.

3. Сохранение нейронных культур

  1. Удалите из ячеек NBM (примерно 30 мкл с пипеткой) и нанесите новый предварительно нагретый NBM на следующий день после их введения в устройства (то есть через 1 д после шага 2).
  2. Проверяйте каждые 2 дня, если в каждом канале достаточно среды. Если булочка tOp - это просто добавьте больше среды в верхние лунки.
  3. Культуральные клетки в течение по меньшей мере 7 дней перед удалением микрожидкостных устройств. Клетки могут выживать в этих устройствах в течение нескольких недель. Удалите устройства за 1-2 дня до проведения экспериментов на образцах.

4. Удаление микрожидкостных устройств

  1. 1 - 2 d перед удалением микрожидкостных устройств, добавьте 2 мл NBM, предварительно нагретого до 37 ° C, к каждой чашке для образца, затоплению камер и обслуживанию устройств в инкубаторе.
  2. Используйте стерильные пинцеты и один наконечник, чтобы удалить микрожидкостные устройства из покровных листьев, оставляя узорную конфигурацию нейронов. Используйте наконечник для удержания покровного на месте и пинцета, чтобы закрепить край устройства в нижнем левом углу колодца. Деликатно применяйте торсион, поднимая устройство с помощью пинцета, чтобы он отслаивался от покровного стекла. См . Рис. 2c - 2d .
  3. Каждые 2-3 дня замените гаВ НБМ до тех пор, пока образец не будет использован для экспериментов.
  4. Перед выполнением повторных экспериментов на образце убедитесь, что нейриты в каналах одного популяционного устройства и популяции нейронов в множественном популяционном устройстве изолированы, исследуя промежутки между ними в микроскопе, чтобы гарантировать отсутствие нитей, связывающих популяции нейронов.

5. Подготовка шариков с покрытием PDL

  1. Добавьте 2 x 50 мкл капли из 4, 10 или 20 мкм гранул полистирола, разбавленных в воде (1: 500), до 1 мл PDL (100 мкг / мл). Оставьте в течение не менее 2 часов при комнатной температуре.
    Примечание. Протокол можно приостановить здесь и возобновить на следующий день.
  2. Центрифугируют раствор при 8,820 мкг в течение 1 мин. Осторожно удалите супернатант, не нарушая бусины, накопленные на дне контейнера.
  3. Промойте бусины дважды 1 мл стерильного раствора 10 мМ HEPES pH 8,4.
  4. Ресуспендируют гранулы, покрытые PDL, в 200 мл 10 мМ HEPES pH 8,4решение.

6. Подготовка микропипетки

  1. Подготовьте пипетки из стеклянных капиллярных труб (внутренний диаметр 1 мм, внешний диаметр 1,5 мм) с помощью горизонтального съемника электродов. Отрегулируйте настройки, чтобы внешний наконечник вытащил микропипетку ~ 2-5 мкм. Перед вытягиванием убедитесь, что стеклянные трубки чистые.
  2. Фиксируйте пипетки на стеклянные слайды для хранения и убедитесь, что наконечник не контактирует с поверхностью слайда, так как наконечник является хрупким. Хранить при комнатной температуре в закрытом контейнере для защиты от пыли. Используйте пипетки в тот же день, когда их вытаскивают.

7. Адгезия PDL-шариков к нейронам

  1. Добавьте 40-60 мкл шариков с PDL-покрытием, полученных на стадии 5, в культуру клеток, приготовленную на стадии 4. Центрируйте наконечник пипетки над нейронами, которые слабо видны на покровном стекле, и добавьте шарики (см . Рисунок 3 ).
  2. Верните образец в инкубатор в течение 1 часа, чтобы способствовать образованию syНаптические контакты 8 , 9 .
  3. После инкубации удалите любые несвязанные бусины, осторожно промойте культуру предварительно нагретым NBM.

8. Подготовка физиологического раствора соли (для экспериментов с комнатной температурой)

  1. Подготовьте физиологический солевой раствор, объединив ингредиенты, перечисленные в ссылках 7 , 8 . Это должно регулировать клеточную среду вне инкубатора.
  2. Проверьте осмолярность и уровень рН, как указано в ссылках 7 , 8 .
  3. Непрерывно вводить раствор с O 2, чтобы минимизировать флуктуации рН при проведении экспериментов.
  4. Нагрейте до комнатной температуры.
  5. Настройте перфузионную систему, вставив один конец пластиковой трубки (необязательные размеры) в O 2 -инфузированное физиологическое решение и зафиксировав другое eИ иглу, вставленную в держатель образца. Поместите трубку и раствор выше образца (см . Рис. 4 ).
    1. Отсоедините трубку от иглы и подсоедините ее к шприцу. Используйте шприц, чтобы нанести давление и налить жидкость, заполнив трубку. Уплотните с помощью ролика и заново закрепите иглу.

9. Микроманипуляция бисером

  1. Установите образец в экспериментальной установке таким образом, чтобы к клеткам можно было получить доступ с помощью двух микропипеток, установленных в микроманипуляторах, и получить оптическое изображение ниже, например, с объективом 40X-фазы (числовая апертура 0,6) инвертированного оптического микроскопа. В этой конфигурации установите ПЗС-камеру для захвата изображения на боковой порт микроскопа. Подключите каждую пипетку к 1 мл шприцам через пластиковую трубку. На этом этапе замените НБМ физиологическим солевым раствором (1-2 мл) (см . Рисунок 4 ).
  2. Во время экспериментаНепрерывно продуцируют клетки физиологическим солевым раствором, приготовленным на стадии 8, со скоростью 0,5-1 мл / мин.
  3. Выберите PDL-шарик, не прикрепленный к нейрону в поле зрения. Совместите шарик с наконечником микропипетки, сфокусировавшись на шарике, затем до микропипетки. Принесите наконечник как можно ближе к шарику, проверив его через микроскоп.
  4. Примените отрицательное давление, используя 1 мл шприц, подключенный к пипетке, чтобы поднять шарик. Поддерживайте отрицательное давление в течение всего эксперимента.

10. Вытягивание нейритов

  1. Выберите шарик PDL, прикрепленный к нейрону в поле зрения, и прикрепите его ко второй микропипетке, используя всасывание, как описано в шагах 9.3-9.4.
  2. Потяните комплекс PDL-шарик-нейрон медленно (~ 0,5 мкм / мин), перемещая либо микроманипулятор, либо образец образца на 1 мкм, и паузу в течение 5 минут, чтобы инициировать нейриты.
  3. Повторите шаг 10.2 дважды.
    Примечание: первые 3 &# 181; m нужно тянуть очень медленно, чтобы гарантировать экспериментальный успех, который происходит в 95% случаев.
  4. Потяните комплекс PDL-шарик-нейрон медленно (~ 0,5 мкм / мин), перемещая либо микроманипулятор, либо образец образца на 2 мкм, и паузу в течение 5 минут, чтобы удлинить удлинение нейрита.
  5. После успешного инициирования и расширения нейритов на первые 5 мкм потяните нейрит со скоростью 20 мкм / мин на миллиметровые расстояния.
    Примечание: Тяги могут выполняться непрерывно или поэтапно и с разной скоростью. См . Рисунок 5b -5c .

11. Подключение нейронов

  1. Выберите регион, богатый нейритами, и опустите комплекс PDL-шарик-нейрит, чтобы он физически связался с ним. Используйте другие бусины для измерения высоты наконечника над поверхностью покровного стекла. См . Рис. 5d .
  2. Оставьте комплекс PDL-шарик-нейрит в контакте с целевым нейритом, манипулируя вторым микропомPette. Опустите вторую пипетку со вторым шариком PDL поверх новообразованного нейрита около 20 мкм из первого шарика. Используйте второй PDL-шарик, чтобы подтолкнуть новую нивритную нить к целевой клетке.
  3. Держите оба бусинки на месте в течение как минимум 1 часа. Проверьте отсутствие фокальной опухоли, утолщение нейритов, контактирующих с бортом, с микроскопом 16 .
  4. В течение этого времени используйте перфузию для медленного изменения среды образца от физиологического раствора до предварительно нагретого СО 2 -эквилибрированного NBM.
  5. Отпустите шарик со второй пипетки, высвободив всасывание. Если новый нейрит остается прикрепленным, отпустите также первый шарик. См . Рис. 5е .
  6. Аккуратно удалите солевой раствор и замените NBM (~ 2 мл).
  7. Осторожно поместите образец обратно в инкубатор, чтобы усилить нейронное соединение для будущих экспериментов. Это соединение стабильно в течение> 24 ч 7

12. Проверка функциональности нового соединения с помощью цельноклеточных фиксированных зажимных зажима

  1. Следуйте рекомендациям 7 , 18 , 19 . Для сборки электрофизиологической установки.
  2. Следуйте рекомендациям 7 . Для подготовки пред- и постсинаптических электродов.
  3. Соберите данные зажима паттерна, снова следуя ссылкам 18 , 19 .
  4. Сравните результаты с естественными сигналами 7, чтобы определить тип соединения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эмбриональные нейроны гиппокампа крысы культивируют в микрожидкостных устройствах, чтобы обеспечить точное позиционирование клеток, PDL-шариков и микроманипуляторов. Первый шаг - правильно собрать микрожидкостное устройство на стеклянном покровном стекле или блюде. Очень важно, чтобы микрожидкостное устройство было хорошо прикреплено к подложке, чтобы избежать попадания ячеек из камер и перемещения под частями устройства, которые должны быть запечатаны ( рис. 1а ). Чтобы поддерживать здоровые культуры в течение нескольких недель, важно предотвратить испарение среды путем проверки клеточной среды каждые 2-3 дня и сохранения положительного мениска среды ( рис. 2а ). Среднего испарения также избегают, сохраняя как ячейки, так и открытую посуду с водой в большей пластине ( рис. 2b ). Микрожидкостные устройства могут быть удалены в любое время. Для достижения оптимальных результатов НБМ следует добавить в ячейкуПо меньшей мере, на 1 д до снятия устройства. Это минимизирует клеточное напряжение, поскольку нейроны находятся в контакте со средой при идеальной температуре и рН при удалении устройств. Когда микрожидкостные устройства медленно очищаются от тарелки ( рис. 2c И 2d ) будут оставаться в узорном положении ( рис. 3 и рис. 5а ).

Используются два типа микрожидкостных устройств: нейро-устройство и устройство для совместной культивирования. Первый позволяет легко идентифицировать аксоны, дендриты и клеточные тела. Сома остается в верхней соматической камере, тогда как аксоны и дендриты растут вдоль микрожидкостных каналов ( рис. 5а ) к аксональной камере.

Рекомендуется, чтобы PDL-бисер добавляли в ячейки в соотношении 10: 1, и большинство из них было выполнено из шариков,Не прилипают к культуре, удаляются путем промывки клеток один раз NBM после 1 часа инкубации ( рисунок 3 ). После адгезии PDL-шарика к нейритам комплекс PDL-шарик-нейрит вытягивается и может растягиваться на большие расстояния. Недавно образовавшийся нейрит может быть точно связан с нейритами или сомами в миллиметрах ( рис. 5b -5e ). Вероятность успеха нового нейрита для первых 3 мкм при скоростях ниже 1 мкм / мин составляет> 95% (n = 206). Уровень успеха для подключения нового нейрита к другой ячейке составляет 70% (n = 30). Соединение очень хрупкое в первые 18 ч, главным образом потому, что новый нейрит представляет собой нить диаметром менее 1 мкм, закрепленную 10-миллиметровым шариком PDL. Если чашка быстро перемещается в течение первых минут контакта, возникающая в результате турбулентность среды может привести к тому, что бусина будет катиться, и, следовательно, адгезия будет потеряна. Однако, если образец не является шаКен, через 30 мин шарик прикрепляется к нейритам на блюде, и новое соединение остается не менее 48 часов. См . Рисунок 4 для схемы настройки.

Положение PDL-шарика на культуре также может быть использовано для того, чтобы легко идентифицировать местоположение связанного нейрита ( фиг.6d-6e ). После инициации, удлинения и соединения нового нейрита второй, неадгезивный PDL-шарик, собранный через микроманипулятор, используется для создания второго места адгезии между инициированным нейритом и второй нейронной популяцией. Второй PDL-шарик помещается поверх нового нейрита, сжимая его так, что новый нейрит просто контактирует с второй нейронной популяцией 11 . Это будет способствовать адгезии со вторым населением нейронов ( рис. 5f ).

Многопользовательское устройство enabУвеличивают рост 4 изолированных популяций нейронов на одном и том же блюде. Каждая популяция нейронов ограничена прямоугольником размером 4 х 7 мм, отделенным от других популяций нейронов пробелами 100 или 200 мкм ( рис. 6а ). Здоровые нейроны могут расти внутри устройств в течение нескольких недель. Как правило, популяции нейронов остаются изолированными до 48 ч после удаления устройства. После этого 48-часового периода нейроны имеют тенденцию расти к соседним популяциям нейронов и образуют естественные связи. Прежде чем подключить две изолированные популяции, следует убедиться, что популяции действительно действительно изолированы, исследуя весь пробел с микроскопом, чтобы установить, что между двумя группами нейронов нет связи ( рис. 6b ).

После соединения образцы инкубировали в течение 24 часов, а электрические цельные ячейки с парными зажимами фиксировали, чтобы исследовать,Сформированный нейрит, используемый для соединения двух изолированных нейронных популяций, был функциональным и способен передавать электрические сигналы. Для регистрации пресинаптических потенциалов действия (PAPs) был выбран нейрон в популяции один, расположенный менее радиуса 100 мкм от места, где был инициирован индуцированный нейрит. Этот нейрон считался пресинаптической клеткой. Постсинаптическая возбуждающая или ингибирующая активность регистрировалась из нейронов в популяции, расположенных на другой стороне зазора, находящейся в радиусе менее 100 мкм микроманипулированного соединения ( рис. 7а- ). Записи, полученные из механически индуцированных соединений, были проанализированы и сопоставлены с данными из естественно связанных нейронных популяций и несвязанных популяций ( рис. 7 ). Электрические ответы после PAP, зарегистрированные из нейронов, связанных естественным путем и с помощью микроманипуляции, значительно выше и временно коррелируют с пресинаптической( Рис. 7 ).

Рисунок 1
Рисунок 1: Стандартизация нейронных культур с использованием микрожидкостных устройств 7 . ( A ) Узел устройства: когда микрожидкостные устройства правильно собраны на сухой поверхности, все камеры видны. ( Б ) Оклеивание ячеек: наклеить клетки на верхнюю правую лунку, и клетки должны двигаться в направлении левой лунки. ( C ) Плотность клеток: сразу после нанесения покрытия, проверьте микроскоп, если концентрация клеток адекватна. ( D ) Через 1 д в культуре нейроны гиппокампа хорошо прилипают близко к микроканалам и начинают формировать нейриты. Нажмите здесь, чтобы посмотреть большой Er версии этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2 : Поддержание здоровых нейронных культур в течение нескольких недель 7 . ( A ) Добавьте среду каждые 2-3 дня и сохраните положительный мениск в верхних лунках микрожидкостных камер, чтобы клетки имели постоянную подачу питательных веществ. ( B ) Держите клетки в большей пластине с чашкой, содержащей воду, для уменьшения испарения среды. ( C ) Используйте стерильный наконечник и пинцет, чтобы ( d ) легко отслаивать микроприборы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

P_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
Рисунок 3 : Расположение насадок для подачи пипетки в культуру. Как только микрофлюидическое устройство было удалено, на покровном стекле видны нейроны. При нанесении бусинок расположите наконечник пипетки так, чтобы он находился в центре клеток. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Схема типичного создания нейритов. Образец опирается на (пьезо-приведенную) стадию и может быть доступен сверху двумя микропипетками, содержащимися в микроманипуляторах, и соединен с 1 мл шприцев через пластиковые трубки. Образец получает доступ оптически снизу объективом, подключенным к ПЗС-камере, которая отправляетS изображения в CPU. Входная трубка подает насыщенный кислородом физиологический солевой раствор в образец, который лежит ниже него, и выходная трубка, соединенная с шприцем, позволяет отводить раствор в случае переполнения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5
Рисунок 5 : Адгезия PDL-шарика к нейронам и микроманипуляция пипеткой 7 . ( А ) Нейроны остаются организованными в образцах после удаления микрожидкостных камер, что позволяет легко идентифицировать сому и нейриты. ( Б ) Микроманипуляция шариков PDL, прикрепленных к нейритам, позволяет инициировать нейриты, удлинение ( c ) и соединение ( d ),С последующим выпуском PDL-шарика из пипетки ( e ). ( F ) После контакта с двумя изолированными популяциями нейронов (стрелка внизу), второй PDL-шарик и микроманипулятор пипетки (стрелка вверх) используются для установки второй точки адгезии на расстоянии нескольких сотен микрон от первой точки контакта и гарантируют функционирование соединения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6
Рисунок 6 . Инициирование, удлинение и подключение новых нейритов для подключения двух изолированных групп населения с использованием нескольких устройств и микроманипуляции 7 . ( А ) Устройство изолирует 4 группы нейроновМежду 3 зазорами по 100 или 200 мкм каждый. ( B ) После удаления устройства выберите один пробел и удостоверьтесь, что никариты не соединяют две отдельные популяции. ( C ) Схема экспериментальной установки, которая должна быть видна в оптическом микроскопе, указывает положение двух микропипетков и присутствие шариков с покрытием PDL. ( D ) Прикладывая отрицательное давление к пипетке, шарик PDL, прикрепленный к одной популяции нейронов, тянут с наконечником пипетки, тем самым инициируя новый нейрит. Поддерживая отрицательное давление в пипетке, PDL-шарик-нейритный комплекс (зеленый) можно вытягивать, удлиняя нейриты. ( E ) Гибкость микроманипуляции направляет расширение нового нейрита на щель и образование связи с новой популяцией нейронов. Чтобы обеспечить адгезию нового нейрита со второй популяцией, PDL-шарик (красный) позиционируется со второй пипеткой сверху и расширенного нейрита и нейроНаселения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7
Рисунок 7: Недавно индуцированный, удлиненный и подсоединенный нейрит может передавать информацию между двумя изолированными группами нейронов 7 . Изолированные популяции нейронов культивировали, разделенные зазором 100 мкм в микродеформах PDMS. Записи с фиксированным патчом были выполнены в конфигурации целых клеток из нейрона в популяции 1 и у нейронов в популяции два (с другой стороны щели), когда две популяции были связаны посредством механических манипуляций ( а ), позволили естественным образом соединиться через ( B ) или оставаться не связанными с( С ). Для каждого условия ( df ) показаны типичные следы парных записей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Используя стандартную микроманипуляцию и инновационные микрожидкостные устройства, был разработан новый метод для быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на больших расстояниях. Микроманипуляция пипеткой является обычным инструментом в большинстве нейронаучных лабораторий 4 , 13 . Реальной задачей достижения воспроизводимых и надежных результатов была стандартизация здоровых, точно позиционированных нейронных культур на протяжении всего эксперимента (который может составлять несколько недель) путем разработки микрожидкостных устройств для организации клеточных культур с точностью до микрометра. Высококачественные культуры клеток являются краеугольным камнем проверки данных. Это способствует более быстрой и быстрой микроскопической визуализации и стандартизации культур и результатов. Микрожидкостные устройства были разработаны для культивирования клеток in vitro с аналогичной организацией, как in vivo . Однопользовательское устройство позволяетРост длинных нейритов и легкая идентификация аксонов, нейритов и сомы. Количество клеток, покрытых микрофлюидными камерами, определяет плотность нейронов. Поэтому, покрывая меньшее количество клеток на устройство, легко идентифицировать одиночные нейроны, близкие к каналам. Актон и множественные дендриты одного одиночного нейрона растут внутри одного канала. Дендриты растут как минимум в 5 раз медленнее, чем аксоны 6 , 17, и через 2-3 недели in vitro их рост в каналах обычно ограничен 200 мкм, в то время как быстрорастущие аксоны могут достигать 2 мм 17 . Поэтому после добавления PDL-бисер к образцам относительно легко оценить, прилипают ли шарики в основном к аксонам или к аксонам и дендритам ( рис. 5b - 5f ). Есть более высокие шансы вытащить новые аксоны и дендриты при вытягивании шариков PDL, прикрепленных к нейритам короче 200 мкм, whIle существуют большие шансы вытягивания только новых аксонов при вытягивании PDL-шариков, прикрепленных к нейритам длиннее 500 мкм. Множественное популяционное устройство полезно для воспроизводимого роста здоровых отделенных популяций в течение нескольких недель. Эта система каналов полезна для изучения до 4 разных типов клеток или сравнения тех же ячеек с различными методами лечения.

Более того, контролируемая и воспроизводимая среда клеточной культуры является идеальной основой для анализа и манипулирования клетками. Точное позиционирование клеток на блюде облегчает идентификацию интересующих регионов, а также ориентацию и навигацию по этим областям, в конечном счете позволяющим беспрецедентный контроль над сайтом инициации нейритов. Контролируемое распределение клеток облегчает визуализацию вновь образованного соединения и намного быстрее, чтобы найти новое соединение с микроскопом в последующие дни после инкубации. Кроме того, воспроизводимые конфигурации ячеекПозволяют легко и точно позиционировать химические сигналы, такие как шарики с покрытием PDL, на соме, дендритах или аксонах 8 . Взятые вместе, визуализация и анализ клеток, выращенных в микрожидкостных устройствах, быстрее из-за стандартной сотовой организации, воспроизводимой во всех блюдах. Кроме того, устройства изготовлены из биосовместимого, прозрачного и съемного материала, что позволяет получать изображения на всех видимых длинах волн и выживание клеток внутри устройств в течение нескольких недель. Миниатюризация клеточных анализов также помогает собирать больше данных с меньшим количеством клеток. Низкий объем потребления микрожидкостных устройств уменьшает количество клеток, необходимых на эксперимент, и увеличивает экспериментальную эффективность. Например, вместо того, чтобы проводить несколько часов в поисках микроскопа, возможно, для одного или двух изолированных аксонов в тарелке, однопользовательское устройство может быть использовано для немедленного доступа к более чем 100 изолированным аксонам на образец клетки. Микрофлюидные устройства предлагают миниатюрные надежные и контролируемыеСреда клеточной культуры, способствующая анализу редких образцов со временем для выполнения нескольких тестов.

Потенциальные вариации метода включают прямое прикрепление шарика к микропипетке. В текущем протоколе описан способ прикрепления шарика к кончику с помощью всасывания, но борт также можно приклеить к наконечнику. Клей является лучшим вариантом, если желательно очень стабильное соединение между наконечником и бортом, например, если измерения силы производятся с использованием пипетки в качестве датчика или если исследование адгезии между PDL и нейритом является основной экспериментальной целью. В другом случае всасывание выгодно, так как оно позволяет выпускать борт после размещения без разрушения комплекса нейритных шариков, что позволяет параллельно производить несколько соединений. Всасывание обеспечивает средства для экспериментов с высокой пропускной способностью, улучшение по сравнению с другими методами манипуляции, такими как атомно-силовая микроскопия (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Обе модификации этого метода позволяют выбрать сайт инициации нейрита, просто поддерживая борт в контакте с дендритом, поэтому образуются синапсы. Однако стратегия инкубации нескольких шариков, как описано в шаге 7, экономит время на этапе манипуляции и рекомендуется, если в эксперименте не требуется точный контроль над сайтом инициации.

Будущие исследования могут быть направлены на решение различных инструментальных ограничений, а именно контроля температуры и доступности выборок. Механические свойства клеточной мембраны могут значительно варьироваться при разных температурах 27 . В идеале все эксперименты должны проводиться при 37 ° C в нейронной среде и в адекватных условиях (правильное управление давлением и влажностью CO 2 ). Однако использование инкубатора с закрытыми ячейками невозможно, поскольку для микроманипуляторов требуется доступ к образцам сверху.Снизу для микроскопа и сбоку для перемещения сцены. Поэтому применялась перфузия при комнатной температуре. В том же духе, поскольку в настройке достаточно места для размещения 2 микроманипуляторов, и для установления единственного соединения требуется почти 1 час, существует ограничение на количество экспериментов, которые можно выполнить. Эта проблема может быть решена с помощью манипулятора, который одновременно натягивает более одного шарика. Другим потенциальным усовершенствованием этого протокола является возможность регистрации высоты комплекса бортовой пипетки с поверхности образца. Неспособность сделать это может привести к неточности при снижении второго шарика и его установке на индуцированный нейрит для его устранения. Бусина опускается сверху нового нейрита в богатой нейритом области до тех пор, пока новый нейрит и те на блюде не окажутся в одной фокальной плоскости. Новый нейрит никогда не бывает между бусиной и блюдом, но всегда между подушкой клеточного вещества и бортом, поэтому сжатие уменьшается. Кроме того,Новый нейрит наблюдается в течение 10 мин в микроскопе, чтобы оценить, образуются ли очаговые очаги нейритов вблизи шарика. Как описано в ссылке 16 , наличие опухолей указывает на дегенерацию нейритов. Тем не менее, поскольку применение различных величин давления к аксонам может привести к физиологическим изменениям 16 , будущие исследования могут быть сосредоточены на адаптации зондов пипетки путем фиксации их отражателей и контроля смещения, перпендикулярного поверхности образца с помощью методов AFM. Наконец, возможно, самой большой проблемой для этого протокола является проверка функциональности управляемого соединения. Самым прямым, надежным и хорошо зарекомендовавшим себя методом является парная запись цельного клеточного зажима. Тем не менее, частота успешной записи парных патч-фиксаторов очень низкая (<25%) 18 . Цельный клеточный патч имеет несколько недостатков, включая длительное время настройки, ограниченное количество экспериментов / день, ограниченное время записи (~ 30Мин), низкий экспериментальный выход для парных записей зажимных зажимов и гибели клеток после измерений. Из-за этих технических трудностей экспериментальный выход цельноклеточных патч-клещей с парными записями после микроманипуляции очень низок. Для более точного стимулирования, регистрации и сравнения активности нейронов в естественных и микроманипулированных связях необходимы более совершенные платформы и методы.

Важность натяжения в аксональном росте была известна с первых дней нейроанатомии, имея в виду ее как пассивное растяжение 20 . Во время раннего эмбрионального развития нейриты мигрируют на небольшие расстояния, чтобы достичь своих целей. Поскольку большинство клеток делятся и дублируются, аксоны подвергаются непрерывным усилиям удлиняться и корректировать их длину до эмбрионального роста 20 , 21 . Несколько групп пытались проверить пределы роста нейритов, применяя химические сигналы и / или механическое натяжение к нейRons (обзор см. В ссылке 22 ). В этих отчетах 23 , 24 , 25 , 26 , а также при физиологическом росте нейриты вытягиваются при прикреплении к субстрату. Основное отличие нашей установки заключается в том, что в настоящей технике новые нейриты имеют только два адгезионных контакта; У основания нейрит прикреплен к нейрону, а на кончике нейрит прикреплен к шарику. Во время удлинения компоненты нового нейрита имеют свободу для наиболее эффективного расчёта для размещения тянущих сил. Что еще более важно, этот протокол описывает, как воспроизводить эти эксперименты, не вызывая разрыва или дегенерации нейритов, на основе предыдущих исследований образования синаптических контактов 8 и сопротивления аксонов до давления 16 , показывающего, как использовать микро- и нанотрубки дляНепрерывно вытягивайте нейриты с соответствующей силой. Описанные здесь скорости расширения нейритов (1,2 мм / ч) в 30-60 раз быстрее, чем скорости in vivo наиболее быстро растущих аксонов периферической нервной системы (0,02-0,04 мм / ч) 28 . По сравнению с тем же самым типом нейронального типа in vitro описанные здесь скорости расширения аксонов в 7,5 раза быстрее, чем скорости роста, описанные другими авторами на более ранней стадии разработки (0,1 мм / ч) 4 . Было обнаружено, что различные типы нейронов расширяют аксоны с различными внутренними скоростями, которые изменяются в несколько раз 29 . Кроме того, аксоны центральной нервной системы обычно теряют высокую скорость роста аксонов после иннервации мишени in vivo 29 и 3 d культуры in vitro 6 . Поэтому текущий метод расширения аксонов должен быть протестирован с различными типами нейронов, чтобы лучше понятьE пределы расширения нейритов.

Микроманипуляция пипеткой и микрожидкостные устройства - это методы, демонстрирующие создание новых функциональных нейритов и контролируемое позиционирование или (пере) нейронную сеть. Эта платформа идеально подходит для систематических, стандартизированных измерений. Он вводит воспроизводимость и контроль in vivo в экспериментах по сложным сетям нейронов. Достигнутые скорости расширения превышают 20 мкм / мин на расстояниях в миллиметрах и устанавливаются функциональные соединения. Эти результаты неожиданно показывают, что внутренняя емкость аксонов для удлинения, в том числе и у их цитоскелетных компонентов, намного быстрее, чем считалось ранее 10 , 11 , 12 . Этот предложенный механический подход обходит медленные химические стратегии и, таким образом, представляет собой сдвиг парадигмы для терапевтических разработок для восстановления связи нейронов после травмыИ для микронейроинженерии искусственных нейронных сетей для их контролируемого исследования in vitro . Эти результаты также оказывают существенное влияние на регенеративную медицину и нейро-инженерные подходы с прямым воздействием на терапию, целью которой является воссоединение нейронных цепей после травмы или нейродегенеративных заболеваний. Эта платформа открывает двери для получения данных о связи нейронов, модуляции сигнала, а также роста и регенерации. Это новый способ механической регенерации ЦНС, и подобные методы могут позволить восстановить функцию после травмы. Кроме того, этот метод может быть использован для создания систематически спроектированных нейронных сетей в качестве новых платформ биоанализа для обнаружения лекарств и проверки цели. Он является предшественником прямой проводки надежных интерфейсов «мозг-машина».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автор Margaret H Magdesian является генеральным директором Ananda Devices, который выпускает инструменты, используемые в этой статье.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Yoichi Miyahara за многие полезные обсуждения и идеи. MA и PG признают финансирование со стороны НСУРК.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Co-culture devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
Neuro devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round Warner Instruments 64-0705
35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated MatTex Incorporation P35G-0-20-C
35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile Corning Inc 430165
95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene Fisherbrand FB0875714G
50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps VWR 89039-656
15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile Falcon 352097
Neurobasal Medium Life Technologies 21103-049 Extracellular solution
B-27 Supplement (50X), serum free B-27 Supplement (50X), serum free 17504044 Extracellular solution
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine Thermo Fisher Scientific  11995-065 Extracellular solution
200 μ L Pipettors VWR 89079-458
2 - 20 μL Pipettors Aerosol Resistant Tips 2149P
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] BD Falcon 357524
Glucose Gibco 15023-021 Extracellular solution
HEPES Sigma 7365-45-9 Extracellular solution/Beads
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 Extracellular solution
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7 Extracellular solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Extracellular solution
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3 Extracellular solution
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm World Precision Instruments 500233
Dissection tools Braun, Aesculap
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P6407
Micro particles based on polystyrene, 10 μm Sigma-Aldrich 72986
Borosilicate tubes King Precision Glass, Inc. 14696-2
Horizontal Pipette Puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Micromanipulators, PCS-5000 Series SD Instruments MC7600R
1 mL Syringe BD Luer-Lok 309628
Inverted Microscope Olympus  IX71
Objective Olympus UIS2, LUCPLFLN 40X
CCD Camera Photometrics Cascade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15 Medium Life Technologies 11415-064 Rat Dissection
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red Life Technologies 25300054 Rat Dissection
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] Life Technologies 11995-065 Rat Dissection
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] Life Technologies 14170-112 Rat Dissection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13, (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108, (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36, (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29, (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103, (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2, (4), 001925 (2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50, (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27, (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24, (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics