Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cellulaire ion vervoer kan vaak worden geëvalueerd door het toezicht van de intracellulaire pH (pHik). Genetisch een Encoded pH-indicatoren (GEpHIs) optische kwantificering van intracellulaire pH in onbeschadigde cellen. Dit protocol gegevens de kwantificering van de intracellulaire pH via cellulaire ex vivo wonen-imaging van Malpighian tubuli van Drosophila melanogaster met pHerry, een pseudo-ratiometric genetisch gecodeerd pH-indicator.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Epitheliale ion vervoer is essentieel voor systemische ion homeostase evenals onderhoud van essentiële cellulaire elektrochemische verlopen. Intracellulaire pH (pHik) wordt beïnvloed door vele ion vervoerders en dus controle pHik is een nuttig instrument voor de beoordeling van de activiteit van de vervoerder. Moderne genetisch gecodeerd pH-indicatoren (GEpHIs) een optische kwantificering pHik in onbeschadigde cellen op een cellulaire en subcellular schaal. Dit protocol beschrijft real-time kwantificering van cellulaire pHik regulering in Malpighian tubuli (MTs) van Drosophila melanogaster via ex vivo wonen-imaging van pHerry, een pseudo-ratiometric-GEpHI met een pKeen geschikt voor pH wijzigingen bijhouden in het cytosol. Uitgepakte volwassen vliegen MTs zijn samengesteld uit morfologisch en functioneel verschillende secties van eencellige laag epitheel, en kunnen dienen als een model voor toegankelijk en genetisch hanteerbare voor onderzoek van epitheliale vervoer. GEpHIs bieden verschillende voordelen ten opzichte conventionele pH-gevoelige fluorescente kleurstoffen en ion-Ionselectieve electroden. GEpHIs kan verschillende cel populaties label mits passende promotor elementen beschikbaar zijn. Deze etikettering is vooral handig in ex vivo, in vivoen in situ preparaten, die intrinsiek heterogeen. GEpHIs ook de kwantificering van pHi in intact weefsels na verloop van tijd zonder de behoefte aan herhaalde kleurstof behandeling of weefsel externalization toestaan. Het primaire nadeel van de huidige GEpHIs is de neiging om aggregaat in cytosolische inclusies in reactie op weefselbeschadiging en overmatige expressie op te bouwen. Deze tekortkomingen, hun oplossingen, en de inherente voordelen van GEpHIs zijn in dit protocol door evaluatie van de basolaterale proton (H+) vervoer in functioneel verschillende hoofd- en Notti cellen van uitgepakte vlieg MTs gedemonstreerd. De technieken en analyse beschreven zijn gemakkelijk aanpasbaar aan een breed scala aan gewervelde en ongewervelde preparaten, en de verfijning van de bepaling van het onderwijs labs voor ingewikkelde bepaling van ion flux via specifieke vervoerders kan worden geschaald.

Introduction

Het doel van dit protocol is kwantificering van intracellulaire pH (pHi) met behulp van een genetisch-gecodeerde pH-Indicator (GEpHI) beschrijven en demonstreren hoe deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen basolaterale H+ vervoer in een model insect (overleden melanogaster) renale structuur, de Malpighian zaadvormende (MT). MTs dienen als de uitscheidingsmechanisme organen van de fruitvlieg en functioneel vergelijkbaar zijn met de zoogdieren nefronen in enkele belangrijke opzichten1. MTs zijn gerangschikt als 2 paar tubuli (anterior en posterior) in de borstkas en de buik van de vlieg. De eencellige epitheliale buis voor elke MT is samengesteld uit metabolisch actief belangrijkste cellen met verschillende apicale (luminal) en basolaterale (hemocoel) polariteit evenals tussenliggende Notti cellen. Anterior MTs zijn samengesteld uit 3 morfologisch, functioneel, en ontwikkelingsachterstand afzonderlijke segmenten, met name de aanvankelijke uitgezet segment, overgangs segment en secretoire belangrijkste segment, die naar de urineleider2. Op de cellulaire schaal trans-epitheliale ion vervoer in het lumen wordt bereikt door een apicaal plasmamembraan V-ATPase-3 , evenals een alkali-metalen/H+ -wisselaar en een basolaterale nb+-K+-ATPase4, actieve veredeling-gelijkrichter K+ kanalen5, nb+-gedreven Cl/HCO3 exchanger (NDAE1)6en nb+-K+-2 Cl cotransporter (NKCC; Ncc69)7, terwijl Notti cellen Cl- bemiddelen en water transport8,9. Dit complexe maar toegankelijk fysiologische systeem biedt uitstekende mogelijkheden voor onderzoek van endogene ion vervoer mechanismen in combinatie met de diverse genetische en gedragsmatige toolsets van Drosophila.

De reden voor dit protocol was in het beschrijven van een genetisch smeedbaar systeem voor het bestuderen van epitheliale ion vervoer met potentieel voor de integratie van cel tot gedrag en uitvoer van hulpprogramma's voor andere modelsystemen. Uitdrukking van pHerry10, een GEpHI die zijn afgeleid uit een fusie van groene pH-gevoelige super ecliptica pHluorin11,12 (SEpH) en rode pH-ongevoelig mCherry13, in MTs toelaat kwantificering in vervoermiddelen H+ afzonderlijke MT cellen tot en met de hoge K+/nigericin kalibratie techniek14. Zoals vele ion transporters H+ -equivalenten verplaatsen, dient kwantificering van intracellulaire pHik als een functionele weergave van ion verkeer via diverse transporteurs. Het systeem van Drosophila MT model biedt ook krachtige genetische hulpmiddelen in weefsel-specifieke transgenic15 en RNA interferentie (RNAi)16 expressie, die kan worden gecombineerd met cellulaire beeldvorming en geheel-orgel testen17 , 18 , 19 van zaadvormende functie voor het maken van een robuuste toolset met verticale integratie van moleculen tot gedrag. Dit staat in contrast met veel andere protocollen voor de beoordeling van epitheliale biologie, zoals historisch dergelijke metingen hebben vertrouwd op ingewikkeld en ontmoedigend micro-dissectie, verfijnde ion-Ionselectieve electroden20,21, en dure pH-gevoelige kleurstoffen22 met beperkende laden eisen en arme cellulaire specificiteit in heterogene weefsels. GEpHIs werden gebruikt voor het meten van pHik in een verscheidenheid van cel typen23uitgebreid. Vroege werk benut de inherente pH-gevoeligheid van groen Fluorescent proteïne (GFP) volgen pHik in gekweekte epitheliale cellen24 maar de afgelopen twee decennia heb gezien GEpHIs gebruikt in neuronen25, glia26, schimmels27 , en28van de cellen van de plant. De combinatie van het potentieel voor cellulaire targeting van genetische constructies door middel van de GAL4/UAS expressie systeem15 en de fysiologische toegankelijkheid van de Drosophila MT maken dit een ideale voorbereiding voor onderzoek van de pHik verordening en epitheliale ion vervoer.

pHik verordening decennialang is onderzocht en is essentieel voor leven. De MT-voorbereiding biedt een robuust model om te leren van de Fysiologie van pHik verordening maar ook uitvoeren geavanceerde onderzoeken bij pHi verordening ex vivo en in vivo. Dit protocol beschrijft kwantificering van H+ verkeer over het basolaterale membraan van de epitheliale cellen van de Drosophila MT met behulp van de NH-4Cl pulse zuur laden techniek21, maar als pH-indicator is genetisch gecodeerd, kunnen deze methoden en hun theoretisch kader worden toegepast op elk preparaat vatbaar voor Transgenese en live-imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle stappen in dit protocol voldoen aan de richtsnoeren voor het gebruik van de dieren van de Mayo Clinic (Rochester, MN).

1. vliegen veehouderij

  1. Raise vliegt en set kruist volgens standaard veehouderij29.
    Opmerking: TL verslaggever expressie door het systeem GAL4/UAS is evenredig met de temperatuur en dus fokken temperatuur kan worden aangepast om te veranderen van expressie niveau. Terwijl hoge expressie niveaus vaak tot een betere signaal-/ ruisverhouding leiden wordt deze voorwaarde ook geassocieerd met verhoogde cytosolische en organellar aggregaten wanneer met behulp van GFP naar rood fluorescerende eiwit (RFP) fusion zoals pHerry10construeert, 30,31. Als samenvoeging onvermijdelijk is, kwantificering is het nog steeds mogelijk door het uitvoeren van punt kalibraties in elk experiment en normaliseren gegevens zodanig dat een verhouding van de fluorescentie van 1.0 komt met pHik 7.0 overeen (zie stap 7.4 nota over kalibratie hieronder).
  2. Set doorkruist homozygoot capaR-GAL432 mannen naar homozygoot UAS-pHerry10 maagdelijke vrouwtjes en homozygoot c724-GAL42 mannetjes met homozygoot UAS-pHerry Maagd vrouwen toe te staan van imaging van pHik in de belangrijkste cellen en Notti cellen van het MT, respectievelijk. Plaats 6 UAS-pHerry vrouwtjes met 3 mannen van de GAL4 in frisse flesjes van voedsel en verlof om te paren bij 28 ° C.
    Opmerking: Larven moeten blijken binnen 4 d en volwassenen zullen beginnen te eclose rond dag 10.
  3. Verzamelen van vrouwelijke vliegen op eclosion en gereserveerd voor de leeftijd voor 10 d bij 28 ° C.
    Opmerking: De timing van de experimenten kan worden aangepast overeen met eventuele beperkende gedrags assays (zoals de Ramsay secretie assay17,19) dat zal worden gecorreleerd aan intracellulair levende pH imaging. Mannelijke vliegen kunnen worden gebruikt maar tubuli van de vrouwtjes zijn vaak groter en robuuster.

2. voorbereiding van Poly-L-Lysine dia's.

  1. Een 40 x 20 mm randen tekenen met de pen van een hydrofobe PAP rond de top van standaard 75 x 25 mm dia's en zet opzij te drogen voor 15 min op RT. gebruik grote coverslips als de dia's niet compatibel zijn met imaging optica.
  2. Pipetteer 2 mL van 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) stockoplossing op elke dia en gereserveerd voor 1 h op RT.
  3. Verwijder overtollige PLL met een pipet. De oplossing in een flacon 50 mL conische voor toekomstig gebruik opslaan. Bewaren bij 4 ° C.
  4. Enige overige oplossing met een vacuüm lijn gecombineerd. De vacuüm lijn over het oppervlak van de hele dia om ervoor te zorgen dat geen oplossing op de dia's blijft worden uitgevoerd.
  5. De dia's gereserveerd voor 1 extra h vastgesteldop RT vóór gebruik. De dia's die op RT droog opslaan voor maximaal 1 maand in een standaard dia-boek.

3. voorbereiding van de ontrafeling van de schotel en glazen buizen

  1. 0,5 mL van elastomeer uithardende agent aan 4.5 mL van elastomeer basis in een 35 x 10 mm polystyreen petrischaal op RT tot een diepte van 5 mm. Mix met een wegwerp pipet tip toevoegen. Toestaan van elastomeer te genezen O/N op RT.
    Opmerking: Elastomeer moet duidelijk en vrij van bubbels. Verrekening van bubbels kan worden vergemakkelijkt door het houden van elastomeer platen in een vacuüm pot voor 10-15 min na het gieten.
  2. Houd een roerstaaf van 5 mm diameter tussen handen en smelt het midden van de staaf over een verlichte Bunsenbrander terwijl de uiteinden uit elkaar trekken. Als het glas trekken smelt meer snel tot een dunne (0,1 mm) en taps toelopende schacht (Figuur 1).
    Opmerking: Een hoek van 45 ° op de schacht is vaak nuttig bij de behandeling van de tubuli. Dit kan worden bereikt door het verlagen van enerzijds, zoals de schacht wordt getrokken (Zie Figuur 1).
  3. Breken de dunne as in het midden met de botte kant van een single-edged koolstofstaal scheermesje. Inspecteer het dunne uiteinde van de staaf onder een ontleden om ervoor te zorgen dat de pauze is schoon.

Figure 1
Figuur 1: Fabriceren glazen buizen voor de verwerking van de tubuli van de Malpighian.
A - E. Proces van verwarmings- en trekken een roerstaaf hoek te produceren een taper geschikt voor de behandeling van MTs. pijlen duiden de richting en de omvang van geweld moeten worden toegepast. F. foto van een hulpmiddel op de juiste manier verzonnen glas. Schaal bar = 10 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

4. bereiding van de oplossingen en perfusie systeem

Opmerking: Perfusie systemen verschillen door fabrikant. Dit protocol is gebaseerd rond een zwaartekracht-gevoed 8-kanaals open reservoir met een input stroom tarief regulator en een uitstroom vacuüm-gedreven, maar de wijze van montage die MTS zoals hier beschreven kunnen worden aangepast om te werken met elk perfusie-systeem.

  1. Voorbereiding van de volgende oplossingen:
    1. Aliquot Schneiders medium (40 mL in 50 mL conische flesjes) en bewaren bij 4 ° C.
    2. Bereiden van oplossingen (d.w.z. insect zoute Phosphate-Buffered (iPBS) en iPBS met NH4Cl) op RT desgewenst volgens tabel 1). Warme oplossingen aan RT vóór gebruik op dag van experiment.
      Opmerking: iPBS en iPBS met 40 mM NH4Cl kunnen worden bereid in grote hoeveelheden (1 L of meer) en opgeslagen bij 4 ° C.
    3. Bereiden van 8 ijkoplossingen in 500 mL volumes bij pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 en 9.0 als aangegeven in tabel 1 en winkel bij 4 ° C. Breng de pH van elke oplossing getitreerd wordt met N-methyl-D-glucamine (NMDG) en HCl.
    4. Op de dag van experimenten, 5 mL aliquots van ijkoplossingen aan RT warm en voorraad nigericin oplossing (20 mM dimethylsulfoxide (DMSO)) toevoegen om een eindconcentratie van 10 µM.
      Let op: De nigericin van de greep met handschoenen. Het behandelen van alle apparatuur die in contact met nigericin als wegwerp komt. Nigericin blijft op glas en plastic en biologische preparaten zal compromitteren als apparatuur wordt hergebruikt.
  2. Perfusie-systeem:
    1. Prime de perfusie-systeem door het invullen van alle reservoirs met ddH2O (Figuur 2). Open de kanalen een op een moment dat alle lijnen proximale aan de regulerende instantie van stroom, tarief te vullen.
      Opmerking: Het kan noodzakelijk zijn om lucht in de lijnen door te openen het vastgelopen kanaal en met behulp van een zuiger naar station stroom uit het reservoir zijn.
    2. Open 2 kanalen en toestaan van ddH2O om het uitlekken. Zodra de stuwmeren bijna leeg zijn, vul de eerste reservoir met iPBS en het tweede reservoir met NH4Cl-gepulseerde iPBS. Debiet ingesteld op maximale met de stroom tarief regulator en toestaan van elke oplossing te stromen voor 1 min te vullen van de distale lijnen, dan stoppen met de stroom (Figuur 2).
    3. Positie 2 sets van solderen klemmen "helping hands" het imaging Microscoop werkgebied. Plaats een klem aan weerskanten van de imaging platform.
    4. Zorgvuldig verwarmen de distale 0,5 inch van een stuk van capillaire glas (binnendiameter 1,5 mm, buitendiameter 0,86 mm, lengte 100 mm) over een bunsenbrander. Een 45 °-bocht maken waardoor het distale einde om te buigen door de zwaartekracht en het verwijderen van het glas van de vlam, zodra de gewenste hoek is bereikt. Herhaal dit proces met een tweede bagagestuk van capillaire glas.
    5. De gebogen glazen capillairen invoegen in de lijn van in-flow en vacuüm-verbonden uitstroom lijn, respectievelijk en monteer ze in de "helpende handen" ze worden uitgelijnd met de beeldvorming stadium van de Microscoop (Figuur 3).

Figure 2
Figuur 2: Perfusie systeem en Imaging configuratie.
Componenten die nodig zijn voor de fysiologische beoordeling van MT basolaterale vervoer functie door middel van gelijktijdige leven fluorescentie beeldvorming en snelle uitwisseling van de oplossing. Gas lijnen getoond zijn optioneel en mogelijk uitbreiding van experimenten voor de beoordeling van het HCO3- vervoer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Flow schema van perfusie toestellen voor NH4Cl Pulse experimenten.
Pijlen verbeelden stroom pad en ventiel schakelpunten. Oplossing beweegt uit reservoir model door zwaartekracht stroom en is ontleend aan het specimen kamer aan de afval maatkolf door vacuüm afzuigen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

5. dissectie van volwassen Drosophila Anterior Malpighian tubuli.

  1. Verzamelen van de dissectie-schotel en trok glasstaafje van sectie 3, een PLL beklede dia uit sectie 2, een zelfklevende perfusie-well scheidingslijn, vacuüm vet, een strook 4 x 2" van de sluiting van de film, #5 2 paar fijne pincet, en 40 mL aliquots van ijskoude Schneider's medium en RT iPBS.
  2. Verspreiden van vacuüm vet op de afdichtende tape en druk op de zelfklevende perfusie-well scheidingslijn op de tape onder jas met vet. De zelfklevende perfusie-well scheidingslijn afschilferen en plaats deze vet-side-down op de top van een PLL gecoate dia. Verwijder de perfusie-well scheidingslijn te laten individuele specimen wells getraceerd in hydrofobe vet.
  3. Plaats 200 µL van RT iPBS in de vet-omringd goed op de PLL gecoate dia en verplaats de dia onder de stereoscoop.
  4. Plaats UAS-pHerry/capaR-GAL4 vliegen in een lege fly ampul en anesthetize ze op het ijs gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Deze methode van anesthesie, in tegenstelling tot CO2, zorgt ervoor dat de vliegen niet doen uitdrogen.
  5. Giet ijskoude Schneiders medium in de ontleden schotel en fijne pincet gebruiken voor het overbrengen van een enkele narcose vrouwelijke vlieg in de schotel onder een ontleden stereoscoop.
  6. Houd de vlieg door de thorax met een pincet en gebruik de andere om zachtjes greep de posterior van de buik. Trek de achterste van het vliegen met behulp van de verlostang Kortom, bewuste bewegingen open. Zodra de methaanproductie zichtbaar is, greep het distale einde en vrij van de darm en MTs van de onderliggende tracheoles door te trekken de methaanproductie uit de buurt van het lichaam door repetitieve, korte sleepboten.
    Opmerking: De anterieure en posterieure MTs worden zichtbaar wanneer zij voldoen aan de kruising van de middendarm en methaanproductie via de urineleider. Het eerste paar van MTs als vrije zal waarschijnlijk worden de achterste tubuli zoals ze de methaanproductie omcirkelen. Dit kunnen worden genegeerd (figuur 4A).
  7. Snuifje uit de voorste MTs op de ureter met een fijne Tang zodra de tweede reeks van MTs is gratis van de buik. Dit zal de anterior MTs scheiden van de darm en sluit de urineleider.
  8. De gratis anterior MTs met de getrokken roerstaaf halen door te schuiven van de staaf onder de urineleider, zodanig dat de tubuli aan beide zijden vallen. Til de MTs recht omhoog uit de oplossing.
  9. Draai het glazen staafje zodanig dat de MTs urineleider de hand wordt gehouden aan de onderkant van de staaf en de urineleider recht naar beneden in de dia verschijnt verlagen. Brengt de urineleider en verzegel de distale uiteinden van de MTs door te drukken op de urineleider down op het glasplaatje (figuur 4B). Niet manipuleren de MTs meer dan nodig. De MTs moeten met de urineleider verankerd aan de dia omhoog zweven in de oplossing.
  10. Gebruik het mooie einde van het glazen staafje voorzichtig vegen elke zaadvormende over het oppervlak van de dia. Brace de staaf tegen de dia om te voorkomen breken de zaadvormende en schuif de staaf over de bovenkant van de zaadvormende, verhuizen DISTAAL naar proximaal, de volledige lengte van elke zaadvormende hechten aan het oppervlak van de PLL beklede dia (figuur 4C).
  11. Plaats de zelfklevende perfusie-well scheidingslijn weer op de dia om te vormen van een kleine vloeistof gevulde ruim de gemonteerde zaadvormende.
  12. Plaats het model in het werkgebied van de Microscoop. Plaats de instroom en uitstroom van haarvaten over de inlaat en uitlaat opening van de perfusie goed, respectievelijk.
    Opmerking: De goed scheidingslijn kan worden gebleven als een open perfusie-kamer is gewenst. In dit geval kunnen de instroom en uitstroom haarvaten aan weerszijden van een imaging goed worden uitgelijnd.

6. bevestiging van Imaging Protocol en zaadvormende gezondheid

Opmerking: Dit protocol wordt uitgevoerd op een omgekeerde breed-gebied epifluorescerende Microscoop met GFP (SEpH) en RFP (mCherry) filter sets (470/40 nm excitatie (ex-) 515 nm longpass emissie (em), 500 nm dichroïde en 546/10 nm ex, 590 nm longpass em, 565 nm dichroïde), een 10 X / 0,45 lucht objective, een monochromatische camera voor live-Fotolader en beeldbewerkingssoftware. Het protocol kan worden aangepast voor elke rechtop of ondersteboven Microscoop met geautomatiseerde filter schakelen tussen GFP en RFP optica en afbeelding acquisitie software, hoewel de optimale belichtingstijden, lichtintensiteit en weggooien van parameters zal variëren. In alle analyse, moet de intensiteit van de fluorescentie worden geanalyseerd als gemiddelde pixel intensiteit in de regio van belang (ROI), nadat de achtergrond aftrekken in elk kanaal met behulp van een ROI met bevat geen fluorescentie grenzend aan het signaal ROI.

  1. Inschakelen van de Microscoop, lichtbron en imaging systeem.
  2. Open bijbehorende imaging software.
  3. Kijk door de ooglens en focus handmatig aan te passen totdat het lumen van de MT duidelijk zichtbaar onder doorvallend licht is.
  4. Klik op het tabblad van de "Overname" in de software van de analyse van de afbeelding en selecteer "2 x 2" in het "Weggooien" pull-down menu in de sectie 'Overname modus'.
  5. Een neutrale-opaciteitsfilter van 5% in het licht pad naar verlichting lichte verminderen en minimaliseren photobleaching invoegen.
  6. Klik op het GFP (SEpH) kanaal in het menu "Kanalen", en "Live" om te zien hoe het fluorescent signaal via de camera.
  7. Pas de schuifregelaar voor "Tijd" om in te stellen van de blootstellingstijd zodanig dat de helderste pixelwaarden in het histogram intensiteit ongeveer 40% van de maximale waarde zijn en klik op 'Stop' om te stoppen met de verlichting.
  8. Herhaal stappen 6.6-6,7 in de RFP (mCherry) kanaal en de aanwezigheid van de verwijde eerste segment van de voorste MT bevestigen en het ontbreken van cytosolische mCherry aggregaten (indicatief van weefselschade of overexpressie) (Figuur 4 d).
    Opmerking: De verwijde segment moet duidelijk als het is het meest proximale segment van de zaadvormende en de diameter van de innerlijke lumen van dit segment ~ 20 µm groter dan die van de aangrenzende overgangsperiode segment is. 2 x 2 pixel weggooien is vaak voldoende maar kan worden verhoogd om het verder verminderen van de intensiteit van de vereiste verlichtingssterkte. Typische blootstelling tijden zijn tussen 150 & 800 ms/kanaal. Gebruik zo weinig licht mogelijk te minimaliseren photobleaching. Minimaliseren van photobleaching is essentieel voor het gebruik van dual-fluorophore indicatoren zoals pHerry zoals de twee fluorophores kan zelfstandig, bleken dus ongeldig te laten verklaren elke verhouding kalibratie.
  9. Een time-lapse imaging protocol inschakelen door te klikken op het selectievakje "Tijdreeks".
  10. De "duur" in het pull-down menu in de "Tijdreeks" sectie 10 min en de 'Interval' schuif op 0 als u wilt instellen met een maximale beeldsnelheid van de overname de totale opnametijd aanpassen. Een percentage van de totale overname van 0.2 Hz is vaak voldoende.
  11. Controleer zowel de GFP (SEpH) en RFP (mCherry) vakken in de sectie "Kanalen".
  12. Open de iPBS lijn van de perfusie-systeem door het activeren van de daarvoor bestemde afsluiters controller en start het imaging protocol door te klikken op "Start Experiment." Na 1 minuut, overschakelen naar NH4Cl pulse oplossing voor 20 s door de daarvoor bestemde afsluiters openen en sluiten van de iPBS-lijn, dan terug naar de iPBS door te sluiten van de NH-4Cl lijn en heropening van de iPBS klep. Het volledige imaging protocol om te voltooien voordat u stopt de perfusie-systeem toestaan.
    Opmerking: Time-lapse analyse moet onthullen een stabiele mCherry signaal en een signaal SEpH die toeneemt in aanwezigheid van NH4Cl, Lest op wassen, en geleidelijk herstelt.
  13. Een 2-punts-kalibratie uit te voeren.
    1. De goed scheidslijn door peeling het uit de buurt van de onderliggende dia verwijderen en verwijder de perfusie haarvaten en klemmen van de beeldvorming goed.
    2. 200 µL kalibratie iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericin) van toepassing op de beeldvorming goed met een 200 µL pipet. De oplossing van de beeldvorming goed met de pipet te verwijderen, vervolgens vervangen door een andere 200 µL van kalibratie-oplossing. Herhaal dit proces 4 keer om totaaloplossing uitwisseling te waarborgen.
    3. Incubeer de voorbereiding in de kalibratie-oplossing voor 30 min vóór imaging. Herhaal het imaging protocol gebruikt dezelfde parameters bepaald in stappen 6.6-6.11, met de wijziging van slechts 1 min van beeld vastleggen.
      Opmerking: De perfusie systeem en de haarvaten zijn niet nodig in deze stap en moet niet worden gekoppeld aan de beeldvorming ook om te voorkomen dat bloot de haarvaten naar nigericin.
    4. 200 µL kalibratie iPBS (pH 9.0, 10 µM nigericin) aan de beeldvorming goed met een 200 µL pipet toevoegen. De oplossing van de beeldvorming goed met de pipet te verwijderen, vervolgens vervangen door een andere 200 µL van kalibratie-oplossing. Herhaal dit proces 4 keer om totaaloplossing uitwisseling te waarborgen.
    5. Incubeer de voorbereiding in de tweede kalibratie-oplossing voor 10 minuten vóór imaging. Herhaal het imaging protocol zoals in stap 6.13.3.
    6. Bekijk de stack van de vastgelegde afbeelding in software van de analyse van het beeld om te bevestigen dat er geen pixels in elk kanaal zijn verzadigd door te klikken op "Bedoel ROI" en bladeren al de afbeeldingsstapel met de schuifregelaar om "Frame" met inachtneming van die geen waarden gemeld in het histogram van de intensiteit de maximale waarneembare waarde wordt bereikt. Als alle frames pixels die het bereiken van de maximale detecteerbare intensiteit bevat, verminderen de blootstelling tijd of verlichting intensiteit en herhaal punt 6.
      Opmerking: Zodra vastgesteld imaging parameters tussen experimenten of kalibratie niet wijzigen tenzij punt kalibraties moeten worden gebruikt in elk preparaat (zie stap 8.3).
  14. Analyseer de afbeeldingsstapel u wilt uitzetten van fluorescerende intensiteit en fluorescentie ratio (SEpH/mCherry) als een functie van de tijd.
    1. Klik op "Bedoel ROI" en selecteer het gereedschap Vrije vorm. Klik met de linkermuisknop op te sporen een ~ 50 µm lengte van MT. houden Klik met de rechtermuisknop om te voltooien met het tekenen van de ROI, herhaal dan in een gebied grenzend aan het MT om te definiëren een achtergrond ROI (figuur 5A).
    2. Klik op "Gemiddelde intensiteit" onder "Metingen." Een inhoudsopgave intensiteitswaarden maken door te klikken op "exporteren > tabel > maken."
    3. Klik op het pictogram van de tandrad configuratie en deselecteert u alle parameters staan, behalve "Tijd" en "Mean intensiteit." Met de rechtermuisknop op het tabblad voor de zojuist gemaakte gegevenstabel, selecteer "Save As" en de gegevens exporteren als een CSV-bestand.
      Nota: Soortgelijke metingen kunnen ook worden gemaakt met behulp van vrije software zoals ImageJ.
    4. Open een werkblad tabel en de tabel importeren door te selecteren op het tabblad "Gegevens" gevolgd door "Van de tekst".
    5. Gebruik de functies in het werkblad wilt aftrekken van de achtergrond van de SEpH intensiteit vanaf de SEpH signaal intensiteit op elk tijdstip. Herhaal dit proces voor het mCherry signaal.
    6. Uitzetten van de intensiteit van elk kanaal als een functie van de tijd door te selecteren de kolommen die de tijd en achtergrond-gecorrigeerde intensiteit die gegevens bevat en vervolgens te klikken op "invoegen > Scatter (Charts) > spreidingsdiagram met rechte lijnen" (figuur 5B).
    7. Werkbladfuncties gebruiken voor het berekenen van de verhouding van de fluorescentie SEpH/mCherry op elk tijdstip.
    8. Perceel fluorescentie verhouding als functie van de tijd door te selecteren de kolommen die de tijd en de verhouding die gegevens bevat en vervolgens te klikken op "invoegen > Scatter (Charts) > spreidingsdiagram met rechte lijnen" (figuur 5C).

7. volledige kalibratie van pHerry in Malpighian tubuli Ex Vivo.

  1. Ontleden en monteren van een nieuwe reeks van anterior MTs zoals beschreven in sectie 5.
  2. Uitwisseling iPBS voor kalibratie iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericin) zoals beschreven in stap 6.13.2. Incubeer gedurende 30 min.
  3. Zoek het MTs en verzamelen van paren van SEpH/mCherry beelden zoals beschreven in stappen 6.1-6.11. De oplossing wordt vervangen door een ander bestand van kalibratie iPBS zoals beschreven in stap 6.13.4, wacht 10 minuten en beeld weer. Herhaal dit proces totdat de SEpH/mCherry verhouding heeft zijn beeld in alle oplossingen. Verkrijgen van pH 9.0 beelden duren zoals het specimen zelden van hoge pH herstelt.
  4. Plot fluorescentie verhouding van SEpH aan mCherry van kalibraties in acht exemplaren als een functie van opgelegde pHik zoals beschreven in stap 6.14.9. Grootte van de kalibratiegegevens met een Boltzmann-curve te verkrijgen van de volledige kalibratiefunctie volgens vergelijking 1 (figuur 5D). Als gegevens inconsistent zijn, kalibratie sets van elk specimen genormaliseerd zodat een fluorescentie-ratio van 1.0 komt met de pHi 7.0 overeen uitzetten en opnieuw analyseren (figuur 5E).
    Opmerking: Als het laatste proces noodzakelijk is individuele experimenten moet hun eigen interne punt kalibraties33 (Zie kwantificering onderstaande procedure (stap 8.3)).
  5. Vergelijking 1
    Equation 1
    Waar R = SEpH/mCherry verhouding en een1, een2 xoen dx zijn kromme montage-parameters die minimale fluorescentie verhouding, maximale fluorescentie verhouding, pKeenen breedte van de functie respectievelijk. x-o = schijnbare pKeen van pHerry, die van 7.1 tot 7.4 afhankelijk van het celtype en de kalibratie van de exacte voorwaarden variëren kan.

8. kwantificering van basolaterale zuur extrusie van Ex Vivo Malpighian zaadvormende epitheel.

  1. Afbeelding pHerry-uiten Notti cellen en pHerry-uiten hoofdsom cellen tegelijk.
    1. Ontleden van anterior MTs uit een vlieg UAS-pHerry/capaR-GAL4 , zoals beschreven in sectie 5, maar niet overdragen MTs van het ontleden Schneiders medium aan de imaging goed.
    2. Ontleden anterior MTs uit een vlieg UAS-pHerry/c724-GAL4 in de dezelfde ontleden schotel met behulp van de procedure die wordt beschreven in sectie 5.
    3. Breng de 2 sets van MTs in de zelfde imaging goed zoals beschreven in stappen 5,8-5.11.
      Opmerking: Wanneer het vegen van de takken van de MTs neer aan de dia, plaats de MTs van de UAS-pHerry/c724-GAL4 en de tubuli UAS-pHerry/capaR-GAL4 in de buurt van elkaar zodat pHerry-uiting geven aan hoofd- en Notti cellen kunnen worden gevisualiseerd in de dezelfde veld ( Figuur 6A).
  2. Toepassing van de NH-4Cl prepulse zoals beschreven in stap 6.12.
    Opmerking: Als consistente kalibratie (figuur 4B) kan niet worden bereikt, voert u een punts kalibratie door pHi op 7.0 aan het einde van elk experiment met kalibratie iPBS (pH 7.0, 10 µM nigericin, 30 min incubatie) na de lijm perfusie-well divider en de perfusie-apparatuur zijn verwijderd.
  3. Kalibreren van sporen van Notti en belangrijkste cellen van verschillende MT-segmenten (met behulp van de verhouding tussen de absolute of genormaliseerde voorkomend) met vergelijking 2 en analyseren van de herstelfase na NH4Cl intrekking door toepassing van exponentiële afname functies met behulp van statistische analysesoftware en wijzend op de verval-constante (τ) (figuur 6B).
    Vergelijking 2
    Equation 2
    Waar R = SEpH/mCherry verhouding en een1, een2 xoen dx zijn kromme montage parameters bepaald door kalibratie in stap 7.4 (vergelijking 1).
    1. Berekenen zure extrusie (JH +, Zie vergelijking 3) als een functie van de pHik meetvariaties rusten pHik en zuur laden tussen preparaten34. De exponentiële functies afgeleid in stap 8.3 gebruiken voor het berekenen van de afgeleide van pHik met betrekking tot tijd in elk tijdsinterval.
      Vergelijking 3
      Equation 3
    2. Berekenen van de intrinsieke buffercapaciteit (βi; Vergelijking 4) van het cytosol bij de pHik vanaf het begin van elk interval in stap 8.3.1 gebaseerd op bestaande literatuur (Zie vergelijking 4).
      Opmerking: In Drosophila, komt de meest grondige karakterisering van βik larvale motorische zenuw terminals €35 en deze gegevens kan worden verondersteld te houden voor MT cellen in de afwezigheid van de andere beschikbare gegevens.
      Vergelijking 4
      Equation 4
    3. Berekent het product van βT (uit stap 8.3.2)en departementik/dt (uit stap 8.3.1) om te bepalen JH + (vergelijking 3).
      Opmerking: In nominaal bicarbonaat-vrije oplossingen zoals die welke in dit protocol, bicarbonaat afkomstige buffercapaciteit (β-b) wordt ervan uitgegaan dat ~ 0 mM. Totaal buffercapaciteit (βT) is de som van βik enβben dus βik = βT bij gebrek aan HCO3-/CO236.
    4. Plot JH + als een functie van de pHik aan het begin van elk tijdsinterval zoals beschreven in stap 6.14.9.
    5. Exponentiële afname functies toepassen op het gedeelte van alle datasets die overlappen in pHik met behulp van statistische analysesoftware. Vergelijk tarieven van de verandering van de resulterende functies te vergelijken zure extrusie tarieven tussen cellen en MT segmenten (Figuur 6 c).
      Opmerking: De meest geschikte functie gebruikt voor curve-fitting wellicht niet altijd een exponentiële honkslag. Andere functies kunnen worden vervangen als ze de goedheid van fit verbeteren.
    6. Berekenen van zuur flux (Zie vergelijking 5) als een functie van de pHik meetvariaties Celgrootte en vorm.
      Vergelijking 5
      Equation 5
      Opmerking: Cel dimensies worden rechtstreeks gemeten bij afbeeldingen of kunnen worden benaderd. Belangrijkste cellen kunnen worden weergegeven als de helften van een holle buis met de volgende afmetingen: inwendige diameter 24 µm; buitendiameter 48 µm; hoogte 50 µm. overgangsmaatregelen Notti cellen zijn variabel maar ruwweg kunnen worden weergegeven als cilinders met hoogtes van 50 µm en een diameter van 10 µm. Zie de laatste alinea van Vertegenwoordiger resultaten hieronder.
    7. Exponentiële afname functies toepassen op het gedeelte van alle datasets die overlappen in pHik met behulp van statistische analysesoftware. Vergelijk tarieven van de verandering van de resulterende functies te vergelijken zure stromen tussen cellen en MT segmenten (figuur 6D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gezonde weefsels en correcte identificatie van anterior MTs zijn essentieel voor het succes van dit protocol. Tijdens de dissectie, moet worden gewaakt om niet direct touch de MTs en enige greep zal hen door de ureter als aangrijpend de MTs rechtstreeks leiden tot breuk (figuur 4Avan- B). Bij MTs zijn geveegd plat op de dia, de tubuli moeten zo weinig mogelijk worden aangeraakt en overtollige beweging vermeden als dit zal schade aan de epitheliale laag van eencellige (figuur 4C). Goed ontleed zal anterior MTs gelijkmatige verdeling van zowel rode als groene fluorescentie via het cytosol van epitheliale cellen en morfologisch verschillende zaadvormende segmenten tonen. Tubuli beschadigd door onjuiste perfusie of samenvoeging van rode fluorescentie met geen gekoppelde groene aggregaten stroompiek wordt weergegeven, en posterieure MTs zal tonen uniforme morfologie van het proximale blinde einde aan de distale urineleider (Figuur 4 d) . 

Werking van de pHerry moet worden bevestigd hoewel fysiologische evaluatie evenals morfologie. De meest doelmatige methode van bevestiging van de juiste pH-sensing is toe te passen van een NH-4Cl puls. Onder deze omstandigheden de groene SEpH signaal moet het verslag van de verwachte pH-veranderingen (een stijging van de pHik tijdens de pols als NH3 treedt de cel, een geleidelijke daling tijdens de pols als NH4+ via K+ vervoerders binnenkomt en kanalen, en een snelle verzuring en geleidelijk herstel bij NH4Cl terugtrekking,21, terwijl het rode mCherry signaal zou constant moeten blijven (figuur 5A- B). De omvang van de wijzigingen in het SEpH signaal zal variëren met protocol en cell type, maar het mCherry signaal moet stabiel zijn in alle gevallen. Wijzigingen in het mCherry signaal tijdens individuele experimenten aangeven bewegingsartefacten of progressieve generatie sensor aggregaten vanwege celbeschadiging. De laatste kwantificering van pHik zal voorkomen en moet worden vermeden. Na het voltooien van de NH-4Cl puls is het belangrijk om een 2-punts-kalibratie uit te voeren (Calibration iPBS, pH 7.4 en 9.0, 10 µM nigericin) bevestigen een rust pHik in de buurt van 7.4 en ervoor zorgen dat de huidige imaging parameters niet tot verzadiging van leiden fluorescentie detectie wanneer fluorescentie wordt gemaximaliseerd bij pH 9.0 (figuur 5C). Als rust pH aanzienlijk lager dan 7,4 is, moet het protocol worden herhaald met gezonde MTs; en als er verzadiging optreedt met een pH van 9,0, het protocol moet worden herhaald met lagere licht intensiteit of blootstelling tijd. Zodra voldoende imaging parameters worden bepaald, mag ze niet worden gewijzigd tussen experimenten of kalibraties als de absolute fluorescentie ratio's moeten worden gebruikt. Hoewel de aard van de pseudo-ratiometric van pHerry een methode van beweging correctie in preparaten die gevoelig zijn voor beweging of veranderingen in de diameter van de cel bieden kan, de absolute kwantificering van pHik vereist volledige systematische correlatie van de pHerry SEpH / mCherry in verhouding tot pHik via de nigericin/hoge K+ techniek. De kalibratie van pHerry in gezonde preparaten moet produceren consistente kalibratiekrommen met een schijnbare pKeen van 7.1-7.4 afhankelijk van de cel type en kalibratie voorwaarden (figuur 5D). Voor preparaten in welke mCherry samenvoeging onvermijdelijk is, normalisatie van de verhouding tussen waarden zodanig dat een verhouding van de fluorescentie van 1.0 komt met de pH overeen moetik 7.0 vergelijkbare resultaten (figuur 5E) opleveren. Als punt kalibraties en genormaliseerde curven worden gebruikt, imaging parameters kan worden geoptimaliseerd voor elk preparaat. 

Gekalibreerde pHik sporen kunnen worden gebruikt om te vergelijken reguleringsmechanisme van het pH tussen celtypes. De GAL4/UAS expressie systeem in Drosophila kan worden gebruikt om uit te drukken van de pHerry in de belangrijkste cellen en Notti cellen van de voorste MT (figuur 6A). pHik verordening kan worden beoordeeld door zuur-laden cellen met NH4Cl pulsen en kwantificeren van het percentage pHik nuttige. Dit kan worden bereikt door het aanbrengen van exponentiële functies aan de herstelfase in verschillende experimentele omstandigheden uitpakken van de verval-constante (τ) als cellen met een snellere H+ efflux verschijnt een sneller herstel (en dus lagere waarden van τ). Op basis van deze analyse, lijken Notti cellen van de MT te hebben meer robuuste zure extrusie dan belangrijkste cellen (figuur 6B). Deze analyse zal houden zo lang als de rust pHik, mate van zuur laden en buffercapaciteit lijken tussen experimentele groepen. Nochtans, wanneer niet aan deze voorwaarden wordt voldaan, is het noodzakelijk ter verantwoording voor de observatie dat intrinsieke buffercapaciteit van het cytosol (βi) van veel cellen zelf is pH-afhankelijke35,37,38 en dus het mutatietempo van pHik bij verschillende pHi kan niet direct vergelijkbaar. In dergelijke gevallen aanpassen Exponentiële krommen aan de zure extrusie fase na die een NH-4Cl puls en vooraf bepaalde ramingen van de intrinsieke buffercapaciteit (βi) kunnen worden gebruikt tot het uitzetten van de koers van de zure extrusie (JH +) als een functie van pHik en gecompenseerd tarief van zure extrusie (vergelijkingen 3 & 4) te bepalen. Zodra de verschillen in zuur laden en rusten pHik worden verantwoord, want het is duidelijk zure extrusie in belangrijkste cellen van de overgangsperiode segment groter zijn dan die van Notti cellen (Figuur 6 c). Terwijl de boeiende, deze analyse niet verhelpt dat gemeten pHik is een functie van volume terwijl zure extrusie in het plasma-membraan een functie van de oppervlakte membraan is. Verdelen JH + door het oppervlak volumeverhouding van de cel van belang zal opleveren waarden in Mol zure equivalenten per oppervlakte-eenheid per tijdseenheid (vergelijking 5), zodat de correctie voor verschillen in de celgrootte en morfologie. Ongeveer twee belangrijkste cellen omvatten de omtrek van de MT in de overgangsperiode segmenten en dus de afzonderlijke cellen als de helft van een buis (buitendiameter 48 µm, inwendige diameter 24 µm; hoogte 50 µm) kunnen worden gemodelleerd. Notti cellen zijn kleiner en zijn meestal bar-vormige in de overgangsperiode segment van de MT-2. Precieze kwantificering van oppervlakte en volume is moeilijk maar zelfs conservatief benaderingen van overgangsmaatregelen Notti cel vorm (cilinder met een hoogte van 50 µm en een diameter van 10 µm) wijzen op een oppervlak volumeverhouding ten minste 2 x die van de belangrijkste cellen. Dit rekening houdend met blijkt dat de zure flux van Notti cel aanzienlijk lager dan die van overgangsmaatregelen belangrijkste cellen ligt, en in feite die van eerste segment belangrijkste cellen (figuur 6D benadert).

Figure 4
Figuur 4: Dissectie van volwassen Drosophila Anterior Malpighian tubuli.
A. Schematische weergave van anterior MT verwijdering met 2 paar fijne pincet in gekoeld Schneiders medium. "A. zaadvormende" = Anterior MT. "P. zaadvormende" = posterieure MT. B. Proces van het ophalen en montage geëxtraheerd MTs met dunne glazen buizen. C. proces van naleving van de volledige lengte van MTs uitgepakt naar een dia voor imaging en fysiologische beoordeling. D. vertegenwoordiger widefield beelden van de SEpH (470/510 nm ex / em) en mCherry (556/630 nm ex / em) componenten van UAS-pHerry aangedreven door capaR-GAL4 beeltenis van gezonde anterior MTs, anterior MTs beschadigd door onvoldoende doorbloeding, en geïdentificeerd posterieure MTs. opmerking dat gezonde anterior MTs een duidelijke verwijde blind eerste segment, een vernauwde overgangsperiode segment met relatief meer expressie van UAS-pHerry wanneer gedreven door capaR-GAL4, en een distale main weergeven segment. MTs display merkbaar aggregaten van mCherry fluorescentie met geen overeenkomstige SEpH fluorescentie beschadigd. Posterieure MTs zijn uniform in diameter met geen morfologisch verschillende segmenten. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Validatie en kalibratie van pHerry in Malpighian tubuli.
A. vertegenwoordiger widefield beelden van de SEpH (470/510 nm ex / em) en mCherry (556/630 nm ex / em) componenten van UAS-pHerry aangedreven door capaR-GAL4 beeltenis van gezonde anterior MTs. "ROI" merken signaal regio van belang. "BG" merken gebied op de achtergrond van belang die vervolgens van het signaal ROI in hetzelfde kanaal afgetrokken werd. Schaal bar = 50 µm. B. De veranderingen van de relatieve fluorescentie in SEpH en mCherry signalen van pHerry in reactie op een 20 s 40 mM NH4Cl puls. Merk op dat het mCherry signaal stabiel is, terwijl het signaal SEpH een karakteristiek toename tijdens de pols geeft (indicatieve van alkalization, dat wil zeggen verhoogde pHik) en een scherpe daling na wassen (indicatief van verzuring, d.w.z. verminderd pHik). C. fluorescentie verhouding van pHerry (SEpH/mCherry) berekend op basis van gegevens in B voorzien van aanvullende gegevens na een incubatieperiode van het 30 min in kalibratie iPBS (pH 7.4 en 9.0, 10 µM nigericin, 130 mM K-+). D. kalibratiekromme opgebouwd uit absolute pHerry verhouding (SEpH / mCherry) als een functie van pHik tijdens blootstelling aan kalibratie iPBS gebufferd naar een van de acht pH-waarden opgelegde. Grijze cirkels zijn afzonderlijke waarden vorm 8 preparaten. Zwarte vierkantjes en bars zijn gemiddelde ±SD. Curve is Boltzmann pasvorm. E. dezelfde gegevens zoals in D genormaliseerd dergelijke die verhouding van de fluorescentie bij pH 7.0 is 1.0. Curve wordt gewijzigd sigmoïdale curve aanpassen (zie stap 7.4, vergelijking 1). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Kwantificering van zure extrusie in Malpighian zaadvormende epitheel.
A. Widefield beeld van SEpH fluorescentie (van pHerry) in de belangrijkste cellen op de voorste MT (links, gedreven door capaR-GAL4 bestuurder) en Notti cellen van de voorste MT (rechts, aangestuurd door c724-GAL4). Merk op dat Notti cellen bar-vormige in het eerste segment, variabele in de overgangsperiode segment zijn, en weergeven van de verschillende cellulaire projecties in het belangrijkste segment. Schaal bar = 100 µm. B. Gekalibreerd pHik veranderingen in reactie op een 20 s 40 mM NH4Cl puls in de regio's van belang aangeduid in een (belangrijkste cellen van de overgangsperiode segment, belangrijkste cellen van het eerste segment en Notti cellen van de overgangsperiode segment). Onderbroken curven duiden één exponentiële past toegepast op de zure herstelfase na NH4Cl terugtrekking waarvan aangegeven verval (τ)-constante waarden zijn afgeleid. C. zure extrusie tarief (JH +) uitgezet als een functie pHi afgeleid van de exponentiële gezien in B. past Zie stap 8.3.1 voor JH + berekening (vergelijking 3). Onderbroken curven zijn exponentiële past toegepast op ieder waarnemingspunt gegevens binnen het gebied van overlappende pHik aangeduid met het grijze vak. D. zure flux uitgezet als een functie pHi afgeleid van de exponentiële waarde gezien in B en vergelijking 5past. Onderbroken curven zijn exponentiële past toegepast op ieder waarnemingspunt gegevens binnen het gebied van overlappende pHik aangeduid met het grijze vak. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

iPBS NH4Cl Pulse iPBS Kalibratie-iPBS
NaCl 121.5 81,5 0
NH4Cl 0 40 0
KCl 20 20 130
Glucose 20 20 20
Buffer HEPES; 8.6 HEPES; 8.6 MES, HEPES of kranen; 8.6
NaHCO3 10,24 10,24 0
NaH2PO4 (1 H2O) 4.5 4.5 0
NMDG 0 0 30,5
pH 6,8 6,8 Varieert
Osmolariteit 350 ±5 350 ±5 350 ±5

Tabel 1: Experimentele vliegen oplossingen.
iPBS oplossingen zijn bereid bij kamer temperatuur en pH titratie met HCl en NaOH wordt ingesteld. Kalibratie-oplossing getitreerd wordt met gesteld HCl en NMDG. Buffer van kalibratie-oplossing op basis van de gewenste pH is gevarieerd [2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) voor pH = 4.0-6.0; 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) voor pH = 6.5-7.5; N-[tris (hydroxymethyl) methyl] -3-aminopropanesulfonic zuur (kranen) voor pH = 8.0-9.0]. Alle waarden in mM, behalve (unitless) pH en de osmolaliteit (mmol/kg). Stock nigericin in DMSO wordt toegevoegd aan de ijkoplossingen met een eindconcentratie van 10 µM vlak voor gebruik.

GEpHI Excitatie (nm) Emissie (nm) pKeen Notities
Superecliptic pHluorin (SEpH)11 395, 488 530 7.2 Grote lineaire bereik, grote vouw (50 x) stijging van de pH-gevoelige fluorescentie in lineaire scala
PT GFP42 390, 475 540 7.3 Gevalideerd voor gebruik in plantencellen
Superecliptic pHluorin - mCherry fusion31 488, 556 530, 620 7.2 Produceert ongepaarde mCherry aggregaten in sommige cellen
ClopHensor40 488, 545 525, 590 6,8 pH en Cl- -sensor. Bijgewerkte ClopHensorN30 variant geeft minder aggregatie in neuronen
pHerry10 488, 556 530, 620 7.2 Bijgewerkte SEpH-mCherry fusion met linker van ClopHensor
mNectarine44 558 578 6,9 Correctie voor photobleaching is vaak noodzakelijk
pHluorin245 395, 475 509 6,9 Variant van Ratiometric pHluorin12
pHred47 440, 585 610 7,8 Bijgewerkte variant van lange-Stokes shift mKeima49, compatibel met FLIM NIR 2-photon imaging
pHuji43 566 598 7.7 Variant van mApple; lager dan verwachte pH gevoeligheid in sommige cellen
pHtomato46 550 580 7,8 Gevalideerd voor het bijhouden van vesiculaire endocytose, slechte cytocolic pH gevoeligheid
pHoran443 547 561 7.5 Verbeterde pH-gevoelige oranje fluorescent proteïne
SypHer-248 427, 504 525 8.1 Helderder variant van ratiometric SypHer51, oorspronkelijk voor mitochondriale metingen

Tabel 2: Lijst van gepubliceerde cytosolische GEpHIs
Excitatie maxima, emissie-maxima en schijnbare pKeen waarden zijn schattingen en kunnen variëren afhankelijk van de expressie systeem, beeldvormende techniek en kalibreringsmethode. FLIM = fluorescentie levensduur microscopie imaging. NIR = nabij infrarood.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het succes van kwantificering van pHik in Drosophila MTs hangt volledig af van de gezondheid van uitgepakte MTs en de kwaliteit van de montage en dissectie (Figuur A - C). De zorgvuldige behandeling van weefsel als is beschreven dus noodzakelijk. Dia's vers gecoat in PLL aanzienlijk steun MT montage als ze de neiging om veel meer lijm dan dia's die eerder zijn blootgesteld aan oplossing. Zorgvuldige montage zal ook helpen bij de identificatie van de verschillende segmenten van de MT (Figuur D). Gezonde MTs vergemakkelijken kalibratie van pHerry en functionele beoordeling door vermindering van de mCherry aggregatie en opbrengst veel consequenter kwantificering van zure extrusie, respectievelijk. In sommige gevallen is het vermijden van mCherry aggregatie niet mogelijk omdat de experimentele omstandigheden kunnen inherent MT epitheel beschadigen of produceren van aanzienlijk overmatige uitdrukking van de fluorescerende verslaggever. In deze gevallen een pseudo-ratiometric kalibratie genormaliseerd zodat fluorescentie verhouding 1.0 komt met pHik 7.0 overeen, en punt kalibraties kwantificering (Figuur E toestaat). Zorg moet worden genomen bij het uitvoeren van punt kalibraties om te voorkomen dat de permanente elementen van de beeldvorming en perfusie systemen voor nigericin als de ionophore bloot zal houden aan glas en plastic. Zelfs pseudo-ratiometric kalibratie is niet mogelijk voor omstandigheden waarin een experimentele manipulatie cellulaire schade tijdens een experiment induceert, d.w.z. deze schade zal veroorzaken een schijnbare progressieve toename van mCherry fluorescentie gedurende het gehele experiment. In deze gevallen later het SEpH fluorescentie signaal kan worden gebruikt met een genormaliseerde kalibratiekromme en wijs kalibraties, met het voorbehoud dat de beeldvorming niet langer voor bewegingsartefacten en focale verschuivingen corrigeren zal.

GEpHIs voeren verschillende algemene beperkingen in vergelijking met kwantificering van pHik met fluorescente kleurstoffen. Kleurstof retentie kan worden gebruikt als een indicator van de membraan integriteit en cell gezondheid39, maar geen gelijkwaardige assay GEpHIs gebruiksklaar is. Als zodanig is dat de gezondheid van de voorbereiding moet worden gecontroleerd door onafhankelijke middelen als celbeschadiging is voorspeld te beschamen resultaten. GEpHIs toestaan potentieel beeldvorming van minimaal gestoord in vivo voorbereidingen maar weefsel integriteit inherent beperkt experimentele manipulaties en wijs kalibraties niet onmogelijk kan maken. Een andere specifieke beperking die inherent zijn aan het gebruik van pHerry en andere cytosolische dual fluorophore pH indicatoren (zoals ClopHensor40) is afgeleid van de neiging van de twee fluorophores te wijzigen hun fluorescentie onafhankelijk van elkaar zowel pHik . RFP aggregatie artefacten zijn de meest significante manifestatie van deze beperking, maar kwantificering kan ook worden aangetast door photobleaching van één of beide fluorophores. Dus, imaging protocollen veel worden aangepast om te minimaliseren photobleaching, die tot lange belichtingstijden en overname tarieven leiden kan < 0.2 Hz. lange belichtingstijden zal nalaten te melden snelle pHik verschuift. SEpH fluorescentie toont lineaire correlatie om pHik van pH 6.8-7,8 bij de meeste voorbereidingen, maar de nauwkeurigheid van deze metingen is afhankelijk van de nauwkeurigheid van de nigericin/hoge K+ techniek. Nigericin fungeert als een K+/H+ -ionophore en juiste kalibratie steunt op zo extracellulaire [K+] met intracellulaire [K+]. Schattingen van intracellulaire [K+] zijn niet beschikbaar of gemakkelijk kunnen worden verkregen voor alle experimentele systemen. Nauwkeurigheid van kwantificering van pHik zullen alleen zo betrouwbaar als de raming van de intracellulaire [K+], hoewel de tarieven van de relatieve verandering in pHik in overeenstemming zal zijn. Gegeven deze beperking en de inverse van de logaritmische relatie van pHik aan intracellulaire [H+], het is altijd beter om rapportgegevens als tarieven voor verandering in pHik, zure extrusie tarief (JH +, Figuur 6 c), of zure flux (figuur 6D) in plaats van absolute veranderingen in de pHik. Analyse van de gegevens zoals zure flux heeft het extra voordeel van de correctie voor verschillen in oppervlak moeten volumeverhouding tussen celtypes.

Verschillende waarschuwingen moeten worden gewaardeerd wanneer vertolking gegevens uit de volwassen MT voorbereiding beschreven in dit protocol vliegen. De morfologische onderscheid van de eerste, transitional en hoofdsegmenten is waarschijnlijk een vereenvoudiging van de ware verscheidenheid van functionele en genetische domeinen aanwezig in de MTs-2. Bovendien, terwijl dit protocol is ontworpen voor het opsporen van de functie van basolaterale zure vervoerders is het mogelijk dat apicale vervoer pHi metingen zo goed kan beïnvloeden. Afdichten van de urineleiders bij montage van de MTs (stap 5,9) zorgt voor de uitwisseling van die oplossing voornamelijk optreedt bij het basolaterale oppervlak maar para-cellulaire en apicaal beweging van ionen kan nog beïnvloeden pHi basolaterale vervoer uiteindelijk verandert de cytoplasmatische kant van lumen/cytosolische ion verlopen. Absolute scheiding van apicale en basolaterale functie kan worden bereikt door zelfstandig de luminal zoogdierlevercellen en basolaterale oppervlakken van de MT maar dergelijke methoden zijn aanzienlijk meer technisch veeleisende aangezien zij micropipet cannulation41 vereisen .

GEpHIs presenteren veel voordelen ten opzichte van conventionele methoden voor het meten van pHik, en deze sterke punten worden versterkt wanneer gecombineerd met de genetische buigbaarheid en lage kosten van de voorbereiding van Drosophila MT. Kwantificering van pHik heeft historisch ingeroepen fluorescente kleurstoffen zoals (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)22 of ingewikkelde elektrofysiologische beoordeling via ion-Ionselectieve electroden20 ,21. Als pHerry is genetisch gecodeerd, het kan worden uitgedrukt in specifieke cellulaire populaties specifieke initiatiefnemers (zoals hier gedemonstreerd in de belangrijkste cellen en Notti cellen van het MT, Figuur 6) en is vatbaar voor het gebruik in elk weefsel onder Transgenese, transfectie, of virale-gemedieerde infectie. Kleurstoffen zijn beperkt door de kosten van de afzonderlijke preparaten en potentieel ingewikkeld toepassingsprotocollen die geen cel specificiteit in heterogene weefsels te vervoeren. Ion-Ionselectieve electroden vereisen gespecialiseerde apparatuur voor fabricage en meting, terwijl pHerry vereist enige widefield epifluorescerende microscopie met conventionele GFP en RFP filter sets. Gebruik van kleurstoffen en elektroden vergen fysische en optische toegang tot het weefsel van belang, terwijl GEpHIs kunnen worden gecontroleerd in vers gehaalde weefsels en over tijd in vivo. De kans voor levende imaging in intact preparaten is van bijzonder belang wanneer de beoordeling van de cellulaire fysiologie van pHik verordening als geen andere technologie toelaat kwantificering van pHik in het bijzijn van de endogene bufferen mechanismen.

De voorbereiding van Drosophila volwassen MT presenteert vele aantrekkelijke kenmerken voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het cellulaire pH regulering en ion vervoer. Drosophila veehouderij is goedkoop en hulpprogramma's zoals genetisch-gecodeerde biosensor constructies en RNAi expressie inserts zijn beschikbaar uit een verscheidenheid van voorraad centra (Bloomington Drosophila voorraad Center aan de Indiana University; Vienna Drosophila Research Center). Drosophila MTs bestaan uit een enkele laag van gepolariseerde epitheliale cellen, waardoor ze ideaal zijn voor onderzoek van het transepithelial ion vervoer. Basolaterale vervoer kan worden gemakkelijk vehiculumcontrolegroep (zoals hier aangetoond) maar volledige beoordeling van de apicale en basolaterale ion beweging is mogelijk met micropipet cannulation41. Bovendien orgaanfunctie testen zoals de Ramsay secretie assay17 en de luminal calcium-oxalaat afzetting18 goed gekarakteriseerd zijn en toestaan van de correlatie van epitheliale cellulaire fysiologie modellen van vloeibare secretie en nefrolithiase, respectievelijk. Terwijl deze functies mogelijkheden voor robuuste analyse bieden, maakt de lage kosten en brede beschikbaarheid van epifluorescerende microscopie het model Drosophila MT ideaal voor demonstraties van cellulaire en geheel-orgel fysiologie in het onderwijzen van laboratoria.

Beheersing van deze methoden toelaat kwantificering van pHik verordening door basolaterale H+ flux in volwassen Drosophila MTs, een toegankelijk en toch robuust model van transepithelial ion vervoer. Gebruik van GEpHIs gekweekte zoals pHerry kunnen gemakkelijk aan te passen om te beoordelen pHi verordening in andere ongewervelde celtypen, cellen van zoogdieren, en in vivo preparaten. Ontwikkeling van nieuwe GEpHIs zal waarschijnlijk volgen die van genetisch-gecodeerde calcium indicatoren, met nieuwe generaties spanning van het zichtbare spectrum en de aanpak van de huidige beperkingen zoals aggregatie artefacten30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49. GEpHIs zijn reeds uitvoerig gebruikt om het verslag van mitochondriale matrix pH50,51, en subcellular gerichte strategieën bestaan om te lokaliseren van biosensoren endoplasmatisch reticulum52, nucleus 53, synaptische vesikels12,43, en de cytoplasmatische54 en externe oppervlakken van cellulaire plasmamembraan55 (Zie tabel 2 voor een lijst met gepubliceerde reagentia). Als zodanig tools beschikbaar komen ze toestaat verticale integratie van sub cellulaire pH verordening met andere aspecten van cellulaire fysiologie, zoals Ca2 + behandeling en intracellulaire signalering, en hele orgaanfunctie over een verscheidenheid van gewervelde en ongewervelde preparaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de NIH DK092408 en DK100227 naar MFR. AJR werd gesteund door T32-DK007013. De auteurs bedank Dr. Julian A.T. Dow voor de CapaR-GAL4 en c724-GAL4 Drosophila voorraden. Wij danken ook Jacob B. Anderson voor bijstand behoud van experimentele vliegen kruisen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299, (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94, (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271, (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101, (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208, (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281, (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207, (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274, (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111, (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595, (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79, (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22, (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18, (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126, (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67, (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95, (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393, (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74, (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36, (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8, (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63, (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188, (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7, (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255, (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34, (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591, (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61, (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58, (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7, (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309, (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207, (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284, (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2, (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15, (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850, (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24, (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95, (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286, (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14, (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6, (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410, (1), 134-139 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics