Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

Neuroscience

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Summary

Dieses Verfahren beschreibt, wie man schnell Neuriten initiiert, verlängert und verbindet, die in mikrofluidischen Kammern organisiert sind, wobei Poly-D-Lysin-beschichtete Perlen an Mikropipetten befestigt sind, die die Neuritendehnung begleiten.

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Magdesian, M. H., Anthonisen, M., Lopez-Ayon, G. M., Chua, X. Y., Rigby, M., Grütter, P. Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection. J. Vis. Exp. (124), e55697, doi:10.3791/55697 (2017).

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Abstract

Gehirn- und Rückenmarksverletzungen können zu dauerhafter Behinderung und Tod führen, weil es immer noch nicht möglich ist, Neuronen über lange Distanzen zu regenerieren und sie mit einem geeigneten Ziel genau wieder zu verbinden. Hier wird beschrieben, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über lange Distanzen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Die erreichten Verlängerungsraten reichen über 1,2 mm / h, 30-60 mal schneller als die In-vivo- Raten der am schnellsten wachsenden Axone aus dem peripheren Nervensystem (0,02 bis 0,04 mm / h) 28 und 10-mal schneller als bisher berichtet Neuronaler Typus in einem früheren Entwicklungsstadium 4 . Zuerst werden isolierte Populationen von Ratten-Hippocampus-Neuronen für 2-3 Wochen in mikrofluidischen Vorrichtungen gewachsen, um die Zellen präzise zu positionieren, was eine einfache Mikromanipulation und experimentelle Reproduzierbarkeit ermöglicht. Als nächstes werden Perlen, die mit Poly-D-lysin (PDL) beschichtet sind, auf Neuriten gelegt, um Klebstoff zu bildenHandlungen und Pipetten-Mikromanipulation wird verwendet, um den resultierenden Wulst-Neurit-Komplex zu bewegen. Als der Wulst bewegt wird, zieht er einen neuen Neuriten heraus, der über Hunderte Mikrometer erweitert werden kann und funktionell mit einer Zielzelle in weniger als 1 h verbunden ist. Dieser Prozess ermöglicht die experimentelle Reproduzierbarkeit und die Leichtigkeit der Manipulation, während sie langsamere chemische Strategien umgehen, um das Neuritenwachstum zu induzieren. Vorläufige Messungen zeigen hier eine neuronale Wachstumsrate, die weit über physiologische hinausgeht. Die Kombination dieser Innovationen ermöglicht die präzise Etablierung von neuronalen Netzwerken in Kultur mit einem noch nie dagewesenen Maß an Kontrolle. Es ist eine neuartige Methode, die die Tür zu einer Fülle von Informationen und Einsichten in die Signalübertragung und Kommunikation im neuronalen Netzwerk öffnet und auch ein Spielplatz ist, um die Grenzen des neuronalen Wachstums zu erforschen. Die potenziellen Anwendungen und Experimente sind weit verbreitet mit direkten Implikationen für Therapien, die darauf abzielen, neurona wieder anzuschließenL Kreisläufe nach Trauma oder bei neurodegenerativen Erkrankungen

Introduction

Verletzungen des erwachsenen zentralen Nervensystems (ZNS) können zu einer dauerhaften Behinderung führen, die auf mehrere Mechanismen zurückzuführen ist, die das axonale Nachwachsen begrenzen. Nach der Verletzung bilden viele ZNS-Axone keinen neuen Wachstumskegel und scheitern eine effektive regenerative Antwort 2 . Darüber hinaus hemmen Schäden und Narbengewebe, die ZNS-Läsionen umgeben, das axonale Wachstum signifikant 1 , 2 , 3 . Aktuelle Therapien zur Förderung der ZNS-Regeneration nach Verletzung konzentrierten sich auf die Verbesserung der intrinsischen Wachstumspotential des verletzten Neurons und auf Maskierung der Inhibitoren der axonalen Erweiterung mit Myelin-Trümmer und die gliale Narbe 1 , 3 verbunden. Trotzdem bleibt die Fähigkeit, lange Axone zu entfernten Zielen zu regenerieren und geeignete funktionelle Synapsen zu bilden, nach wie vor stark eingeschränkt 4 , 5 , 6 , 7

In der vorliegenden Arbeit werden Mikroperlen, Pipettenmikromanipulation und mikrofluidische Vorrichtungen verwendet, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über lange Distanzen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass Poly-D-Lysin-beschichtete Perlen (PDL-Perlen) die Membranadhäsion induzieren, gefolgt von der Clusterbildung von synaptischen Vesikelkomplexen und der Bildung von funktionellen präsynaptischen Boutons 8 . Es wurde auch gezeigt, dass, wenn die PDL-Perle nach der präsynaptischen Differenzierung mechanisch weggezogen wird, der synaptische Proteincluster dem Wulst folgt und einen neuen Neuriten initiiert. Das folgende Verfahren nutzt diese Tatsache zusammen mit der Fähigkeit, embryonale hippocampale Neuronen von Ratten in organisierte Regionen auf einem Deckglas unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen zu kultivieren, um eine Neuronale genau umzuwickelnSchaltung.

Diese PDMS-Mikrofluidik-Geräte sind ungiftig, optisch transparent und bestehen aus zwei Kammern, die durch ein System von Mikrokanälen verbunden sind. Nach dem Zusammenbau auf einem Deckglas dient jede Vorrichtung als Form, um das neuronale Wachstum zu leiten und gesunde neuronale Kulturen auf präzisen Mustern für länger als 4 Wochen in vitro zu pflegen.

Hier wird ein Rahmen vorgestellt, in dem die Grenzen der Erweiterung und Funktionalität des neuen Neuriten untersucht werden sollen. Neue, funktionale Neuriten werden erstellt und positioniert, um die neuronalen Netzwerke kontrollierbar zu erneuern. Die erreichten Verlängerungsraten sind schneller als 20 μm / min über Millimeter-Skalen und funktionale Verbindungen hergestellt. Diese Ergebnisse zeigen, unerwartet, dass die intrinsische Kapazität dieser Neuriten für die Dehnung viel schneller ist als bisher angenommen. Dieser vorgeschlagene mechanische Ansatz umgibt langsame chemische Strategien und ermöglicht eine kontrollierte Verbindung zu einem bestimmten Ziel. ThIst die Technik eröffnet neue Wege für die in-vitro- Studie von neuartigen Therapien, um neuronale Konnektivität nach Verletzung wiederherzustellen. Es ermöglicht auch die Manipulation und Umverdrahtung von neuronalen Netzwerken, um grundlegende Aspekte der neuronalen Signalverarbeitung und der neuronalen Funktion in vitro zu untersuchen.

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Protocol

Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden vom Tierpflegeausschuss der McGill University genehmigt und entsprechen den Richtlinien des Canadian Council of Animal Care.

1. Standardisierung von neuronalen Kulturen mit mikrofluidischen Geräten: Gerätemontage

  1. Wählen Sie eine geeignete mikrofluidische Vorrichtung für das gewünschte Experiment aus. Um Neuronen in der gleichen Population zu verbinden, verwenden Sie die Neuro-Geräte (Abbildung 1 ) und verbinden Sie die Neuronen in verschiedenen Populationen mit den Co-Kultur-Geräten (Abbildung 6 ).
  2. Reinigen und vorbereiten die gewünschte Anzahl von sterilen Deckgläschen oder Glasbodenschalen. Für beste Ergebnisse auf Kunststoffoberflächen verwenden Sie 35 mm Geschirr, auf Glas verwenden Sie 25 mm Deckgläser oder 35 mm Glasbodenschalen. Wählen Sie die Glasdicke auf der Grundlage des Bildgebungssystems, z. B. 0,15 mm.
  3. Die Schalen oder Deckgläser mit 0,5-1 ml 100 μg / ml PDL für 2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur auftragenAture
    Hinweis: Protokoll kann hier pausiert und am folgenden Tag wieder aufgenommen werden. Außerdem können Gerichte mit Borat-Puffer-verdünnter PDL, Poly-L-Lysin (PLL), Laminin oder einem anderen Zelladhäsionsmolekül beschichtet werden.
  4. Waschen Sie das Geschirr zweimal mit Wasser (verwenden Sie keine phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS), da Salzkristalle die Kanäle blockieren können), entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung wie einem Biosicherheitsschrank für 5-10 Minuten oder bis zu trocknen Die Oberfläche ist völlig trocken.
    Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Deckgläser absolut trocken sind, da jede verbleibende Flüssigkeit die Einhaltung der mikrofluidischen Systeme beeinträchtigen wird.
  5. Legen Sie mikrofluidische Geräte mit Mustern nach oben unter UV-Licht in einer sterilen Umgebung (Biosicherheit Schrank) für 10 min. Achten Sie darauf, sterile Verfahren bei der Arbeit im Biosicherheitsschrank 10 zu folgen.
  6. Mit Pinzetten legen Sie eine mikrofluidische Gerät mit Muster nach unten in Kontakt mit dem sauberen DeckelIp / dish Benutzen Sie die Pinzette, um das Gerät sanft zu drücken, damit es an dem Glas haftet.
    Hinweis: Die Transparenz der angeklebten Region ist sichtbar, wenn man gegen das Licht schaut. Stellen Sie sicher, dass alle Ecken das Glas berühren. Tun Sie dies für alle mikrofluidischen Geräte. Siehe Abbildung 1a .
  7. Um das einzelne Populationsgerät mit Medium zu füllen, punktiere die Pipette auf die Kanäle und füge 50 μl vollständiges Zellmedium, ergänzt mit serumfreiem B-27 (Volumenverhältnis 1:50) und 500 μg / ml Penicillin / Streptomycin / Glutamin (zusammen Genannt NBM) in die rechte obere Vertiefung, und füge dann weitere 50 μl zu der gut diagonal liegenden Wanne hinzu. Tun Sie dies für alle Geräte, um sicherzustellen, dass das Medium zwischen Brunnen fließt. Als nächstes werden 50 μl Medium zu den restlichen 2 Vertiefungen gegeben. Siehe Abbildung 2a .
    1. Um das Mehrfach-Populationsgerät mit Medium zu füllen, punkte die Pipette auf die Kanäle und füge 30 μl hinzuDer vollständigen NBM zu den rechten Brunnen, siehe Abbildung 6a . Tun Sie dies für alle Geräte, um sicherzustellen, dass das Medium zwischen Brunnen fließt. Als nächstes werden 50 μl Medium zu den restlichen 4 Vertiefungen gegeben.
  8. Legen Sie die Geräte in eine größere Platte mit einer offenen Schale mit autoklaviertem Wasser (Nasskammer) und legen Sie in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit) für 1-2 h bei der Herstellung der Zellkultur. Siehe Abbildung 2b .

2. Überzug Neuronen in mikrofluidischen Systemen

  1. Nach dem in Ref. 8 , erhalten dissoziierte hippocampale oder kortikale Neuronen von Sprague Dawley Rattenembryonen (entweder Geschlecht).
  2. Wiederholen embryonale Neuronen in NBM in einer Konzentration von 1-2 Millionen Neuronen / ml. Überprüfen Sie die Zellkonzentrationen im Mikroskop mit einem Hämocytometer und nach Referenz 8 . Stellen Sie die Zellkonzentration einG auf die gewünschte Zelldichte. Um die Chancen zu erhöhen, einzelne Hippocampus-Axone pro Kanal zu erhalten, schicke man 10.000 Neuronen pro Gerät. Um mehrere Axone im selben Kanal zu haben, tafel 60.000 Neuronen pro Gerät.
    Anmerkung: Diese Zahlen variieren je nach dem verwendeten neuronalen Typ.
  3. Entfernen Sie das Medium von den mikrofluidischen Geräten, ohne die Brunnen zu entleeren. Lassen Sie ca. 5 μl in jedem.
  4. Um Zellen in der einzelnen Populationsvorrichtung zu trennen, füge 50 & mgr; l NBM zu der unteren rechten Vertiefung hinzu. An diesem Punkt fließt das Medium von selbst, um den anderen unteren Brunnen zu füllen. Füge 20 μl der Konzentratzelllösung in die obere rechte Vertiefung der mikrofluidischen Vorrichtung ein, wie in Abbildung 1b angegeben.
    1. Um Zellen in der Mehrfachbevölkerungsvorrichtung zu trennen, fügen Sie 20 & mgr; l der Konzentratzelllösung in jede der rechten Vertiefungen in 6a hinzu.
  5. Überprüfen Sie das Mikroskop, wenn ZellenBefinden sich in den Kammern und legen die Geräte 15-30 min in den Inkubator, um die Zellbefestigung auf dem Substrat zu fördern.
  6. Überprüfen Sie das Mikroskop, wenn genügend Zellen in den Kammern vorhanden sind. Wenn mehr erforderlich sind, wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5.
  7. Füge 50 μl NBM zu den 2 Top-Vertiefungen der einzelnen Populations-Apparatur und 20 & mgr; l NBM in dieselbe hinzu, wie die Zellen in die Mehrfach-Populations-Vorrichtung injiziert wurden. Die Medien ragen leicht aus, um einen positiven Meniskus zu bilden, der den Brunnen einen Muffin-Top-Aspekt verleiht. Wieder siehe Abbildung 2a .
  8. Halten Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit.

3. Erhaltung der neuronalen Kulturen

  1. NBM (ca. 30 μl mit einer Pipette) aus den Zellen entfernen und am Tag nach der Einführung in die Geräte eine neue vorgewärmte NBM auftragen (das ist 1 d nach Schritt 2).
  2. Überprüfen Sie alle 2 Tage, wenn genügend Medium in jedem Kanal vorhanden ist. Wenn das Muffin tOp ist niedrig nur noch mehr Mittel zu den Top-Brunnen hinzufügen.
  3. Kulturzellen für mindestens 7 d vor dem Entfernen der mikrofluidischen Geräte. Die Zellen können in diesen Geräten für mehrere Wochen überleben. Entfernen Sie die Geräte 1-2 Tage, bevor die Versuche an Proben durchgeführt werden.

4. Entfernung von mikrofluidischen Geräten

  1. 1 - 2 d vor dem Entfernen von mikrofluidischen Geräten, fügen Sie 2 mL NBM vorgewärmt auf 37 ° C zu jeder Probe Schale, Überschwemmung der Kammern, und pflegen die Geräte in den Inkubator.
  2. Verwenden Sie sterile Pinzette und eine Spitze, um die mikrofluidischen Geräte aus den Deckgläsern zu entfernen und eine gemusterte Konfiguration von Neuronen zu hinterlassen. Benutze die Spitze, um das Deckglas an Ort und Stelle zu halten, und die Pinzette, um die Kante des Geräts an der unteren linken Ecke des Brunnens zu verschließen. Wenden Sie die Torsion sorgfältig an und heben Sie das Gerät mit der Pinzette an, damit es das Deckglas abzieht. Siehe Abbildung 2c - 2d .
  3. Alle 2-3 Tage, ersetzen Sie haWenn die NBM bis zur Probe für Experimente verwendet wird.
  4. Bevor Sie Umverdrahtungsversuche an der Probe durchführen, stellen Sie sicher, dass Neuriten in den einzelnen Populationsgerätskanälen und den neuronalen Populationen in der Mehrfachbevölkerungsvorrichtung isoliert werden, indem die Lücken zwischen ihnen im Mikroskop untersucht werden, um sicherzustellen, dass keine Filamente vorhanden sind, die neuronale Populationen verbinden.

5. Vorbereitung von PDL-beschichteten Perlen

  1. Füge 2 x 50 & mgr; l Tropfen von 4, 10 oder 20 & mgr; m Polystyrolkugeln hinzu, die in Wasser (1: 500) verdünnt wurden, zu 1 ml PDL (100 & mgr; g / ml). Lassen Sie mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen.
    Hinweis: Protokoll kann hier pausiert und am nächsten Tag wieder aufgenommen werden.
  2. Die Lösung bei 8.820 xg für 1 min zentrifugieren Den Überstand vorsichtig entfernen, ohne die an der Unterseite des Behälters angesammelten Perlen zu stören.
  3. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml steriler 10 mM HEPES pH 8.4 Lösung.
  4. Resuspendieren der PDL-beschichteten Perlen in 200 ml 10 mM HEPES pH 8,4Lösung.

6. Vorbereitung von Mikropipetten

  1. Pipetten aus Glas-Kapillarrohren (1 mm Innendurchmesser, 1,5 mm Außendurchmesser) mit einem horizontalen Elektrodenabzieher vorbereiten. Stellen Sie die Einstellungen so ein, dass die äußere Spitze der gezogenen Mikropipette ~ 2-5 μm beträgt. Vor dem Ziehen sicherstellen, dass die Glasrohre sauber sind.
  2. Fixieren Sie Pipetten auf Glasrutschen für die Lagerung und stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht die Oberfläche der Folie berührt, da die Spitze zerbrechlich ist. Bei Raumtemperatur in einem überdachten Behälter aufbewahren, um vor Staub zu schützen. Verwenden Sie Pipetten am selben Tag, an dem sie gezogen werden.

7. PDL-Wulst Adhäsion an Neuronen

  1. Fügen Sie 40-60 μl PDL-beschichtete Perlen in Schritt 5 zu einer in Schritt 4 hergestellten Zellkultur hinzu. Zentrieren Sie die Pipettenspitze über die Neuronen, die auf dem Deckglas schwach sichtbar sind, und fügen Sie die Perlen hinzu (siehe Abbildung 3 ).
  2. Bringt die Probe 1 Stunde lang in den Inkubator zurück, um die Bildung von sy zu fördernNaptische Kontakte 8 , 9 .
  3. Nach der Inkubation entfernen Sie alle nicht aufgeklebten Perlen, indem Sie die Kultur vorsichtig mit vorgewärmtem NBM waschen.

8. Vorbereitung der physiologischen Kochsalzlösung (für Raumtemperaturversuche)

  1. Vorbereitung der physiologischen Kochsalzlösung durch Kombination der in den Literaturstellen 7 , 8 aufgeführten Zutaten. Dies soll die Zellumgebung außerhalb des Inkubators regeln.
  2. Überprüfen Sie die Osmolarität und den pH-Wert, wie in den Literaturstellen 7 , 8 angegeben.
  3. Kontinuierlich Lösung mit O 2 , um pH-Schwankungen bei der Durchführung von Experimenten zu minimieren.
  4. Auf Raumtemperatur erhitzen
  5. Stellen Sie das Perfusionssystem ein, indem Sie ein Ende eines Plastikschlauches (optionale Abmessungen) in O 2 einfließende physiologische Lösung einsetzen und die andere eNd zu einer Nadel, die in den Probenhalter eingefügt ist. Stellen Sie den Schlauch und die Lösung höher als die Probe (siehe Abbildung 4 ).
    1. Trennen Sie den Schlauch von der Nadel und verbinden Sie ihn mit einer Spritze. Verwenden Sie die Spritze, um Druck auszuüben und Flüssigkeit zu füllen, füllen Sie den Schlauch. Mit einer Rollenklemme abdichten und die Nadel wieder anschließen.

9. Perlenmikromanipulation

  1. Setzen Sie die Probe in eine Versuchsanordnung ein, so dass die Zellen von oben durch zwei Mikromipipetten, die in Mikromanipulatoren montiert sind, zugegriffen und optisch unterhalb, beispielsweise mit dem 40X-Phasenobjektiv (numerische Apertur von 0,6) eines invertierten optischen Mikroskops, zugegriffen werden können. In dieser Konfiguration montieren Sie eine CCD-Kamera für die Bildaufnahme am Seitenanschluss des Mikroskops. Verbinden Sie jede Pipette mit 1 ml Spritzen über Plastikschläuche. Bei diesem Schritt ersetzen Sie NBM mit physiologischer Kochsalzlösung (1-2 ml) (siehe Abbildung 4 ).
  2. Während der experiKontinuierlich perfuse Zellen mit der in Schritt 8 hergestellten physiologischen Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,5-1 mL / min.
  3. Wähle einen PDL-Bead, der NICHT an ein Neuron im Sichtfeld angehängt ist. Richten Sie den Wulst mit einer Mikropipettenspitze aus, indem Sie auf die Perle auf die Mikropipette fokussieren. Bringen Sie die Spitze so nah wie möglich an die Perle, indem Sie sie durch das Mikroskop überwachen.
  4. Unterdruck mit der 1-ml-Spritze auftragen, die mit der Pipette verbunden ist, um den Wulst aufzunehmen. Unterdruck während des gesamten Experiments beibehalten.

10. Ziehen von Neuriten

  1. Wählen Sie eine PDL-Perle, die an einem Neuron im Sichtfeld befestigt ist, und befestigen Sie es mit der Sekunde, wie in den Schritten 9.3-9.4 beschrieben, an die zweite Mikropipette.
  2. Ziehen Sie den PDL-Wulst-Neuron-Komplex langsam (~ 0,5 μm / min), indem Sie entweder den Mikromanipulator oder die Probenstufe um 1 μm bewegen und für 5 min anhalten, um die Neuritinitiierung zu ermöglichen.
  3. Wiederholen Sie Schritt 10.2 zweimal.
    Hinweis: Die ersten 3 &# 181; m müssen sehr langsam gezogen werden, um den experimentellen Erfolg zu garantieren, der über 95% der Zeit auftritt.
  4. Ziehen Sie den PDL-Wulst-Neuron-Komplex langsam (~ 0,5 μm / min), indem Sie entweder den Mikromanipulator oder die Probenstufe um 2 μm bewegen und für 5 min anhalten, um eine Neuritendehnung zu ermöglichen.
  5. Nach erfolgreicher Initiation und Neuritenverlängerung für die ersten 5 μm ziehen Sie den Neuriten mit 20 μm / min über Millimeter-Skalen zurück.
    Hinweis: Das Ziehen kann kontinuierlich oder in Schritten und mit unterschiedlichen Raten durchgeführt werden. Siehe Abbildung 5b -5c .

11. Neuronen verbinden

  1. Wählen Sie eine Region, die reich an Neuriten ist, und senken Sie den PDL-Wulst-Neuriten-Komplex, so dass es physisch Kontakte hat. Verwenden Sie andere Perlen, um die Spitze Höhe über Deckglasoberfläche zu messen. Siehe Abbildung 5d .
  2. Verlassen Sie den PDL-Wulst-Neurit-Komplex in Kontakt mit dem Ziel-Neuriten bei der Manipulation der zweiten MikropiPette Senken Sie die zweite Pipette mit dem zweiten PDL-Wulst auf den neu gebildeten Neuriten um ca. 20 μm aus der ersten Perle. Benutze den zweiten PDL-Wulst, um den neuen Neuritenfaden auf die Zielzelle zu drücken.
  3. Halten Sie beide Perlen mindestens 1 Stunde an Ort und Stelle. Überprüfen Sie die Abwesenheit der fokalen Schwellung, eine Verdickung der Neuriten, die mit dem Wulst in Berührung kommen, mit dem Mikroskop 16 .
  4. Während dieser Zeit, verwenden Sie Perfusion, um langsam das Medium der Probe von physiologischen Kochsalzlösung zu vorgewärmten, CO 2 -equilibrierten NBM zu ändern.
  5. Lösen Sie die Perle aus der zweiten Pipette, indem Sie die Saugwalze lösen. Wenn der neue Neurit anhängt, lassen Sie auch die erste Perle los. Siehe Abbildung 5e .
  6. Entfernen Sie vorsichtig Salzlösung und ersetzen Sie sie durch NBM (~ 2 ml).
  7. Setzen Sie die Probe vorsichtig wieder in den Inkubator, um die neuronale Verbindung für zukünftige Experimente zu verstärken. Diese Verbindung ist stabil für> 24 h 7

12. Überprüfen der Funktionalität der neuen Verbindung über ganzzellige gepaarte Patch-Clamp-Aufnahmen

  1. Verweise beachten 7 , 18 , 19 . Um eine elektrophysiologische Einrichtung zusammenzustellen.
  2. Verweise beachten 7 . Um die vor- und postsynaptischen Elektroden vorzubereiten.
  3. Sammle Patch-Clamp-Daten, wieder nach den Referenzen 18 , 19 .
  4. Vergleichen Sie die Ergebnisse mit den natürlich vorkommenden Signalen 7 , um den Verbindungstyp zu bestimmen.

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Representative Results

Embryonale Ratten-Hippocampus-Neuronen werden in mikrofluidischen Vorrichtungen kultiviert, um eine präzise Positionierung von Zellen, PDL-Kügelchen und Mikromanipulatoren zu ermöglichen. Der erste Schritt besteht darin, die mikrofluidische Vorrichtung auf einem Glasdeckel oder einer Schale richtig zusammenzubauen. Es ist wesentlich, dass die mikrofluidische Vorrichtung gut an dem Substrat befestigt ist, um zu vermeiden, dass Zellen aus den Kammern austreten und sich unter den Teilen der Vorrichtung bewegen, die versiegelt werden sollten ( 1a ). Um gesunde Kulturen für mehrere Wochen zu erhalten, ist es wichtig, eine mittlere Verdampfung zu verhindern, indem man das Zellmedium alle 2-3 Tage überprüft und einen positiven Meniskus des Mediums erhält (Abbildung 2a ). Eine mittlere Verdampfung wird auch vermieden, indem sowohl die Zellen als auch eine offene Schale von Wasser in einer größeren Platte gehalten werden (Abbildung 2b ). Die mikrofluidischen Geräte können jederzeit entfernt werden. Für optimale Ergebnisse sollte NBM der Zelle hinzugefügt werdenVice-System mindestens 1 d vor der Geräteentfernung. Dies minimiert die zelluläre Belastung, wenn die Neuronen mit dem Medium bei optimaler Temperatur und dem pH-Wert in Berührung kommen, wenn die Geräte entfernt werden. Wenn die mikrofluidischen Vorrichtungen langsam von der Schale abgezogen werden (Abbildung 2c Und 2d ) Zellen bleiben in der gemusterten Position (Abbildung 3 und Abbildung 5a ).

Es werden zwei Arten von mikrofluidischen Geräten verwendet: Neuro Device und Co-Culture Device. Die erste ermöglicht eine einfache Identifizierung von Axonen, Dendriten und Zellkörpern. Der Soma bleibt in der oberen Soma-Kammer, während Axone und Dendriten entlang der mikrofluidischen Kanäle ( Fig. 5a ) zur Axonalkammer wachsen.

Es wird empfohlen, dass PDL-Perlen zu Zellen im Verhältnis von 10: 1 hinzugefügt werden und dass die meisten Perlen, die haIch hafte nicht an der Kultur, indem ich die Zellen einmal mit NBM nach der 1-stündigen Inkubation waschen kann (Abbildung 3 ). Nach der PDL-Wulst-Adhäsion an Neuriten wird der PDL-Wulst-Neurit-Komplex gezogen und kann über große Entfernungen verlängert werden. Der neu gebildete Neurit kann genau mit Neuriten oder Soma Millimeter entfernt verbunden werden ( Abbildung 5b -5e ). Die Erfolgsquote für das Ziehen eines neuen Neurits für die ersten 3 μm bei Geschwindigkeiten unter 1 μm / min beträgt> 95% (n = 206). Die Erfolgsquote für den Anschluss des neuen Neuriten an eine andere Zelle beträgt 70% (n = 30). Die Verbindung ist in den ersten 18 h sehr zerbrechlich, vor allem, weil der neue Neurit ein Faden von weniger als 1 μm Durchmesser ist, der durch einen 10 μm PDL-Wulst verankert ist. Wenn die Schale während der ersten Kontaktminuten schnell bewegt wird, kann die resultierende Turbulenz des Mediums dazu führen, dass der Wulst rollt und folglich die Haftung verloren geht. Allerdings, wenn die Probe nicht sha istKen, in 30 min der perlen haftet an den neuriten auf dem teller und die neue verbindung bleibt für mindestens 48 h. Siehe Abbildung 4 für ein Schema des Aufbaus.

Die PDL-Wulstposition auf der Kultur kann auch verwendet werden, um die Lage des verbundenen Neuriten leicht zu identifizieren ( Fig. 6d-6e ). Nach der Initiation, Erweiterung und Verbindung eines neuen Neuriten wird eine zweite, nicht adhärente PDL-Perle, die über den Mikromanipulator aufgenommen wird, verwendet, um eine zweite Adhäsionsstelle zwischen dem initiierten Neuriten und der zweiten neuronalen Population zu erzeugen. Die zweite PDL-Perle wird auf den neuen Neuriten gelegt und so komprimiert, dass der neue Neurit nur die zweite neuronale Population kontaktiert. Dies wird die Haftung mit der zweiten neuronalen Population fördern (Abbildung 5f ).

Die Mehrfachbevölkerungseinrichtung enabDas Wachstum von 4 isolierten neuronalen Populationen auf demselben Teller. Jede neuronale Population beschränkt sich auf ein 4 x 7 mm Rechteck, das von anderen neuronalen Populationen durch 100 oder 200 μm Lücken getrennt ist (Abbildung 6a ). Gesunde Neuronen können innerhalb der Geräte für mehrere Wochen wachsen. Normalerweise bleiben die neuronalen Populationen bis zu 48 h nach dem Entfernen des Gerätes isoliert. Nach dieser 48-stündigen Periode neigen Neuronen dazu, zu benachbarten neuronalen Populationen zu wachsen und bilden natürliche Verbindungen. Vor der Verbindung von zwei isolierten Populationen sollte überprüft werden, dass die Populationen tatsächlich durch die Untersuchung der gesamten Lücke mit dem Mikroskop isoliert sind, um festzustellen, dass es keine Verbindung zwischen den beiden neuronalen Populationen gibt (Abbildung 6b ).

Nach der Verbindung wurden die Proben für 24 h inkubiert und es wurden elektrische Ganzzell-gepaarte Patch-Clamp-Aufnahmen durchgeführt, um zu untersuchen, ob die neuGebildetes Neurit, das verwendet wurde, um zwei isolierte neuronale Populationen zu verbinden, war funktionell und in der Lage, elektrische Signale zu übertragen. Ein Neuron in der Population eins, der weniger als 100 μm Radius von der Stelle, wo der induzierte Neurit initiiert wurde, wurde ausgewählt, um präsynaptische Aktionspotentiale (PAPs) aufzuzeichnen. Dieses Neuron wurde als die präsynaptische Zelle betrachtet. Postsynaptische exzitatorische oder inhibitorische Aktivität wurde von einem Neuron in der Population zwei auf der anderen Seite des Spalts aufgezeichnet, die sich in einem Radius von weniger als 100 μm der mikromanipulierten Verbindung befand ( Abbildung 7a -7c ). Aufnahmen aus den mechanisch induzierten Verbindungen wurden analysiert und mit denen aus natürlich verbundenen neuronalen Populationen und nicht verbundenen Populationen verglichen (Abbildung 7 ). Die elektrischen Reaktionen nach PAP, aufgenommen von Neuronen, die natürlich und durch Mikromanipulation verbunden sind, sind signifikant höher und zeitlich korrelieren mit dem präsynaptischenAktivität ( Abbildung 7 ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Standardisierung von neuronalen Kulturen mit mikrofluidischen Mitteln 7 . ( A ) Geräteanordnung: Wenn die mikrofluidischen Geräte ordnungsgemäß auf einer trockenen Oberfläche montiert sind, sind alle Kammern sichtbar. ( B ) Zellplattierung: Platte die Zellen oben rechts gut und Zellen sollten sich nach links gut bewegen. ( C ) Zelldichte: kurz nach dem Plattieren, Check in das Mikroskop, wenn die Konzentration der Zellen ausreichend ist. ( D ) Nach 1 d in Kultur werden hippocampale Neuronen in der Nähe der Mikrokanäle gut verklebt und beginnen, Neuriten zu bilden. Bitte klicken Sie hier um ein larg anzuzeigen Version dieser Figur.

Figur 2
Abbildung 2 : Pflege von gesunden neuronalen Kulturen für mehrere Wochen 7 . ( A ) Füge Medium alle 2-3 d hinzu und behalte einen positiven Meniskus in den oberen Brunnen der mikrofluidischen Kammern, so dass die Zellen eine konstante Versorgung mit Nährstoffen haben werden. ( B ) Halten Sie die Zellen in einer größeren Platte mit einer Schale, die Wasser enthält, um die mittlere Verdampfung zu reduzieren. ( C ) Verwenden Sie die sterile Spitze und die Pinzette, um ( d ) die Mikrovorrichtungen leicht abzuschälen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3 : Ort der Pipettenablagerung von Perlen in Kulturen. Sobald die mikrofluidische Vorrichtung entfernt worden ist, sind Neuronen auf dem Deckglas sichtbar. Beim Ablegen von Perlen die Pipettenspitze so positionieren, dass sie sich in der Mitte der Zellen befindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Schema eines typischen Neuriten-Zieh-Aufbaus. Die Probe ruht auf einer (piezo-betätigten) Stufe und kann von oben durch 2 Mikropipetten, die in Mikromanipulatoren gehalten werden, zugänglich sein und über Plastikschläuche mit 1 ml Spritzen verbunden werden. Die Probe wird optisch von unten durch ein Objektiv aufgerufen, das mit einer CCD-Kamera verbunden ist, die sendetS Bilder zu einer CPU. Ein Einlaßrohr speist mit Sauerstoff eine sauerstoffhaltige physiologische Kochsalzlösung zu der Probe, die darunterliegt, und ein mit einer Spritze verbundenes Auslaßrohr ermöglicht das Entnehmen der Lösung im Falle eines Überlaufs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5 : PDL-Wulst Adhäsion an Neuronen und Pipettenmikromanipulation 7 . ( A ) Neuronen bleiben nach dem Entfernen von mikrofluidischen Kammern in Mustern organisiert, die eine einfache Identifizierung von Soma und Neuriten ermöglichen. ( B ) Die Mikromanipulation von PDL-Perlen, die an Neuriten haften, ermöglicht die Neuritinitiierung, die Extension ( c ) und die Verbindung ( d ),Gefolgt von der Freigabe der PDL-Perle aus der Pipette ( e ). ( F ) Nach dem Kontakt mit zwei isolierten neuronalen Populationen (unterer Pfeil) wird ein zweiter PDL-Wulst- und Pipetten-Mikromanipulator (oberer Pfeil) verwendet, um einen zweiten Adhäsionspunkt zu bilden, ein paar Hundert Mikrometer auseinander bilden die erste Kontaktstelle und garantieren funktionelle Verbindungen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6 Initiation, Dehnung und Verbindung neuer Neuriten, um zwei isolierte Populationen mit Multiple Population Device und Mikromanipulation zu verbinden 7 . ( A ) Das Gerät isoliert 4 neuronale PopulationenZwischen 3 Lücken von jeweils 100 oder 200 μm ( B ) Nach dem Entfernen des Gerätes, wählen Sie eine Lücke und bestätigen, dass keine Neuriten die 2 einzelnen Populationen verbinden. ( C ) Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus, wie sie im optischen Mikroskop sichtbar ist, zeigt die Position von zwei Mikropipetten und die Anwesenheit von PDL-beschichteten Perlen an. ( D ) Durch die Anwendung von Unterdruck auf eine Pipette wird ein PDL-Wulst, der an einer neuronalen Population haftet, mit der Pipettenspitze gezogen, wodurch ein neuer Neurit initiiert wird. Durch Aufrechterhalten des Unterdrucks in der Pipette kann der PDL-Wulst-Neurit-Komplex (grün) gezogen und der Neurit verlängert werden. ( E ) Pipettenmikromanipulation führt die Erweiterung des neuen Neuriten über die Lücke und die Bildung einer Verbindung mit einer neuen neuronalen Population. Um die Adhäsion des neuen Neuriten an die zweite Population zu sichern, wird ein PDL-Bead (rot) mit einer zweiten Pipette auf dem ausgedehnten Neuriten und Neuro positioniertNal Bevölkerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7
Abbildung 7: Der neu induzierte, langgestreckte und vernetzte Neurit kann Informationen zwischen zwei isolierten neuronalen Populationen übertragen 7 . Isolierte neuronale Populationen wurden durch eine 100 μm Lücke in PDMS-Mikrogeräten kultiviert. Die gepaarten Patch-Clamp-Aufnahmen wurden in der gesamten Zellkonfiguration von einem Neuron in der Population eins und einem Neuron in der Population zwei (auf der anderen Seite der Lücke) durchgeführt, als die beiden Populationen durch mechanische Manipulation ( a ) verbunden waren, die natürlich über die Verbindung miteinander verbunden waren Lücke ( b ) oder bleiben nicht verbunden durch maintDie Lücke zu schließen ( c ). Repräsentative Spuren von gepaarten Aufnahmen werden für jede Bedingung ( df ) angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Unter Verwendung von Standardmikromanipulation und innovativen mikrofluidischen Geräten wurde eine neue Technik entwickelt, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über große Entfernungen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Pipettenmikromanipulation ist ein allgemeines Werkzeug in den meisten Neurowissenschaften Labors 4 , 13 . Die eigentliche Herausforderung für die Erreichung reproduzierbarer und zuverlässiger Ergebnisse war die Standardisierung von gesunden, präzise positionierten neuronalen Kulturen für die Dauer des Experiments (die in der Größenordnung von Wochen liegen kann) durch die Entwicklung von mikrofluidischen Geräten zur Organisation von Zellkulturen mit Mikrometergenauigkeit. Hochwertige Zellkulturen sind der Eckpfeiler der Datenvalidierung. Dies trägt zur leichteren und schnelleren mikroskopischen Bildgebung und Standardisierung von Kulturen und Ergebnissen bei. Die mikrofluidischen Vorrichtungen wurden entworfen, um Zellen in vitro mit einer ähnlichen Organisation wie in vivo zu kultivieren. Das einzelne Populationsgerät ermöglicht esDas Wachstum der langen Neuriten und die einfache Identifizierung von Axonen, Neuriten und Soma. Die Anzahl der in den mikrofluidischen Kammern plattierten Zellen bestimmt die neuronale Dichte. Daher ist es durch das Plattieren von weniger Zellen pro Gerät einfach, einzelne Neuronen in der Nähe der Kanäle zu identifizieren. Das Axon und die mehreren Dendriten eines einzelnen Neurons wachsen innerhalb eines Kanals. Dendriten wachsen mindestens 5 mal langsamer als die Axone 6 , 17 und nach 2-3 Wochen in vitro ist ihr Wachstum in den Kanälen meist auf 200 μm begrenzt, während schnell wachsende Axone über 2 mm hinausgehen können. Daher ist es nach dem Hinzufügen von PDL-Kügelchen zu den Proben relativ einfach zu schätzen, ob die Perlen hauptsächlich an Axonen oder an Axonen und Dendriten haften (Abbildung 5b - 5f ). Es gibt höhere Chancen, neue Axone und Dendriten zu ziehen, wenn man die an Neuriten angebrachten PDL-Perlen kürzer als 200 μm ziehtIle gibt es größere Chancen, nur neue Axone zu ziehen, wenn man PDL-Perlen an Neuriten anhängt, die länger als 500 μm sind. Die Mehrfachbevölkerung ist für das reproduzierbare Wachstum von gesunden, getrennten Populationen für mehrere Wochen nützlich. Dieses System von Kanälen ist nützlich für das Studium von bis zu 4 verschiedenen Zelltypen oder Vergleich der gleichen Zellen mit verschiedenen Behandlungen.

Darüber hinaus bietet eine kontrollierte und reproduzierbare Zellkulturumgebung einen idealen Rahmen für die Zellanalyse und -manipulation. Die präzise Positionierung von Zellen auf einer Schale erleichtert die Identifizierung von interessierenden Regionen sowie Orientierung und Navigation durch diese Interessengebiete, was letztlich eine beispiellose Kontrolle über die Neuriteninitiierungsstelle ermöglicht. Eine kontrollierte Zellverteilung macht es einfacher, die neu gebildete Verbindung zu visualisieren und viel schneller, um die neue Verbindung mit dem Mikroskop in den Tagen nach der Inkubation zu finden. Darüber hinaus reproduzierbare Konfigurationen von ZellenErmöglichen eine einfache und präzise Positionierung von chemischen Queues, wie die PDL-beschichteten Perlen, auf den Soma, Dendriten oder Axonen 8 . Zusammengenommen ist die Bildgebung und Analyse von Zellen, die in mikrofluidischen Geräten angebaut werden, aufgrund der standardmäßigen zellulären Organisation, die in allen Gerichten wiedergegeben wird, schneller. Darüber hinaus sind die Geräte aus biokompatiblen, transparenten und entfernbaren Material hergestellt, so dass die Bildgebung bei allen sichtbaren Wellenlängen und das Zellüberleben innerhalb der Geräte für mehrere Wochen ermöglicht wird. Die Miniaturisierung von zellulären Assays hilft auch, mehr Daten mit weniger Zellen zu sammeln. Der geringe Volumen der mikrofluidischen Geräte reduziert die Anzahl der benötigten Zellen pro Experiment und erhöht die experimentelle Wirksamkeit. Zum Beispiel, anstatt mehrere Stunden mit einem Mikroskop für vielleicht 1 oder 2 isolierte Axone in einer Schale zu suchen, kann die einzelne Populationsvorrichtung verwendet werden, um sofort über 100 isolierte Axone pro Zellprobe zuzugreifen. Die mikrofluidischen Geräte bieten eine miniaturisierte, zuverlässige und kontrollierteZellkultur-Umgebung begünstigt die Analyse von seltenen Proben mit der Zeit, um mehrere Tests durchzuführen.

Potenzielle Variationen der Technik beinhalten die direkte Anbindung der Perle an die Mikropipette. In dem aktuellen Protokoll wird ein Verfahren zum Anbringen des Wulstes an der Spitze über Absaugen beschrieben, aber der Wulst kann auch an die Spitze geklebt werden. Klebstoff ist die bessere Option, wenn eine sehr stabile Verbindung zwischen der Spitze und dem Wulst wünschenswert ist, zum Beispiel wenn Kraftmessungen mit der Pipette als Sensor durchgeführt werden oder wenn die Untersuchung der Haftung zwischen PDL und dem Neuriten das wichtigste experimentelle Ziel ist. In einer anderen Vene ist das Absaugen vorteilhaft, da es die Freigabe des Wulstes nach der Platzierung ermöglicht, ohne den Neurit-Wulstkomplex zu trennen, wodurch mehrere Verbindungen parallel hergestellt werden können. Saugung bietet Mittel für Hochdurchsatzverdrahtungsexperimente, eine Verbesserung gegenüber anderen Manipulationstechniken wie Atomkraftmikroskopie (AFM) 7 </ Sup> , 16 Beide Modifikationen dieses Verfahrens erlauben es, die Neuriten-Initiationsstelle durch einfaches Aufrechterhalten eines Wulstes in Kontakt mit einem Dendrit zu wählen, so dass Synapsen gebildet werden. Die Strategie der Inkubation von mehreren Perlen, wie in Schritt 7 beschrieben, spart jedoch Zeit in der Manipulationsstufe und wird empfohlen, wenn eine präzise Kontrolle über die Initiierungsstelle im Experiment nicht erforderlich ist.

Die zukünftige Forschung könnte versuchen, verschiedene instrumentelle Einschränkungen zu adressieren, nämlich Temperaturkontrolle und Probenzugänglichkeit. Die mechanischen Eigenschaften der Zellmembran können bei verschiedenen Temperaturen signifikant variieren 27 . Idealerweise sollten alle Experimente bei 37 ° C in neuronalem Medium und adäquaten Bedingungen durchgeführt werden (korrekte CO 2 -Druck- und Feuchtigkeitskontrollen). Es war jedoch nicht möglich, einen geschlossenen Zellinkubator zu verwenden, da für die Mikromanipulatoren der Zugang zu den Proben von oben benötigt wirdUnten für das Mikroskop und von der Seite, um die Bühne zu bewegen. Daher wurde eine Perfusion bei Raumtemperatur verwendet. In ähnlicher Weise, da der Aufbau nur genug Platz hat, um 2 Mikromanipulatoren unterzubringen, und es dauert fast 1 h, um eine einzige Verbindung herzustellen, gibt es eine Grenze für die Anzahl der Experimente, die man ausführen kann. Dieses Problem könnte mit einem Manipulator angesprochen werden, der mehr als eine Perle zu einer Zeit zieht. Eine weitere mögliche Verbesserung dieses Protokolls ist die Fähigkeit, die Höhe des Wulstpipettenkomplexes von der Probenoberfläche zu erfassen. Die Unfähigkeit, dies zu tun, kann zu Ungenauigkeiten führen, wenn man die zweite Perle herunterbringt und sie auf den induzierten Neuriten setzt, um sie zu fixieren. Die Perle wird auf dem neuen Neuriten in einer neuritenreichen Region abgesenkt, bis der neue Neurit und die auf dem Teller in der gleichen Brennebene liegen. Der neue Neurit ist nie zwischen dem Wulst und dem Teller, sondern immer zwischen einem Kissen von Zellmaterie und dem Wulst, daher wird die Kompression reduziert.Der neue Neurit wird für 10 min im Mikroskop beobachtet, um zu beurteilen, ob Neuriten-Fokusschwellungen in der Nähe von Perlen gebildet werden. Wie in Referenz 16 beschrieben, zeigt das Vorhandensein von Schwellungen eine Neuritendegeneration an. Dennoch kann, da die Anwendung unterschiedlicher Druckmengen auf Axone zu physiologischen Veränderungen führen kann, die zukünftige Forschung auf die Anpassung der Pipetten-Sonden durch Festlegung von Reflektoren an sie und die Überwachung der Verschiebung senkrecht zur Probenoberfläche mit AFM-Methoden konzentrieren. Schließlich ist vielleicht die größte Herausforderung für dieses Protokoll, die Funktionalität der manipulierten Verbindung zu testen. Die direkteste, zuverlässigste und gut etablierte Technik ist gepaartes Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. Allerdings ist die Erfolgsrate der regulären gepaarten Patch-Clamp-Aufzeichnung sehr gering (<25%) 18 . Voll-Zell-Patch-Clamp hat mehrere Nachteile einschließlich lange Rüstzeit, begrenzte Anzahl von Experimenten / Tag, begrenzte Aufnahmezeit (~ 30Min), geringe experimentelle Ausbeute für gepaarte Patch-Clamp-Aufnahmen und Zelltod nach Messungen. Aufgrund dieser technischen Herausforderungen ist die experimentelle Ausbeute von Ganzzell-Patch-Clamp-gepaarten Aufnahmen nach der Mikromanipulation sehr gering. Bessere Plattformen und Techniken sind notwendig, um die neuronale Aktivität in natürlichen und mikromanipulierten Verbindungen präziser zu stimulieren, aufzuzeichnen und zu vergleichen.

Die Bedeutung der Spannungen im axonalen Wachstum ist seit den frühen Tagen der Neuroanatomie bekannt - als passive Dehnung 20 . Während der frühen embryonalen Entwicklung wandern Neuriten durch kleine Entfernungen, um ihre Ziele zu erreichen. Wenn die meisten Zellen sich teilen und duplizieren, werden die Axone kontinuierlichen Kräften unterworfen, um sich zu dehnen und ihre Länge dem embryonalen Wachstum anzupassen 20 , 21 . Mehrere Gruppen haben versucht, die Grenzen des Neuritenwachstums zu testen, indem sie chemische Hinweise und / oder mechanische Spannungen auf neu anwendenRons (zur Überprüfung siehe Referenz 22 ). In diesen Berichten 23 , 24 , 25 , 26 sowie während des physiologischen Wachstums werden die Neuriten gezogen, während sie an einem Substrat befestigt sind. Der Hauptunterschied zu unserem Aufbau ist, dass in der vorliegenden Technik die neuen Neuriten nur zwei Adhäsionskontakte haben; An der Basis ist der Neurit an das Neuron gebunden und an der Spitze ist der Neurit an der Perle befestigt. Während der Dehnung haben die Komponenten des neuen Neuriten die Freiheit, sich in der effizientesten Weise zu bewegen, um die Zugkräfte aufzunehmen. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll beschreibt, wie diese Experimente reproduziert werden können, ohne Neuritenbruch oder Degeneration zu verursachen, basierend auf früheren Studien über die Bildung von synaptischen Kontakten 8 und auf den Widerstand von Axonen auf Druck 16 , wie man Mikro- und Nanotools verwendetDie Neuriten mit der entsprechenden Kraft kontinuierlich abziehen. Die hier beschriebenen Neuritenverlängerungsraten (1,2 mm / h) sind 30-60 mal schneller als die In-vivo- Raten der am schnellsten wachsenden Axone aus dem peripheren Nervensystem (0,02 bis 0,04 mm / h) 28 . Im Vergleich zum gleichen neuronalen Typ in vitro sind die hier beschriebenen axonalen Ausdehnungsraten 7,5 mal schneller als die von anderen Autoren beschriebenen Wachstumsraten in einem früheren Entwicklungsstadium (0,1 mm / h) 4 . Es wurde festgestellt, dass verschiedene Arten von Neuronen Axone mit unterschiedlichen intrinsischen Raten erweitern, die um mehrere Falten 29 variieren. Darüber hinaus verlieren Zentralachsen des Nervensystems in der Regel die hohe Rate des axonalen Wachstums nach der Zielinnervation in vivo 29 und 3 d der Kultur in vitro 6 . Daher sollte die aktuelle axonale Erweiterungstechnik mit verschiedenen neuronalen Typen getestet werden, um das zu verstehenE Grenzen der Neuritenverlängerung

Pipettenmikromanipulation und mikrofluidische Vorrichtungen sind Techniken, die gezeigt werden, um neue funktionelle Neuriten zu schaffen und um neuronale Netzwerke kontrollierbar zu positionieren oder zu regenerieren. Diese Plattform eignet sich ideal für systematische, standardisierte Messungen. Es führt die Reproduzierbarkeit und In-vivo -Kontrolle in Experimente in komplexen Netzwerken von Neuronen ein. Die erreichten Verlängerungsraten sind schneller als 20 μm / min über Millimeter-Skalen und funktionale Verbindungen hergestellt. Diese Ergebnisse zeigen unerwartet, dass die intrinsische Kapazität von Axonen für die Dehnung, einschließlich der ihrer zytoskeletalen Komponenten, viel schneller ist als bisher angenommen 10 , 11 , 12 . Dieser vorgeschlagene mechanische Ansatz umgibt langsame chemische Strategien und stellt somit einen Paradigmenwechsel für therapeutische Entwicklungen dar, um die neuronale Konnektivität nach Verletzung wiederherzustellenUnd für die Mikro-Neuroengineering von künstlichen neuronalen Netzwerken für ihre kontrollierte Studie in vitro . Diese Ergebnisse haben auch einen großen Einfluss auf die regenerative Medizin und neurotechnische Ansätze mit direkter Implikation für Therapien, die darauf abzielen, neuronale Kreisläufe nach Trauma oder bei neurodegenerativen Erkrankungen wieder anzuschließen. Diese Plattform öffnet die Tür, um Daten über die Neuronenkommunikation, die Signalmodulation sowie das Wachstum und die Regeneration zu erhalten. Es ist eine neue Möglichkeit, das ZNS mechanisch zu regenerieren und ähnliche Techniken können die Wiederherstellung der Funktion nach Verletzung ermöglichen. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um systematisch konstruierte neuronale Netzwerke als neuartige Bioassay-Plattformen für die Wirkstoffforschung und Zielvalidierung zu schaffen. Es ist ein Vorläufer der direkten Verdrahtung von robusten Gehirn-Maschine-Schnittstellen.

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Disclosures

Der Autor Margaret H Magdesian ist der CEO von Ananda Devices, der Instrumente produziert, die in diesem Artikel verwendet werden.

Acknowledgments

Wir danken Yoichi Miyahara für viele hilfreiche Diskussionen und Einsichten. MA und PG bestätigen die Finanzierung von NSERC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Co-culture devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
Neuro devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round Warner Instruments 64-0705
35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated MatTex Incorporation P35G-0-20-C
35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile Corning Inc 430165
95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene Fisherbrand FB0875714G
50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps VWR 89039-656
15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile Falcon 352097
Neurobasal Medium Life Technologies 21103-049 Extracellular solution
B-27 Supplement (50X), serum free B-27 Supplement (50X), serum free 17504044 Extracellular solution
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine Thermo Fisher Scientific  11995-065 Extracellular solution
200 μ L Pipettors VWR 89079-458
2 - 20 μL Pipettors Aerosol Resistant Tips 2149P
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] BD Falcon 357524
Glucose Gibco 15023-021 Extracellular solution
HEPES Sigma 7365-45-9 Extracellular solution/Beads
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 Extracellular solution
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7 Extracellular solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Extracellular solution
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3 Extracellular solution
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm World Precision Instruments 500233
Dissection tools Braun, Aesculap
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P6407
Micro particles based on polystyrene, 10 μm Sigma-Aldrich 72986
Borosilicate tubes King Precision Glass, Inc. 14696-2
Horizontal Pipette Puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Micromanipulators, PCS-5000 Series SD Instruments MC7600R
1 mL Syringe BD Luer-Lok 309628
Inverted Microscope Olympus  IX71
Objective Olympus UIS2, LUCPLFLN 40X
CCD Camera Photometrics Cascade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15 Medium Life Technologies 11415-064 Rat Dissection
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red Life Technologies 25300054 Rat Dissection
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] Life Technologies 11995-065 Rat Dissection
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] Life Technologies 14170-112 Rat Dissection

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References

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