एक फ्लोरोसेंट आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच संकेतक के साथ Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia में Intracellular पीएच के ऑप्टिकल ठहराव

Biology

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Summary

सेलुलर आयन परिवहन अक्सर निगरानी intracellular पीएच (पीएचमैं)द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच-संकेतक (GEpHIs) बरकरार कोशिकाओं में intracellular पीएच के ऑप्टिकल ठहराव प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल के माध्यम से intracellular पीएच के ठहराव सेलुलर पूर्व vivo live-इमेजिंग Drosophila के Malpighian नलिकाओं के melanogaster, एक छद्म pHerry आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच-संकेतक के माध्यम से विवरण ।

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Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

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Abstract

उपकला आयन परिवहन प्रणालीगत आयन homeostasis के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आवश्यक सेलुलर विद्युत ढाल के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है । Intracellular पीएच (phi) कई आयन ट्रांसपोर्टरों से प्रभावित है और इस प्रकार पीएच निगरानीमैं ट्रांसपोर्टर गतिविधि का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । आधुनिक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच संकेतक (GEpHIs) एक सेलुलर और सेलुलर पैमाने पर बरकरार कोशिकाओं मेंमैं पीएच के ऑप्टिकल ठहराव प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन वास्तविक समय ठहराव सेलुलर पीएचमैं विनियमन के Malpighian नलिकाओं (MTs) में Drosophila melanogaster के माध्यम से पूर्व vivo live-इमेजिंग के माध्यम से pHerry, एक छद्म ratiometric GEpHI के साथ एक पीकश्मीर cytosol में पीएच परिवर्तन ट्रैक करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल । निकाले गए वयस्क मक्खी MTs आकृति से बना रहे हैं और एकल सेल परत epithelia के कार्यात्मक अलग वर्गों, और उपकला परिवहन की जांच के लिए एक सुलभ और आनुवंशिक रूप से तंत्रीय मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं. GEpHIs पारंपरिक पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक और आयन-चुनिंदा इलेक्ट्रोड पर कई लाभ प्रदान करते हैं । GEpHIs विशिष्ट कोशिका आबादी लेबल कर सकते है प्रदान की उपयुक्त प्रमोटर तत्वों उपलब्ध हैं । इस लेबलिंग पूर्व vivoमें विशेष रूप से उपयोगी है, vivo में, और सीटू की तैयारी में है, जो स्वाभाविक रूप से विषम हैं. GEpHIs भी दोहराया डाई उपचार या ऊतक externalization के लिए आवश्यकता के बिना समय के साथ बरकरार ऊतकों मेंमैं पीएच के ठहराव अनुमति देते हैं । वर्तमान GEpHIs की प्राथमिक खामी ऊतक नुकसान के जवाब में cytosolic समावेशन में कुल करने की प्रवृत्ति है और अधिक से अधिक अभिव्यक्ति का निर्माण । इन कमियों, उनके समाधान, और GEpHIs के निहित लाभ basolateral प्रोटॉन (एच+) के आकलन के माध्यम से इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन कर रहे है कार्यात्मक विशिष्ट प्रिंसिपल और निकाले फ्लाई MTs की stellate कोशिकाओं में परिवहन । तकनीक और वर्णित विश्लेषण हड्डीवाला और invertebrate की तैयारी की एक विस्तृत विविधता के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैं, और परख के परिष्कार विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से आयन प्रवाह के जटिल निर्धारण के लिए प्रयोगशालाओं शिक्षण से बढ़ाया जा सकता है ।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य ठहराव का वर्णन करने के लिए है intracellular पीएच (phi) का उपयोग कर एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच-संकेतक (GEpHI) और प्रदर्शन कैसे इस विधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है basolateral H+ परिवहन में एक मॉडल कीट (डी । melanogaster) गुर्दे की संरचना, Malpighian tubule (मीट्रिक टन) । टन फल मक्खी के निकालनेवाला अंगों के रूप में सेवा और कार्यात्मक स्तनधारी nephron में कई प्रमुख संमान के समान है1। MTs छाती और मक्खी के पेट में नलिकाओं के 2 जोड़े (पूर्वकाल और पीछे) के रूप में व्यवस्थित कर रहे हैं । प्रत्येक मीट्रिक टन के एकल-कोशिका उपकला ट्यूब विशिष्ट शिखर (चमकदार) और basolateral (hemocoel) के साथ ही intercalated stellate कोशिकाओं के साथ चयापचयी सक्रिय प्रिंसिपल कोशिकाओं से बना है. पूर्वकाल MTs 3 आकृति से बना रहे हैं, कार्यात्मक, और विकास के विशिष्ट क्षेत्रों, विशेष रूप से प्रारंभिक फैली खंड, संक्रमणकालीन खंड, और स्रावी मुख्य खंड है, जो यूरेटर2करने के लिए मिलती है । सेलुलर पैमाने पर ट्रांस-लुमेन में उपकला आयन परिवहन एक शिखर प्लाज्मा झिल्ली वी-ATPase3 और एक क्षार धातु/एच+ एक्सचेंजर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक basolateral ना+-K+-ATPase4से पूरा हो गया है, आवक-दिष्टकारी K+ channels5, na+चालित सीएल/HCO3 एक्सचेंजर (NDAE1)6, और ना+-k+-2Cl cotransporter (NKCC; Ncc69)7, जबकि stellate कोशिकाओं की मध्यस्थता सीएल- और जल परिवहन8,9. इस जटिल लेकिन सुलभ शारीरिक प्रणाली अंतर्जात आयन परिवहन तंत्र की जांच के लिए उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है जब Drosophilaके विविध आनुवंशिक और व्यवहार toolsets के साथ संयुक्त ।

इस प्रोटोकॉल के लिए तर्क को सेल से व्यवहार और अंय मॉडल प्रणालियों के लिए उपकरणों के निर्यात के एकीकरण के लिए क्षमता के साथ उपकला आयन परिवहन का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से निंदनीय प्रणाली का वर्णन था । pHerry की अभिव्यक्ति10, एक GEpHI ग्रीन पीएच के एक संलयन से व्युत्पंन-संवेदनशील सुपर-क्रांतिवृत्त pHluorin11,12 (SEpH) और लाल पीएच असंवेदनशील mCherry13, में MTs परमिट ठहराव के एच+ परिवहन में उच्च K+/nigericin अंशांकन तकनीक के माध्यम से एकल मीट्रिक टन कोशिकाओं14. के रूप में कई आयन ट्रांसपोर्टरों कदम एच+ समकक्ष, intracellular पीएच के ठहरावमैं ट्रांसपोर्टरों की एक किस्म के माध्यम से आयन आंदोलन के एक कार्यात्मक प्रतिनिधित्व के रूप में कार्य करता है । Drosophila मीट्रिक टन मॉडल प्रणाली भी ऊतक विशिष्ट transgene15 और आरएनए हस्तक्षेप (RNAi)16 अभिव्यक्ति है, जो सेलुलर इमेजिंग और पूरे अंग परख के साथ संयुक्त किया जा सकता है में शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण प्रदान करता है17 , 18 , 19 tubule समारोह के अणुओं से व्यवहार करने के लिए ऊर्ध्वाधर एकीकरण के साथ एक मजबूत toolset बनाने के लिए । यह उपकला जीव विज्ञान के आकलन के लिए कई अन्य प्रोटोकॉल के विपरीत में खड़ा है, ऐतिहासिक रूप से इस तरह के माप जटिल और चुनौतीपूर्ण सूक्ष्म-विच्छेदन पर भरोसा किया है, परिष्कृत आयन-चुनिंदा इलेक्ट्रोड20,21, और महंगी पीएच संवेदनशील रंजक सीमित आवश्यकताओं और विषम ऊतकों में गरीब सेलुलर विशिष्टता के साथ22 रंग । GEpHIs बड़े पैमाने पर माप के लिए इस्तेमाल किया गया हैमैं सेल प्रकार23की एक किस्म में पीएच । जल्दी काम अंतर्निहित पीएच-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संवेदनशीलता (GFP) का दोहनमैं प्रसंस्कृत उपकला कोशिकाओं24 में पीएच पर नजर रखने के लिए, लेकिन पिछले दो दशकों GEpHIs में प्रयुक्त देखा है ंयूरॉंस25, glia26, कवक27 , और संयंत्र28कोशिकाओं । GAL4/यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली15 और Drosophila मीट्रिक टन के शारीरिक पहुंच के माध्यम से आनुवंशिक निर्माण के सेलुलर लक्ष्यीकरण के लिए क्षमता का संयोजन यह पीएचमैं की जांच के लिए एक आदर्श तैयारी कर विनियमन और उपकला आयन परिवहन.

पीएचमैं विनियमन दशकों के लिए अध्ययन किया गया है और जीवन के लिए महत्वपूर्ण है । मीट्रिक टन तैयारी एक मजबूत मॉडल के लिए पीएच के फिजियोलॉजी सिखानेमैं विनियमन प्रदान करता है, लेकिन यह भी पीएचमैं विनियमन पूर्व vivo और vivo मेंकी परिष्कृत जांच प्रदर्शन । इस प्रोटोकॉल का वर्णन ठहराव एच+ Drosophila मीट्रिक टन की उपकला कोशिकाओं के basolateral झिल्ली में आंदोलन एनएच4सीएल पल्स एसिड लोडिंग तकनीक21का उपयोग कर, लेकिन के रूप में पीएच संकेतक आनुवंशिक रूप से है इनकोडिंग, इन तरीकों और उनके सैद्धांतिक रूपरेखा किसी भी तैयारी transgenesis और जीने के लिए उत्तरदाई-इमेजिंग करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में सभी कदम मेयो क्लिनिक (रोचेस्टर, MN) पशु उपयोग दिशानिर्देश के साथ अनुपालन ।

1. पशुपालन उड़ना

  1. मक्खियों बढ़ाएं और निर्धारित मानक पशुपालन के अनुसार पार कर29
    नोट: GAL4/यूएएस प्रणाली द्वारा फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अभिव्यक्ति तापमान के लिए आनुपातिक है और इस प्रकार तापमान के पीछे अभिव्यक्ति स्तर को बदलने के लिए समायोजित किया जा सकता है । जबकि उच्च अभिव्यक्ति का स्तर अक्सर एक बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात इस हालत भी वृद्धि हुई cytosolic और organellar समुच्चय के साथ जुड़ा हुआ है जब लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए GFP का उपयोग करने के लिए सीसा (आरएफपी) फ्यूजन ऐसे pHerry के रूप में निर्माण10, 30,31. यदि एकत्रीकरण अपरिहार्य है, ठहराव प्रत्येक प्रयोग में बिंदु अंशांकन प्रदर्शन और डेटा को सामान्य करने के द्वारा अभी भी संभव है कि १.० के एक प्रतिदीप्ति अनुपात पीएचi ७.० से मेल खाती है (नीचे अंशांकन पर चरण ७.४ नोट देखें).
  2. सेट पार करता है homozygous capaR-GAL4३२ नर को homozygous यूएएस-pHerry10 कुंवारी महिलाओं और homozygous c724-GAL42 नर को homozygous यूएएस-pHerry कुंवारी महिलाओं को इमेजिंग की अनुमति के प्रमुख कोशिकाओं और मीट्रिक टन, क्रमशः के stellate कोशिकाओं में पीएचमैं । 6 यूएएस-pHerry महिलाओं को 3 GAL4 पुरुषों के साथ भोजन की ताजा शीशियों में रखें और 28 डिग्री सेल्सियस पर मेट को छोड़ दें ।
    नोट: लार्वा 4 डी के भीतर स्पष्ट किया जाना चाहिए और वयस्कों 10 दिन के आसपास eclose करने के लिए शुरू हो जाएगा ।
  3. eclosion पर मादा मक्खियों को इकट्ठा करने और 28 डिग्री सेल्सियस पर 10 डी के लिए उम्र के लिए अलग सेट ।
    ध्यान दें: प्रयोग के समय के लिए किसी भी प्रतिबंधात्मक व्यवहार परख के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है (जैसे Ramsay स्राव परख17,19) कि intracellular लाइव पीएच इमेजिंग करने के लिए संबंधित किया जाएगा के रूप में । पुरुष मक्खियों इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन महिलाओं से नलिकाओं अक्सर बड़ा और अधिक मजबूत कर रहे हैं ।

2. पाली-एल-Lysine स्लाइड की तैयारी ।

  1. मानक ७५ x 25 मिमी स्लाइड के शीर्ष के चारों ओर एक hydrophobic पीएपी कलम के साथ एक ४० x 20 मिमी सीमा ड्रा और आर टी पर 15 मिनट के लिए शुष्क करने के लिए अलग सेट । स्लाइड इमेजिंग प्रकाशिकी के साथ संगत नहीं हैं, तो बड़े coverslips का उपयोग करें ।
  2. प्रत्येक स्लाइड पर स्टॉक ०.०१% पाली-L-Lysine (पीएलएल) समाधान के 2 मिलीलीटर स्थानांतरण और आरटी पर 1 ज के लिए अलग सेट ।
  3. एक पिपेट के साथ अतिरिक्त पीएलएल निकालें । भविष्य में उपयोग के लिए ५० मिलीलीटर शंकु शीशी में समाधान सहेजें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. महाप्राण एक वैक्यूम लाइन के साथ किसी भी शेष समाधान । यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड्स पर कोई समाधान नहीं रहता है, संपूर्ण स्लाइड सरफ़ेस पर वैक्यूम लाइन चलाएं ।
  5. उपयोग करने से पहले RT पर 1 अतिरिक्त एच के लिए स्लाइड अलग सेट करें. स्लाइड को किसी मानक स्लाइड पुस्तिका में 1 माह तक के लिए प्रारंभ पर संग्रहीत करें ।

3. विच्छेदन पकवान और कांच की छड़ की तैयारी

  1. 5 मिमी की एक गहराई का उत्पादन करने के लिए RT पर एक ३५ x 10 मिमी polystyrene पेट्री डिश में elastomer बेस के ४.५ मिलीलीटर के लिए elastomer इलाज एजेंट के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें एक डिस्पोजेबल पिपेट टिप के साथ मिश्रण । elastomer को O/N पर इलाज करने की अनुमति दें ।
    नोट: Elastomer स्पष्ट और बुलबुले से मुक्त होना चाहिए । बुलबुले के समाशोधन डालने के बाद 10-15 मिनट के लिए एक वैक्यूम जार में elastomer प्लेट रखने से सुविधा हो सकती है ।
  2. हाथों के बीच एक 5 मिमी व्यास ग्लास रॉड पकड़ो और एक जलाई Bunsen बर्नर पर रॉड के केंद्र पिघलते हुए सिरों के अलावा खींच । के रूप में कांच पिघला देता है और अधिक जल्दी से एक पतली (०.१ mm) और पतला शाफ्ट (चित्रा 1) का उत्पादन ।
    नोट: पिंडली पर एक ४५ ° कोण अक्सर नलिकाओं से निपटने में सहायक है । यह एक हाथ कम से प्राप्त किया जा सकता है के रूप में टांग खींच लिया है ( चित्रा 1देखें) ।
  3. एक एकल धार कार्बन इस्पात उस्तरा ब्लेड के कुंद पक्ष के साथ बीच में पतली शाफ्ट तोड़ो । एक विदारक गुंजाइश के तहत रॉड के पतले अंत का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि तोड़ साफ है ।

Figure 1
चित्रा 1: Malpighian नलिकाओं से निपटने के लिए कांच की छड़ बनाना ।
-ई. हीटिंग की प्रक्रिया और एक गिलास रॉड खींच एक शंकु और कोण से निपटने के लिए उपयुक्त उत्पादन के लिए MTs. तीर दिशा और बल का परिमाण निरूपित करने के लिए लागू किया जाएगा । एक उचित गढ़े कांच उपकरण के एफफोटोग्राफ । स्केल बार = 10 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

4. समाधान और छिड़काव प्रणाली तैयार करना

नोट: छिड़काव सिस्टम निर्माता द्वारा अलग है । इस प्रोटोकॉल एक गुरुत्वाकर्षण के आसपास आधारित है 8 चैनल खुले एक इनपुट प्रवाह दर नियामक और एक वैक्यूम चालित बहिर्वाह के साथ जलाशय, लेकिन बढ़ते टन की विधि के रूप में यहां वर्णित के लिए किसी भी छिड़काव प्रणाली के साथ काम अनुकूलित किया जा सकता है ।

  1. निंन समाधान तैयार करें:
    1. Aliquot Schneider के मध्यम (४० मिलीलीटर में ५० मिलीलीटर शंकु शीशियों) और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. तालिका 1के अनुसार RT पर समाधान (अर्थात कीट फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (iPBS) और iPBS के साथ एनएच4सीएल) तैयार करें । प्रयोग के दिन से पहले आरटी के लिए गर्म समाधान ।
      नोट: ४० mM NH4सीएल के साथ iPBS और iPBS बड़ी मात्रा (1 L या अधिक) में तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित है ।
    3. तालिका 1 में दर्शाई गई और 4 ° c पर संग्रहीत करें के रूप में 8 अंशांकन समाधानों को ५०० मिलीलीटर वॉल्यूम में pH = ५.०, ६.०, ६.५, ७.०, ७.३, ७.६, ८.०, और ९.० पर तैयार करना । N-मिथाइल-D-glucamine (NMDG) और HCl के साथ अनुमापन द्वारा प्रत्येक समाधान का पीएच समायोजित करें ।
    4. प्रयोगों के दिन, गर्म अंशांकन समाधान के 5 मिलीलीटर aliquots आरटी और जोड़ने के लिए स्टॉक nigericin समाधान (dimethyl sulfoxide (DMSO) में 20 मिमी) 10 µ एम के एक अंतिम एकाग्रता का उत्पादन करने के लिए
      चेतावनी: दस्ताने के साथ nigericin संभाल । सभी उपकरणों है कि प्रयोज्य के रूप में nigericin के साथ संपर्क में आता है समझो । Nigericin कांच और प्लास्टिक पर रहता है और जैविक तैयारी समझौता अगर उपकरण reused है ।
  2. छिड़काव प्रणाली:
    1. प्रधानमन्त्री ने सभी जलाशयों को ddH2O (figure 2) के साथ भरकर छिड़काव प्रणाली अपनाई । सभी लाइनों को प्रवाह दर नियामक को भरने के लिए समीपस्थ की अनुमति देने के लिए एक समय में एक चैनल खोलें ।
      नोट: यह बंद चैनल खोलने और जलाशय से प्रवाह ड्राइव करने के लिए एक सवार का उपयोग करके लाइनों में हवा स्पष्ट करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    2. 2 चैनलों को खोलें और ddH2O को छानकर अनुमति दें । एक बार जलाशयों के लगभग खाली हो जाने पर iPBS के साथ पहला जलाशय भरेगा और दूसरा जलाशय एनएच4सीएल-स्पंदित iPBS के साथ । प्रवाह दर नियामक के साथ अधिकतम करने के लिए प्रवाह दर सेट करें और प्रत्येक समाधान को बाहर की रेखाओं को भरने के लिए 1 मिनट के लिए प्रवाहित करने दें, फिर प्रवाह रोकें (चित्र 2) ।
    3. इमेजिंग माइक्रोस्कोप स्टेज पर सोल्डर "मदद हाथ" clamps के 2 सेट की स्थिति । इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म के प्रत्येक पक्ष पर एक क्लैंप लगाएं ।
    4. ध्यान से केशिका ग्लास (भीतरी व्यास १.५ मिमी, बाहरी व्यास ०.८६ मिमी, लंबाई १०० मिमी) के एक टुकड़े के बाहर ०.५ इंच एक Bunsen बर्नर पर गर्मी । एक ४५ ° मोड़ बनाने के लिए गुरुत्वाकर्षण से मोड़ और लौ से कांच हटाने एक बार वांछित कोण हासिल की है की अनुमति देकर । केशिका कांच के एक दूसरे टुकड़े के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    5. में प्रवाह लाइन और वैक्यूम जुड़े बहिर्वाह लाइन में तुला ग्लास केशिकाओं डालें, क्रमशः और उंहें "मदद हाथ" माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के इमेजिंग चरण के साथ संरेखित करने के लिए उन्हें माउंट.

Figure 2
चित्र 2: छिड़काव सिस्टम और इमेजिंग कॉंफ़िगरेशन ।
एक साथ लाइव प्रतिदीप्ति इमेजिंग और तेजी से समाधान विनिमय के माध्यम से मीट्रिक टन basolateral परिवहन समारोह के शारीरिक आकलन के लिए आवश्यक घटक । दिखाया गैस लाइनों वैकल्पिक और HCO3परिवहन के आकलन के लिए प्रयोगों के विस्तार की अनुमति है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एनएच4सीएल पल्स प्रयोगों के लिए छिड़काव तंत्र के प्रवाह की योजनाबद्ध ।
तीर प्रवाह पथ और वाल्व स्विचन अंक चित्रित । समाधान जलाशय से गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा नमूना के लिए ले जाता है और वैक्यूम चूषण द्वारा अपशिष्ट कुप्पी के लिए नमूना चैंबर से तैयार की जाती है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

५. प्रौढ़ Drosophila पूर्वकालिक Malpighian नलिकाओं का विच्छेदन.

  1. विच्छेदन पकवान इकट्ठा और 3 धारा से ग्लास रॉड खींच लिया, धारा 2 से एक पीएलएल-लेपित स्लाइड, एक चिपकने वाला छिड़काव-well विभाजक, वैक्यूम तेल, एक 4 एक्स 2 "सील फिल्म की पट्टी, #5 ठीक संदंश के 2 जोड़े, और बर्फ के ४० मिलीलीटर aliquots-शीत Schneider के मध्यम और आरटी iPBS ।
  2. सील टेप पर वैक्यूम तेल फैलाओ और टेप पर चिपकने वाला छिड़काव-अच्छी तरह से डिवाइडर को तेल के साथ नीचे कोट करने के लिए दबाएं । चिपकने वाला छिड़काव-अच्छी तरह से विभक्त छील और यह जगह एक पीएलएल लेपित स्लाइड के शीर्ष पर तेल-पक्ष नीचे । व्यक्तिगत नमूना कुओं hydrophobic चर्बी में पता लगाया छोड़ने के लिए छिड़काव-well विभाजक निकालें ।
  3. प्लेस २०० µ एल आर टी iPBS के तेल में-अच्छी तरह से पीएलएल लेपित स्लाइड पर घेर और stereoscope के तहत स्लाइड कदम ।
  4. एक खाली मक्खी की शीशी में यूएएस-pHerry/capaR-GAL4 मक्खियों प्लेस और 10 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें anesthetize ।
    नोट: संज्ञाहरण के इस विधि2के विपरीत, यह सुनिश्चित करता है कि मक्खियों निर्जलित नहीं है ।
  5. कीट पकवान में बर्फ ठंडा Schneider के माध्यम डालो और एक विदारक stereoscope के तहत पकवान में एक एकल anesthetized मादा मक्खी हस्तांतरण करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें ।
  6. संदंश का एक सेट के साथ छाती द्वारा मक्खी पकड़ो और दूसरे का उपयोग करने के लिए धीरे पेट के पीछे पकड़ । खींचो छोटे, जानबूझकर गति में संदंश का उपयोग कर मक्खी के पीछे खोलो । एक बार hindgut दिखाई दे रहा है, पकड़ बाहर का अंत और आंत और MTs अंतर्निहित tracheoles से hindgut दोहराए, संक्षिप्त टग के माध्यम से शरीर से दूर खींच द्वारा मुक्त ।
    नोट: पूर्वकाल और पीछे MTs जहां वे यूरेटर के माध्यम से midgut और hindgut के जंक्शन से मिलने दिखाई जाएगी । MTs की पहली जोड़ी के लिए स्वतंत्र होने की संभावना पीछे नलिकाओं के रूप में वे hindgut घेरना होगा । इन (चित्र 4a) की अनदेखी की जा सकती है ।
  7. ठीक संदंश के साथ यूरेटर में पूर्वकाल mts बंद चुटकी एक बार MTs का दूसरा सेट पेट से मुक्त है । यह पेट से पूर्वकाल MTs अलग और यूरेटर बंद हो जाएगा ।
  8. इस तरह के यूरेटर के तहत रॉड फिसलने से खींच लिया ग्लास रॉड के साथ मुक्त पूर्वकाल MTs उठाओ कि नलिकाओं दोनों तरफ गिर जाते हैं । सीधे समाधान से बाहर टन उठा ।
  9. इस तरह कि टन और यूरेटर रॉड के नीचे करने के लिए पालन कर रहे है और सीधे स्लाइड पर नीचे यूरेटर कम कांच की छड़ मुड़ें । यूरेटर प्रत्यय और ग्लास स्लाइड (चित्रा 4B) पर नीचे यूरेटर दबाकर MTs के बाहर के सिरों को सील. कोई आवश्यक से अधिक MTs हेरफेर मत करो । MTs स्लाइड करने के लिए एंकर्ड यूरेटर के साथ समाधान में फ़्लोट करना चाहिए ।
  10. धीरे स्लाइड सतह भर में प्रत्येक tubule स्वीप करने के लिए ग्लास रॉड के ठीक अंत का उपयोग करें । स्लाइड के खिलाफ रॉड संभालो tubule कुचल से बचने के लिए और tubule के शीर्ष पर रॉड स्लाइड, समीपस्थ के लिए बाहर ले जाने, पीएलएल लेपित स्लाइड की सतह के लिए प्रत्येक tubule की पूरी लंबाई संलग्न करने के लिए (चित्र 4c) ।
  11. स्लाइड पर चिपकने वाला छिड़काव-well विभक्त करने के लिए एक छोटा सा द्रव-tubule घुड़सवार पर अच्छी तरह से भरा फार्म प्लेस ।
  12. नमूना माइक्रोस्कोप मंच पर रखें । छिड़काव के प्रवेश और आउटलेट खोलने पर बहिर्वाह और बहिर्वाह केशिकाओं की स्थिति अच्छी तरह से, क्रमशः ।
    नोट: अगर एक खुला छिड़काव चैंबर वांछित है अच्छी तरह से विभक्त छोड़ दिया जा सकता है । इस मामले में बहिर्वाह और बहिर्वाह केशिकाओं एक इमेजिंग अच्छी तरह से विपरीत पक्षों के लिए गठबंधन किया जा सकता है ।

6. इमेजिंग प्रोटोकॉल और Tubule स्वास्थ्य की मांयता

नोट: इस प्रोटोकॉल GFP (SEpH) और आरएफपी (mCherry) फिल्टर सेट (470/40 एनएम उत्तेजना (पूर्व) के साथ एक औंधा व्यापक क्षेत्र epifluorescent माइक्रोस्कोप पर किया जाता है, ५१५ एनएम longpass उत्सर्जन (em), ५०० एनएम dichroic और 546/10 एनएम ex, ५९० एनएम longpass em, ५६५ एनएम dichroic), ए 10x/ ०.४५ वायु उद्देश्य, लाइव छवि पर कब्जा करने के लिए एक रंग कैमरा, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर । प्रोटोकॉल GFP और आरएफपी प्रकाशिकी और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के बीच स्वचालित फिल्टर स्विचन के साथ किसी भी ईमानदार या उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि इष्टतम जोखिम बार, प्रकाश की तीव्रता, और बिन्नी मापदंडों भिन्न होगा. सभी विश्लेषण में, प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में ब्याज के क्षेत्र (रॉय) में मतलब पिक्सेल तीव्रता का विश्लेषण किया जाना चाहिए, प्रत्येक चैनल में पृष्ठभूमि घटाव के साथ एक रॉय का उपयोग कर के साथ कोई संकेत रॉय के निकट प्रतिदीप्ति शामिल हैं ।

  1. माइक्रोस्कोप, प्रकाश स्रोत, और इमेजिंग प्रणाली को चालू करें ।
  2. ओपन एसोसिएटेड इमेजिंग सॉफ्टवेयर ।
  3. ऐपिस के माध्यम से देखो और मैंयुअल रूप से मीट्रिक टन के लुमेन स्पष्ट रूप से प्रसारित प्रकाश के तहत दिखाई है जब तक ध्यान समायोजित करें ।
  4. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में "अधिग्रहण" टैब पर क्लिक करें और "अर्जन मोड" अनुभाग में "बिन्नी" पुल-डाउन मेनू में "2x2" चुनें.
  5. प्रकाश की रोशनी को कम करने और photobleaching ंयूनतम करने के लिए हल्के रास्ते में एक 5% तटस्थ घनत्व फिल्टर डालें ।
  6. "चैनल" मेनू में GFP (SEpH) चैनल पर क्लिक करें, तो कैमरे के माध्यम से फ्लोरोसेंट संकेत का पालन करने के लिए "लाइव" क्लिक करें ।
  7. "समय" स्लाइडर को समायोजित करने के लिए जोखिम समय ऐसी है कि तीव्रता में सबसे प्रतिभाशाली पिक्सेल मूल्यों हिस्टोग्राम अधिकतम मूल्य के लगभग ४०% कर रहे हैं, तो क्लिक करें "बंद करो" रोशनी को रोकने के लिए ।
  8. दोहराएँ चरण ६.६-६.७ आरएफपी (mCherry) चैनल में और पूर्वकाल मीट्रिक टन की फैली हुई प्रारंभिक खंड की उपस्थिति की पुष्टि और cytosolic mCherry समुच्चय के अभाव (ऊतक क्षति या एक्सप्रेस के संकेत) (चित्रा 4d).
    नोट: यह tubule के सबसे समीपस्थ खंड और इस खंड के भीतरी लुमेन के व्यास है के रूप में फैली हुई खंड स्पष्ट रूप से स्पष्ट होना चाहिए ~ 20 µm आसन्न संक्रमणकालीन खंड की तुलना में अधिक है । 2 x 2 पिक्सेल बिन्नी अक्सर पर्याप्त है, लेकिन आगे आवश्यक रोशनी तीव्रता को कम करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । विशिष्ट एक्सपोज़र बार १५० और ८०० ms/ photobleaching को कम करने के लिए यथासंभव कम रोशनी का प्रयोग करें । photobleaching ंयूनतम दोहरे fluorophore संकेतक के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है जैसे कि pHerry के रूप में दो fluorophores ब्लीच स्वतंत्र रूप से कर सकते हैं, इस प्रकार किसी भी अनुपात अंशांकन आक ।
  9. "समय श्रृंखला" चेक बॉक्स पर क्लिक करके एक टाइम-चूक इमेजिंग प्रोटोकॉल सक्षम करें ।
  10. 10 मिनट के लिए "समय श्रृंखला" खंड में पुल-डाउन मेनू में "अवधि" समायोजित करें और अधिकतम छवि प्राप्ति दर के साथ कुल कैप्चर समय सेट करने के लिए 0 के लिए "अंतराल" स्लाइडर । ०.२ हर्ट्ज की कुल अधिग्रहण दर अक्सर पर्याप्त है ।
  11. GFP (SEpH) और आरएफपी (mCherry) बॉक्स में "चैनल" खंड की जाँच करें ।
  12. उपयुक्त वॉल्व कंट्रोलर को सक्रिय करके छिड़काव सिस्टम की iPBS लाइन खोलें और "प्रयोग शुरू करें" पर क्लिक करके इमेजिंग प्रोटोकॉल को शुरू करें । 1 मिनट के बाद, उपयुक्त वाल्व खोलने और iPBS लाइन को बंद करने के द्वारा 20 एस के लिए nh4सीएल पल्स समाधान के लिए स्विच, तो एनएच4सीएल लाइन बंद करने और iPBS वाल्व को खोलने के द्वारा iPBS के लिए वापस । पूर्ण इमेजिंग प्रोटोकॉल छिड़काव सिस्टम को रोकने से पहले पूरा करने के लिए अनुमति दें ।
    नोट: समय चूक विश्लेषण एक स्थिर mCherry संकेत प्रकट करना चाहिए और एक SEpH संकेत है जो एनएच4सीएल की उपस्थिति में बढ़ जाती है, वॉशआउट पर बुझती है, और धीरे से ठीक हो जाती है ।
  13. 2-बिंदु अंशांकन निष्पादित करें ।
    1. यह दूर अंतर्निहित स्लाइड से छील द्वारा अच्छी तरह से विभाजक निकालें और छिड़काव केशिकाओं और इमेजिंग अच्छी तरह से clamps निकालें ।
    2. २०० µ l अंशांकन iPBS (pH ७.४, 10 µ m nigericin) को इमेजिंग अच्छी तरह से एक २०० µ l पिपेट के साथ लागू करें । पिपेट के साथ अच्छी तरह से इमेजिंग से समाधान निकालें, फिर अंशांकन समाधान के एक और २०० µ l के साथ प्रतिस्थापित करें । पूर्ण समाधान विनिमय सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया को 4 बार दोहराएं ।
    3. इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए अंशांकन समाधान में तैयारी की मशीन । छवि कैप्चर के केवल 1 मिनट के संशोधन के साथ चरण ६.६-६.११ में निर्धारित पैरामीटर्स का उपयोग करते हुए इमेजिंग प्रोटोकॉल दोहराएं ।
      नोट: छिड़काव प्रणाली और केशिकाओं इस कदम में जरूरत नहीं है और इमेजिंग करने के लिए अच्छी तरह से संलग्न नहीं किया जाना चाहिए nigericin करने के लिए केशिकाओं को उजागर करने से बचें ।
    4. जोड़ें २०० µ l अंशांकन iPBS (pH ९.०, 10 µ m nigericin) इमेजिंग करने के लिए अच्छी तरह से एक २०० µ l पिपेट के साथ. पिपेट के साथ अच्छी तरह से इमेजिंग से समाधान निकालें, फिर अंशांकन समाधान के एक और २०० µ l के साथ प्रतिस्थापित करें । पूर्ण समाधान विनिमय सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया को 4 बार दोहराएं ।
    5. इमेजिंग से पहले 10 मिनट के लिए दूसरा अंशांकन समाधान में तैयारी की मशीन । इमेजिंग प्रोटोकॉल चरण 6.13.3 के रूप में दोहराएँ ।
    6. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कब्जा कर लिया छवि ढेर की समीक्षा करें कि या तो चैनल में कोई पिक्सल पर क्लिक करके संतृप्त है पुष्टि करने के लिए "रॉय मतलब" और स्क्रॉल हालांकि छवि "फ्रेम" स्लाइडर के साथ ढेर जबकि देख रहा है कि कोई मूल्यों की तीव्रता में रिपोर्ट हिस्टोग्राम अधिकतम पता लगाने योग्य मान तक पहुंचें । यदि किसी भी फ्रेम पिक्सल है कि अधिकतम पता लगाने की तीव्रता तक पहुंचने, जोखिम समय या रोशनी की तीव्रता को कम करने और 6 अनुभाग दोहराने होते हैं ।
      नोट: एक बार स्थापित प्रयोग या अंशांकन के बीच इमेजिंग मापदंडों नहीं बदल जब तक बिंदु अंशांकन प्रत्येक तैयारी में इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं (चरण ८.३ देखें).
  14. समय के एक समारोह के रूप में फ्लोरोसेंट तीव्रता और प्रतिदीप्ति अनुपात (SEpH/mCherry) प्लॉट करने के लिए छवि स्टैक का विश्लेषण करें ।
    1. "ROI का मतलब" पर क्लिक करें और मुक्ताकार टूल का चयन करे. एक ~ ५० µm की लंबाई मीट्रिक टन का पता लगाने के लिए बाएं क्लिक करें पकड़ो । रॉय को आरेखित करना समाप्त करने के लिए दायां क्लिक करें, फिर मीट्रिक टन के निकटवर्ती क्षेत्र में दोहराएं कि वह पृष्ठभूमि ROI (चित्र 5/) को परिभाषित करे ।
    2. "माप" के अंतर्गत "माध्य तीव्रता" पर क्लिक करें. "निर्यात करें > डेटा तालिका > बनाएं" क्लिक करके तीव्रता मानों की तालिका बनाएं ।
    3. विन्यास दांतेदार आइकन पर क्लिक करें और "समय" और "मतलब तीव्रता" के अलावा सभी मापदंडों de-चुनें । नई बनाई गई डेटा तालिका के लिए टैब पर राइट-क्लिक करें, "इस रूप में सहेजें" का चयन करें और डेटा को. csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करे.
      नोट: इसी तरह के माप भी ImageJ जैसे मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है ।
    4. स्प्रेडशीट तालिका खोलें और "पाठ से" के बाद "डेटा" टैब का चयन करके डेटा तालिका आयात करें.
    5. प्रत्येक समय बिंदु पर SEpH संकेत तीव्रता से SEpH पृष्ठभूमि तीव्रता घटाना करने के लिए स्प्रेडशीट में कार्यों का उपयोग करें । mCherry संकेत के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    6. समय और पृष्ठभूमि-सही तीव्रता डेटा वाले स्तंभों का चयन करके और फिर "सम्मिलित करें > स्कैटर (चार्ट्स) > सीधी रेखाओं के साथ स्कैटर" (आरेख 5B) पर क्लिक करके प्रत्येक चैनल तीव्रता को समय के एक फ़ंक्शन के रूप में प्लॉट करे.
    7. प्रत्येक समय बिंदु पर SEpH/mCherry प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट फ़ंक्शंस का उपयोग करें ।
    8. समय और अनुपात डेटा वाले स्तंभों का चयन करके और फिर "सम्मिलित करें > स्कैटर (चार्ट्स) > सीधी रेखाओं के साथ स्कैटर" (आरेख 5C) पर क्लिक करके समय के एक फ़ंक्शन के रूप में प्लॉट प्रतिदीप्ति अनुपात.

7. Malpighian नलिकाओं में pHerry की पूर्ण अंशांकन पूर्व Vivo.

  1. टुकड़े और खंड 5 में वर्णित के रूप में पूर्वकाल MTs के एक नए सेट माउंट ।
  2. चरण 6.13.2 में बताए गए अनुसार अंशांकन iPBS (pH ७.४, 10 µ m nigericin) के लिए Exchange iPBS । 30 मिनट के लिए मशीन ।
  3. MTs की स्थिति जानें और ६.१-६.११ चरणों में वर्णित के रूप में SEpH/mCherry छवियों के जोड़े एकत्रित करें । चरण 6.13.4 में वर्णित के रूप में अंशांकन iPBS के अंय स्टॉक के साथ समाधान बदलें, 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और पुन: छवि । SEpH/mCherry अनुपात सभी समाधानों में imaged किया गया है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ । प्राप्त पीएच ९.० छवियां पिछले नमूना के रूप में शायद ही कभी उच्च पीएच से ठीक हो ।
  4. SEpH के भूखंड प्रतिदीप्ति अनुपात आठ नमूनों में अंशांकन से mCherry करने के लिए लगाया पीएचमैं के रूप में कदम 6.14.9 में वर्णित के एक समारोह के रूप में । समीकरण 1 (चित्र 5d) के अनुसार पूर्ण अंशांकन फ़ंक्शन प्राप्त करने के लिए अंशांकन डेटा को लैटिस वक्र के साथ फ़िट करें । यदि डेटा असंगत हैं, तो एक प्रतिदीप्ति अनुपात १.० केमैं ७.० और फिर से विश्लेषण (चित्रा 5E) के लिए मेल खाती है कि इस तरह सामान्यीकृत एक नमूना से प्लॉट अंशांकन सेट ।
    नोट: उत्तरार्द्ध प्रक्रिया आवश्यक है, तो व्यक्तिगत प्रयोगों अपने स्वयं के आंतरिक बिंदु अंशांकन की आवश्यकता होगी३३ (नीचे ठहराव प्रक्रिया (चरण ८.३) देखें) ।
  5. समीकरण 1
    Equation 1
    जहां R = SEpH/mCherry अनुपात और एक1,2, x, और dx , ंयूनतम प्रतिदीप्ति अनुपात, अधिकतम प्रतिदीप्ति अनुपात, pKA, और फ़ंक्शन की चौड़ाई का प्रतिनिधित्व करने वाली वक्र फिटिंग पैरामीटर्स हैं क्रमश. x = pHerry का स्पष्ट pKa, जो कक्ष प्रकार और सटीक अंशांकन शर्तों के आधार पर ७.१ और ७.४ के बीच भिंनहो सकता है ।

8. ठहराव ऑफ Basolateral एसिड बाहर निकालना से Ex Vivo Malpighian Tubule Epithelia.

  1. छवि pHerry-एक्सप्रेस stellate कोशिकाओं और pHerry-व्यक्त प्रिंसिपल कोशिकाओं को एक साथ ।
    1. खंड 5 में वर्णित के रूप में एक यूएएस-pHerry/capaR-GAL4 मक्खी से टुकड़े पूर्वकाल mts, लेकिन इमेजिंग अच्छी तरह से करने के लिए विदारक Schneider के माध्यम से MTs स्थानांतरण नहीं है ।
    2. धारा 5 में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए एक ही विदारक पकवान में एक यूएएस-pHerry/c724-GAL4 मक्खी से टुकड़े पूर्वकाल MTs.
    3. ५.८-५.११ चरणों में वर्णित के रूप में एक ही इमेजिंग में MTs के 2 सेट स्थानांतरण ।
      नोट: जब स्लाइड करने के लिए नीचे MTs की बाहों झाडू, टन की जगह यूएएस-pHerry/c724-GAL4 और यूएएस-pHerry/capaR-GAL4 नलिकाओं एक दूसरे के पास तो pHerry-व्यक्त प्रधानाचार्य और stellate कोशिकाओं को एक ही क्षेत्र में visualized किया जा सकता है ( चित्रा 6A).
  2. चरण ६.१२ में वर्णित के रूप में NH4सीएल पल्स लागू करें ।
    नोट: यदि संगत अंशांकन (आरेख 4B) प्राप्त नहीं किया जा सका, तो चिपकने के बाद एक अंशांकन iPBS (ph ७.०, 10 µ m nigericin, 30 मिनट की मशीन) के साथ प्रत्येक प्रयोग के अंत में phi को ७.० से सेट करके एक पॉइंट अंशांकन निष्पादित करें छिड़काव-वेल डिवाइडर और छिड़काव के उपकरण हटा दिए गए हैं ।
  3. stellate और अलग मीट्रिक टन क्षेत्रों के प्रमुख कोशिकाओं से निशान जांचना (उचित रूप में निरपेक्ष या सामान्यीकृत अनुपात का उपयोग कर) समीकरण 2 के साथ और उपयोग घातीय क्षय कार्यों को लागू करने से NH4सीएल वापसी के बाद वसूली चरण का विश्लेषण सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर और क्षय स्थिर (τ) (चित्रा घमण्ड) टिप्पण ।
    समीकरण 2
    Equation 2
    जहां R = SEpH/mCherry अनुपात और1, a2, x, और dx चरण ७.४ (समीकरण 1) में अंशांकन द्वारा निर्धारित वक्र फिटिंग पैरामीटर्स हैं ।
    1. की गणना एसिड बाहर निकालना दर (जेएच +, समीकरण 3देखें) पीएच के एक समारोह के रूप मेंमैं आराम करने के लिएमैं और तैयारियों के बीच३४एसिड लोडिंग में भिन्नता के लिए खाते में । प्रत्येक समय अंतराल में समय के संबंध मेंमैं पीएच के व्युत्पंन की गणना करने के लिए ८.३ कदम में व्युत्पंन घातीय कार्यों का प्रयोग करें ।
      समीकरण 3
      Equation 3
    2. आंतरिक बफ़रिंग क्षमता का परिकलन करें (βi; समीकरण 4) पीएच पर cytosol कीमैं कदम 8.3.1 में प्रत्येक अंतराल के शुरू से पिछले साहित्य के आधार पर ( समीकरण 4देखें) ।
      नोट: Drosophilaमें, β के सबसे गहन लक्षण वर्णनमैं लार्वा मोटर तंत्रिका टर्मिनलों३५ से आता है और इन आंकड़ों अन्य उपलब्ध डेटा के अभाव में मीट्रिक टन कोशिकाओं के लिए पकड़ करने के लिए ग्रहण किया जा सकता है.
      समीकरण 4
      Equation 4
    3. βT के उत्पाद की गणना (चरण 8.3.2 से)और dpHi/dt (चरण 8.3.1 से) का निर्धारण करने के लिए JH + (समीकरण 3) ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में नाममात्र बिकारबोनिट-मुक्त समाधान में, बिकारबोनिट-व्युत्पन्न बफ़रिंग क्षमता (βb) ~ 0 मिमी माना जाता है । कुल बफ़रिंग क्षमता (βt) βi औरβbका योग है, और इस प्रकार βi = βटी के अभाव में HCO3-/CO2३६.
    4. प्लॉट JH + के रूप में चरण 6.14.9 में उल्लिखित प्रत्येक समय अंतराल की शुरुआत मेंमैं पीएच के एक समारोह के रूप में ।
    5. सभी डेटासेट जो पीएचमैं सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर में ओवरलैप के भाग के लिए घातीय क्षय कार्य लागू होते हैं । परिणामी फ़ंक्शंस के परिवर्तन की दरों की तुलना कक्षों और मीट्रिक टन सेगमेंट (आरेख 6C) के बीच एसिड बाहर निकालना दरों की तुलना करने के लिए करें ।
      नोट: वक्र फिटिंग के लिए इस्तेमाल सबसे उपयुक्त समारोह हमेशा एक घातीय नहीं हो सकता है । अंय कार्यों अगर वे फिट की भलाई में सुधार प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
    6. गणना एसिड फ्लक्स (देखें समीकरण 5) के एक समारोह के रूप में पीएचमैं सेल आकार और आकार में बदलाव के लिए खाते में.
      समीकरण 5
      Equation 5
      नोट: सेल आयाम या तो सीधे छवियों में मापा जा सकता है या अनुमानित । मुख्य कोशिकाओं को निंनलिखित आयामों के साथ एक खोखले ट्यूब के आधा के रूप में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है: भीतरी व्यास 24 µm; बाहरी व्यास ४८ µm; ऊंचाई ५० µm. संक्रमणकालीन stellate कोशिकाओं चर रहे हैं, लेकिन मोटे तौर पर ५० µm और 10 µm के व्यास की ऊंचाइयों के साथ सिलेंडर के रूप में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है । नीचे प्रतिनिधि परिणामों के अंतिम पैरा देखें ।
    7. सभी डेटासेट कि पीएचमैं सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर में ओवरलैप के भाग के लिए घातीय क्षय कार्य लागू होते हैं । कोशिकाओं और मीट्रिक टन खंडों (चित्रा 6D) के बीच अम्ल प्रवाहों की तुलना करने के लिए परिणामी फ़ंक्शंस के परिवर्तन की तुलना करें.

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Representative Results

स्वस्थ ऊतकों और पूर्वकाल MTs की उचित पहचान इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । विच्छेदन के दौरान, देखभाल के लिए सीधे नहीं mts टच लिया जाना चाहिए और केवल उंहें यूरेटर द्वारा संभाल के रूप में टन मनोरंजक सीधे टूटना (चित्र 4a- B) के लिए नेतृत्व करेंगे । जब टन फ्लैट स्लाइड पर बह रहे हैं, नलिकाओं के रूप में संभव है और अतिरिक्त गति के रूप में इस एकल कोशिका उपकला परत (आंकड़ा 4c) को नुकसान होगा से परहेज के रूप में थोड़ा छुआ जाना चाहिए । ठीक से विच्छेदित पूर्वकाल MTs उपकला कोशिकाओं और आकृति विशिष्ट tubule खंडों के cytosol के माध्यम से लाल और हरे प्रतिदीप्ति दोनों का भी वितरण दिखाएगा । अनुचित छिड़काव या गलत हैंडलिंग द्वारा क्षतिग्रस्त नलिकाओं कोई बनती हरी समुच्चय के साथ लाल प्रतिदीप्ति के एकत्रीकरण प्रदर्शित करेगा, और अज्ञात पीछे MTs समीपस्थ ब्लाइंड अंत से बाहर यूरेटर (चित्रा 4dके लिए वर्दी आकृति विज्ञान दिखाएगा . 

pHerry के समुचित कार्य की पुष्टि की जानी चाहिए, हालांकि शारीरिक मूल्यांकन के रूप में भी आकृति विज्ञान । उचित पीएच-संवेदन की पुष्टि करने का सबसे समीचीन तरीका एक एनएच4सीएल पल्स लागू है । इन शर्तों के तहत ग्रीन SEpH संकेत उंमीद पीएच परिवर्तन (पीएच में वृद्धि की रिपोर्ट चाहिए के रूप मेंमैं पल्स के दौरान एनएच3 सेल में प्रवेश करती है, के रूप में नाड़ी के दौरान एक क्रमिक गिरावट के रूप में एनएच4+ कश्मीर के माध्यम से प्रवेश करती है+ ट्रांसपोर्टरों और चैनल, और एक तेजी से अंलीकरण और एनएच पर क्रमिक वसूली4सीएल आहरण21, जबकि लाल mCherry संकेत स्थिर रहना चाहिए (आंकड़ा 5- बी) । SEpH संकेत में परिवर्तन की भयावहता प्रोटोकॉल और कक्ष प्रकार के साथ भिन्न होगी, लेकिन mCherry संकेत सभी मामलों में स्थिर होना चाहिए । व्यक्तिगत प्रयोगों के दौरान mCherry संकेत में परिवर्तन सेल क्षति के कारण आंदोलन कलाकृतियों या सेंसर समुच्चय के प्रगतिशील पीढ़ी के संकेत देते हैं । बाद पीएच के ठहराव को रोकने जाएगामैं और बचा जाना चाहिए । एनएच4सीएल पल्स पूरा करने पर यह एक 2-बिंदु अंशांकन (अंशांकन iPBS, पीएच ७.४ और ९.०, 10 µ m nigericin) प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है एक आराममैं ७.४ के पास पीएच पुष्टि करने के लिए और यह सुनिश्चित करें कि वर्तमान इमेजिंग पैरामीटर संतृप्ति के लिए नेतृत्व नहीं करते प्रतिदीप्ति का पता लगाने जब प्रतिदीप्ति पीएच ९.० (चित्रा 5C) में अधिकतम है । यदि आराम पीएच ७.४ की तुलना में काफी कम है, प्रोटोकॉल स्वस्थ MTs के साथ दोहराया जाना चाहिए; और अगर संतृप्ति ९.० पीएच पर होता है, प्रोटोकॉल कम प्रकाश तीव्रता या जोखिम समय के साथ दोहराया जाना चाहिए । एक बार पर्याप्त इमेजिंग पैरामीटर निर्धारित कर रहे हैं, वे प्रयोग या अंशांकन के बीच नहीं बदला जाना चाहिए अगर निरपेक्ष प्रतिदीप्ति अनुपात का इस्तेमाल किया जा रहे हैं । जबकि pHerry की छद्म ratiometric प्रकृति आंदोलन या सेल व्यास में परिवर्तन करने के लिए प्रवण तैयारियों में आंदोलन सुधार की एक विधि प्रदान कर सकते हैं, पीएच के निरपेक्ष ठहरावमैं pHerry SEpH के पूर्ण व्यवस्थित सहसंबंध की आवश्यकता है/ mCherry अनुपात के माध्यम से पीएचमैं nigericin/ स्वस्थ तैयारी में pHerry के अंशांकन सेल प्रकार और अंशांकन शर्तों (चित्रा 5d) के आधार पर 7.1-7.4 के एक स्पष्ट pKa के साथ सुसंगत अंशांकन curves का उत्पादन करना चाहिए । तैयारियों के लिए जिसमें mCherry एकत्रीकरण अपरिहार्य है, अनुपात मूल्यों का सामान्यीकरण है कि १.० के एक प्रतिदीप्ति अनुपात पीएचi ७.० समान परिणाम (चित्रा 5E) उपज चाहिए करने के लिए मेल खाती है । बिंदु अंशांकन और सामान्यीकृत घटता उपयोग किया जाता है, तो इमेजिंग पैरामीटर प्रत्येक तैयारी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । 

नपे पीएचमैं निशान सेल प्रकार के बीच पीएच विनियामक तंत्र की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । GAL4/यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली में Drosophila पूर्वकाल मीट्रिक टन (चित्रा stellate) के प्रमुख कोशिकाओं और 6A कोशिकाओं में pHerry व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पीएचमैं विनियमन एनएच4सीएल दालों के साथ एसिड लोडिंग कोशिकाओं द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और पीएचमैं वसूली की दर को बढ़ाता है । यह अलग प्रयोगात्मक परिस्थितियों में वसूली चरण के लिए घातीय कार्य फिटिंग द्वारा पूरा किया जा सकता है और अधिक तेजी से एच+ समाप्ति के साथ कोशिकाओं के रूप में क्षय लगातार (τ) निकालने के लिए एक और अधिक तेजी से वसूली प्रदर्शित करेगा (और इस प्रकार τ के कम मूल्यों) । इस विश्लेषण के आधार पर, मीट्रिक टन के stellate कोशिकाओं को मुख्य कोशिकाओं (चित्रा घमण्ड) की तुलना में अधिक मजबूत एसिड बाहर निकालना है दिखाई देते हैं । इस विश्लेषण के रूप में लंबे समय के रूप में रखना होगा पीएचमैं, एसिड लदान की हद तक, और बफर क्षमता प्रयोगात्मक समूहों के बीच समान हैं । हालांकि, जब इन शर्तों को पूरा नहीं कर रहे हैं, यह अवलोकन के लिए खाते के लिए आवश्यक है कि cytosol (βi) कई कक्षों की आंतरिक बफ़रिंग क्षमता ही है पीएच-निर्भर३५,३७,३८ और इस प्रकार पीएच की दरमैं अलग पीएच में बदलमैं सीधे तुलनीय नहीं हो सकता है । इस तरह के मामलों में, घातीय वक्र के बाद एसिड बाहर निकालना चरण के लिए फिट एक4सीएल पल्स और आंतरिक बफर क्षमता के पहले से निर्धारित अनुमान (βमैं) एक समारोह के रूप में एसिड बाहर निकालना दर (जेएच +) साजिश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता पीएचमैं और एसिड बाहर निकालना (समीकरण 3 और 4) की क्षतिपूर्ति दर निर्धारित करते हैं । एक बार एसिड लोड हो रहा है और आराम पीएचमैं के लिए जवाबदेह है में मतभेद है, यह संक्रमणकालीन खंड के प्रमुख कोशिकाओं में स्पष्ट एसिड बाहर निकालना है कि stellate कोशिकाओं (चित्रा 6C) से अधिक है । जबकि संमोहक, इस विश्लेषण है कि मापा पीएच पता नहीं हैमैं मात्रा के एक समारोह है, जबकि प्लाज्मा झिल्ली भर में एसिड बाहर निकालना झिल्ली की सतह क्षेत्र के एक समारोह है । विभाजन जंमूएच + सतह क्षेत्र के द्वारा ब्याज की कोशिका के अनुपात को इकाई समय प्रति इकाई सतह क्षेत्र (समीकरण 5), इस प्रकार सेल आकार और आकृति विज्ञान में अंतर के लिए सुधार की अनुमति के अनुसार एसिड के बराबर के तिल में मूल्यों की उपज होगी । लगभग दो प्रमुख कोशिकाओं संक्रमणकालीन क्षेत्रों में मीट्रिक टन की परिधि में शामिल है और इस तरह एकल कोशिकाओं एक ट्यूब के आधे के रूप में मॉडलिंग की जा सकती है (भीतरी व्यास 24 µm; बाहरी व्यास ४८ µm; ऊँचाई ५० µm). Stellate कोशिकाओं छोटे होते हैं और मीट्रिक टन के संक्रमणकालीन क्षेत्र में बार के आकार का हो जाते हैं2. सतह क्षेत्र और मात्रा के सटीक ठहराव मुश्किल है लेकिन यहां तक कि संक्रमणकालीन stellate कोशिका आकार के रूढ़िवादी सन्निकटियों (५० µm की ऊंचाई और 10 µm के व्यास के साथ सिलेंडर) मात्रा अनुपात करने के लिए एक सतह क्षेत्र से संकेत मिलता है कि प्रमुख कोशिकाओं के कम 2x । इस खाते में लेने से पता चलता है कि stellate कोशिका एसिड प्रवाह काफी नीचे है कि संक्रमणकालीन प्रमुख कोशिकाओं की है, और वास्तव में दृष्टिकोण है कि प्रारंभिक खंड प्रमुख कोशिकाओं के (चित्रा 6D) ।

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क के विच्छेदन Drosophila पूर्वकाल Malpighian नलिकाओं.
ठंडा Schneider के माध्यम में ठीक संदंश के 2 जोड़े के साथ पूर्वकाल मीट्रिक टन हटाने के A. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । "A. Tubule" = पूर्वकाल मीट्रिक टन. "P. Tubule" = पीछे mt. B. पुनः प्राप्त करने की प्रक्रिया और निकाले पतले कांच की छड़ का उपयोग कर MTs बढ़ते । इमेजिंग और शारीरिक मूल्यांकन के लिए एक स्लाइड के लिए निकाले MTs की पूरी लंबाई का पालन करने की प्रक्रिया D. प्रतिनिधि widefield की छवियां SEpH (470/510 एनएम पूर्व/और mCherry (556/630 एनएम पूर्व/) के अवयव यूएएस- pHerry द्वारा संचालित capaR- GAL4 स्वस्थ पूर्वकाल mts चित्रण, पूर्वकाल mts अपर्याप्त छिड़काव द्वारा क्षतिग्रस्त, और अज्ञात पीछे mts. ध्यान दें कि स्वस्थ पूर्वकाल mts एक स्पष्ट फैली हुई अंधा प्रारंभिक खंड प्रदर्शित, यूएएस-pHerry की अपेक्षाकृत वृद्धि की अभिव्यक्ति के साथ एक सीमित संक्रमणकालीन खंड जब capaR-GAL4, और एक बाहर का मुख्य द्वारा संचालित सेगमेंट. क्षतिग्रस्त MTs प्रदर्शन कोई इसी SEpH प्रतिदीप्ति के साथ mCherry प्रतिदीप्ति की नजर समुच्चय । पीछे MTs कोई आकृति अलग क्षेत्रों के साथ व्यास में समान हैं । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आकृति का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: Malpighian नलिकाओं में pHerry के सत्यापन और अंशांकन ।
A. प्रतिनिधि widefield की छवियां SEpH (470/510 एनएम पूर्व/और mCherry (556/630 एनएम पूर्व/) के अवयव यूएएस- pHerry द्वारा संचालित capaR- GAL4 का चित्रण स्वस्थ पूर्वकाल MTs. "ROI" मार्क्स ब्याज की क्षेत्र संकेत । "BG" अंक ब्याज की पृष्ठभूमि क्षेत्र है जो बाद में एक ही चैनल में संकेत रॉय से घटाया गया था । स्केल बार = ५० µm. B. सापेक्ष एक 20 एस ४० मिमी NH4सीएल पल्स के जवाब में pHerry के SEpH और mCherry संकेतों में प्रतिदीप्ति परिवर्तन । ध्यान दें कि mCherry संकेत स्थिर है, जबकि SEpH संकेत पल्स के दौरान एक विशेषता वृद्धि प्रदर्शित करता है (alkalization का संकेत है, यानी वृद्धि हुई पीएचi) और वॉशआउट पर एक तेज कमी (अंलीकरण का संकेत है, यानी कम पीएचi) । Cप्रतिदीप्ति अनुपात pHerry (SEpH/mCherry) की गणना B में डेटा से अंशांकन iPBS (10 µ m nigericin, १३० mM K+, pH ७.४ और ९.०) में 30 मिनट की मशीन के बाद अतिरिक्त डेटा के साथ । Dअंशांकन वक्र पूर्ण pHerry अनुपात (SEpH/mCherry) से निर्माण के रूप में एक समारोह के रूप में लगाए गए पीएचमैं अंशांकन iPBS के लिए जोखिम के दौरान आठ पीएच मूल्यों में से एक के लिए बफर । धूसर वृत्त व्यक्तिगत मान 8 तैयारी प्रपत्र हैं । काले चौकों और सलाखों के मतलब है ± एसडी. वक्र लैटिस फिट है । डी में के रूप में एक ही डेटा इस तरह है कि पीएच ७.० में प्रतिदीप्ति अनुपात सामान्यीकृत १.० है । वक्र sigmoidal वक्र फ़िट संशोधित है (चरण ७.४, समीकरण 1देखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: Malpighian Tubule Epithelia में एसिड बाहर निकालना के ठहराव ।
पूर्वकाल मीट्रिक टन के प्रमुख कोशिकाओं में (pHerry से) SEpH प्रतिदीप्ति की . Widefield छवि (बाएँ, capaR-GAL4 चालक द्वारा संचालित) और पूर्वकाल मीट्रिक टन की stellate कोशिकाओं (ठीक है, c724-GAL4द्वारा संचालित). ध्यान दें कि stellate कोशिकाओं प्रारंभिक खंड में पट्टी के आकार का, संक्रमणकालीन खंड में चर रहे हैं, और मुख्य खंड में विशिष्ट सेलुलर अनुमानों प्रदर्शित करते हैं । स्केल बार = १०० µm. B. नपे पीएचमैं एक 20 एस ४० मिमी NH4सीएल पल्स के जवाब में ब्याज चिह्नित के क्षेत्रों में एक (संक्रमणकालीन खंड के प्रमुख कोशिकाओं, प्रारंभिक खंड के प्रमुख कोशिकाओं, और संक्रमणकालीन खंड के stellate कोशिकाओं) में परिवर्तन । डैश्ड वक्रों निरूपित एकल घातीय एसिड वसूली चरण के बाद लागू किया फिट बैठता है NH4सीएल वापसी जिसमें से कहा क्षय स्थिरांक (τ) मूल्यों को प्राप्त कर रहे हैं । C. एसिड बाहर निकालना दर (जेएच +) एक समारोह के रूप में रची गई पीएचमैं घातीय से व्युत्पंन बी में देखा फिट बैठता है । JH + परिकलन (समीकरण 3) के लिए चरण 8.3.1 देखें । डैश्ड curves के क्षेत्र में प्रत्येक डेटा प्लॉट करने के लिए लागू घातांक फिट बैठता है ओवरलैपिंग pHi चिह्नित द्वारा धूसर बॉक्स । D. एसिड फ्लक्स एक समारोह के रूप में साजिश रचीमैं घातीय से व्युत्पंन बी और समीकरण 5में देखा फिट बैठता है । डैश्ड curves के क्षेत्र में प्रत्येक डेटा प्लॉट करने के लिए लागू घातांक फिट बैठता है ओवरलैपिंग pHi चिह्नित द्वारा धूसर बॉक्स । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

iPBS एनएच4सीएल पल्स iPBS अंशांकन iPBS
nacl १२१.५ ८१.५ 0
एनएच4सीएल 0 ४० 0
kcl 20 20 १३०
ग्लूकोज 20 20 20
बफ़र HEPES; ८.६ HEPES; ८.६ एमईएस, HEPES, या नल; ८.६
NaHCO3 १०.२४ १०.२४ 0
णः2पो4 (1 ज2O) ४.५ ४.५ 0
NMDG 0 0 ३०.५
पीएच ६.८ ६.८ है
Osmolarity ३५० ± 5 ३५० ± 5 ३५० ± 5

तालिका 1: प्रयोगात्मक मक्खी समाधान ।
iPBS समाधान कमरे के तापमान पर तैयार कर रहे हैं और पीएच एचसीएल और NaOH के साथ अनुमापन द्वारा निर्धारित है । अंशांकन समाधान एचसीएल और NMDG के साथ titrated है । अंशांकन समाधान के बफर वांछित पीएच के आधार पर विविध है [2-(N-morpholino) पीएच के लिए ethanesulfonic एसिड (एमईएस) = ४.०-६.०; ph के लिए 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) = ६.५-७.५; N-[tris (hydroxymethyl) मिथाइल] -3-aminopropanesulfonic एसिड (नल) पीएच = ८.०-९.०] के लिए । मिमी में सभी मान, सिवाय पीएच (इम्युनिटी) और परासरणीयता (mmol/ स्टॉक nigericin DMSO में एक अंतिम एकाग्रता के लिए अंशांकन समाधान करने के लिए जोड़ा गया है 10 µ m बस का उपयोग करने से पहले.

GEpHI उत्तेजना (एनएम) उत्सर्जन (एनएम) पीके नोट्स
Superecliptic pHluorin (SEpH)11 ३९५, ४८८ ५३० ७.२ बड़े रेखीय श्रेणी, बड़े फ़ोल्ड (50x) रेखीय श्रेणी में पीएच-संवेदी प्रतिदीप्ति में वृद्धि
पीटी GFP४२ ३९०, ४७५ ५४० ७.३ संयंत्र कोशिकाओं में उपयोग के लिए मांय
Superecliptic pHluorin-mCherry फ्यूजन31 ४८८, ५५६ ५३०, ६२० ७.२ कुछ कक्षों में ख़राब mCherry एग्रीगेट का उत्पादन करता है
ClopHensor४० ४८८, ५४५ ५२५, ५९० ६.८ पीएच और सीएल- संवेदक । अद्यतन ClopHensorN30 वेरियेंट ंयूरॉंस में कम एकत्रीकरण से पता चलता है
pHerry10 ४८८, ५५६ ५३०, ६२० ७.२ अपडेटेड SEpH-ClopHensor से linker के साथ mCherry फ्यूजन
mNectarine४४ ५५८ ५७८ ६.९ photobleaching के लिए सुधार अक्सर आवश्यक है
pHluorin2४५ ३९५, ४७५ ५०९ ६.९ Ratiometric pHluorin12 के संस्करण
pHred४७ ४४०, ५८५ ६१० ७.८ नवीनीकृत वेरियेंट की लंबी स्टोक्स shift mKeima४९, FLIM NIR 2-फोटॉन इमेजिंग के साथ संगत
pHuji४३ ५६६ ५९८ ७.७ वेरियेंट of mApple; कुछ कक्षों में अपेक्षा से कम पीएच संवेदनशीलता
pHtomato४६ ५५० ५८० ७.८ vesicular endocytosis, गरीब cytocolic पीएच संवेदनशीलता ट्रैक करने के लिए मान्य
pHoran4४३ ५४७ ५६१ ७.५ बढ़ाया पीएच के प्रति संवेदनशील ऑरेंज फ्लोरोसेंट प्रोटीन
SypHer-2४८ ४२७, ५०४ ५२५ ८.१ ratiometric SypHer के उज्जवल संस्करण५१, मूल रूप से mitochondrial मापन के लिए

तालिका 2: प्रकाशित Cytosolic GEpHIs की सूची
उत्तेजना maxima, उत्सर्जन maxima, और स्पष्ट pKमान अनुमानित है और अभिव्यक्ति सिस्टम, इमेजिंग तकनीक और अंशांकन पद्धति के आधार पर भिंन हो सकते हैं । FLIM = प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी । NIR = अवरक्त के पास ।

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Discussion

मैं Drosophila mts में पीएच के ठहराव की सफलता निकाले mts के स्वास्थ्य पर पूरी तरह से निर्भर करता है और बढ़ते और विच्छेदन की गुणवत्ता (चित्र A - C) । इस प्रकार, वर्णित के रूप में ऊतक के सावधान हैंडलिंग जरूरी है । स्लाइड हौसले से पीएलएल में लेपित काफी सहायता मीट्रिक टन के रूप में वे स्लाइड जो पहले समाधान के लिए उजागर किया गया है की तुलना में ज्यादा चिपकने वाले होते है बढ़ते । सावधान बढ़ते भी अलग मीट्रिक टन खंडों (चित्रा डी) की पहचान में सहायता करेगा । स्वस्थ टन mCherry एकत्रीकरण को कम करने और एसिड बाहर निकालना के अधिक सुसंगत ठहराव उपज द्वारा pHerry और कार्यात्मक मूल्यांकन के अंशांकन की सुविधा, क्रमशः । कुछ मामलों में, mCherry एकत्रीकरण से परहेज संभव नहीं है के रूप में प्रयोगात्मक शर्तों स्वाभाविक मीट्रिक टन epithelia नुकसान या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अधिक महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति का उत्पादन हो सकता है । इन मामलों में, एक छद्म ratiometric अंशांकन सामान्यीकृत ऐसी है कि प्रतिदीप्ति अनुपात १.० के लिए पीएचमैं ७.० से मेल खाती है, और बिंदु अंशांकन ठहराव (चित्रा ई) की अनुमति देगा । ध्यान रखा जाना चाहिए जब बिंदु अंशांकन प्रदर्शन के लिए इमेजिंग और छिड़काव प्रणालियों के स्थाई तत्वों को उजागर करने से बचने के लिए nigericin के रूप में ionophore ग्लास और प्लास्टिक का पालन करेंगे । यहां तक कि छद्म ratiometric अंशांकन परिस्थितियों में एक प्रयोगात्मक हेरफेर एक प्रयोग के दौरान सेलुलर नुकसान लाती है, यानी इस नुकसान mCherry में एक प्रगतिशील स्पष्ट वृद्धि का कारण होगा के लिए संभव नहीं है प्रतिदीप्ति प्रयोग के दौरान । इन मामलों में बाद में, SEpH प्रतिदीप्ति संकेत एक सामान्यीकृत अंशांकन वक्र और बिंदु अंशांकन के साथ, चेतावनी है कि इमेजिंग अब आंदोलन कलाकृतियों और फोकल शिफ्ट के लिए सही होगा के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।

GEpHIs कई सामांय सीमाओं जबमैं फ्लोरोसेंट रंजक के साथ पीएच के ठहराव की तुलना में ले । डाई प्रतिधारण झिल्ली अखंडता और सेल स्वास्थ्य३९का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कोई समकक्ष परख GEpHIs उपयोग के लिए उपलब्ध है । इस तरह, तैयारी स्वास्थ्य के माध्यम से निगरानी की जानी चाहिए स्वतंत्र का मतलब है अगर कोशिका क्षति के परिणाम को पाया भविष्यवाणी की है । GEpHIs संभावित vivo तैयार करने में परेशान है लेकिन ऊतक अखंडता स्वाभाविक रूप से प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की सीमा और बिंदु अंशांकन असंभव कर सकते हैं के रूप में कम से इमेजिंग अनुमति देते हैं । एक अंय विशिष्ट pHerry और अंय cytosolic दोहरी fluorophore पीएच संकेतक (जैसे ClopHensor४०) का उपयोग करने में निहित सीमा दो fluorophores की प्रवृत्ति से निकला दोनों एक दूसरे के स्वतंत्र रूप से अपने प्रतिदीप्ति बदलने के लिए और पीएचमैं . आरएफपी एकत्रीकरण कलाकृतियों इस सीमा की सबसे महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति कर रहे हैं, लेकिन ठहराव भी एक या दोनों fluorophores के photobleaching से समझौता किया जा सकता है । इस प्रकार, इमेजिंग प्रोटोकॉल बहुत photobleaching को कम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, जो लंबे समय जोखिम समय और अधिग्रहण दर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं < 0.2 हर्ट्ज. लंबे समय जोखिम समय तेजी से पीएचमैं बदलाव की रिपोर्ट करने में विफल हो जाएगा । SEpH प्रतिदीप्ति से पता चलता है रैखिक सहसंबंधमैं पीएच ६.८-७.८ से सबसे अधिक तैयारी में है, लेकिन इस तरह के माप की सटीकता nigericin की सटीकता पर निर्भर करता है/ Nigericin k+/H+ ionophore और उचित अंशांकन के रूप में कार्य करता है equilibrating extracellular [k+] intracellular [k+] के साथ पर निर्भर है । intracellular [K+] के अनुमान उपलब्ध नहीं है या सभी प्रायोगिक प्रणालियों के लिए आसानी से प्राप्य । पीएच की सटीकतामैं ठहराव केवल intracellular के अनुमान के रूप में के रूप में विश्वसनीय होगा [K+], हालांकि पीएच में सापेक्ष परिवर्तन की दरमैं सुसंगत हो जाएगा । इस सीमा और पीएच के व्युत्क्रम लघुगणक संबंध को देखते हुएमैं intracellular [H+], यह हमेशा पीएचमैं, एसिड बाहर निकालना दर (जेएच +, चित्रा 6C) में परिवर्तन की दर के रूप में डेटा की रिपोर्ट करने के लिए बेहतर है, या एसिड फ्लक्स (चित्रा 6D) के बजाय पीएच में निरपेक्ष परिवर्तनमैं। एसिड फ्लक्स के रूप में डेटा का विश्लेषण सतह में अंतर के लिए सुधार के अतिरिक्त लाभ है कोशिका प्रकार के बीच मात्रा अनुपात के लिए कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित वयस्क मक्खी मीट्रिक टन तैयारी से डेटा की व्याख्या करते समय कई निरंतर की सराहना की जानी चाहिए. प्रारंभिक, संक्रमणकालीन के रूपात्मक भेद, और मुख्य क्षेत्रों की संभावना है MTs में मौजूद कार्यात्मक और आनुवंशिक डोमेन के सच विविधता का सरलीकरण2। इसके अलावा, जबकि इस प्रोटोकॉल basolateral एसिड ट्रांसपोर्टरों के समारोह का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है यह संभव है कि शिखर परिवहन पीएचमैं माप के रूप में अच्छी तरह से प्रभावित कर सकते हैं । मूत्रवाहिनी सील जब MTs बढ़ते (५.९ कदम) सुनिश्चित करता है कि समाधान विनिमय मुख्य रूप से basolateral सतह पर होता है, लेकिन पैरा सेलुलर और आयनों के शिखर आंदोलन अभी भी पीएचमैं के रूप में basolateral परिवहन अंततः बदल प्रभावित हो सकता है लुमेन/cytosolic आयन ढाल के cytoplasmic पक्ष । शिखर और basolateral समारोह के निरपेक्ष जुदाई स्वतंत्र रूप से perfusing के चमकदार और basolateral सतहों मीट्रिक टन लेकिन इस तरह के तरीके काफी अधिक तकनीकी रूप से वे micropipette cannulation की आवश्यकता के रूप में मांग कर रहे है पूरा किया जा सकता है४१ .

GEpHIs पीएच मैं मापने के पारंपरिक तरीकों पर मौजूद कई फायदे, और इन शक्तियों को परिलक्षित जब आनुवंशिक पर्यावरण और Drosophila मीट्रिक टन की तैयारी के कम लागत के साथ संयुक्त कर रहे हैं । पीएच के ठहरावमैं ऐतिहासिक रूप से फ्लोरोसेंट रंगों पर भरोसा किया है जैसे (2 ', 7 '-बीआईएस-(2-Carboxyethyl)-5-(और-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)22 या आयन के माध्यम से जटिल electrophysiological आकलन-चुनिंदा इलेक्ट्रोड20 ,21. के रूप में pHerry आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग है, यह विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा विशिष्ट सेलुलर आबादी में व्यक्त किया जा सकता है (के रूप में मीट्रिक टन के प्रमुख कोशिकाओं और stellate कोशिकाओं में यहां प्रदर्शन किया, चित्रा 6) और किसी भी ऊतक transgenesis के अधीन में उपयोग करने के लिए उत्तरदायी है, अभिकर्मक, या वायरल-मध्यस्थता संक्रमण । रंजक व्यक्तिगत तैयारी और संभावित जटिल आवेदन प्रोटोकॉल जो विषम ऊतकों में कोई सेल विशिष्टता व्यक्त की लागत से सीमित कर रहे हैं । आयन चुनिंदा इलेक्ट्रोड निर्माण और माप के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, जबकि pHerry पारंपरिक GFP और आरएफपी फिल्टर सेट के साथ केवल widefield epifluorescent माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता है. रंजक और इलेक्ट्रोड का उपयोग जरूरत शारीरिक के साथ ही ब्याज के ऊतकों के लिए ऑप्टिकल पहुँच जबकि GEpHIs हौसले से निकाले जाने वाले ऊतकों में निगरानी की जा सकती है और समय पर vivo में. बरकरार तैयारियों में लाइव इमेजिंग के लिए अवसर विशेष रुचि का है जब पीएचमैं विनियमन के सेलुलर फिजियोलॉजी का आकलन के रूप में कोई अंय प्रौद्योगिकी परमिट पीएच के ठहरावमैं अंतर्जात बफ़रिंग की उपस्थिति में तंत्र.

Drosophila वयस्क मीट्रिक टन तैयारी सेलुलर पीएच विनियमन और आयन परिवहन में रुचि रखने वालों के लिए कई आकर्षक सुविधाओं को प्रस्तुत करता है । Drosophila पशुपालन सस्ती है और इस तरह के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर का निर्माण और RNAi अभिव्यक्ति आवेषण आसानी से शेयर केंद्रों की एक किस्म से उपलब्ध है (ब्लूमिंगटन Drosophila इंडियाना विश्वविद्यालय में शेयर केंद्र; वियना Drosophila अनुसंधान केंद्र) । Drosophila MTs, उंहें transepithelial आयन परिवहन की जांच के लिए आदर्श बनाने, ध्रुवीकरण उपकला कोशिकाओं की एक परत से बना रहे हैं । Basolateral परिवहन को आसानी से परख सकते है (जैसा कि यहां प्रदर्शन किया), लेकिन शिखर और Basolateral आयन आंदोलन का पूरा आकलन micropipette cannulation४१के साथ संभव है । इसके अतिरिक्त, इस तरह के Ramsay स्राव परख17 और चमकदार कैल्शियम के रूप में अंग समारोह परख-oxalate साठा18 अच्छी तरह से विशेषता और तरल पदार्थ स्राव के मॉडल के लिए उपकला सेलुलर फिजियोलॉजी के सहसंबंध की अनुमति है और नेफ्रोलिथियासिस, क्रमशः । हालांकि इन सुविधाओं के मजबूत विश्लेषण के लिए अवसर प्रदान करते हैं, epifluorescent माइक्रोस्कोपी की कम लागत और व्यापक उपलब्धता, शिक्षण प्रयोगशालाओं में सेलुलर और पूरे अंग फिजियोलॉजी के प्रदर्शन के लिए Drosophila मीट्रिक टन आदर्श बनाता है ।

इन तरीकों के स्वामित्व basolateral H+ प्रवाह द्वारा पीएचमैं विनियमन के ठहराव परमिट वयस्क Drosophila MTs, transepithelial आयन परिवहन के एक सुलभ अभी तक मजबूत मॉडल में । pHerry जैसे GEpHIs का उपयोग आसानी से अंय invertebrate सेल प्रकार, संस्कृतिपूर्ण स्तनधारी कोशिकाओं में पीएचमैं विनियमन का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और vivo में तैयारी । नए GEpHIs के विकास की संभावना है कि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक का पालन करेंगे, नई पीढ़ी दिखाई स्पेक्ट्रम फैले और इस तरह के एकत्रीकरण कलाकृतियों के रूप में वर्तमान सीमाओं को संबोधित करने के साथ30,४२, ४३ , ४४ , ४५ , ४६ , ४७ , ४८ , ४९. GEpHIs पहले से ही व्यापक रूप से उपयोग किया गया है mitochondrial मैट्रिक्स पीएच५०,५१, और उपसेलुलर लक्ष्यीकरण रणनीतियां मौजूद करने के लिए endoplasmic जालिका५२, नाभिक को स्थानीयकरण के लिए स्थानीयकृत । ५३, synaptic बुलबुले12,४३, और cytoplasmic५४ और सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली५५ के बाहरी सतहों ( तालिका 2 प्रकाशित एजेंट की एक सूची के लिए देखें) । जैसे उपकरण उपलब्ध हो वे सेलुलर शरीर विज्ञान के अंय पहलुओं के साथ उप सेलुलर पीएच विनियमन के ऊर्ध्वाधर एकीकरण की अनुमति होगी, जैसे कि सीए2 + हैंडलिंग और intracellular संकेतन, और हड्डीवाला की एक किस्म में पूरे अंग समारोह और invertebrate तैयारियां ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को NIH DK092408 और DK100227 ने MFR को सपोर्ट किया. AJR ने T32-DK007013 का समर्थन किया था. लेखक CapaR-GAL4 और c724-GAL4 Drosophila स्टॉक्स के लिए डॉ जूलियन A.T. डो शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम भी प्रयोगात्मक मक्खी पार बनाए रखने के लिए सहायता के लिए याकूब बी एंडरसन धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

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References

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