Optisk kvantifisering av intracellulær pH i Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia med fluorescerende genetisk kodet pH indikator

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mobilnettet ion transport kan ofte vurderes ved å overvåke intracellulær pH (pHjeg). Genetisk gir kodet pH-indikatorer (GEpHIs) optisk kvantifisering av intracellulær pH i intakt celler. Denne protokollen detaljer kvantifisering av intracellulær pH gjennom mobilnettet ex vivo live-avbildning av Malpighian tubules i Drosophila melanogaster med pHerry, en pseudo-ratiometric kodet genetisk pH-indikator.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Epitel ion transport er avgjørende for systemisk ion homeostase samt vedlikehold av avgjørende mobilnettet elektrokjemiske graderinger. Intracellulær pH (pHjeg) er påvirket av mange ion transportører og dermed overvåking pHjeg er et nyttig verktøy for å vurdere transporter aktivitet. Moderne genetisk kodet pH-indikatorer (GEpHIs) gir optisk kvantifisering av pHjeg i intakt celler i mobilnettet og subcellular skala. Denne protokollen beskriver sanntid kvantifisering av mobilnettet pHjeg regulering i Malpighian Tubules (MTs) av Drosophila melanogaster gjennom ex vivo live-avbildning av pHerry, en pseudo-ratiometric GEpHI med en pKen velegnet spore pH endringer i stoffer. Utdraget voksen fly MTs består av morphologically og funksjonelt forskjellige deler av encellede lag epithelia, og kan fungere som en tilgjengelig og genetisk medgjørlig modell for undersøkelse av epitelial transport. GEpHIs tilbyr flere fordeler sammenlignet med konvensjonelle pH-sensitive fluorescerende fargestoffer og ion-selektiv elektroder. GEpHIs kan merke ulike celle populasjoner forutsatt riktig promoter elementer finnes. Denne merking er spesielt nyttig i ex vivo, vivoog i situ preparater, som er iboende heterogene. GEpHIs også tillater kvantifisering av pHi intakt vev over tid uten behovet for gjentatt fargestoff behandling eller vev eksternalisering. Den viktigste ulempen av gjeldende GEpHIs er tendensen å samle i cytosolic Inneslutninger svar vevsskade og konstruere over uttrykk. Disse svakhetene, sine løsninger og de iboende fordelene med GEpHIs er vist i denne protokollen gjennom vurdering av basolateral proton (H+) transport i funksjonelt forskjellige rektor og stellate celler av utdraget fly MTs. Teknikker og analyse beskrevet er lett tilpasses en rekke vertebrate og invertebrate forberedelser, og raffinementet til analysen kan skaleres fra undervisningen labs til intrikate fastsettelse av ion flux via bestemte transportører.

Introduction

Målet med denne protokollen er å beskrive kvantifisering av intracellulær pH (pHi) bruker en genetisk kodet pH-indikator (GEpHI) og demonstrere hvordan denne metoden kan brukes til å vurdere basolateral H+ transport i en modell insekt (D. melanogaster) nyre struktur, Malpighian tubule (MT). MTs tjene som frukt fly excretory organer og ligner funksjonelt på pattedyr nyre i flere viktige henseender1. MTs er arrangert som 2 par av tubules (fremre og bakre) i thorax og buk fly. Encellede epithelial tube hver MT består av metabolsk aktive viktigste celler med forskjellige apikale (luminal) og basolateral (hemocoel) polaritet samt under Sommer stellate celler. Fremre MTs består av 3 morphologically, funksjonelt, og developmentally forskjellige segmenter, spesielt første dilated segmentet, overgangsreglene segmentet og sekretoriske hovedavdeling avsnitt, som kobles til ureter2. I cellular skala trans-epitelial ion transport i lumen oppnås ved en apikale plasma membran V-ATPase3 og en alkali-metall/H+ exchanger, samt en basolateral Na+-K+-ATPase4, innover-likeretter K+ kanaler5, Na+-drevet Cl/HCO3 exchanger (NDAE1)6og Na+-K+-2 Cl cotransporter (NKCC; Ncc69)7, mens stellate celler megle Cl- og vann transport8,9. Dette komplekse, men tilgjengelig fysiologiske systemet gir gode muligheter for undersøkelse av endogene ion transportmekanismer kombinert med de ulike genetiske og atferdsmessige verktøysett av Drosophila.

Begrunnelsen for denne protokollen var å beskrive et genetisk formbare system for å studere epithelial ion transport med potensial for integrasjon fra cellen til oppførsel og eksport av verktøy for andre modellsystemer. Uttrykk for pHerry10, en GEpHI avledet fra en blanding av grønn pH-sensitive super ekliptikken pHluorin11,12 (SEpH) og røde pH-ufølsom mCherry13, i MTs tillater kvantifisering av H+ transport i MT enkeltceller gjennom de høye K+/nigericin kalibrering teknikk14. Som mange ion transportører flytte H+ -ekvivalenter, serverer kvantifisering av intracellulær pHjeg som en funksjonell representasjon av ion bevegelse via en rekke transportører. Drosophila MT modell systemet tilbyr også kraftig genetisk verktøy i vev-spesifikke transgene15 og RNA forstyrrelser (RNAi)16 uttrykk som kan kombineres med mobil bildebehandling og hele-orgel analyser17 , 18 , 19 av tubule-funksjonen til å opprette et solid verktøysett med vertikal integrasjon fra molekyler virkemåten. Dette står i kontrast til mange andre protokoller for å vurdere epithelial biologi, som historisk slike målinger har stolt på intrikate og skremmende mikro-disseksjon, sofistikerte ion-selektiv elektroder20,21, og dyre pH-sensitive fargestoffer22 med restriktiv lasting krav og dårlig mobilnettet spesifisitet heterogen vev. GEpHIs har blitt brukt mye måle pHjeg i en rekke cellen typer23. Tidlige arbeid utnyttet iboende pH-følsomheten av Green fluorescerende Protein (GFP) å overvåke pHjeg kulturperler epitelceller24 men de siste to tiårene har sett GEpHIs brukes i neurons25, glia26, sopp27 , og plant celler28. Kombinasjonen av potensialet for mobilnettet målretting av genetisk konstruksjoner gjennom GAL4/UAS uttrykk systemet15 og fysiologiske tilgjengelighet av Drosophila MT gjør dette til en ideell forberedelse til undersøkelser av pHjeg regulering og epithelial ion transport.

pHjeg regulering har vært studert i flere tiår og er avgjørende for liv. MT utarbeidelse tilbyr en robust modell å lære fysiologi av pHjeg regulering, men også utføre avanserte undersøkelser av pHi regulering ex vivo og i vivo. Denne protokollen beskriver kvantifisering av H+ bevegelse over basolateral membran av epitelceller av Drosophila MT bruker NH4Cl puls syre lasting teknikk21, men som pH-indikatoren er genetisk kodet, kan disse metodene og teoretisk struktur brukes på noen forberedelser mottakelig for transgenesis og live-imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trinn i denne protokollen overholde Mayo Clinic (Rochester, MN) dyr bruk retningslinjene.

1. fly dyrehold

  1. Raise fluer og sett krysser etter standard dyrehold29.
    Merk: Fluorescerende reporter uttrykket av GAL4/UAS systemet er proporsjonal med temperaturen og dermed oppdrett temperatur kan justeres for å endre uttrykket nivå. Mens høy uttrykk nivåer ofte føre til en bedre signal-til-støy-forhold er denne tilstanden også forbundet med økt cytosolic og organellar aggregat når bruker GFP til Red fluorescerende Protein (RFP) fusion konstruerer som pHerry10, 30,31. Hvis aggregering er uunngåelig, kvantifisering er fortsatt mulig ved å peke kalibreringer i hvert eksperiment og normalisere data slik at fluorescens forholdet 1.0 tilsvarer pHjeg 7.0 (se trinn 7.4 oppmerksom på kalibrering nedenfor).
  2. Sett krysser av homozygous capaR-GAL432 menn homozygous UAS-pHerry10 virgin kvinner og homozygous c724-GAL42 menn til homozygous UAS-pHerry jomfru kvinner å tillate bildebehandling av pHjeg i viktigste celler og stellate celler av MT, henholdsvis. Plass 6 UAS-pHerry kvinner med 3 GAL4 menn i frisk ampuller av mat og la kompis på 28 ° C.
    Merk: Larvene skal tydelig innen 4 d og voksne vil begynne å dra rundt dag 10.
  3. Samle kvinnelige fluer på eclosion og avsatt til alder for 10 d på 28 ° C.
    Merk: Timingen av eksperimentering kan justeres for å tilsvare en restriktiv atferdsmessige analyser (for eksempel Ramsay sekresjon analysen17,19) som vil være korrelert intracellulær live pH bildebehandling. Mannlige fluer kan brukes, men tubuli fra kvinner er ofte større og mer robust.

2. utarbeidelse av Poly-L-Lysine lysbilder.

  1. Tegne en 40 x 20 mm kantlinje med en hydrofobe PAP rundt toppen av standard 75 x 25 mm lysbilder og avsette tørke i 15 min på RT. Bruk store coverslips hvis lysbildene ikke er kompatible med imaging optikk.
  2. Overføre 2 mL lager 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) løsning på hvert lysbilde og satt til side for 1t på RT.
  3. Fjern overflødig PLL med en pipette. Lagre løsningen i 50 mL konisk ampuller for fremtidig bruk. Butikken på 4 ° C.
  4. Sug opp alle gjenværende løsning med en vakuum linje. Kjør vakuum linjen over hele lysbildet overflaten for å påse at ingen løsning på lysbildene.
  5. Angi lysbilder til side for flere 1t på RT før bruk. Lagre lysbilder tørr på RT for inntil 1 måned i en standard lysbildet bok.

3. forberedelse av dissekere parabol og Glass stenger

  1. Legg til 0,5 mL av elastomer herding agent 4,5 mL av elastomer base i en 35 x 10 mm isopor Petriskål på RT å produsere en dybde av 5 mm. blanding med disponibel pipette tips. Tillate elastomer å kurere O/N på RT.
    Merk: Elastomer bør være klar og uten bobler. Clearing av bobler kan bli lettere ved å holde elastomer plater i et vakuum krukke for 10-15 min etter pouring.
  2. Hold 5 mm diameter glass stang mellom hendene og smelte midten av stangen over en tent Bunsen brenner mens du trekker endene fra hverandre. Som glass tre smelter raskt å produsere en tynn (0,1 mm) og konisk aksel (figur 1).
    Merk: En 45 ° vinkel på skaft er ofte nyttig i håndtering tubuli. Dette kan oppnås ved å senke en hånd som skaft trekkes (se figur 1).
  3. Bryte tynn akselen i midten med blunt siden av en enkelt kanter karbonstål razor blad. Inspisere den tynne enden av stangen under en dissecting omfang slik pause er ren.

Figure 1
Figur 1: Fabrikere Glass stenger for håndtering Malpighian tubuli.
A - E. Oppvarming og trekke glass stang for å produsere en taper og vinkel egnet for håndtering av MTs. piler betegne retning og omfanget av makt skal brukes. F. fotografi av en hensiktsmessig fabrikkerte glass verktøy. Skala bar = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. forberedelse av løsninger og perfusjon System

Merk: Perfusjon systemer variere fra produsent. Denne protokollen er basert rundt et gravitasjon-matet 8-kanals åpne reservoar med en input flow rate regulator og et vakuum-drevet ut, men metoden for montering MTs som beskrevet her kan tilpasses til å arbeide med noen perfusjon system.

  1. Klargjør følgende løsninger:
    1. Aliquot Schneider's medium (40 mL til 50 mL konisk ampuller) og butikk på 4 ° C.
    2. Utarbeide løsninger (i.e. insekt Phosphate-Buffered saltvann (iPBS) og iPBS med NH4Cl) på RT behov etter tabell 1). Varm løsninger til RT før bruk dagen av eksperimentet.
      Merk: iPBS og iPBS med 40 mM NH4Cl kan være forberedt i store mengder (1 L eller mer) og lagret på 4 ° C.
    3. Forberede 8 kalibrering løsninger i 500 mL volumer ved pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 og 9.0 som vist i tabell 1 og butikk på 4 ° C. Justere pH i hver løsning ved titrering med N-methyl-D-glucamine (NMDG) og HCl.
    4. På dagen eksperimenter, varme 5 mL dele kalibrering løsninger RT og legge til lager nigericin løsning (20 mM i dimethyl sulfoxide (DMSO)) produsere en siste konsentrasjon av 10 µM.
      FORSIKTIG: Håndtere nigericin med hansker. Behandle alle utstyr som kommer i kontakt med nigericin som disponibel. Nigericin forblir på glass og plast og vil invadere biologiske preparater hvis utstyret er på nytt.
  2. Perfusjon system:
    1. Prime perfusjon systemet ved å fylle alle reservoarer med ddH2O (figur 2). Åpne kanalene en for å tillate alle linjer proksimale til flow rate regulator å fylle.
      Merk: Det kan være nødvendig å fjerne luft i linjene ved å åpne fastlåste kanalen og bruker en plunger til stasjonen flyt fra reservoaret.
    2. Åpne 2 kanaler og la ddH2O renne. Når reservoarene er nesten tom, fyll første tanken med iPBS og andre reservoaret med NH4Cl-pulserende iPBS. Angi strømningshastighet maksimal med flow rate regulator tillate hver løsning å strømme for 1 min fylle distale linjene, og stanse strømmen (figur 2).
    3. Posisjon 2 sett med lodding "hjelpende hender" klemmer på tenkelig mikroskop scenen. Plass en klemme på hver side av tenkelig plattformen.
    4. Nøye varme de distale 0,5 tommene av et stykke kapillær glass (indre diameter 1,5 mm ytre diameter 0,86 mm lengde 100 mm) over en Bunsen-brenner. Opprette en 45 ° sving ved at den klubbeformede enden å bøye av tyngdekraften og fjerne glass fra flammen når ønsket er oppnådd. Gjenta denne prosessen med en andre kapillær glass.
    5. Sett inn bøyd glass kapillærene i i flyt linje og vakuum-tilkoblet strøm linje, henholdsvis og monterer dem i "hjelpende hender" justere dem med imaging scenen av mikroskopet (Figur 3).

Figure 2
Figur 2: Perfusjon systemet og Imaging konfigurasjon.
Nødvendige komponenter for fysiologiske vurdering av MT basolateral transport funksjonen gjennom samtidig leve fluorescens tenkelig og rask løsning exchange. Gass linjer vist er valgfrie og tillate utvidelse av eksperimenter for å vurdere HCO3- transport. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Flyt skjematisk av perfusjon apparater for NH4Cl puls eksperimenter.
Pilene viser strømningsbane og ventil bytte poeng. Løsningen beveger seg fra reservoar til prøven av gravitasjon flow og trekkes fra prøven kammer til avfall kolbe av vakuum sugekraft. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

5. Disseksjon av voksen Drosophila fremre Malpighian tubuli.

  1. Samle disseksjon fatet og trakk glass stang fra avsnitt 3, et PLL-belagt lysbilde fra delen 2, en selvklebende perfusjon-vel deler, vakuum fett, en 4 x 2" stripe av tetting filmen, 2 par #5 fine tang og 40 mL dele iskald Schneider's medium og RT iPBS.
  2. Spre vakuum fett tetting tape og trykk selvklebende perfusjon-vel delelinjen på båndet til pels bunnen med fett. Løsner lim perfusjon-vel skillet og plasser det fett-side-ned på et PLL bestrøket lysbilde. Fjerne perfusjon-vel skillet for å forlate enkelt prøve brønner sporet i hydrofobe fett.
  3. Sted 200 µL av RT iPBS i fett-omkranset godt på PLL bestrøket lysbildet, og flytter lysbildet under stereoscope.
  4. Sted UAS-pHerry/capaR-GAL4 fluer i en tom fly medisinglass og bedøve dem på is 10 min.
    Merk: Denne metoden av anestesi, i motsetning til CO2, sikrer at flyr ikke tørke.
  5. Hell iskald Schneider's medium i dissecting parabolen, og bruk fint tang til å overføre en enkelt bedøvet kvinnelige fly i retten under en dissecting stereoscope.
  6. Hold fly thorax med et sett med tang og bruk den andre til forsiktig grep bakre av magen. Trekke åpne bakre fly ved hjelp av pinsett kort sagt, bevisst bevegelser. Når baktarm er synlig, grep den klubbeformede enden og gratis gut og MTs fra de underliggende tracheoles ved å trekke baktarm fra kroppen gjennom repeterende, kort Slepebåter.
    Merk: De fremre og bakre MTs vises hvor de møter krysset av midttarmen og baktarm gjennom ureter. De første par MTs til gratis vil trolig være på bakre tubuli som de omkranser baktarm. Disse kan være ignorert (figur 4A).
  7. Klype av fremre MTs på ureter med fine tang når det andre settet med MTs er gratis magen. Dette skille fremre MTs fra tarmen og lukke ureter.
  8. Plukk opp gratis fremre MTs med trakk glass stangen ved å skyve stang under ureter slik at på tubuli faller på hver side. Løft MTs rett ut av løsningen.
  9. Slå glass stangen slik at MTs og ureter følges til undersiden av stangen og lavere ureter rett ned på lysbildet. Påføre ureter og forsegle de distale endene av MTs ved å trykke ureter ned på objektglass (figur 4B). Ikke manipulere MTs lenger enn nødvendig. MTs bør være flytende opp i løsningen med ureter forankret til lysbildet.
  10. Bruk fine slutten av glass stangen til å forsiktig feie hvert tubule over lysbildet overflaten. Spenne stangen mot lysbildet å unngå knuse tubule og skyv stangen over toppen av tubule, flytte distale til proksimale, knytte hele lengden av hver tubule på overflaten av PLL-belagt lysbilde (figur 4C).
  11. Plass selvklebende perfusjon-vel skillet bak på lysbildet for å danne en liten væskefylte godt over det monterte tubule.
  12. Plass prøven på mikroskopet scenen. Plasser tilsig og utløp kapillærene over innløp og utløp åpningen av perfusjon Vel, henholdsvis.
    Merk: Godt skillet kan stå hvis en åpen perfusjon kammer. I dette tilfellet kan tilsig og utløp kapillærene venstrejusteres motsatte sider av bilde godt.

6. validering av tenkelig protokollen og Tubule helse

Merk: Denne protokollen utføres på en invertert wide-field epifluorescent mikroskopet med GFP (SEpH) og RFP (mCherry) filter setter (470/40 nm eksitasjon (ex), 515 nm longpass utslipp (em), 500 nm dichroic og 546/10 nm ex, 590 nm longpass em, 565 nm dichroic), en 10 X / 0.45 luft målet, en monokromatisk kamera for live bildebehandling og programvare. Protokollen kan tilpasses for alle stående eller invertert mikroskop med automatisert filter bytte mellom GFP og RFP optikk og bilde oppkjøpet programvare, selv om optimal eksponeringstider, lysintensitet og binning parametere vil variere. I alle analyse, bør fluorescens intensiteten analyseres som mener pixel intensiteten i regionen rundt (ROI), etter bakgrunn subtraksjon i hver kanal med en avkastning med inneholder ingen fluorescens tilstøtende på signalet avkastning.

  1. Slå på mikroskopet, lyskilde og tenkelig system.
  2. Åpne tilknyttet programvare.
  3. Se gjennom i okularet og justere fokus manuelt til lumen til MT er godt synlig under lyset.
  4. Klikk kategorien "Erverv" i analyseprogramvare og velg "2 x 2" i den "Binning" rullegardinmenyen i delen «Vinningen måte».
  5. Sett inn en 5% Nøytralfilter i lys banen til redusere belysning lys og minimere photobleaching.
  6. Klikk GFP (SEpH) kanalen i menyen "Kanaler" og deretter "Live" å observere fluorescerende signalet via kameraet.
  7. Skyveknappen "Tid" til å angi eksponeringstid slik at smarteste bildepunktverdiene i intensitet histogrammet ca 40% av maksimal verdi og velger "Stopp" for å stoppe belysning.
  8. Gjenta trinnene 6.6-6.7 i RFP (mCherry) kanal og bekrefte tilstedeværelse av utvidede første segmentet fremre merketråden og fravær av cytosolic mCherry samler (indikativ vevsskade eller overuttrykte) (Figur 4 d).
    Merk: Strekte segmentet skal tydelig tydelig som det er den mest proksimale delen av tubule og diameteren på den indre lumen i dette segmentet er ~ 20 µm større enn tilstøtende overgangsreglene segmentet. 2 x 2 pixel binning er ofte nok, men kan økes for å ytterligere redusere nødvendig belysning intensitet. Typisk eksponeringstider er mellom 150 og 800 ms/kanal. Bruk som lite lys som mulig for å minimere photobleaching. Minimere photobleaching er avgjørende for bruk av to-fluorophore indikatorer som pHerry som to fluorophores kan bleke uavhengig, dermed ugyldiggjør noen forholdet kalibrering.
  9. Aktivere en time-lapse tenkelig protokoll ved å klikke boksen "Tid serien".
  10. Justere "Varighet" i rullegardinmenyen i delen "Tid serien" 10 min og "Intervall," glidebryteren til 0 for å angi den totale opptakstiden med en maksimal bilde oppkjøpet hastighet. En totale anskaffelseskosten 0,2 Hz er ofte tilstrekkelig.
  11. Sjekk både av GFP (SEpH) og RFP (mCherry) i delen "Kanaler".
  12. Åpne iPBS linjen av perfusjon av den aktuelle ventilstiller og starter tenkelig protokollen ved å klikke "Start Experiment." Etter 1 min, bytte til NH4Cl puls løsning for 20 s ved å åpne riktig ventilen og lukke iPBS linjen, deretter tilbake til iPBS ved å lukke NH4Cl linje og åpne iPBS ventilen. Tillat full tenkelig protokollen å fullføre før du stopper perfusjon systemet.
    Merk: Time-lapse analyse bør avsløre en stabil mCherry-signal og en SEpH signal som øker i nærvær av NH4Cl slukker på bleke og gradvis gjenoppretter.
  13. Utføre en 2-punkts kalibrering.
    1. Fjerne den godt skillelinjen ved peeling det fra underliggende lysbildet og fjerne perfusjon kapillærene og klemmer fra avbilding godt.
    2. Gjelde avbilding godt med en 200 µL pipette 200 µL kalibrering iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericin). Fjern løsningen fra avbilding godt med pipette og erstatte med en annen 200 µL av kalibrering løsning. Gjenta denne prosessen 4 ganger for å sikre komplett løsning exchange.
    3. Inkuber forberedelse i kalibrering løsning for 30 min før bildebehandling. Gjenta tenkelig protokollen med de samme parameterne i trinn 6.6-6.11, endringen bare 1 min av image capture.
      Merk: Perfusjon systemet og kapillærene er ikke nødvendig i dette trinnet og skal ikke knyttes til avbilding godt for å unngå å utsette kapillærene til nigericin.
    4. Legge til 200 µL kalibrering iPBS (pH 9.0, 10 µM nigericin) bildebehandling med en 200 µL pipette. Fjern løsningen fra avbilding godt med pipette og erstatte med en annen 200 µL av kalibrering løsning. Gjenta denne prosessen 4 ganger for å sikre komplett løsning exchange.
    5. Inkuber forberedelse i den andre kalibrering løsningen for 10 min før bildebehandling. Gjenta tenkelig protokollen som i trinn 6.13.3.
    6. Se bildet stabelen i analyseprogramvare å bekrefte at ingen bildepunkter i enten kanalen er mettet ved å klikke "Mener ROI" og rulling skjønt bildestakk med "Ramme" glidebryteren mens observere noen verdier rapportert i intensitet histogrammet nå synlig maksimumsverdien. Hvis alle rammer inneholder piksler som når den maksimale synlig intensiteten, redusere eksponeringen tid eller belysning intensitet og gjenta §6.
      Merk: Når etablert endrer tenkelig parametere mellom eksperimenter eller kalibrering poeng kalibreringene er i hvert preparat (se trinn 8.3).
  14. Analysere bildestakk for å tegne fluorescerende intensitet og fluorescens forholdet (SEpH/mCherry) som en funksjon av tid.
    1. Klikk "Mener ROI" og velg Frihåndsverktøy. Hold venstre å spore en ~ 50 µm lengde av MT. Høyreklikk for å fullføre tegning Avkastningen, deretter gjenta i et område som grenser til MT til å definere en bakgrunn avkastning (figur 5A).
    2. Klikk "Betyr intensitet" under "Mål." Opprette en intensitetsverdiene ved å klikke "eksportere > datatabell > Opprett."
    3. Klikk konfigurasjon cogwheel ikonet og avmerkingen alle parametere unntatt "Tid" og "Betyr intensitet." Høyreklikker du kategorien for nyopprettede tabellen, velg "Lagre som" og eksporterer du dataene som en CSV-fil.
      Merk: Tilsvarende målinger kan også gjøres ved hjelp av fri programvare som ImageJ.
    4. Åpner et regneark bord og importere tabellen ved å velge kategorien "Data" etterfulgt av "Fra tekst".
    5. Bruke funksjonene i regnearket trekke SEpH bakgrunn intensiteten fra SEpH Signal intensiteten på hvert punkt. Gjenta denne prosessen for mCherry signalet.
    6. Tegne hver kanal intensiteten som en funksjon av tid ved å velge kolonnene som inneholder tid og bakgrunn-korrigert intensitet data og deretter klikke "Sett inn > Scatter (Charts) > punktdiagram med rette linjer" (figur 5B).
    7. Bruke regnearkfunksjoner til å beregne SEpH/mCherry fluorescens forholdet på hvert tidspunkt.
    8. Tomten fluorescens ratio som en funksjon av tid ved å velge kolonnene som inneholder tid og forholdet og deretter klikke "Sett inn > Scatter (Charts) > punktdiagram med rette linjer" (figur 5C).

7. full kalibrering av pHerry i Malpighian tubuli Ex Vivo.

  1. Analysere og montere et friskt sett med fremre MTs som beskrevet i seksjon 5.
  2. Utveksle iPBS for kalibrering iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericin) som beskrevet i trinn 6.13.2. Inkuber i 30 min.
  3. Finn MTs og samle par SEpH/mCherry bilder som beskrevet i trinnene 6.1-6.11. Erstatt løsningen med en annen lager av kalibrering iPBS som beskrevet i trinn 6.13.4, vente 10 min, og image igjen. Gjenta denne prosessen til SEpH/mCherry forholdet har blitt avbildet i alle løsninger. Få pH 9.0 bilder siste som prøven sjelden gjenoppretter fra høy pH.
  4. Tegne fluorescens forholdet mellom SEpH til mCherry fra kalibreringer i åtte eksemplarer som en funksjon av pålagt pHjeg som beskrevet i trinn 6.14.9. Passe kalibreringsdataene med Boltzmann sving å få full kalibrering funksjon etter Formel 1 (figur 5 d). Hvis data er inkonsekvent, plot kalibrering sett fra hver prøven normalisert slik at fluorescens forholdet 1.0 tilsvarer pHi 7.0 og re-analysere (figur 5E).
    Merk: Hvis den sistnevnte er nødvendig personlige eksperimenter må egne interne punkt kalibreringer33 (se kvantifisering fremgangsmåten nedenfor (trinn 8.3)).
  5. Formel 1
    Equation 1
    Der R = SEpH/mCherry forhold og1,2, xoog dx er kurve passende parametere som representerer minimum fluorescens forholdet maksimale fluorescens forholdet, pKenog bredden av funksjonen henholdsvis. xo = tilsynelatende pKen av pHerry, som kan variere mellom 7.1 og 7.4 avhengig av celle type nøyaktig kalibrering.

8. kvantifisering av Basolateral Acid ekstrudering fra Ex Vivo Malpighian Tubule Epithelia.

  1. Bilde pHerry-uttrykke stellate celler og pHerry-uttrykke rektor cellene samtidig.
    1. Dissekere fremre MTs fra en UAS-pHerry/capaR-GAL4 fly som beskrevet i seksjon 5, men ikke overføre MTs fra dissecting Schneider's medium bildebehandling godt.
    2. Dissekere fremre MTs fra en UAS-pHerry/c724-GAL4 fly i samme dissecting parabolen bruker du fremgangsmåten i del 5.
    3. Overfør de 2 settene med MTs til den samme imaging som beskrevet i trinn 5.8-5.11.
      Merk: Når feiing armene for MTs til lysbildet, plassere MTs UAS-pHerry/c724-GAL4 og på UAS-pHerry/capaR-GAL4 tubuli nær hverandre så pHerry-uttrykke rektor og stellate celler kan visualiseres i det samme feltet ( Figur 6A).
  2. Bruke NH4Cl prepulse som beskrevet i trinn 6.12.
    Merk: Hvis konsekvent kalibrering (figur 4B) ikke kan oppnås, utføre en punkts kalibrering ved å angi pHi 7.0 på slutten av hvert eksperiment med kalibrering iPBS (pH 7.0, 10 µM nigericin, 30 min incubation) etter limet perfusjon-og skillelinje og perfusjon utstyret er fjernet.
  3. Kalibrere spor fra stellate og viktigste celler for ulike MT segmenter (med absolutt eller normalisert forholdet som passer) med ligning 2 og analysere restitusjonsfasen etter NH4Cl uttak ved å bruke eksponensiell decay funksjoner ved hjelp av statistisk analyse software og merke decay konstant (τ) (figur 6B).
    Ligning 2
    Equation 2
    Der R = SEpH/mCherry forhold og1,2, xoog dx er kurve passende parametere etter kalibrering i trinn 7.4 (Formel 1).
    1. Beregne syre ekstrudering rate (Jh, se formel 3) som en funksjon av pHjeg rede for variasjoner i hvile pHjeg og syre lasting mellom forberedelser34. Bruke eksponentialfunksjoner avledet i trinn 8.3 til å beregne deriverte av pHjeg med hensyn til tid i hvert tidsintervall.
      Formel 3
      Equation 3
    2. Beregne den iboende bufring kapasiteten (βjeg; Ligningen 4) av stoffer på pHjeg fra begynnelsen av hvert intervall i trinn 8.3.1 basert på tidligere litteratur (se ligningen 4).
      Merk: I Drosophila, mest grundige karakterisering av βjeg kommer fra larver motor nerve terminaler35 og disse dataene kan antas for å holde for MT celler i fravær av andre tilgjengelige data.
      Ligningen 4
      Equation 4
    3. Beregn produktet av βT (fra trinn 8.3.2)og dpHjeg/dt (fra trinn 8.3.1) for å fastslå JH + (formel 3).
      Merk: Nominelt bikarbonat-ledig løsninger som beskrevet i denne protokollen, bikarbonat-avledet bufring kapasitet (βb) antas for å være ~ 0 mM. Totalt bufring kapasitet (βT) er summen av βjeg ogβbog dermed βjeg = βT i fravær av HCO3-/CO236.
    4. Tomt JH + som en funksjon av den pHjeg i begynnelsen av hvert tidsintervall som beskrevet i trinn 6.14.9.
    5. Bruke eksponensiell decay funksjoner på delen av alle datasett som overlapping i pHjeg bruker statistisk analyse software. Sammenlign priser på endre resulterende funksjoner sammenligne syre ekstrudering priser mellom celler og MT segmenter (figur 6C).
      Merk: Funksjonen passende brukes for montering kurve kan ikke alltid være en enkelt eksponentiell. Andre funksjoner kan erstattes hvis de forbedre godhet av fit.
    6. Beregne syre flux (se ligningen 5) som en funksjon av pHjeg rede for variasjoner i Cellestørrelse og form.
      Ligningen 5
      Equation 5
      Merk: Cellen dimensjoner kan enten måles direkte i bilder eller etterlignes. Viktigste celler kan representeres som halvdelene av en hul tube med følgende dimensjoner: indre diameter 24 µm; ytre diameter 48 µm; høyde 50 µm. Transitional stellate celler er variabel, men omtrent kan representeres som sylindere med høyder av 50 µm og en diameter på 10 µm. Se siste avsnitt av Representant resultatene nedenfor.
    7. Bruke eksponensiell decay funksjoner på delen av alle datasett som overlapper i pHjeg bruker statistisk analyse software. Sammenlign priser på endre resulterende funksjoner sammenligne syre flukser mellom celler og MT segmenter (figur 6D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sunt vev og korrekt identifisering av fremre MTs er avgjørende for suksessen til denne protokollen. Under disseksjon, bør man være forsiktig å ikke direkte berøring MTs og skal bare dem ved ureter så gripende MTs direkte fører til brudd (figur 4A- B). Når MTs er feid flatt inn i lysbildet, på tubuli må bli rørt mulig og overflødig bevegelse unngått som dette vil skade encellede epiteliale lag (figur 4C). Riktig dissekert vil fremre MTs vise jevn fordeling av både rød og grønn fluorescens gjennom stoffer epitelceller og morphologically distinkte tubule segmenter. Tubuli skadet av feil perfusjon eller mishandling vil vise samling av røde fluorescens med ingen sammenkoblede grønne aggregat og feilidentifisert bakre MTs vises uniform morfologi den proksimale blind enden til distale ureter (Figur 4 d) . 

Riktig funksjon av pHerry må bekreftes skjønt fysiologiske vurdering samt morfologi. Metoden mest hensiktsmessig å bekrefte riktig pH-sensing er å bruke en NH4Cl puls. Under disse forholdene de grønne SEpH signalet skal rapportere endres forventet pH (en økning i pHjeg under pulsen NH3 kommer inn i cellen, en gradvis nedgang under pulsen som NH4+ går gjennom K+ transportører og kanaler, og en rask forsuring og gradvis utvinning på NH4Cl uttak21, mens røde mCherry signalet skal være konstant (figur 5A- B). Omfanget av endringer i SEpH signalet vil variere med protokollen og celle type, men mCherry signalet skal være stabil i alle tilfeller. Endringer i mCherry signalet under personlige eksperimenter viser bevegelse gjenstander eller progressiv generasjon av sensoren aggregater på grunn av celleskader. Sistnevnte vil hindre kvantifisering av pHjeg og må unngås. Etter endt NH4Cl puls er det viktig å utføre en 2-punkts kalibrering (kalibrering iPBS, pH 7.4 og 9.0, 10 µM nigericin) å bekrefte en hvile pHjeg nær 7.4 og sikre at de gjeldende parameterne for bildebehandling ikke fører til metning fluorescens gjenkjenning når fluorescens er maksimert ved pH 9.0 (figur 5C). Hvis hviler pH er betydelig lavere enn 7.4, skal protokollen gjentas med sunn MTs; og hvis metning oppstår ved pH 9.0, protokollen skal gjentas med lavere lys intensitet eller eksponering tid. Når tilstrekkelig tenkelig parameterne bestemmes, bør de ikke endres mellom eksperimenter eller kalibreringer hvis de absolutte fluorescens er skal brukes. Mens pseudo-ratiometric natur pHerry kan gi en metode for bevegelse korreksjon i forberedelsene utsatt for bevegelse eller endringer i celle diameter, den absolutte kvantifiseringen av pHjeg krever full systematisk korrelasjon av pHerry SEpH / mCherry forholdet pHjeg gjennom nigericin/høy K+ teknikken. Kalibrering av pHerry i sunn preparater skal produsere konsekvente kalibrering kurver med en tilsynelatende pKen av 7.1-7.4 avhengig av celle type og kalibrering forholdene (figur 5 d). For preparater som mCherry samling er uunngåelig, normalisering av forholdet verdier slik at fluorescens forholdet 1.0 tilsvarer pH skaljeg 7.0 gi samme resultat (figur 5E). Hvis brukes punkt kalibreringer og normalisert kurver, imaging parametere kan optimaliseres for hvert preparat. 

Kalibrert pHjeg spor kan brukes til å sammenligne pH regulatoriske mekanisme mellom celletyper. GAL4/UAS uttrykk systemet i Drosophila kan brukes til å uttrykke pHerry i viktigste cellene og stellate i fremre MT (figur 6A). pHjeg regulering kan vurderes av syre-lasting celler med NH4Cl pulser og kvantifisere frekvensen av pHjeg utvinning. Dette kan gjøres ved å montere eksponentialfunksjoner til restitusjonsfasen i forskjellige eksperimentelle forhold til ekstra decay konstant (τ) som celler med rask H+ middelklasseinnbyggere vises en raskere utvinning (og dermed lavere verdier av τ). Basert på analysen, synes stellate celler av MT å ha mer robust syre ekstrudering enn viktigste celler (figur 6B). Denne analysen vil holde så lenge den hvile pHjeg, omfanget av syre lasting og bufring kapasitet er like mellom eksperimentelle grupper. Men når disse betingelsene ikke er oppfylt, er det nødvendig å ta hensyn til observasjon at iboende bufring stoffer (βjeg) for mange celler er selv pH-avhengig35,37,38 og dermed frekvensen av pHjeg endre på ulike pHjeg kanskje ikke direkte sammenlignbare. I slike tilfeller passer eksponentiell kurvene syre ekstrudering fase følgende en NH4Cl puls og tidligere fastsatte estimater av iboende bufring kapasitet (βjeg) kan brukes til å tegne syre ekstrudering hastigheten (JH +) som en funksjon av pHjeg og bestemme kompensert rate av syre ekstrudering (ligninger 3 & 4). Når forskjeller i syre lasting og hvile pHjeg er regnskapsført for, er det tydelig syre ekstrudering i viktigste celler av overgangsordning segmentet overgår stellate celler (figur 6C). Denne analysen mens overbevisende, ikke adressen som målte pHjeg er en funksjon av volumet mens syre ekstrudering over plasma membranen er en funksjon av membran areal. Dele JH + av arealet til volumkontrollen i cellen rundt vil gi verdiene i mol av syre ekvivalenter per enhet areal per enhetstid (ligningen 5), slik at korreksjon for forskjeller i Cellestørrelse og morfologi. Omtrent to viktigste celler utgjør omkretsen av MT i overgangsperioden segmenter og dermed enkeltceller kan være formet som halvparten av et rør (indre diameter 24 µm, ytre diameter 48 µm, høyde 50 µm). Stellate celler er mindre og har tendens til være bar-formet i overgangsperioden segmentet av MT2. Nøyaktig kvantifisering av areal og volum er vanskelig, men selv konservative tilnærmelser figurtypen overgangsordning stellate celle (sylindere med en høyde på 50 µm og en diameter på 10 µm) angir et areal til volumkontrollen minst 2 x at av rektor celler. Tar hensyn til dette avslører at stellate celle syre fluks er betydelig under som overgangsordning viktigste celler, og faktisk tilnærminger som første segmentet viktigste celler (figur 6D).

Figure 4
Figur 4: Disseksjon av voksen Drosophila fremre Malpighian tubuli.
A. skjematisk fremstilling av fremre MT fjerning med 2 par fine tang i kjølt Schneider's medium. "A. Tubule" = fremre MT. "P. Tubule" = bakre MT. B. Henting og montering utdraget MTs med tynne glass stenger. C. prosessen ved å følge hele utdraget MTs på et lysbilde for bildebehandling og fysiologiske vurdering. D. representant widefield bilder av SEpH (470/510 nm ex / em) og mCherry (556/630 nm ex / em) komponenter i UAS-pHerry drevet av capaR-GAL4 viser sunn fremre MTs, anterior MTs skadet av utilstrekkelig perfusjon, og feilidentifisert bakre MTs. Merk at sunn fremre MTs viser en klar strekte blind første segment, trange overgangsreglene segment med relativt økt uttrykk for UAS-pHerry når drevet av capaR-GAL4og en distale hoved segmentet. Skadet MTs skjerm merkbare mengder av mCherry fluorescens med ingen tilsvarende SEpH fluorescens. Bakre MTs er jevn i diameter med ingen morphologically forskjellige segmenter. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Validering og kalibrering av pHerry i Malpighian tubuli.
A. representant widefield bilder av SEpH (470/510 nm ex / em) og mCherry (556/630 nm ex / em) komponenter av UAS-pHerry drevet av capaR-GAL4 viser sunn fremre MTs. "ROI" merker signal områder av interesse. "BG" merker bakgrunn regionen rundt som ble senere trukket fra signalet avkastning i samme kanal. Skala bar = 50 µm. B. Relativ fluorescens endringer i SEpH og mCherry signaler av pHerry svar på en 20 s 40 mM NH4Cl puls. MCherry signalet er stabil mens SEpH signalet viser en karakteristisk økning under pulsen (tegn på alkalization, dvs. økt pHjeg) og en kraftig nedgang på bleke (indikativ av forsuring, dvs. redusert pHjeg). C. fluorescens forholdet mellom pHerry (SEpH/mCherry) beregnes ut fra dataene i B med flere data etter 30 min inkubasjon i kalibrering iPBS (10 µM nigericin, 130 mM K+, pH 7.4 og 9.0). D. kalibreringskurven konstruert fra absolutt pHerry forholdet (SEpH / mCherry) som en funksjon av pålagt pHjeg ved eksponering for kalibrering iPBS bufret til en av åtte pH-verdier. Grå sirkler er enkeltverdiene skjema 8 forberedelser. Svarte firkanter og barer er bety ±SD. kurve Boltzmann passer. E. samme data som i D normalisert slik at fluorescens ved pH 7.0 er 1.0. Kurven er endret sigmoidal kurve (se trinn 7.4, Formel 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Kvantifisering av syre ekstrudering i Malpighian Tubule Epithelia.
A. Widefield bilde av SEpH fluorescens (fra pHerry) i viktigste cellene i den fremre MT (venstre, drevet av capaR-GAL4 sjåfør) og stellate celler av fremre MT (høyre, drevet av c724-GAL4). Merk at stellate celler bar-formet i første segmentet, variabel i overgangsperioden segmentet, og vise forskjellige mobilnettet anslag i viktigste segmentet. Skala bar = 100 µm. B. Kalibrert pHjeg endringer i respons til en 20 s 40 mM NH4Cl puls i områder av interesse vises i en (rektor celler av overgangsordning segmentet, rektor cellene i første segmentet og stellate celler av overgangsordning segmentet). Stiplet kurver betegne enkelt eksponentiell passer brukt syre restitusjonsfasen etter NH4Cl uttak som uttalte decay konstant (τ) verdier er utledet. C. Acid ekstrudering rate (JH +) tegnes som en funksjon pHi avledet fra eksponenten passer i B. Se trinn 8.3.1 JH + beregning (formel 3). Stiplet kurver er eksponentiell passer på hver data tomten innenfor området i overlappende pHjeg merket med den grå boksen. D. Acid flux plottet som en funksjon pHi avledet fra eksponenten passer i B og ligningen 5. Stiplet kurver er eksponentiell passer på hver data tomten innenfor området i overlappende pHjeg merket med den grå boksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

iPBS NH4Cl puls iPBS Kalibrering iPBS
NaCl 121.5 81.5 0
NH4Cl 0 40 0
KCl 20 20 130
Glukose 20 20 20
Buffer HEPES; 8.6 HEPES; 8.6 MES, HEPES eller KRANER; 8.6
NaHCO3 10.24 10.24 0
NaH2PO4 (1 H2O) 4.5 4.5 0
NMDG 0 0 30,5
pH 6.8 6.8 Varierer
OSMOLARITETSSYSTEM 350 ±5 350 ±5 350 ±5

Tabell 1: Eksperimentelle Fly løsninger.
iPBS løsninger tilberedes ved romtemperatur og pH er satt av titrering HCl og NaOH. Kalibrering løsning titreres med HCl og NMDG. Buffer med kalibrering løsning er variert basert på ønsket pH [2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) for pH = 4.0-6.0; 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) for pH = 6.5-7.5; N-[tris (hydroxymethyl) metyl] -3-aminopropanesulfonic acid (KRANER) for pH = 8.0-9.0]. Alle verdier i mM, unntatt pH (uten enhet) og osmolality (mmol/kg). Lager nigericin i DMSO legges til kalibrering løsninger på en siste konsentrasjon av 10 µM like før bruk.

GEpHI Eksitasjon (nm) Utslipp (nm) pKen Notater
Superecliptic pHluorin (SEpH)11 395, 488 530 7.2 Lineær mange, store fold (50 x) økning i pH-sensitive fluorescens over lineær spekter
PT GFP42 390, 475 540 7.3 Godkjent for bruk i anlegget celler
Superecliptic pHluorin - mCherry fusion31 488, 556 530, 620 7.2 Gir kortet mCherry mengdefunksjoner i noen celler
ClopHensor40 488, 545 525, 590 6.8 pH og Cl- sensor. Oppdaterte ClopHensorN30 variant viser mindre samling på nerveceller
pHerry10 488, 556 530, 620 7.2 Oppdatert SEpH-mCherry fusion med linker fra ClopHensor
mNectarine44 558 578 6.9 Korreksjon for photobleaching er ofte nødvendig
pHluorin245 395, 475 509 6.9 Variant av Ratiometric pHluorin12
pHred47 440, 585 610 7.8 Oppdatert variant av lang-Stokes Skift mKeima49, kompatibel med FLIM NIR 2-fotonet bildebehandling
pHuji43 566 598 7.7 Variant av mApple; lavere enn forventet pH følsomhet i noen celler
pHtomato46 550 580 7.8 Validert for å spore vesicula endocytose, dårlig cytocolic pH følsomhet
pHoran443 547 561 7.5 Forbedret pH-sensitive oransje fluorescerende protein
SypHer-248 427, 504 525 8.1 Lysere variant av ratiometric SypHer51, opprinnelig for mitokondrie målinger

Tabell 2: Listen over publiserte Cytosolic GEpHIs
Eksitasjon maxima, utslipp maxima, ogtilsynelatende pKverdier er omtrentlig og kan variere avhengig av uttrykket system, tenkelig teknikk og kalibrering metoden. FLIM = fluorescens levetid imaging mikroskopi. NIR = nær infrarød.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Suksessen til kvantifisering av pHjeg i Drosophila MTs avhenger helt helse utdraget MTs og kvaliteten på montering og disseksjon (Figur A - C). Således, forsiktig håndtering av vev som beskrevet er viktig. Lysbilder fersk belagt i PLL vesentlig hjelpemiddel MT montering som de pleier å være mye mer lim enn lysbilder som tidligere har vært utsatt til løsning. Forsiktig montering vil også hjelpe i identifikasjon av forskjellige MT segmenter (Figur D). Sunn MTs lette kalibrering av pHerry og funksjonelle vurdering ved å redusere mCherry aggregering og gir mye mer konsekvent kvantifisering av syre ekstrudering, henholdsvis. I noen tilfeller kan er unngå mCherry samling ikke mulig da eksperimentelle forhold kan iboende skade MT epithelia eller produsere betydelig over-uttrykk for fluorescerende reporteren I disse tilfellene, en pseudo-ratiometric kalibrering normalisert slik at fluorescens forholdet 1.0 tilsvarer pHjeg 7.0, og punktet kalibreringer tillater kvantifisering (Figur E). Forsiktighet bør utvises når utføre punkt kalibreringer for å unngå å utsette de permanente elementene av imaging og perfusjon å nigericin som ionophore vil følge glass og plast. Med pseudo-ratiometric kalibrering er ikke mulig for omstendigheter som induserer en eksperimentell manipulasjon cellular skade under et eksperiment, dvs skade vil føre en progressiv tilsynelatende økning i mCherry fluorescens gjennom hele eksperimentet. I disse senere tilfeller SEpH fluorescens signalet kan brukes med en normalisert kalibreringskurven og velg kalibreringer, med forbeholdet at avbilding vil ikke lenger rette bevegelse gjenstander og fokus SKIFT.

GEpHIs har flere generelle begrensninger i forhold til kvantifisering av pHjeg med fluorescerende fargestoffer. Fargestoff oppbevaring kan brukes som en indikator på membran integritet og celle helse39, men ingen tilsvarende analysen er tilgjengelig for GEpHIs. Slik må forberedelse helse overvåkes gjennom uavhengige hvis celleskader er spådd for å forvirre resultater. GEpHIs lar imaging fra minimalt forstyrret i vivo forberedelser men vev integritet iboende begrenser eksperimentelle manipulasjoner og kan gjøre peker kalibreringer umulig. En annen bestemt begrensning i pHerry og andre cytosolic dobbelt fluorophore pH indikatorer (som ClopHensor40) kommer fra tendensen til de to fluorophores til å endre deres fluorescens uavhengig av både hverandre og pHjeg . RFP samling gjenstander er viktigste manifestasjonen av denne begrensningen, men kvantifisering kan også bli svekket av photobleaching av en eller begge fluorophores. Dermed imaging protokoller mye justeres for å redusere photobleaching, som kan føre til lange eksponeringstider og oppkjøp priser < 0,2 Hz. lange eksponeringstider vil mislykkes i å rapportere rask pHjeg skifter. SEpH fluorescens viser lineær sammenheng pHjeg fra pH 6.8-7,8 i de fleste preparater, men nøyaktigheten av slike mål avhenger av nøyaktigheten av nigericin/høy K+ teknikken. Nigericin fungerer som en K+h+ ionophore og riktig kalibrering avhengig equilibrating ekstracellulære [K+] med intracellulære [K+]. Anslag over intracellulær [K+] er ikke tilgjengelig eller lett oppnåelig for alle eksperimentelle systemer. Nøyaktigheten av pHjeg kvantifisering vil bare være like pålitelig som anslag over intracellulær [K+], selv om tallene for relative endringen i pHjeg vil være konsekvent. Gitt denne begrensningen og den inverse logaritmiske forholdet mellom pHjeg til intracellulær [H+], er det alltid best å rapportdata som prosentvise endringer i pHjeg, acid ekstrudering rate (JH +, figur 6C) eller Acid flux (figur 6D) i stedet for absolutte endringer i pHjeg. Analyse av data som acid flux har den ekstra fordelen av å korrigere for forskjeller i overflaten er volum forhold mellom celletyper.

Flere ting må være verdsatt når tolke data fra voksen flyr MT forberedelse beskrevet i denne protokollen. Morfologiske æren av første, overgang, og viktigste segmenter er trolig en forenkling av ekte mangfoldet av funksjonelle og genetisk domener stede i MTs2. Videre mens denne protokollen er utformet for å oppdage funksjon av basolateral syre transportører er det mulig at apikale transport kan påvirke pHi mål også. Tetting av urinlederne når montering MTs (trinn 5.9) sikrer at løsningen utveksling primært oppstår på basolateral overflaten men para-mobil og apikale bevegelse ioner kan fortsatt påvirke pHi som basolateral transport til slutt endrer det cytoplasmatiske siden av lumen/cytosolic ion graderinger. Absolutt separasjon av apikale basolateral funksjonen kan oppnås ved uavhengig perfusing den luminal og basolateral flater MT men slike metoder er vesentlig mer teknisk krevende som de krever brønnene cannulation41 .

GEpHIs presenterer mange fordeler fremfor konvensjonelle metoder å måle pHi, og disse styrkene er forsterket når kombinert med den genetiske malleability og lavpris Drosophila MT forberedelser. Kvantifisering av pHjeg har historisk grunnlag fluorescerende fargestoffer som (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)22 eller komplisert elektrofysiologiske vurdering ion-selektiv elektroder20 ,21. Som pHerry er genetisk kodet, det kan uttrykkes i bestemte mobilnettet populasjoner av bestemte arrangører (som vist her i viktigste celler og stellate celler av MT, figur 6), og passer til bruk i alle typer vev kan transgenesis, Hva eller viral-mediert infeksjon. Fargestoffer er begrenset av personlige forberedelser og potensielt komplisert programprotokoller som formidler ingen celle spesifisitet heterogen vev. Ion-selektiv elektroder krever spesialisert utstyr for fabrikasjon og mål, mens pHerry krever bare widefield epifluorescent mikroskopi med konvensjonelle GFP og RFP filter sett. Bruk av fargestoffer og elektroder nødvendiggjøre fysiske og optisk tilgang til vevet rundt mens GEpHIs kan overvåkes i fersk utdraget vev og over tid i vivo. Muligheten for live bildebehandling i intakt preparater er av spesiell interesse når vurdere mobilnettet fysiologi av pHjeg forskrift som ingen annen teknologi tillater kvantifisering av pHjeg i nærvær av endogene bufring mekanismer.

Drosophila voksen MT utarbeidelse presenterer mange attraktive funksjoner for de som er interessert i mobilnettet pH regulering og ion transport. Drosophila dyrehold er billig og verktøy som genetisk kodet biosensor konstruksjoner og RNAi uttrykk setter er lett tilgjengelig fra en rekke lager sentre (Bloomington Drosophila lager Center ved Indiana University; Vienna Drosophila Research Center). Drosophila MTs består av en enkelt lag av polarisert epitelceller, noe som gjør dem ideelle for undersøkelse av transepithelial ion. Basolateral transport kan være lett assayed (som vist her) men full vurdering av apikale basolateral ion bevegelse er mulig med brønnene cannulation41. I tillegg organfunksjon søk som Ramsay sekresjon analysen17 og luminal kalsium oksalat deponering18 er godt karakterisert tillater korrelasjon av epitelial mobilnettet fysiologi modeller av væske sekresjon og nephrolithiasis, henholdsvis. Disse funksjonene gir muligheter for robuste analyser, gjør rimelige og bredt tilgjengeligheten av epifluorescent mikroskopi Drosophila MT modellen ideelt for demonstrasjoner av mobilnettet og hele-orgel fysiologi i undervisningen laboratorier.

Mestring av disse metodene tillater kvantifisering av pHjeg regulering av basolateral H+ flux i voksen Drosophila MTs, en tilgjengelig men robust modell av transepithelial ion transport. Bruk av GEpHIs kultivert som pHerry lett kan tilpasses å vurdere pHi regulering i andre virvelløse celletyper, pattedyrceller, og i vivo forberedelser. Utvikling av nye GEpHIs vil trolig følge av genetisk kodet kalsium indikatorer, med nye generasjoner som dekker det synlige spekteret og adressering gjeldende begrensninger som samling gjenstander30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49. GEpHIs har allerede blitt brukt mye å rapportere mitokondrie matrix pH50,51, og subcellular rettet mot strategier finnes for å lokalisere biosensors til endoplasmatiske retikulum52, kjernen 53, synaptic blemmer12,43, og cytoplasmatiske54 og ytre flater mobilnettet plasma membranen55 (se tabell 2 for en liste over publiserte reagenser). Som sådan verktøyene blir tilgjengelige vil de tillate vertikal integrasjon av sub mobilnettet pH regulering med andre aspekter av mobilnettet fysiologi, som Ca2 + håndtering og intracellulær signalnettverk, og hele organfunksjon over en rekke virveldyr og virvelløse forberedelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH DK092408 og DK100227 å MFR. AJR ble støttet av T32-DK007013. Forfatterne vil takke Dr. Julian A.T. Dow for CapaR-GAL4 og c724-GAL4 Drosophila aksjer. Vi takker også Jacob B. Anderson for hjelp opprettholde eksperimentelle fly kors.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299, (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94, (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271, (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101, (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208, (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281, (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207, (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274, (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111, (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595, (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79, (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22, (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18, (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126, (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67, (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95, (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393, (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74, (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36, (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8, (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63, (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188, (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7, (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255, (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34, (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591, (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61, (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58, (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7, (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309, (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207, (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284, (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2, (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15, (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850, (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24, (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95, (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286, (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14, (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6, (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410, (1), 134-139 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics