Optiska kvantifiering av intracellulära pH i Drosophila melanogaster Malpighian tubuli epitel med ett fluorescerande genetiskt-kodade pH indikatorn

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cellulära ion transport kan ofta bedömas genom att övervaka intracellulära pH (pHjag). Genetiskt ger kodade pH-indikatorer (GEpHIs) optiska kvantifiering av intracellulära pH i intakta celler. Detta protokoll Detaljer kvantifiering av intracellulära pH genom cellulär ex vivo live-imaging av Malpighian tubuli av Drosophila melanogaster med pHerry, en pseudo-proportionerlig kodade genetiskt pH-indikator.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Epitelial ion transport är avgörande för systemisk ion homeostas samt underhåll av viktiga cellulära elektrokemiska gradient. Intracellulära pH (pHjag) påverkas av många ion transportörer och därmed övervakning pHjag är ett användbart verktyg för att bedöma transportör aktivitet. Moderna genetiskt kodade pH-indikatorer-(GEpHIs) ger optiska kvantifiering av pHjag i intakta celler på cellulär och subcellulär nivå. Det här protokollet beskriver realtid kvantifiering av cellulära pHjag reglering i Malpighian tubuli (MTs) i Drosophila melanogaster genom ex vivo live-imaging av pHerry, en pseudo-proportionerlig GEpHI med ett pKen väl lämpad att spåra pH-förändringar i cytosolen. Extraherade vuxen fluga MTs består av morfologiskt och funktionellt distinkta delar av encellig skikt epitel, och kan fungera som en lättillgänglig och genetiskt lätthanterlig modell för utredning av epitelial transport. GEpHIs erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella pH-känsliga fluorescerande färgämnen och jonselektiva elektroder. GEpHIs kan märka olika cellpopulationer förutsatt lämpligt arrangören element är tillgängliga. Denna märkning är särskilt användbart i ex vivo, vivooch i situ preparat, som är till sin natur heterogen. GEpHIs möjliggöra kvantifiering av pHi i intakta vävnader över tiden utan behovet av upprepade dye behandling eller vävnad externalisering. Den främsta nackdelen med nuvarande GEpHIs är tendensen att aggregera i cytosoliskt inneslutningar som svar på vävnadsskada och konstruera över uttryck. Dessa brister, sina lösningar och de inneboende fördelarna med GEpHIs är visat i detta protokoll genom bedömning av basolateral proton (H+) transport i funktionellt distinkta huvudman och stjärnformade celler av extraherade fluga MTs. De tekniker och analys som beskrivs är lätt att anpassa till en mängd olika ryggradsdjur och ryggradslösa preparat och förfining av analysen kan skalas från undervisning labs intrikata fastställandet av ion flux via specifika transportörer.

Introduction

Målet med detta protokoll är att beskriva kvantifieringen av intracellulära pH (pHi) använda en genetiskt-kodade pH-indikator (GEpHI) och visar hur denna metod kan användas för att bedöma basolateral H+ transport i en modell insekt (D. melanogaster) nedsatt struktur, den Malpighian tubuli (MT). MTs fungera som bananflugan utsöndrings organ och är funktionellt liknar den hos däggdjur nefronet i flera viktiga avseenden1. MTs arrangeras som 2 par av tubuli (främre och bakre) i bröstkorg och mage av i farten. Encelliga epitelial röret för varje MT består av metaboliskt aktiva huvudsakliga celler med distinkta apikala (luminala) och basolateral (hemocoel) polaritet samt ortodoxas stjärnformade celler. Främre MTs består av 3 morfologiskt, funktionellt, och utvecklingsmässigt distinkta segment, särskilt inledande vidgade segment, övergångsbestämmelser segment och sekretoriska viktigaste segmentet, som ansluter sig till urinledaren2. På cellulär nivå trans-epitelial ion transport till lumen åstadkoms genom en apikal plasmamembranet V-ATPas3 samt en alkali-metall/H+ -växlare och en basolateral Na+-K+-ATPas4, inåt-likriktaren K+ kanaler5, Na+-driven Cl/HCO3 värmeväxlare (NDAE1)6och Na+-K+-2 Cl hämmare (NKCC; Ncc69)7, medan stjärnformade celler medla Cl och vatten transport8,9. Detta komplex men tillgänglig fysiologiska system ger utmärkta möjligheter för utredning av endogena ion transportmekanismer i kombination med olika genetiska och beteendemässiga toolsets av Drosophila.

Motivet för detta protokoll var att beskriva ett genetiskt formbart system för att studera epitelial ion transport med potential för integration från cell till beteende och export av verktyg till andra modellsystem. Uttryck för pHerry10, en GEpHI som härrör från en fusion av gröna pH-känsliga Super ekliptikan pHluorin11,12 (SEpH) och röd pH-okänsliga mCherry13, i MTs möjliggör kvantifiering av H+ transport i enstaka MT celler genom den höga K+/nigericin kalibrering teknik14. Många ion transportörer flyttar H+ medel, fungerar kvantifiering av intracellulära pHjag som en funktionell representation av ion rörelse via en mängd olika transportörer. Drosophila MT modell systemet erbjuder även kraftfulla genetiska verktyg vävnadsspecifika transgenens15 och RNA interferens (RNAi)16 uttryck, som kan kombineras med cellular imaging och hela-orgel analyser17 , 18 , 19 i tubuli-funktionen för att skapa en robust verktygslåda med vertikal integration från molekyler till beteende. Detta står i kontrast till många andra protokoll för att bedöma epitelial biologi, som historiskt sett sådana mätningar har förlitat sig på intrikata och skrämmande mikro-dissektion, sofistikerad jonselektiva elektroder20,21, och dyra pH-känsliga färgämnen22 med restriktiva lastning krav och dålig cellulära specificitet i heterogena vävnader. GEpHIs har använts i stor utsträckning mäta pHjag i en mängd cell typer23. Tidiga verk utnyttjas den inneboende pH-känsligheten av grönt fluorescerande Protein (GFP) att övervaka pHjag i odlade epitelceller24 men de senaste två decennierna har sett GEpHIs som används i nervceller25, glia26, svampar27 , och växten celler28. Kombinationen av potentialen för cellulära inriktning genetisk konstruktioner genom de GAL4/UAS uttryck system15 och den Drosophila MT fysiologiska tillgänglighet gör detta till en idealisk förberedelse för utredningar av pHjag förordning och epitelial ion transport.

pHi förordning har studerats i årtionden och är avgörande för liv. MT preparatet erbjuder en robust modell att lära fysiologi av pHi förordning men också utföra sofistikerade utredningar av pHi förordning ex vivo och in vivo. Detta protokoll beskriver kvantifiering av H+ rörelse över basolateral membranet i epitelcellerna i Drosophila MT använder NH4Cl puls syra lastning teknik21, men som den pH-indikatorn är genetiskt kodade, kan dessa metoder och deras teoretiska ram tillämpas på någon beredning mottagliga för genmodifiering och live-imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla steg i detta protokoll överensstämmer med riktlinjerna Mayo Clinic (Rochester, MN) användning av djur.

1. flyga djurhållning

  1. Höja flugor och uppsättning korsar enligt standard djurhållning29.
    Obs: Fluorescerande reporter uttryck av GAL4/UAS systemet är proportionell mot temperaturen och således uppfödning temperaturen kan justeras för att förändra uttrycket nivå. Medan hög uttrycksnivåerna ofta leda till en bättre signal-brus-förhållande är detta villkor också förknippat med ökad cytosoliska och organellar aggregat när med GFP till röd fluorescerande Protein (RFP) fusion konstruktioner såsom pHerry10, 30,31. Om aggregering är oundvikligt, kvantifiering är fortfarande möjligt genom att utföra peka kalibreringar i varje experiment och normalisera data så att förhållandet fluorescens av 1,0 motsvarar pHjag 7.0 (se steg 7,4 Obs på kalibrering nedan).
  2. Ställa in korsningar av homozygot capaR-GAL432 män homozygot UAS-pHerry10 oskuld tikar och homozygot c724-GAL42 hanar homozygot UAS-pHerry oskuld honor att tillåta imaging av pHjag i huvudsakliga och stjärnformade celler av MT, respektive. Placera 6 UAS-pHerry honor med 3 GAL4 hanar i färska injektionsflaskor med mat och ledighet att para vid 28 ° C.
    Obs: Larver bör vara uppenbart inom 4 d och vuxna kommer att börja eclose runt dag 10.
  3. Samla kvinnliga flugor på eclosion och ställ åt sidan att åldern för 10 d vid 28 ° C.
    Obs: Tidpunkten för experimenterande kan justeras för att motsvara alla restriktiva beteendemässiga analyser (såsom Ramsay sekretion assay17,19) som kommer att vara korrelerade till intracellulära levande pH imaging. Manliga flugor kan användas men tubuli från hondjur är ofta större och mer robust.

2. beredning av Poly-L-lysin diabilder.

  1. Rita en 40 x 20 mm-gränsen med en hydrofob PAP penna runt toppen av standard 75 x 25 mm-diabilder och avsatts för att torka i 15 min på RT. användning stor coverslips om bilderna inte är kompatibla med imaging optik.
  2. 2 ml av 0,01% Poly-L-lysin (PLL) stamlösning till varje bild och avsatt för 1 h på RT.
  3. Ta bort överflödigt PLL med en pipett. Spara lösningen i en 50 mL konisk injektionsflaska för framtida bruk. Förvaras vid 4 ° C.
  4. Aspirera överbliven lösning med en vakuum linje. Kör dammsugaren över hela bilden ytan så att ingen lösning förblir på bilderna.
  5. Ställ glasen åt sidan för 1 extra h på RT före användning. Lagra bilder torr vid RT för upp till 1 månad i en standard bild bok.

3. beredning av dissekera skålen och glasstavar

  1. Tillsätt 0,5 mL av elastomer härdare till 4,5 mL av elastomer bas i en 35 x 10 mm polystyren petriskål på RT att producera ett djup av 5 mm. Mix med en disponibel pipettspetsen. Tillåta elastomer att bota O/N vid RT.
    Obs: Elastomer bör vara klar och fri från bubblor. Röjning av bubblor kan underlättas genom att hålla elastomer plattor i en vakuum burk för 10-15 min efter hälla.
  2. Håll en 5 mm diameter glasstav mellan händerna och smälta mitten av stången över ett upplyst bunsenbrännare samtidigt dra ändarna isär. Som glaset dra smälter mer snabbt att producera en tunn (0.1 mm) och avsmalnande skaft (figur 1).
    Obs: En 45 ° vinkel på skaftet är ofta användbart vid hantering av tubuli. Detta kan uppnås genom att sänka en hand som shanken är drog (se figur 1).
  3. Bryta det tunna skaftet i mitten med den trubbiga sidan av en eneggad kolstål rakblad. Inspektera den tunna änden av stången under en dissekera omfattning att säkerställa avbrottet är ren.

Figure 1
Figur 1: Fabricera glasstavar för hantering Malpighian tubuli.
A - E. Processen för uppvärmning och dra en glasstav för att producera en kona och vinkel lämpliga för hantering av MTs. pilar betecknar riktning och storlek av kraft tillämpas. F. fotografi av ett lämpligt fabricerade glas verktyg. Skalstapeln = 10 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

4. beredning av lösningar och Perfusion System

Obs: Perfusion systemen skiljer sig av tillverkaren. Detta protokoll baseras runt en gravitation matad 8-kanals öppen reservoar med en ingående flödet klassar regulator och ett utflöde på vakuum-driven, men metoden för montering MTs som beskrivs här kan anpassas till arbeta med något perfusion system.

  1. Förbered följande lösningar:
    1. Alikvotens Schneiders medium (40 mL i 50 mL koniska flaskor) och förvaras vid 4 ° C.
    2. Bereda lösningar (dvs insekt Phosphate-Buffered Saline (iPBS) och iPBS med NH4Cl) på RT som behövs enligt tabell 1). Varma lösningar till RT före användning på dagen av experiment.
      Obs: iPBS iPBS med 40 mM NH4Cl kan vara förberedda i stora volymer (1 L eller mer) och lagras vid 4 ° C.
    3. Förbereda 8 kalibreringslösningar i 500 mL volymer vid pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7,6, 8.0 och 9.0 som anges i tabell 1 och förvaras vid 4 ° C. Justera pH-värdet i varje lösning genom titrering med N-metyl-D-glucamine (NMDG) och HCl.
    4. På dagen för experiment, varm 5 mL alikvoter av kalibreringslösningar RT och lägga till lager nigericin lösning (20 mM i dimetyl sulfoxid (DMSO)) för att producera en slutlig koncentration på 10 µM.
      FÖRSIKTIGHET: Hantera nigericin med handskar. Behandla all utrustning som kommer i kontakt med nigericin som disponibel. Nigericin fortfarande på glas och plast och kommer att äventyra biologiska preparat om utrustningen återanvänds.
  2. Perfusion system:
    1. Prime perfusion systemet genom att fylla alla reservoarer med ddH2O (figur 2). Öppna kanaler en i taget så att alla rader proximalt flödet klassar regulatorn att fylla.
      Obs: Det kan vara nödvändigt att rensa luften i rader av öppna kanalen avstannat och använda en kolv till drive flöde från reservoaren.
    2. Öppna 2 kanaler och låta ddH2O rinna. När behållarna är nästan tom, fyll den första behållaren med iPBS och andra reservoaren med NH4Cl pulsade iPBS. Anger flödet till max med flödet klassar regulatorn och tillåta varje lösning att flyta för 1 min att fylla de distala linjerna och stoppa flödet (figur 2).
    3. Position 2 uppsättningar lödning ”helping hands” klämmor på imaging Mikroskop scenen. Placera en klämma på varje sida av imaging plattformen.
    4. Försiktigt värma de distala 0,5 inches av en kapillär glasbit (inre diameter 1,5 mm, ytterdiameter 0,86 mm, längd 100 mm) över en bunsenbrännare. Skapa en 45 ° böj genom att låta den distala änden att böja av gravitationen och ta bort glaset från lågan när önskad vinkel uppnås. Upprepa denna process med en andra kapillär glasbit.
    5. Sätter böjda glas kapillärer i i-flow linje och vakuum-anslutna utflöde linje, respektive och montera dem i ”hjälpande händerna” att anpassa dem till den imaging etappen av mikroskopet (figur 3).

Figure 2
Figur 2: Perfusion systemet och Imaging konfiguration.
Komponenter som är nödvändiga för fysiologisk bedömning av MT basolateral transportfunktionen genom samtidiga live fluorescens imaging och snabb lösning utbyte. Gasledningar som visas är valfria och tillåta expansion av experiment för att bedömningen av HCO3 transport. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Flöde Schematisk bild av Perfusion apparater för NH4Cl puls experiment.
Pilarna skildra flödesväg och ventil funktionslägen. Lösning flyttas från reservoaren till preparatet gravitation flöde och dras från preparatet kammaren till avfall kolven genom dammsugning. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

5. dissektion av vuxen Drosophila främre Malpighian tubuli.

  1. Samla dissektion skålen och drog en PLL-belagda bild från avsnitt 2, vakuum fett, en självhäftande perfusion-väl avdelare, glasstav från avsnitt 3, en 4 x 2 ”remsa av tätning film, 2 par #5 fina pincett, och 40 mL alikvoter av iskall Schneiders medium och RT iPBS.
  2. Sprida vakuum fett på förseglingstejpen och tryck på självhäftande perfusion-väl delaren på bandet att belägga botten med fett. Lossnar den självhäftande perfusion-väl avdelaren och placera den fett-och-ner ovanpå en PLL belagda bild. Ta bort perfusion-väl avdelare för att lämna individuella exemplaret brunnar spåras i hydrofoba fett.
  3. Plats 200 µL av RT iPBS i den fett-omringade väl i PLL belagda bilden och flytta bilden under stereoskop.
  4. Plats UAS-pHerry/capaR-GAL4 flugor i en tom fluga flaska och söva dem på is i 10 min.
    Obs: Denna metod av anestesi, till skillnad från CO2, säkerställer att flugorna inte torkar ut.
  5. Häll iskall Schneiders medium i dissekera skålen och använda fin pincett för att överföra en enda sövda kvinnliga fluga i skålen under en dissekera stereoskop.
  6. Håll i farten i bröstkorgen med en pincett och använda den andra försiktigt greppa den bakre delen av buken. Dra öppna den bakre delen av i farten med tången i korthet, avsiktliga rörelser. När hindgut är synliga, greppa distala änden och gratis tarmen och MTs från de underliggande tracheoles genom att dra hindgut från kroppen genom repetitiva, kort bogserbåtar.
    Obs: De främre och bakre MTs kommer att synas där de möter korsningen midgut och hindgut genom urinledaren. Det första paret MTs vara fri vilja sannolikt vara de bakre tubuli som de omsluta hindgut. Dessa kan vara ignoreras (figur 4A).
  7. Nyp bort de främre MTs på urinledaren med fin pincett när den andra uppsättningen av MTs är gratis av buken. Detta kommer att separera de främre MTs från tarmen och stänga urinledaren.
  8. Plocka upp de gratis främre MTs med drog glasstaven genom att skjuta staven under urinledaren utformade så att tubuli faller på vardera sida. Lyfta MTs rakt upp ur lösningen.
  9. Slå glasstaven så att MTs och urinledaren följs på undersidan av spöet och lägre urinledaren rakt ner in i bilden. Anbringa urinledaren och täta distala ändarna av MTs genom att trycka på urinledaren ner in i glas bilden (figur 4B). Inte manipulera MTs mer än nödvändigt. MTs bör vara flytande upp i lösningen med urinledaren förankrade till bild.
  10. Använd fina slutet av glasstaven till svep varsamt varje tubuli över bild ytan. Håll i staven mot bilden att undvika krossning av tubuli och glida staven över toppen av den tubuli, flytta distala till proximala, bifoga hela längden av varje tubuli till ytan av PLL-belagd bilden (figur 4 c).
  11. Placera den självhäftande perfusion-väl avdelaren tillbaka på bilden att bilda en liten vätskefylld väl över den monterade tubuli.
  12. Placera preparatet på Mikroskop scenen. Placera inflödet och kassautflöde kapillärer över inlopp och utlopp öppnandet av perfusionen väl, respektive.
    Obs: Väl avdelare kan lämnas om en öppen perfusion kammare önskas. I detta fall kan inflöde och utflöde kapillärerna justeras mot motsatta sidor av en avbildning som väl.

6. validering av Imaging protokoll och tubuli hälsa

Obs: Detta protokoll utförs på en inverterad wide-fältet epifluorescerande Mikroskop med GFP (SEpH) och RFP (mCherry) filteruppsättningar (470/40 nm excitation (ex), 515 nm longpass utsläpp (em), 500 nm dichroic och 546/10 nm ex, 590 nm longpass em, 565 nm dichroic), en 10 X / 0,45 luft mål, en monokromatisk kamera för live-image capture och bildprogram. Protokollet kan anpassas för alla upprätt eller inverterade Mikroskop med automatiserade filter växling mellan GFP och RFP optik och bild förvärv programvara, trots optimal exponering gånger, ljusintensitet och binning parametrar kommer att variera. I alla analyser, bör fluorescensintensiteten analyseras som genomsnittlig pixel intensitet i regionen av intresse (ROI), efter bakgrunden subtraktion i varje kanal med en ROI med innehåller ingen fluorescens intill signalen ROI.

  1. Slå på mikroskopet, ljuskälla och bildsystem.
  2. Öppna tillhörande bildprogram.
  3. Titta genom okularet och manuellt justera fokus tills lumen av MT syns tydligt under genomlysning.
  4. Klicka på fliken ”förvärv” i bild analys programvara och välj ”2 x 2” i menyn ”Binning” pull-down i avsnittet ”förvärv läge”.
  5. Infoga en 5% neutral densitet filter i ljusstrålen att minska belysning ljus och minimera fotoblekning.
  6. Klicka på kanalen GFP (SEpH) i menyn ”kanaler”, klicka på ”Live” för att observera den fluorescerande signalen via kameran.
  7. Justera skjutreglaget ”tid” för att ställa in exponeringstiden så att de ljusaste pixelvärdena i intensitet histogrammet är cirka 40% av det högsta värdet, klicka på ”Stop” för att stoppa belysning.
  8. Upprepa steg 6,6-6,7 i på RFP (mCherry) kanal och bekräfta förekomsten av dilaterade inledande segmentet av främre MT och avsaknad av cytosoliska mCherry aggregat (vägledande av vävnadsskada eller överuttryck) (figur 4 d).
    Obs: Vidgade segmentet ska vara tydligt eftersom det är den mest proximala segmentet av tubuli och diameter inre lumen i detta segment är ~ 20 µm större än angränsande övergångsperiod segmentet. 2 x 2 pixel binning räcker ofta men kan ökas för att ytterligare minska krävs belysning intensitet. Typiska exponeringstider är mellan 150 & 800 ms/kanal. Använd så lite ljus som möjligt för att minimera fotoblekning. Minimera fotoblekning är avgörande för användningen av dual-fluorophore indikatorer såsom pHerry som de två fluorophores kan bleka självständigt, således ogiltigförklara eventuella baserat på kalibrering.
  9. Aktivera en time-lapse imaging protokollet genom att klicka på rutan ”tidsserier”.
  10. Justera ”varaktighet” i den nedrullningsbara menyn i avsnittet ”tidsserier” 10 min och skjutreglaget ”intervall” till 0 för att ange den totala insamlingstiden med en maximal bild förvärv. En totalt förvärv 0.2 Hz är ofta tillräcklig.
  11. Kontrollera både GFP (SEpH) och RFP (mCherry) lådor i avsnittet ”kanaler”.
  12. Öppna iPBS raden av perfusion systemet genom att aktivera lämplig ventilregulatorn och starta imaging protokollet genom att klicka på ”Start Experiment”. Efter 1 min, växlar till NH4Cl puls lösning för 20 s genom öppna lämplig ventilen och stänga iPBS linjen, sedan tillbaka till iPBS genom att stänga den NH4Cl line och Nyöppning iPBS ventilen. Tillåt full imaging protokollet att slutföra innan du stoppar perfusion systemet.
    Obs: Time-lapse analysen bör visa en stabil mCherry signal och en SEpH signal som ökar i närvaro av NH4Cl, släcker på blekt och gradvis återvinner.
  13. Utföra en 2-punktskalibrering.
    1. Ta bort väl delaren genom att dra det från den underliggande bilden och ta bort perfusion kapillärer och klämmor från bildtagning väl.
    2. Gälla av imaging väl med 200 µL pipett 200 µL kalibrering iPBS (pH 7,4, 10 µM nigericin). Bort lösningen från bildtagning med pipetten, sedan ersätta med en annan 200 µL kalibreringslösning. Upprepa detta 4 gånger säkerställa komplett lösning utbyte.
    3. Inkubera preparatet i kalibreringslösning för 30 min innan imaging. Upprepa imaging protokollet med samma parametrar fastställs i steg 6,6-6.11, med ändring av endast 1 min av image capture.
      Obs: Perfusion systemet och kapillärer behövs inte i det här steget och bör inte kopplas till bildtagning väl för att undvika att utsätta kapillärerna till nigericin.
    4. Lägga till 200 µL kalibrering iPBS (pH 9.0, 10 µM nigericin) av imaging väl med 200 µL pipett. Bort lösningen från bildtagning med pipetten, sedan ersätta med en annan 200 µL kalibreringslösning. Upprepa detta 4 gånger säkerställa komplett lösning utbyte.
    5. Inkubera preparatet i andra kalibreringslösningen i 10 min innan imaging. Upprepa imaging protokollet som i steg 6.13.3.
    6. Granska den tagna bild stacken i bild analys programvara för att bekräfta att inga pixlar i antingen kanal är mättade genom att klicka ”menar ROI” och rullning men bilden stacken med skjutreglaget ”Frame” medan du observerar att inga värden rapporteras i intensitet histogrammet nå högsta detekterbar värde. Om alla ramar som innehåller pixlar som når detekterbara maximalstyrkan, minska exponeringen tid eller belysning intensitet och repetera avsnitt 6.
      Obs: När väl etablerat inte ändra imaging parametrar mellan experiment eller kalibrering inte punkt kalibreringar kommer att användas i varje beredning (se steg 8,3).
  14. Analysera bilden bunten för att rita fluorescerande intensitet och fluorescens baserat (SEpH/mCherry) som funktion av tiden.
    1. Klicka ”menar ROI” och välj verktyget frihand. Håll vänsterklick att spåra en ~ 50 µm längd på MT. Högerklicka för att avsluta ritning ROI, sedan upprepa i ett område som gränsar till MT att definiera en bakgrund ROI (figur 5A).
    2. Klicka på ”genomsnittliga intensitet” under ”mått”. Skapa en tabell med intensitetsvärden genom att klicka på ”Exportera > datatabell > Skapa”.
    3. Klicka på konfigureringsikonen för kugghjul och avmarkera alla parametrar utom ”Time” och ”betyder intensitet”. Högerklicka på fliken för den nyskapade datatabellen, Välj ”Spara som” och exportera data som en CSV-fil.
      Obs: Liknande mätningar kan också göras med hjälp av fri programvara såsom ImageJ.
    4. Öppna ett kalkylblad tabellen och importera tabellen genom att välja fliken ”Data” följt av ”från Text”.
    5. Använd funktionerna i kalkylbladet för att subtrahera SEpH bakgrund intensiteten från SEpH Signal intensiteten vid varje tidpunkt. Upprepa denna process för mCherry signalen.
    6. Rita varje kanal intensitet som funktion av tiden genom att välja de kolumner som innehåller i tid och bakgrundskorrigerade intensitet data och sedan klicka ”Infoga > Scatter (diagram) > punktdiagram med raka linjer” (figur 5B).
    7. Du kan använda kalkylbladsfunktioner för att beräkna förhållandet SEpH/mCherry fluorescens vid varje tidpunkt.
    8. Plot fluorescens-förhållande som en funktion av tid genom att markera de kolumner som innehåller i tid och baserat på data och sedan klicka ”Infoga > Scatter (diagram) > punktdiagram med raka linjer” (figur 5 c).

7. fullständig kalibrering av pHerry i Malpighian tubuli Ex Vivo.

  1. Dissekera och montera en ny uppsättning av främre MTs som beskrivs i avsnitt 5.
  2. Utbyta iPBS för kalibrering iPBS (pH 7,4, 10 µM nigericin) som beskrivs i steg 6.13.2. Inkubera i 30 min.
  3. Leta upp MTs och samla par SEpH/mCherry bilder enligt beskrivningen i steg 6.1-6.11. Byt ut lösningen med en annan lager av kalibrering iPBS som beskrivs i steg 6.13.4, vänta 10 min, och bild igen. Upprepa denna process tills förhållandet SEpH/mCherry har varit avbildad i alla lösningar. Få pH 9,0 bilder sist när preparatet sällan återhämtar sig från högt pH.
  4. Rita fluorescens förhållandet mellan SEpH till mCherry från kalibreringar i åtta exemplar som en funktion av påtvingade pHjag som beskrivs i steg 6.14.9. Passa kalibreringsdata med en Boltzmann-kurva för att få full kalibreringsfunktion enligt ekvation 1 (figur 5 d). Om data är inkonsekvent, rita kalibrering uppsättningar från varje prov normaliserade så att förhållandet fluorescens av 1,0 motsvarar pHi 7.0 och åter analysera (figur 5E).
    Obs: Om den sistnämnda processen är nödvändigt individuella experiment behöver sina egna inre punkt kalibreringar33 (se kvantifiering proceduren nedan (steg 8,3)).
  5. Ekvation 1
    Equation 1
    Där R = baserat på SEpH/mCherry och en1,2, xooch dx är kurva montering parametrar som representerar baserat på minsta fluorescens, baserat på maximal fluorescens, pKenoch bredd av funktionen respektive. xo = skenbar pKen av pHerry, som kan variera mellan 7.1 och 7.4 beroende på celltyp och exakt kalibrering villkor.

8. kvantifiering av Basolateral syra extrudering från Ex Vivo Malpighian tubuli epitel.

  1. Bild pHerry-uttryckande stjärnformade celler och pHerry-uttryckande principal celler samtidigt.
    1. Dissekera främre MTs från ett UAS-pHerry/capaR-GAL4 fly som beskrivs i avsnitt 5, men inte överför MTs från den dissekera Schneiders medium till bildtagning väl.
    2. Dissekera främre MTs från en UAS-pHerry/c724-GAL4 fluga i samma dissekera skålen med hjälp av proceduren som beskrivs i avsnitt 5.
    3. Över de 2 uppsättningarna av MTs till den samma imaging väl enligt beskrivningen i steg 5.8 – 5.11.
      Obs: När svepande armarna på MTs ner till bilden, placera MTs den UAS-pHerry/c724-GAL4 och de UAS-pHerry/capaR-GAL4 tubuli nära varandra så pHerry-uttryckande huvudman och stjärnformade celler kan visualiseras i på samma fält ( Figur 6A).
  2. Applicera den NH4Cl Repulse som beskrivs i steg 6.12.
    Obs: Om konsekvent kalibrering (figur 4B) inte kunde uppnås, utföra en punktskalibrering genom att ange pHi 7.0 i slutet av varje experiment med kalibrering iPBS (pH 7,0, 10 µM nigericin, 30 min inkubering) efter limmet perfusion-väl avdelare och perfusion utrustningen har tagits bort.
  3. Kalibrera spår från stjärnformade och huvudsakliga celler för olika MT segment (med absolut eller normaliserade kvoten som lämpliga) med ekvation 2 och analysera återhämtningsfasen efter NH4Cl uttag genom att tillämpa exponentiell förruttnelse funktioner med hjälp av statistisk analysprogramvara och att notera konstanten decay (τ) (figur 6B).
    Ekvation 2
    Equation 2
    Där R = baserat på SEpH/mCherry och en1,2, xooch dx är kurva montering parametrar bestäms av kalibrering i steg 7,4 (ekvation 1).
    1. Beräkna syra extrudering (JH +, se ekvation 3) som en funktion av pHjag ta hänsyn till variationer i vila pHjag och syra lastning mellan preparat34. Använd exponentialfunktioner härrör i steg 8,3 för att beräkna derivatan av pHjag när det gäller tid i varje tidsintervall.
      Ekvation 3
      Equation 3
    2. Beräkna den inneboende buffertkapacitet (βi; Ekvation 4) i cytosolen på pHjag från början av varje intervall i steg 8.3.1 baserat på tidigare litteratur (se ekvation 4).
      Obs: I Drosophila, mest grundliga karakterisering av βjag kommer från larval motor nerv terminaler35 och dessa uppgifter kan antas för att hålla för MT celler i avsaknad av andra tillgängliga uppgifter.
      Ekvation 4
      Equation 4
    3. Beräkna produkten av βT (från steg 8.3.2)och dpHjag/DT (från steg 8.3.1) för att avgöra JH + (ekvation 3).
      Obs: I nominellt bikarbonat-fria lösningar såsom de som beskrivs i detta protokoll, bikarbonat-derived buffrande kapacitet (βb) antas vara ~ 0 mM. Totalt buffrande kapacitet (βT) är summan av βjag ochβboch således βjag = βT i avsaknad av HCO3tillpass236.
    4. Rita JH + som en funktion av den pHjag i början av varje tidsintervall som beskrivs i steg 6.14.9.
    5. Gälla del av alla datamängder som överlappar i pHjag använder statistisk analysprogramvara exponentiell förruttnelse funktioner. Jämför priser för förändring av de resulterande funktionerna att jämföra syra extrudering priser mellan celler och MT segment (figur 6 c).
      Obs: Funktionen lämpligaste används för kurva montering kan inte alltid vara en enda exponentiell. Andra funktioner kan ersättas om de förbättrar godhet passform.
    6. Beräkna acid flux (se ekvation 5) som en funktion av pHjag ta hänsyn till variationer i Cellstorlek och form.
      Ekvation 5
      Equation 5
      Obs: Cell dimensioner kan antingen mätas direkt i bilder eller approximerat. Huvudsakliga celler kan representeras som halvor av ett ihåligt rör med följande mått: innerdiameter 24 µm; yttre diameter 48 µm; höjd 50 µm. övergångsbestämmelser stjärnformade celler är variabel men grovt kan representeras som cylindrar med höjder 50 µm och diametrar 10 µm. Se sista stycket i Representativa resultat nedan.
    7. Gälla del av alla datamängder som överlappar i pHjag använder statistisk analysprogramvara exponentiell förruttnelse funktioner. Jämför priser för förändring av de resulterande funktionerna att jämföra syra flöden mellan celler och MT segment (figur 6 d).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Friska vävnader och korrekt identifiering av främre MTs är avgörande för framgång i detta protokoll. Under dissektion, bör man inte direkt beröring MTs och endast handtag dem genom urinledaren som gripande MTs direkt kommer att leda till brott (figur 4A B). När MTs sopas platta in i bilden, tubuli får röras så lite som möjligt och överflödig motion undvikas eftersom detta kommer att skada encelliga epitelskiktet (figur 4 c). Korrekt dissekeras visar främre MTs jämn fördelning av både röda och gröna fluorescens genom cytosolen av epitelceller och morfologiskt skilda tubuli segment. Tubuli skadas av felaktig perfusion eller misskötsel visas aggregering av röd fluorescens med ingen Parade grön aggregat och felidentifierad bakre MTs visar enhetliga morfologi från den proximala blinda änden till distala urinledaren (figur 4 d) . 

Korrekt funktion av pHerry måste bekräftas dock fysiologisk bedömning samt morfologi. Den mest ändamålsenliga metoden för bekräftar korrekt pH-sensing är att tillämpa en NH4Cl puls. Under dessa förhållanden den gröna SEpH signal bör rapportera de förväntade pH-förändringarna (en ökning av pHjag under pulsen som NH3 går in i cellen, en gradvis nedgång under pulsen som NH4+ in genom K+ transportörer och kanaler, och en snabb försurning och gradvis återhämtning på NH4Cl uttag21, medan den röda mCherry signalen bör vara konstant (figur 5A B). Storleken på förändringar i SEpH signalen varierar med protokoll och cell typ, men mCherry signalen ska vara stabil i alla fall. Förändringar i mCherry signalen under enskilda experiment tyder rörelse artefakter eller progressiva generation av sensorn aggregat på grund av cellskador. Den senare kommer att förhindra kvantifiering av pHjag och måste undvikas. Efter att ha avslutat den NH4Cl puls är det viktigt att utföra en 2-punktskalibrering (kalibrering iPBS, pH 7,4 och 9.0, 10 µM nigericin) att bekräfta en vilande pHjag nära 7,4 och säkerställa att de aktuella parametrarna för imaging inte leder till mättnad av fluorescens upptäckt när fluorescens är maximerat vid pH 9,0 (figur 5 c). Om vila pH är betydligt lägre än 7,4, bör protokollet upprepas med friska MTs; och om mättnad uppstår vid pH 9,0, protokollet bör upprepas med lägre ljus intensitet eller exponering tid. När tillräcklig imaging parametrar bestäms, bör de inte ändras mellan experiment eller kalibreringar om absoluta fluorescens nyckeltalen ska användas. Medan de pseudo-proportionerlig naturen av pHerry kan ge en metod för rörelse korrigering i preparat benägna att rörelse eller förändringar i cell diameter, absolut kvantifiering av pHjag kräver fullständig systematisk korrelation mellan pHerry SEpH / mCherry förhållande till pHjag genom nigericin/hög K+ teknik. Kalibrering av pHerry i friska preparat bör producera konsekventa kalibreringskurvorna med en skenbar pKen av 7.1-7.4 beroende på cell typ och kalibrering (figur 5 d). För preparat i vilka mCherry aggregation är oundviklig, normalisering av ratio värden så att förhållandet fluorescens av 1,0 motsvarar pH börjag 7.0 ge liknande resultat (figur 5E). Om punkt kalibreringar och normaliserade kurvorna används, imaging parametrar kan optimeras för varje beredning. 

Kalibrerad pHjag spår kan användas för att jämföra pH reglerande mekanism mellan celltyper. Systemets GAL4/UAS uttryck i Drosophila kan användas för att uttrycka pHerry i huvudsakliga och stjärnformade celler av främre MT (figur 6A). pHi förordning kan bedömas genom syra-lastning celler med NH4Cl pulser och kvantifiera pHjag återhämtningstakten. Detta kan åstadkommas genom att montera exponentialfunktioner att återhämtningsfasen i olika experimentella förhållanden att extrahera konstanten decay (τ) som celler med snabbare H+ efflux visas en snabbare återhämtning (och därmed lägre värden av τ). Baserat på denna analys, verkar stjärnformade celler av MT ha mer robust syra extrudering än huvudsakliga celler (figur 6B). Denna analys kommer att hålla så länge som den vilande pHjag, omfattningen av syra lastning och buffert kapacitet är liknande mellan experimentella grupper. När dessa villkor inte uppfylls, är det dock nödvändigt att ta hänsyn till observationen att inneboende buffertkapacitet i cytosolen (βi) av många celler själv är pH-beroende35,37,38 och därmed förändringstakten pHjag vid olika pHjag kanske inte direkt jämförbara. I sådana fall passa exponentiella kurvor denna syra extrudering fas en NH4Cl puls och tidigare fastställd uppskattningar av inneboende buffertkapacitet (βi) kan användas för att rita andelen sura extrudering (JH +) som en funktion av pHjag och fastställa kompenserad syra extrudering (ekvationer 3 & 4). När skillnaderna i syra lastning och vilar pHjag redovisas, för det är uppenbart överstiga syra extrudering i huvudsakliga celler för segmentet övergångsperiod stjärnformade celler (figur 6 c). Samtidigt övertygande, denna analys behandlar inte som mäts pHjag är en funktion av volymen medan syra extrudering över plasmamembranet är en funktion av membran yta. Att dividera JH + av ytan till volymförhållandet av cellen av intresse kommer att ge värden i mol av syraekvivalenter per ytenhet per tidsenhet (ekvation 5), vilket möjliggör korrigering för olikheter i Cellstorlek och morfologi. Ungefär två huvudsakliga celler utgör omkretsen av MT i segmenten övergångsbestämmelser och således enstaka celler kan modelleras som hälften av en tub (inre diameter 24 µm, yttre diameter 48 µm, höjd 50 µm). Stjärnformade celler är mindre och tenderar att vara bar-formade i segmentet övergångsperiod av MT2. Exakt kvantifiering av yta och volym är svårt men även konservativa approximationer av övergångsbestämmelser stjärnformade cell form (cylindrar med en höjd av 50 µm och en diameter av 10 μm) indikerar en yta att volymförhållandet minst 2 x som av huvudsakliga celler. Beaktat detta avslöjar att den stjärnformade cell acid fluxen ligger betydligt under det av övergångsbestämmelser huvudsakliga celler, och i själva verket närmar sig som inledande segmentet huvudsakliga celler (figur 6 d).

Figure 4
Figur 4: Dissektion av vuxen Drosophila främre Malpighian tubuli.
A. Schematisk framställning av främre MT borttagning med 2 par fina tången i kylda Schneiders medium. ”A. tubuli” = främre MT. ”s. tubuli” = bakre MT. B. Processen för hämtning och montering extraherade MTs med hjälp av tunna glasstavar. C. processen av att följa hela längden av extraherade MTs till en bild för bildhantering och fysiologisk bedömning. D. representant widefield bilder av SEpH (470/510 nm ex / em) och mCherry (556/630 nm ex / em) komponenter av UAS-pHerry drivs av capaR-GAL4 föreställande friska främre MTs, främre MTs skadas av otillräcklig perfusion och felidentifierad bakre MTs. Obs att friska främre MTs visar en tydlig vidgade blinda initiala segment, ett förträngda övergångsperiod segment med relativt ökat uttryck av UAS-pHerry när drivs av capaR-GAL4och en distal huvud segmentet. Skadad MTs display märkbar aggregat av mCherry fluorescens med ingen motsvarande SEpH fluorescens. Bakre MTs är enhetliga i diameter med inga morfologiskt skilda segment. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Validering och kalibrering av pHerry i Malpighian tubuli.
A. representant widefield bilder av SEpH (470/510 nm ex / em) och mCherry (556/630 nm ex / em) komponenter av UAS-pHerry drivs av capaR-GAL4 föreställande friska främre MTs. ”ROI” marks signalerar regionen av intresse. ”BG” märken bakgrund regionen intresse som var därefter subtraheras från signalen ROI i samma kanal. Skalstapeln = 50 µm. B. Relativa fluorescens förändringar i SEpH och mCherry signalerar av pHerry svar på en 20 s 40 mM NH4Cl puls. Observera att mCherry signalen är stabil medan SEpH signalen visar en karakteristisk ökning under pulsen (vägledande av alkalization, dvs ökat pHjag) och en kraftig minskning på blekt (vägledande av försurning, dvs. minskat pHjag). C. fluorescens förhållandet mellan pHerry (SEpH/mCherry) beräknat från data i B med ytterligare data efter 30 min inkubation i kalibrering iPBS (10 µM nigericin, 130 mM K+, pH 7,4 och 9.0). D. kalibreringskurvan konstruerade från absoluta pHerry förhållande (SEpH / mCherry) som en funktion av pHjag under exponering för kalibrering iPBS buffrad till en av åtta pH-värden. Grå cirklar är individuella värden formulär 8 preparat. Svarta fyrkanter och barer är medelvärde ±SD. kurvan är Boltzmann passform. E. samma data som i D normaliserade sådan att fluorescens förhållandet vid pH 7,0 är 1.0. Kurvan är modifierad sigmoidal kurva passar (se steg 7.4, ekvation 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Kvantifiering av syra extrudering i Malpighian tubuli epitel.
A. Widefield bild av SEpH fluorescens (från pHerry) i huvudsakliga celler i främre MT (vänster, drivet av capaR-GAL4 drivrutin) och stjärnformade celler i främre MT (höger, drivs av c724-GAL4). Observera att stjärnformade celler är bar-formade i första segmentet, variabel i segmentet för övergångsbestämmelser och visa olika cellulära prognoser i det största segmentet. Skalstapeln = 100 µm. B. Kalibrerad pHjag förändringar i svar på en 20 s 40 mM NH4Cl puls i regionerna av intresse betecknas i en (huvudsakliga celler av den övergångsperiod segment, huvudsakliga celler för segmentet inledande och stjärnformade celler för segmentet övergångsbestämmelser). Streckad kurvorna beteckna enda exponentiell passar tillämpas på syra återhämtningsfasen efter NH4Cl tillbakadragande som uttalade decay konstant (τ) värdena härrör. C. syra extrudering rate (JH +) ritas som en funktion pHi härrör från den exponentiella passar ses i B. Se punkt 8.3.1 för JH + beräkning (ekvation 3). Streckad kurvor är exponentiell passar tillämpas på varje data tomt inom område överlappande pHjag betecknas med den grå rutan. D. Acid flux ritas som en funktion pHi härrör från den exponentiella passar ses i ekvation 5och B. Streckad kurvor är exponentiell passar tillämpas på varje data tomt inom område överlappande pHjag betecknas med den grå rutan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

iPBS NH4Cl puls iPBS Kalibrering iPBS
NaCl 121,5 81,5 0
NH4Cl 0 40 0
KCl 20 20 130
Glukos 20 20 20
Buffert HEPES; 8,6 HEPES; 8,6 MES, HEPES eller kranar; 8,6
NaHCO3 10,24 10,24 0
NaH2PO4 (1 H2O) 4.5 4.5 0
NMDG 0 0 30,5
pH 6,8 6,8 Varierar
OSMOLARITETSSYSTEM 350 ±5 350 ±5 350 ±5

Tabell 1: Experimentell flyga lösningar.
iPBS lösningar är beredda vid rumstemperatur och pH ställs genom titrering med HCl och NaOH. Kalibreringslösning titreras med HCl och NMDG. Buffert av kalibreringslösningen är varierande utifrån önskad pH [2-(N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES) för pH = 4,0-6,0; 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) för pH = 6,5-7,5; N-[tris (hydroxymetyl) metyl] -3-aminopropanesulfonic syra (kranar) för pH = 8,0-9,0]. Alla värden i mM, utom pH (unitless) och osmolalitet (mmol/kg). Lager nigericin i DMSO läggs till kalibreringslösningarna till en slutlig koncentration av 10 µM strax före användning.

GEpHI Magnetisering (nm) Utsläpp (nm) pKen Anteckningar
Superecliptic pHluorin (SEpH)11 395, 488 530 7.2 Stora linjära området, stora vika (50 x) ökning av pH-känsliga fluorescens över linjära området
PT GFP42 390, 475 540 7,3 Godkänts för användning i växtceller
Superecliptic pHluorin - mCherry fusion31 488, 556 530, 620 7.2 Producerar oparade mCherry aggregat i vissa celler
ClopHensor40 488, 545 525, 590 6,8 pH och Cl sensor. Uppdaterad ClopHensorN30 variant visar mindre aggregation i nervceller
pHerry10 488, 556 530, 620 7.2 Uppdaterad SEpH-mCherry fusion med linker från ClopHensor
mNectarine44 558 578 6,9 Korrigering för fotoblekning är ofta nödvändigt
pHluorin245 395, 475 509 6,9 Variant av proportionerlig pHluorin12
pHred47 440, 585 610 7,8 Uppdaterad variant av lång-Stokes Skift mKeima49, kompatibel med FLIM NIR 2-photon imaging
pHuji43 566 598 7,7 Variant av mApple; lägre än förväntade pH-känslighet i vissa celler
pHtomato46 550 580 7,8 Validerade för att spåra vesikulär endocytos, dålig cytocolic pH känslighet
pHoran443 547 561 7.5 Förbättrad pH-känsliga orange fluorescerande protein
SypHer-248 427, 504 525 8.1 Ljusare variant av proportionerlig SypHer51, ursprungligen för mitokondriell mätningar

Tabell 2: Förteckning över publicerade cytosoliska GEpHIs
Magnetiseringen maxima, utsläpp maxima och uppenbara pKen värden är ungefärliga och kan variera beroende på uttryck systemet, bildteknik och kalibreringsmetod. FLIM = fluorescens livstid imaging mikroskopi. NIR = nära infraröd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Framgången för kvantifiering av pHjag i Drosophila MTs beror helt på extraherade MTs och kvaliteten på montering och dissektion (Figur A C) hälsa. Således är beskrivs noggrann hantering av vävnad som absolut nödvändigt. Bilder nyligen målade i PLL väsentligt stöd MT montering eftersom de tenderar att vara mycket mer lim än glider som tidigare har exponerats lösning. Noggrann montering kommer också stöd i att identifiera distinkta MT segment (Figur D). Friska MTs underlätta kalibrering av pHerry och funktionell bedömning genom att minska mCherry aggregation och ger mycket mer konsekvent kvantifiering av syra extrudering, respektive. I vissa fall går undvika mCherry aggregation inte eftersom de experimentella förhållandena kan till sin natur skada MT epitel eller producera betydande över uttryck av fluorescerande reporter. I dessa fall en pseudo-proportionerlig kalibrering normaliserade så att fluorescens ggr 1,0 motsvarar pHjag 7.0 och punkt kalibreringar kommer att möjliggöra kvantifiering (Figur E). Försiktighet bör iakttas när utför punkt kalibreringar för att undvika att utsätta de permanenta element av imaging och perfusion till nigericin som jonofor fäster på glas och plast. Även pseudo-proportionerlig kalibrering är inte möjligt för omständigheter som inducerar en experimentell manipulation cellulära skador under ett experiment, dvs denna skada kommer att orsaka en progressiv skenbara ökning mCherry fluorescens hela experimentet. I dessa senare fall SEpH fluorescens signalen kan användas med en normaliserad kalibreringskurvan och punkt kalibreringar, med förbehållet att bildtagning inte längre kommer att korrigera för rörelse artefakter och fokal SKIFT.

GEpHIs bär flera allmänna begränsningar jämfört med kvantifiering av pHjag med fluorescerande färgämnen. Dye lagring kan användas som en indikator på membran integritet och cell hälsa39, men ingen motsvarande analys finns för GEpHIs användning. Som sådan måste förberedelse hälsa övervakas genom oberoende om cellskador förutspås att blanda ihop resultaten. GEpHIs tillåter potentiellt imaging från minimalt störd i vivo preparat men vävnad integritet inneboende begränsar experimentella manipulationer och kan göra peka kalibreringar omöjligt. En annan specifik begränsning inneboende in med pHerry och andra cytosoliska dubbla fluorophore pH indikatorer (t.ex. ClopHensor40) härstammar från de två fluorophores tendens att förändra deras fluorescens oberoende av både varandra och pHjag . RFP aggregering artefakter är den mest betydande manifestationen av denna begränsning, men kvantifiering kan också äventyras av fotoblekning av ena eller båda fluorophores. Således, imaging protokoll mycket justeras för att minimera fotoblekning, vilket kan leda till långa exponeringstider och förvärvet priser < 0,2 Hz. långa exponeringstider misslyckas att rapportera snabb pHjag skiftar. SEpH fluorescens visar linjär korrelation till pHjag från pH 6,8-7,8 i de flesta preparat, men riktigheten av sådana mätningar är beroende av noggrannheten i nigericin/hög K+ tekniken. Nigericin fungerar som en K+/h+ jonofor och korrekt kalibrering bygger på equilibrating extracellulära [K+] med intracellulära [K+]. Uppskattningar av intracellulära [K+] är inte tillgängliga eller lätt kan anskaffas för alla experimentella system. Noggrannhet pHjag rapporteringsgräns kommer bara vara lika tillförlitliga som uppskattningar av intracellulära [K+], även om andelen relativ förändring i pHjag blir konsekvent. Med tanke på denna begränsning och det omvända logaritmiska förhållandet av pHjag till intracellulära [H+], det är alltid bättre att rapportera data som förändringstakt i pHjag, sura extrudering rate (JH +, figur 6 c), eller Acid flux (figur 6 d) i stället för absoluta förändringar i pHjag. Analys av data som acid flux har fördelen av att korrigera för skillnader i ytan är att volymförhållandet mellan celltyper.

Flera varningar måste uppskattas när tolka data från vuxen flyga MT förberedelse beskrivs i detta protokoll. Morfologiska skillnaden av de inledande, övergångsbestämmelser, och huvudsegment är sannolikt en förenkling av funktionella och genetiska domäner som är närvarande i MTs2sann mångfald. Dessutom, medan detta protokoll är planerat på upptäcka funktion av basolateral syra transportörer är det möjligt att apikala transport kan påverka pHi mätningar samt. Tätning urinledarna när montering MTs (steg 5,9) säkerställer att lösningen utbyte främst inträffar på basolateral ytan men para-cellulär och apikala rörelse av joner kan fortfarande påverka pHi eftersom basolateral transport i slutändan förändrar den cytoplasmiska sida av lumen/cytosoliska ion övertoningar. Absoluta separation av apikala och basolateral funktion kan åstadkommas genom självständigt startas den luminala och basolateral ytor av MT men sådana metoder väsentligen mer tekniskt krävande eftersom de kräver mikropipett kanylering41 .

GEpHIs presenterar många fördelar jämfört med konventionella metoder för att mäta pHi, och dessa styrkor förstärks när kombinerade med den genetiska formbarheten och låg kostnad av Drosophila MT preparatet. Kvantifiering av pHjag har historiskt åberopas fluorescerande färger såsom (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)22 eller komplicerade elektrofysiologiska bedömning via jonselektiva elektroder20 ,21. Eftersom pHerry är genetiskt kodad, det kan uttryckas i specifika cellulära populationer av specifika initiativtagare (som visas här i främsta och stjärnformade celler av MT, figur 6) och är lämpade att använda i någon vävnad omfattas av genmodifiering, transfection eller viral-medierad infektion. Färgämnen är begränsade av kostnaden för enskilda preparat och potentiellt komplicerade programprotokoll som förmedlar inga cell specificitet i heterogena vävnader. Jonselektiva elektroder kräver specialiserad utrustning för tillverkning och mätning, medan pHerry kräver endast widefield epifluorescerande mikroskopi med konventionella GFP och RFP filter set. Användning av färgämnen och elektroder kräva fysisk samt optisk tillgång till vävnaden i intresse medan GEpHIs kan övervakas i nymalen extraherade vävnader och över tid i vivo. Möjlighet för levande imaging i intakt preparat är av särskilt intresse när bedömningen av cellulär physiologyen av pHi förordning som ingen annan teknik tillåter kvantifiering av pHjag i närvaro av endogena buffring mekanismer.

Drosophila vuxen MT beredningen presenterar många attraktiva funktioner för dem intresserade av cellulära pH reglering och ion transport. Drosophila djurhållning är billig och verktyg såsom genetiskt-kodade biosensor konstruktioner och RNAi uttryck skär är lätt tillgängliga från en mängd olika lager centers (Bloomington Drosophila lager Center vid Indiana University; Vienna Drosophila Research Center). Drosophila MTs består av ett enda lager av polariserade epitelceller, vilket gör dem idealiska för utredning av transepithelial ion transport. Basolateral transport kan enkelt analyseras (som visas här) men fullständig bedömning av apikala och basolateral ion rörelse är möjlig med mikropipett kanylering41. Dessutom organfunktion analyser såsom de Ramsay sekretion assay17 och den luminala kalciumoxalat nedfall18 är välkarakteriserad och möjliggöra korrelation av epitelial cellulär fysiologi till modeller av vätska sekretion och njursten, respektive. Även dessa funktioner ger möjligheter för robust analys, gör låg kostnad och bred tillgång till epifluorescerande mikroskopi Drosophila MT modellen perfekt för demonstrationer av cellulära och hela-orgel fysiologi i undervisning laboratorier.

Behärskning av dessa metoder tillåter kvantifiering av pHi förordning av basolateral H+ flux i vuxen Drosophila MTs, tillgänglig men ändå robust modell av transepithelial ion transport. Användning av GEpHIs odlade såsom pHerry kan lätt anpassas till bedöma pHi förordning i andra ryggradslösa celltyper, däggdjursceller och i vivo preparat. Utveckling av nya GEpHIs kommer att sannolikt följa som genetiskt-kodade kalcium indikatorer, med nya generationer som spänner över det synliga spektrumet och ta itu med nuvarande begränsningar såsom aggregering artefakter30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49. GEpHIs har redan använts i stor utsträckning att rapportera mitokondriell matrix pH50,51och subcellulär inriktning strategier finns för att lokalisera biosensorer endoplasmatiska retiklet52, kärnan 53, synaptiska vesikler12,43, och cytoplasmiska54 och utvändiga ytor av cellulära plasmamembranet55 (se tabell 2 för en lista över publicerade reagenser). Som sådana verktyg som blir tillgängliga de kommer att tillåta vertikal integration av sub cellulära pH-reglering med andra aspekter av cellulär fysiologi, såsom Ca2 + hantering och Intracellulär signalering, och hela organfunktion över en mängd olika ryggradsdjur och ryggradslösa preparat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH DK092408 och DK100227 till MFR. AJR stöddes av T32-DK007013. Författarna vill tacka Dr Julian A.T. Dow för CapaR-GAL4 och c724-GAL4 Drosophila bestånd. Vi tackar också Jacob B. Anderson för hjälp att upprätthålla experimentella flyga kors.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299, (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94, (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271, (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101, (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208, (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281, (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207, (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274, (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111, (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595, (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79, (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22, (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18, (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126, (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67, (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95, (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393, (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74, (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36, (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8, (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63, (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188, (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7, (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255, (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34, (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591, (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61, (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58, (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7, (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309, (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207, (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284, (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2, (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15, (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850, (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24, (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95, (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286, (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14, (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6, (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410, (1), 134-139 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics