Montaje y Seguimiento de Desarrollo Comunitario Microbiano dentro de una Plataforma de Matriz de Micropedulos

Bioengineering

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Summary

El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores, incluyendo la arquitectura ambiental, la abundancia de los miembros, los rasgos y las interacciones. Este protocolo describe un ambiente sintético y microfabricado para el seguimiento simultáneo de miles de comunidades contenidas en pozos de femtoliter, donde factores clave como el tamaño de nicho y el confinamiento pueden ser aproximados.

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Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform. J. Vis. Exp. (124), e55701, doi:10.3791/55701 (2017).

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Abstract

El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores deterministas y estocásticos complejos que pueden alterar drásticamente la distribución espacial y las actividades de los miembros de la comunidad. Hemos desarrollado una plataforma de matriz de micropocillos que se puede utilizar para montar y rastrear rápidamente miles de comunidades bacterianas en paralelo. Este protocolo destaca la utilidad de la plataforma y describe su uso para supervisar ópticamente el desarrollo de comunidades simples de dos miembros dentro de un conjunto de matrices dentro de la plataforma. Esta demostración utiliza dos mutantes de Pseudomonas aeruginosa , parte de una serie de mutantes desarrollados para estudiar la patogenicidad de la secreción de Tipo VI. Las inserciones cromosómicas de los genes mCherry o GFP facilitan la expresión constitutiva de proteínas fluorescentes con distintas longitudes de onda de emisión que pueden usarse para monitorear la abundancia y ubicación de los miembros de la comunidad dentro de cada micropocillo. Este protocolo describe una metodologíaD para ensamblar mezclas de bacterias en los pocillos de la matriz y usar imágenes de fluorescencia en intervalos de tiempo y análisis cuantitativo de imágenes para medir el crecimiento relativo de cada población miembro a lo largo del tiempo. Se discute la siembra y el ensamblaje de la plataforma de micropocillos, los procedimientos de imagen necesarios para el análisis cuantitativo de las comunidades microbianas dentro de la matriz y los métodos que pueden usarse para revelar interacciones entre el área de las especies microbianas.

Introduction

Las comunidades microbianas están formadas por factores deterministas, como la estructura del medio ambiente y los procesos estocásticos, que están asociados con la muerte celular, la división, la concentración de proteínas, el número de organelos y la mutación 1 . Dentro del entorno natural, puede ser casi imposible analizar el impacto individual de estas influencias en la composición y actividad de la comunidad. Obscurecido por las estructuras naturales y enterrado dentro de un medio químico y biológico, la identificación de los miembros de la comunidad y la resolución de su distribución espaciotemporal en el medio ambiente natural es extremadamente difícil. Sin embargo, los esfuerzos recientes han subrayado la importancia de la organización espacial en la función de la comunidad y señalan la necesidad de tener en cuenta tanto la abundancia como la organización de los miembros en los estudios en curso 2 , 3 , 4 .

Eso( Es decir, la disponibilidad de nutrientes y metabolitos secundarios), la estructura física ( por ejemplo, la arquitectura del suelo, las raíces de las plantas, las partículas oceánicas o los microvellos intestinales), la presencia o ausencia de oxígeno y la introducción de Las especies patógenas afectan a la composición, la arquitectura y la función de las comunidades microbianas 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Sin embargo, las técnicas tradicionales para las culturas que descuidan capturar estos factores continúan prevaleciendo. La composición de la comunidad ( por ejemplo, la presencia de especies co-dependientes), la unión física, la concentración de la molécula de señalización y el contacto directo célula-célula son factores importantes para formar una comunidad microbiana y pueden perderse en cCondiciones de cultivo convencionales. Estas propiedades son difíciles de replicar en un cultivo líquido a granel o en una placa de agar. Sin embargo, la disponibilidad de técnicas microfluídicas, micropatternas y de nanofabricación que permiten la replicación de características físicas y químicas claves de entornos naturales ha permitido a muchos investigadores construir comunidades bacterianas para estudiar sus interacciones 12 , 13 , 14 y desarrollar ambientes sintéticos que Imitan las condiciones naturales 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .

Este protocolo describe un método para fabricar un dispositivo de matriz de micropocillos y proporciona procedimientos experimentales detallados que se pueden utilizar paraE en la matriz y para cultivar bacterias, tanto como colonias de una sola especie como en comunidades de múltiples miembros. Este trabajo también demuestra cómo se pueden usar bacterias modificadas para producir proteínas informadoras fluorescentes para monitorear el crecimiento bacteriano dentro de los pozos con el tiempo. Una matriz similar se presentó anteriormente y mostró que es posible rastrear el crecimiento de colonias de una sola especie de Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) en micropocillos. Mediante la modulación del tamaño del pocillo y la densidad de siembra, las condiciones de partida de miles de experimentos de crecimiento se pueden variar en paralelo para determinar cómo las condiciones de inoculación inicial afectan a la capacidad de crecimiento de las bacterias 21 . El trabajo actual utiliza una versión ligeramente modificada de la matriz de micropocillos que se basa en el trabajo anterior, permitiendo la comparación simultánea de múltiples matrices y utilizando un protocolo experimental más robusto. La matriz utilizada en este trabajo contiene múltiples subarrays, o array ensemQue contienen pozos de diferentes tamaños, que van desde 15 - 100 μm de diámetro, que están dispuestos en tres pasos diferentes ( es decir , 2x, 3x y 4x el diámetro del pozo). Las matrices se graban en silicio y el crecimiento de las bacterias sembradas en las matrices de silicio se habilita sellando las matrices con un cubreobjetos que se ha recubierto con un gel de agarosa con infusión media. Los mutantes de P. aeruginosa diseñados para estudiar el sistema de secreción de Tipo VI se usan en esta demostración.

Los resultados presentados aquí se construyen hacia el objetivo final de analizar las comunidades de múltiples miembros dentro de las matrices de micropocillos, lo que permite a los investigadores para controlar la abundancia y la organización de las bacterias in situ mientras controla y sondeo del entorno químico. Esto, en última instancia, ofrecerá información sobre las "reglas" que rigen el desarrollo y la sucesión de la comunidad.

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Protocol

1. Fabricación del Microwell-arsenal del silicio

  1. Revestimiento de parileno
    1. Depositar entre 1-1,5 μm de parileno N en obleas de silicio utilizando un sistema de revestimiento de parileno comercialmente disponible según las especificaciones e instrucciones del fabricante (ajustes: punto de consigna del vaporizador = 160 ° C, punto de ajuste del horno = 650 ° C).
      NOTA: Aproximadamente 6 g de parileno N cargado en una cámara producen recubrimientos de 1-1,5 μm de espesor.
  2. Fotolitografía
    1. Revestir por centrifugación las obleas revestidas con N de parileno con un promotor de adhesión, hexametildisilazano al 20% (HMDS) y acetato de éter monometílico de propilenglicol al 80% (PGMEA) (ver la Tabla de Materiales ) a 3.000 rpm durante 45 s. Llene una pipeta de transferencia de 2 ml con un promotor de adhesión y espolvorearla sobre toda la oblea. Deje que la oblea se sienta durante aproximadamente 10 segundos antes de centrifugarla.
    2. Llene una pipeta de transferencia de 2 ml conNe (ver la Tabla de Materiales ) y dispensar la fotorresistencia en el centro de la oblea. Girar a 3.000 rpm durante 45 s para producir un revestimiento resistente que tiene aproximadamente 1,5 μm de espesor.
    3. Hornear las muestras en una placa caliente a 115 ° C durante 1 min.
    4. Utilice un alineador de contactos y una fotomáscara con el patrón de pozo deseado para exponer la muestra a la luz ultravioleta. Exponer la oblea recubierta por centrifugación a través de la fotomáscara con dibujos durante 6 s, dando una dosis aproximada de 60-80 mJ / cm2 medida a 365 nm.
    5. Desarrollar el patrón sumergiendo la muestra en el revelador (<3% de hidróxido de tetrametilamonio en agua, véase la Tabla de Materiales ) durante 2 min. Enjuagar con agua DI y secar con nitrógeno limpio y seco.
      NOTA: Las áreas de fotorresistencia expuestas a la radiación UV deben ser despejadas durante el desarrollo.
  3. Grabado con iones reactivos
    1. Utilice un grabado con plasma de oxígeno para eliminar el parileno expuestoTodo el camino hasta el sustrato de silicio.
      NOTA: La receta puede ser modulada para alterar la velocidad de grabado del parileno. Para espesores de parileno entre 1 y 5 μm, use una receta con 60 mTorr, 20 ° C, 100 sccm O 2 , 10 W RF, y 2.000 W ICP en una herramienta de Ion Etching Reactivo (RIE). Después de grabar y retirar la capa de parileno expuesta, el área estampada ( es decir , el silicio expuesto) debe lucir brillante y plateada.
    2. Utilice un proceso de grabado profundo de RIE (DRIE, eg, Bosch DRIE) para grabar en el silicio.
      NOTA: La velocidad de grabado y la duración determinarán la profundidad del pozo. Un ciclo completo del proceso Bosch (una etapa de deposición de 3 s: 20 mTorr, 15ºC, 140 sccm C 4 F 8 , 10 W RF y 1,750 W ICP seguido por un proceso de decapado de 10 s: 20 mTorr, 15ºC , 120 sccm SF 6 , 8 W RF y 1,750 W ICP) corresponde a aproximadamente 1 μm de profundidad de ataque. Los pozos utilizados en esta demostración oscilan entre 3 y 3,5 μm de profundidad.
    3. VLa profundidad del grabado utilizando la profilometría física.
      1. Cargue la muestra en un perfilómetro físico (consulte la Tabla de materiales ).
      2. Encienda el vacío de muestra y presione el botón de carga manual.
      3. Enfoque el sistema en la muestra presionando el botón "Focus". Coloque una característica apropiada para la medición en la pantalla de visualización.
      4. Escanear la muestra. Nivele el perfil y mida la profundidad de la característica.
      5. Registre la velocidad de grabado y modifique los tiempos de grabado posteriores para lograr la profundidad deseada.
        NOTA: Las mediciones incluirán la profundidad del pozo de silicio, el espesor del parileno depositado y el grosor de la fotorresistencia. La verificación del espesor de cada capa durante todo el procedimiento es necesaria para lograr una profundidad de pozo precisa.

2. Cultivo bacteriano y siembra ( Figura 1a )

  1. Iniciar colonias en Luria Broth (LB) placas de agar de las existencias de glicerol y el uso dentro de dos semanas. Elije colonias de las cepas deseadas de las placas de agar LB y comience durante la noche los cultivos de P. aeruginosa. Incubar los cultivos durante la noche durante aproximadamente 18 h a 37ºC mientras se agita a 220 rpm en medio R2A.
    NOTA: Las colonias deben ser recogidas dentro de las dos semanas de la galjanoplastia para asegurar que las mutaciones y los genes fluorescentes se mantienen. Todos los trabajos de P. aeruginosa deben realizarse en condiciones BSL-2.
  2. Utilice un escriba de diamante para la sección de la oblea de silicio en fichas individuales que contienen los conjuntos de diferentes tamaños y arreglos de tono-pozo. Asegúrese de que cada chip contenga el complemento completo de tamaños de pozos y campos para el estudio.

Figura 1
Figura 1: Procedimiento de fabricación y siembra de células. (A) Arrays de micropocillos aRe grabado en obleas de silicio revestidas con una fina capa de parileno (i). Para humedecer los pocillos y / o para funcionalizar la superficie, se añade una solución de proteína en una gotita encima de las matrices (ii). Se separa la solución de proteína, se secan las obleas y se añade una nueva solución que contiene las bacterias deseadas (iii). La solución bacteriana se elimina después de un período de incubación, y las obleas se dejan secar dejando bacterias en los pocillos y en la superficie (iv). Las bacterias asociadas a la superficie se eliminan con el despegue de parileno, dejando atrás las bacterias que se siembran limpiamente en los micropocillos y siguen siendo viables debido al medio de glicerol al 2%, lo que ayuda a mantener los pocillos hidratados (v). Los chips de silicio se colocan entonces en el lado de la matriz hacia abajo sobre una lámina de vidrio revestida con gel de agarosa, que alimenta el crecimiento bacteriano en los micropocillos (vi). ( B ) Disposición de sub-matrices en un único dispositivo de silicio. Cada sub-matriz contiene un conjunto de pozos idénticos. El diámetro de los micropocillos a través de todos los sub-aLos rayos varían en diámetro desde 5-100 μm y están organizados en 2x, 3x o 4x el paso de diámetro del pozo, que se indica por los colores blanco a gris oscuro en el esquema del panel inferior. Cuando las profundidades de los pozos son poco profundas (<10 μm), los diámetros de los pozos de 5 y 10 μm son raramente útiles, generalmente debido a la falta de células que colonizan estos pocillos muy pequeños. En este trabajo, sólo se analizaron los datos de pozos con diámetros de 15-100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Como se muestra en la Figura 1b , un chip completo contiene sub-conjuntos de pocillos, con diámetros entre 5 y 100 μm, con tres pasos diferentes ( es decir , 2x, 3x y 4x el diámetro) repitiéndose 4 veces.

  1. Colocar una gotita de 150 μL de Albumina de Suero Bovino (BSA) de 500 μg / mL en solución de PBSEn la parte superior de la matriz para mojar los micropocillos. Incubar la solución de BSA durante 1 h en el chip a RT en una cámara húmeda.
    1. Cree la cámara rellenando la parte inferior de una caja de puntas de pipeta vacía con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: Se pueden usar otras sustancias, como lectinas específicas, en lugar de BSA para funcionalizar la superficie de los micropocillos.
  2. Mientras se incuban chips de silicio con solución de BSA, se centrifugan los cultivos a 2.500 rpm (correspondientes a un promedio de 950 xg) durante 5 min y después se resuspenden en 500 μl de medio R2A fresco con 2% de glicerol.
    1. Determinar la DO del cultivo usando un espectrómetro UV-vis a 600 nm. Ajústelo a una DO de 0,02 utilizando 2% de medio glicerol R2A.
      NOTA: El glicerol ayuda a evitar que los pocillos se sequen durante el despegue de parileno.
  3. Después de la incubación, retirar la solución de BSA y enjuagar 3x con PBS eliminando y reemplazando la gota de líquidoT que cubre la matriz de micropocillos de silicio. Secar bajo nitrógeno.
  4. Añadir 150 μl de 0,02 cultivos OD a cada uno de los conjuntos secos colocados en una cámara húmeda. Incubar durante 1 h a 4 ° C para permitir que las bacterias se adhieran a las paredes del pozo.
    NOTA: La refrigeración no es necesaria para la incubación. El tiempo de incubación de 4 ° C se puede utilizar para prevenir el crecimiento de bacterias antes de que comience la imagen, de modo que se pueda visualizar la organización espacial de las comunidades antes del crecimiento. También puede utilizarse la incubación a temperatura ambiente. Ambos protocolos dan como resultado curvas de crecimiento similares.

3. Configuración del Microscopio

  1. Antes de iniciar la incubación bacteriana en los chips de silicio, encienda la cámara de control medioambiental de la etapa superior (consulte la tabla de materiales) y ajuste los ajustes en la caja de control para que la humedad (~ 100%) y la temperatura (30-32 ° C, véase el paso 3.2) puede equilibrarse antes de añadir las muestras.
  2. Nivele el soporte de la muestra y alinee elAlrededor de la muestra con toallitas de laboratorio empapadas con PBS (ver Tabla de Materiales ) para aumentar la humedad en la cámara hasta el punto de rocío. Ajuste la temperatura de la cámara a 30 ° C y la de la tapa de la cámara a 32 ° C para reducir la condensación en el plano de imagen.
    NOTA: El porta-diapositivas encaja en la cámara de células vivas con una junta de aproximadamente 1 cm de espesor. El soporte de la muestra se nivela con la ayuda de un nivel de burbuja que se coloca en la parte superior del soporte de la muestra. El soporte de la muestra se puede inclinar ligeramente y permanecer sellado en la junta al nivel.
  3. Mientras los cultivos se incuban en los chips de silicio, encienda manualmente el interruptor de alimentación de la lámpara de mercurio por lo menos 30 minutos antes de la formación de imágenes. Activar manualmente la cámara y el escenario automático del microscopio. Abra el software utilizado para controlar el microscopio y el equipo periférico y asegúrese de que el equipo reconoce el equipo.
    NOTA: La ampliación es 10X con NA = 0.3.
  1. Las soluciones de agarosa previamente preparadas en microondas ( es decir, 2% de agarosa en medio R2A) hasta que se alcanza un estado líquido, aproximadamente 60 s.
  2. Mueva la parte posterior de un portaobjetos de vidrio de 75 mm x 22 mm, # 1.5 con etanol y colóquelo longitudinalmente, centrado, a través de un portaobjetos de vidrio de 2 x 3 "(50 x 75 mm) Coloque dos separadores PDMS (espesor de ~ 1 mm) A lo largo de los bordes largos de la cubreobjetos y desplace el cubreobjetos de vidrio de modo que aproximadamente 1 mm de la cubreobjetos sobresalga del borde de la corredera.
  3. Vierta 5 ml de solución de agarosa líquida en la parte superior del cubreobjetos de vidrio, lo suficiente para cubrir completamente, y coloque un segundo 2 "de 3" de vidrio en la parte superior del conjunto para "emparedar" el agar líquido entre el cubreobjetos y la diapositiva.
    NOTA: Esto controla la profundidad de la agarosa, haciendo que el espesor total de la cubreobjetos y agarosa endurecida sea igual en espesor a los espaciadores PDMS.
  4. Permitir que el cristal de diapositivas-coverslip-agarosa gel-vidrio sándwich de diapositivas para establecer hasta que la solución de agarosa comienza a solidificar; Luego, transferirlo a un refrigerador. Después de 15 minutos, retire el exceso de agarosa sólida y corte alrededor del cubreobjetos de vidrio. Mueva esto a un plato limpio y colóquelo en un refrigerador hasta su uso.

5. Sellado de los pozos con un recubrimiento revestido de agarosa e imágenes

  1. Una vez finalizado el período de incubación de las bacterias, retirar el cubreobjetos recubierto de agarosa del refrigerador y preparar los chips de silicio, como sigue.
    1. Sumerja los chips de silicio en agua ultrapura, uno a la vez, durante 10 s cada uno. Póngalos en sus bordes en un trapo o tejido de laboratorio hasta que la mayor parte del exceso de líquido se haya drenado de los bordes de las virutas.
    2. Corte un pedazo de cinta para que coincida con la longitud del borde de cada chip de silicio. Coloque la cinta sobre el parileno que cubre el silicio y utilícelo para pelar rápidamente el revestimiento de parileno.
    3. ImmedInvertir inmediatamente cada viruta pelada y colocar cada chip de tal manera que el lado de la matriz de micropocillos se enfrenta (y hace contacto) con el lado revestido con agarosa de un cubreobjetos revestido con agarosa. Tenga cuidado de no mover o cambiar el chip después de que toque la agarosa para evitar el crecimiento de bacterias fuera de los pozos.
  2. Coloque el cubreobjetos de micropocillos / agarosa ensamblados en el porta-diapositivas de la cámara de control ambiental de nivel superior en el miscroscopio.
    1. Utilice luz ambiental o luz dirigida ( por ejemplo, una linterna) para localizar matrices de interés. Utilice el software comercial que controla la etapa automatizada para guardar esas posiciones (consulte la tabla de materiales). Apague la luz ambiente o la luz dirigida después de almacenar las posiciones.
    2. En el software comercial, abra el panel "ND Acquisition".
      NOTA: Este panel incluye un menú para guardar automáticamente en un directorio específico, así como la adquisición de imágenes programables. Para estos experimentos, Se utilizan los menús "Hora", "XY" y "λ".
    3. Para guardar las ubicaciones en el software, haga clic en el "menú XY" y luego marque una casilla vacía en el lado izquierdo para cada posición que necesita ser guardada. También, haga clic en el botón "Incluir Z".
  3. Adquirir imágenes a lo largo del tiempo a las longitudes de onda deseadas y 10 aumentos utilizando los cubos de filtro de fluorescencia adecuados (ver Tabla de Materiales).
    1. Utilice el software de control y las posiciones de matriz guardadas para moverse a cada ubicación guardada y enfocar los pozos. Haga clic en cada ubicación XY en la lista guardada y ajuste el enfoque utilizando el filtro Green Flourescence Protein (GFP). Guarde la nueva posición z haciendo clic en la flecha que apunta a la ubicación z.
      NOTA: Este proceso puede tardar mucho tiempo. Considere tomar la precaución de aumentar la ganancia y usar el filtro de densidad neutra para reducir la intensidad de la luz para evitar el fotoblanqueo.
    2. Determine la distancia del eje z entre planos focales para cada longitud de onda, anotando la diferencia en la posición del eje z cuando se enfoca en la superficie de la matriz. Elija 2-3 ubicaciones de la matriz con la población mixta de bacterias rojas / verdes y enfoque utilizando el filtro de Proteína de Fluorescencia Roja (RFP).
      1. Reste la distancia entre los planos focales utilizando los filtros de fluorescencia GFP y RFP y añada el ajuste del plano focal en el menú "λ".
        NOTA: Por ejemplo, si la matriz aparece enfocada en el canal GFP en una ubicación z de 50 μm, y la misma matriz aparece enfocada en el canal RFP a 55 μm, añada +5 junto a la configuración óptica RFP en la "λ ".
    3. Comience la adquisición de imágenes de lapso de tiempo.
      NOTA: Para los experimentos mostrados aquí, las imágenes RFP y GFP se adquirieron para cada posición de la matriz a intervalos de 30 minutos usando adquisición de imágenes multidimensional a través de un software comercial que controlaLa cámara, el obturador, la rueda del filtro y la etapa motorizada.
      1. Ajuste el "intervalo" a 30 min y la "duración del experimento" a 24 h en el menú "Tiempo". Haga clic en "Ejecutar ahora".
        NOTA: Con las casillas "Time", "XY" y "λ" marcadas, ejecutar el programa moverá el escenario a la imagen de cada ubicación ( es decir, las ubicaciones XYZ guardadas), tomará una imagen en una longitud de onda, moverá la posición z Para tomar en cuenta las diferencias de plano focal ( es decir, control de la longitud de onda o lambda), tomar la segunda imagen, pasar a la siguiente ubicación de la matriz (multipunto) y realizar un bucle a intervalos de 30 minutos.
  4. Adquirir imágenes de control de iluminación.
    NOTA: Utilice los menús "Adquisición ND", "Tiempo" y "XY" para tomar imágenes de 4 ubicaciones, 25 veces cada una.
    1. Tome una serie de 100 imágenes "darkfield" apagando todas las fuentes de luz y tomandoUna "imagen" de una diapositiva estándar. Estas imágenes capturarán el ruido de la cámara. Utilice el tiempo de exposición más largo utilizado durante el tiempo de espera (paso 5.3.3).
    2. Tomar una serie de 100 "imágenes de campo de iluminación" mediante la proyección de imagen de una diapositiva estándar ( es decir, uniforme RFP o GFP intensidad) en algunos lugares diferentes para capturar la iluminación desigual en las condiciones experimentales dado. Elija un tiempo de exposición que maximice la señal sin alcanzar la saturación.

6. Análisis

  1. Procese las pilas de imágenes utilizando un software de análisis de imágenes ( por ejemplo, ImageJ).
    1. Convierte las imágenes adquiridas en formato de archivo tiff utilizando el software comercial. Suba imágenes al software de análisis de imágenes haciendo clic en "Archivo"> ​​"Importar"> "Secuencia de imagen".
    2. Cree una "imagen de corrección" haciendo un promedio de todas las imágenes de "campo oscuro" y "campo de iluminación". SubtracT la imagen "darkfield" promedio de la imagen promedio de "campo de iluminación" eligiendo "Process"> "Image Calculator". Seleccione las dos imágenes, "Image1" e "Image2", y luego "Subtract" en el campo "Operation". Haga clic en Aceptar."
      1. Para calcular el promedio, cargue las imágenes de corrección (o campo oscuro), haga clic en "Imagen"> "Pilas"> "Proyecto Z"> "Proyección promedio".
    3. Realice el registro de la imagen si es necesario. A continuación, realice la resta de fondo haciendo clic en "Proceso"> "Restar fondo". Introduzca un radio ( por ejemplo, 125) en el campo "radio" y seleccione "deslizante paraboloide".
    4. Realice la corrección de iluminación usando "Proceso"> "Calculadora Plus". Elija los siguientes parámetros: operación, división; I1, imagen del pozo; I2, imagen de corrección; K1, media de imagen de corrección; Y k2, 0. Haga clic en "CreComió Nueva Ventana. "
      NOTA: Este conjunto de datos no requiere registro, pero en otro trabajo, ImageJ Plugin StackReg se utilizó con la transformación "Traducción". Para la sustracción de fondo, use el mismo radio deslizante de paraboloide para cada conjunto de imágenes. Por ejemplo, si los pozos más grandes tienen un radio de pixel de 100, utilice un radio mayor que 100 ( por ejemplo, 125) para cada conjunto de imágenes.
  2. Determinar el crecimiento de cada cepa en los micropocillos.
    1. Seleccione las regiones de interés (ROI) alrededor de cada micropocillo en las matrices deseadas usando el complemento ImageJ "MicroArray".
      1. En el menú "MAP", haga clic en "Restablecer cuadrícula". Especifique filas, columnas y diámetro (basado en el tamaño y el número del pozo en la matriz, consulte la Figura 1b ). Seleccione "círculo" en el menú "ROI forma".
      2. Mantenga pulsada la tecla "Alt" mientras selecciona el ROI superior izquierdo con el ratón para mover tMatriz del ROI. Mantenga pulsada la tecla "shift" mientras selecciona el ROI inferior izquierdo para cambiar el tamaño de la matriz. Mantenga pulsada la tecla "shift" mientras selecciona un ROI del lado derecho de la matriz, pero no en las esquinas, para cambiar el espaciado de los ROI.
      3. Utilice los comandos anteriores para ajustar la matriz ROI sobre los pozos de una imagen. Haga clic en "Medir RT".
        NOTA: El complemento exportará las mediciones deseadas de cada ROI. Utilice tres tamaños ROI, creando anillos concéntricos alrededor de los pozos para recoger localmente la señal de fondo ( es decir, la señal del anillo central restado del anillo externo) y mediciones de fluorescencia ( es decir, la señal del anillo interno).
    2. Recopilar los datos en un software de hoja de cálculo y calcular la señal de fondo. Importar a un software de scripting personalizado para un análisis más detallado.
  3. Organización y análisis de datos
    1. Importe los datos y organice los datosRecogidos en ImageJ en una matriz en el siguiente orden para todos los tiempos: columna 1, sub-array número; Columna 2, fila de pozos; Columna 3, columna de pozo; Columna 4, intensidad media; Columna 5, intensidad de fondo; Y columna 6, intensidad media - intensidad de fondo.
      1. Separe los resultados de la adquisición mCherry y GFP en diferentes matrices. Guarde los resultados de cada sub-matriz y cada color en una celda diferente en una matriz de celdas.
        NOTA: Esta organización facilita el desplazamiento entre datos de imagen y resultados de medición, la limpieza de los datos y la garantía de que las mediciones representan con precisión los datos.
    2. Ajuste para la autofluorescencia de P. aeruginosa .
      NOTA: En experimentos que involucran el co-cultivo de cepas GFP y mCherry, se debe analizar un chip mCherry sólo para determinar la relación entre mCherry y autofluorescencia verde.
      1. Trazar la señal mCherry-versus-GFP de todos los mCherry ΔretS &# 916; tse / i1-6 en todos los puntos temporales para determinar la relación entre la señal mCherry y la autofluorescencia en el canal GFP. Reste la señal de autofluorescencia de los co-cultivos.
    3. Trace las trayectorias y ajuste una ecuación logística modificada a cada trayectoria para extraer los parámetros usando el ajuste de mínimos cuadrados en un software de hoja de cálculo o un software de scripting personalizado.
    4. Busque correlaciones entre y entre los parámetros de trayectoria de GFP y mCherry.

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Representative Results

La plataforma experimental presentada aquí está diseñada para estudios de alto rendimiento y alto contenido de comunidades bacterianas. El diseño permite que miles de comunidades, que crecen en pozos de diferentes tamaños, sean analizadas simultáneamente. Con este diseño de la matriz de micropocillos, se puede determinar la dependencia de la composición final de la comunidad sobre las densidades iniciales de siembra, el tamaño del pozo y el ambiente químico. Este trabajo demuestra el crecimiento de una comunidad de dos miembros en la matriz de micropocillos y presenta métodos para analizar la composición y organización de la comunidad.

El sistema modelo utilizado aquí fue diseñado en el laboratorio de Mougous para estudiar la secreción de Tipo VI en P. aeruginosa . El sistema se compone de varias cepas mutantes, que contienen GFP o mCherry reporteros fluorescentes. En este trabajo se utilizaron 2 cepas diferentes. El primero es un mutante ΔretS marcado con GFP que constitutivaY expresa las proteínas efectoras tóxicas asociadas con la secreción de Tipo VI, resultando en mayores niveles de muerte celular en células susceptibles. La segunda es una cepa ΔretSΔtse / i1-6 marcada por RFP que es un mutante de deleción que falta todas las seis proteínas efectoras conocidas y que se ha mostrado ser más susceptible a la patogenia de Tipo VI 22 , 23 , 24 . Las trayectorias del crecimiento de cada especie fueron seguidas individualmente y dentro de dos comunidades del miembro ( es decir , co-cultivo dentro de la plataforma del arsenal).

Los mutantes ΔretS y ΔretSΔtse / i1-6 se sembraron en tres matrices, cada uno por separado y también se mezclaron juntos en una proporción de 1: 2, y luego se formaron imágenes cada 30 min durante 20 h. El crecimiento bacteriano en los pozos cesó entre 6 y 12 h después de la siembra. Ejemplos de los datos de imagen fluorescente se muestran en las Figuras 2 y 3. La Figura 2 muestra el crecimiento a lo largo del tiempo de las cepas ΔretS y ΔretSΔtse / i1-6 en pozos de 45 μm de diámetro, y la Figura 3 muestra el estado de estas mismas comunidades de dos miembros aproximadamente 6 h después de hundimiento en pocillos de diversos tamaños.

Figura 2
Figura 2: Ejemplo de imágenes de un experimento de crecimiento de co-cultivo de tiempo. Se sembraron dos mutantes de P. aeruginosa , que expresan mCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (rojo) o GFP (ΔretS) (verde), en una relación 2: 1 mCherry: GFP en las matrices de micropocillos. En la imagen se muestran imágenes compuestas tomadas en 3 momentos diferentes en los pozos de 45 μm de diámetro. Haga clic aquí para ver una versión más grandeDe esta cifra.

figura 3
Figura 3: Rango de diámetros de pozo incluidos en el dispositivo de matriz de micropocillos. Imágenes representativas de comunidades de dos miembros capturadas a las 8 h de crecimiento. Generalmente, las colonias mCherry (ΔretSΔtse / i1-6) (rojo) o GFP (ΔretS) (verde) muestran una colocalización mínima, permaneciendo dentro de áreas distintas en los micropocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Antes de la adquisición de las mediciones, se realizó una restauración deslizante de fondo parabaloide. Se utilizó un paso de corrección de la iluminación para que la señal de cada micropocillo obtenida en un experimento dado pudiera compararse cuantitativamente. Estos métodos han sido pDescrita con anterioridad 25 . Utilizando el complemento de microarrays en ImageJ, se midió la intensidad media de las bacterias roja y verde en las imágenes corregidas, junto con una señal de fondo local. La señal de fondo local se restó de la señal de pozo y la señal de GFP se ajustó para corregir la autofluorescencia de co-cultivos de P. aeruginosa (autofluorescencia determinada a partir de matrices de mCherry ΔretSΔtse / i1-6 solamente) . Una vez realizadas todas estas correcciones, las trayectorias de crecimiento cuantitativo de las bacterias que expresan mCherry- y GFP podrían ser trazadas. Ejemplo de trayectorias de crecimiento de pozos de 20 y 50 μm de diámetro se muestran en la Figura 4 .

Figura 4
Figura 4: Curvas de crecimiento de monocultivos y co-cultivos de mutantes de secreción de tipo VI de P. aeruginosa .(A y d ) curvas de crecimiento del monocultivo GFP-ΔretS en pozos de 20 μm y 50 μm, respectivamente. ( B ye ) mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 curvas de crecimiento de monocultivos en pozos de 20 y 50 μm, respectivamente. (C y f) Co-cultivo de una mezcla de relación 1: 2 de cepas de P. aeruginosa GFP (verde) y mCherry (rojo). Las curvas de crecimiento se representan a partir de la adquisición de la imagen, aproximadamente 2 horas después de la hinchazón (hps). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las trayectorias de crecimiento del mono y co-cultivo de cepas de P. aeruginosa indican que existe cierta variabilidad en el crecimiento de pozo a pozo y que esta variabilidad se incrementa en pozos de dimensiones menores. Sin embargo, la intensidad media no se ve afectadaZe No parece haber un efecto negativo dramático o claro sobre el crecimiento de la cepa susceptible (ΔretSΔtse / i1-6) cuando está presente la cepa ΔretS. La intensidad global de cada cepa disminuyó, pero esto se debió a una menor concentración inicial de cada cepa en los pocillos, ya que la OD total se mantuvo consistente a través de los experimentos, no la DO individual de cada cepa. Sin embargo, es difícil determinar qué factores son más importantes para entender el crecimiento de bacterias en estos pozos, simplemente mirando las trayectorias de crecimiento por sí solas. Por lo tanto, cada trayectoria fue ajustada con una función logística modificada 26 ( Figura 5a ) de modo que los parámetros pertinentes podrían ser extraídos y utilizados para analizar los datos de crecimiento bacteriano. Cada trayectoria se transformó tomando el registro natural de la señal dividido por la señal inicial. Una función logística modificada, con tres parámetros correspondientes a una señal máxima (A), un máximo(Μ), y un tiempo de retardo (τ), se utilizó para adaptarse a cada trayectoria.

Dada la conocida interacción entre las cepas GFP-ΔretS y mCherry-ΔretSΔtse / i1-6, se podría hipotetizar que el crecimiento de la cepa mCherry sería inhibido en co-cultivos con la cepa GFP-ΔretS 22 , 24 . Utilizando los parámetros extraídos, es posible buscar correlaciones positivas o negativas entre los parámetros extraídos de las trayectorias GFP y mCherry. El análisis de parámetros iniciales sugirió que el co-cultivo de estas especies tuvo un efecto insignificante sobre su crecimiento global. La variabilidad observada en las curvas de crecimiento es probablemente debido a factores ambientales, como la densidad inicial de siembra, que se vuelve más variable en diámetros de pozos más pequeños ( Figura 5b ). Efectos negativos significativos sobre la cepa mCherry debido a la presencia de GFP-ΔretS no se observaron. Por ejemplo, cuando se traza la máxima señal de mCherry frente a la relación de la señal GFP-RFP inicial, no se encontró ninguna disminución en la expresión de mCherry cuando había una proporción más alta de GFP-ΔretS en los pocillos.

Figura 5
Figura 5: Trayectoria de crecimiento fluorescente ajustada con una ecuación logística modificada. (A) La curva de ejemplo se normaliza y luego se ajusta con una ecuación logística modificada ajustando tres parámetros, una intensidad máxima (A), una velocidad máxima (μ) y un tiempo de retardo (τ). ( B ) Señal inicial de mCherry frente a señal GFP inicial en pocillos individuales de varios diámetros. ( C ) La máxima señal informadora mCherry trazada frente a la relación de la intensidad inicial de las bacterias que expresan GFP a las bacterias que expresan RFP.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Trabajos anteriores en el laboratorio Mougous indicó que los efectos de la secreción de Tipo VI requieren el contacto directo célula a célula entre las células secretoras y susceptibles y que un período de contacto más largo resulta en más lisis celular [ 23] . Por lo tanto, creemos que, en estos arrays, el crecimiento exponencial de los dos mutantes es simplemente superar los efectos patógenos mediada por contacto en este sistema modelo. Sin embargo, en pocillos de todos los tamaños, las bacterias que expresan GFP y mCherry crecen en parches distintos ( Figuras 2 y 3 ). Por lo tanto, en lugar de centrarse en las tasas de crecimiento, las comunidades bacterianas que contienen agentes patógenos mediados por contacto pueden estudiarse mejor mediante análisis espaciales. Por ejemplo, en lugar de focusiNg en la intensidad integrada, que es representativa del número total de células rojas o verdes en un pozo, este formato de micropocillo permite contar el número y la ubicación de píxeles rojos y / o verdes. Es posible analizar el crecimiento de colonias o parches individuales dentro de estos pozos, centrándose en los bordes donde las señales roja y verde se superponen ( Figura 6a ). La cuantificación de los eventos de co-localización y los análisis de vecinos más cercanos pueden ser ejecutados para observar más de cerca las propiedades como el tamaño de parche, la tasa de crecimiento del parche y la superposición de parches dentro de los pozos individuales. Los análisis espaciales serían ayudados por imágenes de mayor magnificación y microscopía confocal ( Figura 6b ).

Figura 6
Figura 6: La Organización Espacial de Diferentes Especies puede ser Analizada usando Epifluorescencia y Microscopía Confocal. Unesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org B y c ) Imágenes confocales (ampliación 20X, NA = 0,8) de 15 μm de diámetro, ~ 7,5 μm de pozos profundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este artículo se presentó un dispositivo de matriz de micropocillos y protocolos experimentales diseñados para permitir el análisis de alta capacidad y alto contenido de células vivas basados ​​en imágenes del desarrollo de la comunidad bacteriana. Si bien el objetivo de la demostración aquí fue estudiar los efectos de la secreción de tipo VI mediada por contacto en el desarrollo de la comunidad, los arrays fueron diseñados para ser flexible y acomodar el estudio de una amplia gama de comunidades microbianas y las interacciones microbio-microbios. El trabajo aquí se centra únicamente en el uso de bacterias que expresan constitutivamente marcadores fluorescentes para permitir fácil seguimiento de la abundancia de miembros y la ubicación. Sin embargo, las oportunidades de muestrear material biológico de pozos individuales tras el crecimiento o la perturbación cambiando el entorno químico podrían utilizarse, en principio, para identificar la composición de la comunidad y la expresión génica.

Cada dispositivo de silicio está compuesto de decenas de matrices que contienen micropocillos con varios pocillosDiámetros, organizados en un paso de 2x, 3x o 4x de diámetro y grabados a una profundidad entre 3 y 3,5 μm. Debido a que los nutrientes y los metabolitos secundarios pueden difundirse libremente a través ya través de la tapa de agarosa, se incluyeron diferentes subenlaces de tono para permitir el examen de cómo la señalización entre micropocillos o el agotamiento de nutrientes local afecta el desarrollo de la comunidad. En esta demostración, el crecimiento y el desarrollo de la comunidad no parecieron verse afectados por el espaciamiento o ubicación de los micropocillos dentro de las matrices. Se escogió la profundidad poco profunda para simplificar el análisis de imagen, limitando todo el crecimiento y desarrollo microbiano a un único plano de imagen. Sin embargo, se han utilizado anteriormente pozos más profundos (20 μm de profundidad) y pueden modularse fácilmente en profundidad variando la duración del proceso de grabado con silicio. El aumento de la relación de aspecto de los pocillos altera esencialmente el grado de confinamiento experimentado por las células en el interior de los pocillos, cambiando eficazmente la relación del volumen total del pocilloA la zona a través de la cual los nutrientes difunden en la parte superior del pozo. Esta variedad de configuraciones de matrices se podría utilizar para estudiar los efectos de bien a bien o intra-bien de señalización.

Una limitación del uso de silicio para fabricar los micropocillos es que es opaca a la luz visible. En consecuencia, los análisis de rutina que dependen de la transmisión de luz ( por ejemplo, campo claro, fase o contraste diferencial de imágenes de contraste) no pueden utilizarse para controlar el crecimiento. La investigación y desarrollo en curso en nuestro grupo se ha centrado en la adaptación de esta configuración de microcavidades de silicio y el protocolo experimental para el trabajo con matrices transparentes para permitir la fluorescencia de alta resolución y la imagen de campo claro para el seguimiento y la cuantificación [ 27] . Mediante el uso de materiales transparentes para la fabricación, tales como SU-8 epoxi en un cubreobjetos de vidrio, es posible adquirir imágenes de campo claro y fluorescencia con objetivos operando a distancias de trabajo más cortas.Esto permite obtener una resolución más óptima con objetivos de inmersión en agua o de aceite con una ampliación ≥ 40X, sin la dificultad de obtener imágenes a través de una capa de agar, como es el caso de las matrices de silicio.

Como se describió en nuestro trabajo anterior, las condiciones de siembra y la geometría del pozo afectan la siembra de células dentro de las matrices de pozos. En densidades de siembra bajas o en pozos pequeños, los altos niveles de variación en el número y tipos de células que se cargan en pozos individuales permite una exploración amplia y rápida del espacio de parámetros experimental. Las mayores densidades de siembra y / o la obtención de imágenes de pozos más grandes producen proporciones más consistentes de tipos de células y niveles de inóculo total, permitiendo el análisis de un gran número de repeticiones experimentales. Un rápido vistazo a las imágenes durante las primeras etapas de crecimiento sugiere que las células se adhieren y crecen principalmente a lo largo de los bordes de los pozos ( Figura 5a ]. No está claro si se trata de un artefacto relacionado con sDurante el proceso de siembra o sugiere una preferencia por la unión de células a múltiples bordes. Alterar intencionalmente la topografía o la química superficial de los pozos de una manera determinista podría revelar qué factores tienen el mayor impacto sobre la fijación celular y la formación de biofilm.

El crecimiento de las bacterias en estos pocillos se sustenta mediante el uso de un cubreobjetos de vidrio revestido con gel de agarosa infundido con medio R2A. Los métodos descritos para crear este cubreobjetos revestidos con agarosa aseguran un grosor uniforme a través del cual se obtiene una imagen y una posición z bastante constante, que permite la posibilidad de visualizar simultáneamente múltiples chips de silicio. El uso de agarosa ultra-pura como el agente gelificante y un medio mínimo en lugar de un medio completo da como resultado un fondo más limpio, menos autofluorescente, aumentando la relación total señal / ruido. Al confiar en la fluorescencia para el seguimiento cuantitativo de las comunidades microbianas, es esencial mantener imágenesNg condiciones consistentes y ser muy conscientes de las contribuciones de autofluorescencia, photobleaching, y la iluminación no uniforme. Además, para experimentos que requieran una adquisición de imágenes en intervalos de tiempo prolongados, se desea una capa gruesa de agarosa, tal como se usa aquí. Se pueden hacer capas más delgadas (~ 100 μm de grosor) para permitir imágenes de ampliación más altas. Sin embargo, es difícil mantener el conjunto suficientemente húmedo para evitar que la capa delgada se seque.

Aunque el análisis inicial de los parámetros de crecimiento y los niveles iniciales de inóculo aún no ha revelado correlaciones significativas para el sistema simple descrito aquí, los protocolos y datos mostrados enfatizan la profundidad de la información que se puede extraer de las imágenes del desarrollo comunitario en el tiempo. La organización espacial dentro de los pozos evoluciona a medida que las colonias de una sola especie se expanden desde los sitios iniciales de "nucleación". Por lo tanto, los factores asociados con la densidad de unión inicial ( es decir,Ps de la mayor preferencia de una especie por la superficie del pozo en comparación con otra) o la tasa de crecimiento de parches individuales podría influir drásticamente en el desarrollo de la comunidad. Interacciones más sutiles, tales como las mediadas por el contacto entre las especies (parches) establecido muy tarde en el proceso de crecimiento puede requerir un análisis más profundo de los datos de la imagen.

La plataforma de la matriz de micropocillos y el protocolo presentado aquí facilitan el rápido montaje y análisis de alto contenido de desarrollo comunitario microbiano y las interacciones microbio-microbios. El trabajo futuro que permite el control del ambiente químico local, cambiando la composición del medio dentro de la tapa de agar o modulando y muestreando directamente a través de la microfluídica integrada, debería permitir protocolos experimentales que van más allá de imitar el confinamiento natural y el tamaño del nicho y comenzar a Explorar el impacto de entornos dinámicamente cambiantes, similares a los encontrados en la naturaleza. El trabajo futuro aumentaráEl diseño de la matriz con microfluidos integrados que se pueden utilizar para modular dinámicamente el ambiente químico local y para muestrear el fluido de pozos individuales. Se ha descrito otro trabajo adicional sobre el desarrollo de matrices de micropocillos ópticamente claras que pueden usarse para una mayor resolución y un seguimiento de campo claro del crecimiento de la comunidad 27 .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Las matrices de micropocillos se fabricaron y caracterizaron en la División de Instalaciones de Usuarios del Centro de Ciencia de Materiales de Nanofase, Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Departamento de Energía de los Estados Unidos. El apoyo financiero para este trabajo se proporcionó a través del Fondo de Investigación y Desarrollo del Director del Laboratorio Nacional de Oak Ridge. Los autores también desean agradecer al Laboratorio J. Mougous (Universidad de Washington, Seattle, WA) por el suministro de cepas de P. aeruginosa usadas en estos estudios.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Parylene N Specialty Coating Systems CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater Specialty Coating Systems Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010
Silicon Wafer WRS Materials 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>,
adhesion promoter Shin-Etsu Microsci MicroPrime P20 adhesion promoter
postive tone photoresist Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)
Quintel Contact Aligner Neutronix Quintel Corp NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool Oxford Instruments Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher
R2A Broth TEKnova R0005
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Multimode Plate Reader Perkin Elmer Enspire, 2300-0000
Fluorescent Microscope Nikon Eclipse Ti-U
Automated Stage Prior ProScan III
CCD camera Nikon DS-QiMc
Stage-top environmental control chamber In Vivo Scientific STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190144
UltraPure Agarose ThermoFisher Scientific 16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip Nexterion High performance #1.5H coverslips
Fluorescence Reference Slides Ted Pella 2273
Physical Stylus Profilometer KLA Tencor P-6
lab wipes Kimberly Clark Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial software Nikon NIS Elements
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss
filter cubes Nikon Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)

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