Samling og sporing af mikrobiell fællesskabsudvikling inden for en Microwell Array Platform

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Udviklingen af ​​mikrobielle samfund afhænger af en kombination af faktorer, herunder miljøarkitektur, medlemskrænkelse, træk og interaktioner. Denne protokol beskriver et syntetisk, mikrofabrikeret miljø til samtidig tracking af tusinder af samfund indeholdt i femtoliter brønde, hvor nøglefaktorer såsom niche størrelse og indeslutning kan tilnærmes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform. J. Vis. Exp. (124), e55701, doi:10.3791/55701 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Udviklingen af ​​mikrobielle samfund afhænger af en kombination af komplekse deterministiske og stokastiske faktorer, som dramatisk kan ændre rummets fordeling og aktiviteter i fællesskabsmedlemmer. Vi har udviklet en mikrowell array platform, som kan bruges til hurtigt at samle og spore tusindvis af bakterielle samfund parallelt. Denne protokol fremhæver platformens anvendelighed og beskriver dens anvendelse til optisk overvågning af udviklingen af ​​simple, tomedlemsamfund inden for et ensemble af arrays inden for platformen. Denne demonstration anvender to mutanter af Pseudomonas aeruginosa , en del af en række mutanter udviklet til at studere patogenitet af type VI-sekretion. Kromosomale indlæg af enten mCherry- eller GFP-gener letter den konstitutive ekspression af fluorescerende proteiner med forskellige emissionsbølgelængder, som kan bruges til at overvåge overlegenhed og lokalitet inden for hver mikrobølge. Denne protokol beskriver en detaljeret methoD til montering af blandinger af bakterier i brøndene i arrayet og anvendelse af tidsforskydningsfluorescensbilleddannelse og kvantitativ billedanalyse til måling af den relative vækst for hver medlemspopulation over tid. Sejningen og samlingen af ​​microwell-platformen, de billeddannelsesprocedurer, der er nødvendige for den kvantitative analyse af mikrobielle samfund i gruppen, og de metoder, der kan anvendes til at afsløre interaktioner mellem mikrobielle arter, som alle diskuteres.

Introduction

Mikrobielle samfund er formet af både deterministiske faktorer, såsom miljøets struktur og stokastiske processer, som er forbundet med celledød, opdeling, proteinkoncentration, antal organeller og mutation 1 . Inden for det naturlige miljø kan det næsten umuligt at analysere de individuelle virkninger af disse påvirkninger på samfunds sammensætning og aktivitet. Obscured af naturlige strukturer og begravet inden for et kemisk og biologisk miljø, er det ekstremt udfordrende at identificere samfundets medlemmer og yderligere løse deres spatiotemporale fordeling inden for det naturlige miljø. Ikke desto mindre har de seneste bestræbelser understreget betydningen af ​​rumlig organisation på samfundsfunktionen og peger på behovet for at redegøre for både medlemskvalitet og organisation i løbende studier 2 , 3 , 4 .

DetDet er tydeligt, at det lokale kemiske miljø ( dvs. tilgængeligheden af ​​næringsstoffer og sekundære metabolitter), den fysiske struktur ( f.eks. Jordarkitektur, planterødder, havpartikler eller tarmmilvilli), tilstedeværelse eller fravær af ilt og indførelsen af Patogene arter har alle indflydelse på mikrobielle samfunds sammensætning, arkitektur og funktion 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Ikke desto mindre fortsætter traditionelle teknikker til kulturer, der forsømmer at opfange disse faktorer, at sejre. Fælles sammensætning ( fx tilstedeværelsen af ​​co-afhængige arter), fysisk binding, signalmolekylkoncentration og direkte cellecellekontakt er alle vigtige faktorer for at forme et mikrobielt samfund og kan gå tabt i cUventede kulturbetingelser. Disse egenskaber er vanskelige at replikere i en bulkvæskekultur eller på en agarplade. Tilgængeligheden af ​​mikrofluidiske, mikropatterings- og nanofabrikationsteknikker, der muliggør replikation af nøgle fysiske og kemiske egenskaber i naturlige miljøer har dog gjort det muligt for mange forskere at opbygge bakteriefællesskaber for at studere deres interaktioner 12 , 13 , 14 og at udvikle syntetiske miljøer, der Efterligne naturlige forhold 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .

Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af en microwell array enhed og giver detaljerede eksperimentelle procedurer, som kan bruges til at funktionalisere thE brønde i rækken og at vokse bakterier, både som single-species kolonier og i multi-medlems samfund. Dette arbejde viser også, hvordan bakterier, der er modificeret til fremstilling af fluorescerende reporterproteiner, kan anvendes til at overvåge bakterievækst i brønde over tid. En lignende matrix blev præsenteret tidligere og viste, at det er muligt at spore væksten af enkeltartskolonier af Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) i mikrobrønde. Ved at modulere brøndstørrelse og seedensitet kan startbetingelserne for tusindvis af vækstforsøg varieres parallelt for at bestemme, hvordan de indledende inokulationsbetingelser påvirker bakteriens evne til at vokse 21 . Det nuværende arbejde bruger en lidt ændret version af microwell-arrayet, der bygger på det foregående arbejde, ved at muliggøre samtidig sammenligning af flere arrayer og ved hjælp af en mere robust forsøgsprotokol. Arrayet, der bruges i dette arbejde, indeholder flere undergrupper eller array ensemBles, der indeholder brønde i forskellige størrelser, varierende fra 15 til 100 μm i diameter, der er arrangeret på tre forskellige pladser ( dvs. 2x, 3x og 4x brønddiameteren). Arraysne er ætset i silicium, og væksten af ​​bakterierne, der er podet i silicium-arrays, aktiveres ved at forsegle arraysne med en dæksel, der er belagt med en medium-infusions agarosegel. P. aeruginosa mutanter designet til at studere type VI sekretionssystemet anvendes i denne demonstration.

Resultaterne præsenteret her bygger op til det ultimative mål at analysere multimember-samfund inden for microwell arrays, hvilket gør det muligt for forskere at overvåge overflod og organisering af bakterier in situ, samtidig med at man kontrollerer og proberer det kemiske miljø. Dette skal i sidste ende give indsigt i "reglerne", der styrer samfundsudvikling og arv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Silicon Microwell-array Fabrication

  1. Parylencoating
    1. Indsættelse mellem 1-1,5 μm parylene N på siliciumplader ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt parylene-belægningssystem ifølge fabrikantens specifikationer og instruktioner (indstillinger: Vaporizer setpunkt = 160 ° C, ovnens setpunkt = 650 ° C).
      BEMÆRK: Ca. 6 g parylene N, der er anbragt i et kammer, giver coatings 1-1,5 μm tykke.
  2. fotolitografi
    1. Spin-coat de parylene N-belagte wafers med adhæsionspromotor, 20% hexamethyldisilazan (HMDS) og 80% propylenglycolmonomethyletheracetat (PGMEA) (se Materialetabellen ) ved 3000 rpm i 45 s. Fyld en 2 ml transferpipette med adhæsionspromotor og drys den over hele waferen. Lad waferen sidde i ca. 10 s, før den tørres.
    2. Fyld en 2 ml transfer pipette med positiv tilNe fotoresist (se Materialetabellen ) og dispensere fotoresisten i midten af ​​waferen. Spin ved 3.000 omdr./min. I 45 s for at give en resistbelægning, der er ca. 1,5 μm tyk.
    3. Gentag prøverne på en kogeplade ved 115 ° C i 1 minut.
    4. Brug en kontaktjustering og fotomask med det ønskede brøndsmønster for at udsætte prøven for ultraviolet lys. Udsæt den spin-coatede wafer gennem den mønstrede fotomask i 6 s, hvilket giver en omtrentlig dosis på 60-80 mJ / cm2 målt ved 365 nm.
    5. Udvikl mønsteret ved at nedsænke prøven i udvikleren (<3% tetramethylammoniumhydroxid i vand, se Materialetabellen ) i 2 minutter. Skyl med DI vand og tør med rent, tørt nitrogen.
      BEMÆRK: De områder af fotoresist udsat for UV bør ryddes under udvikling.
  3. Reaktiv ionetsning
    1. Brug et iltplasmaetch til at fjerne det eksponerede parylenHele vejen til siliciumsubstratet.
      BEMÆRK: Opskriften kan moduleres for at ændre ætsningshastigheden af ​​parylenen. For parylentykkelser mellem 1 og 5 μm, brug en opskrift med 60 mTorr, 20 ° C, 100 sccm O 2 , 10 W RF og 2.000 W ICP på et Reactive Ion Etching (RIE) værktøj. Efter ætsning og fjernelse af det eksponerede parylene lag skal det mønstrede område ( dvs. det udsatte silicium) se skinnende ud og sølv.
    2. Brug en dyb RIE (DRIE, f.eks. Bosch DRIE) ætseproces til at ætses i siliconen.
      BEMÆRK: Etch rate og varighed bestemmer brønddybden. En fuld cyklus af Bosch-processen (et 3 s deponeringstrin: 20 mTorr, 15 ° C, 140 sccm C 4 F 8 , 10 W RF og 1.750 W ICP efterfulgt af en 10 s ætseproces: 20 mTorr, 15 ° C , 120 sccm SF 6 , 8 W RF og 1,750 W ICP) svarer til ca. 1 μm ætsedybde. Brøndene anvendt i dette demonstrationsområde spænder fra 3 til 3,5 μm dyb.
    3. VErify ætsedybden ved hjælp af fysisk profilometri.
      1. Indlæs prøven i et fysisk profilometer (se Materialetabellen ).
      2. Tænd prøvesugerummet og tryk på den manuelle belastningsknap.
      3. Fokuser systemet på prøven ved at trykke på "Focus" -knappen. Placer en passende funktion til måling på visningsskærmen.
      4. Scan prøven. Niveau profilen og måle funktionsdybden.
      5. Optag etchraten og moduler efterfølgende ætsningstider for at opnå den ønskede dybde.
        BEMÆRK: Målingen vil omfatte dybden af ​​siliciumbrønden, tykkelsen af ​​deponeret parylene og tykkelsen af ​​fotoresisten. Bekræftelse af tykkelsen af ​​hvert lag gennem hele proceduren er nødvendig for at opnå en præcis brønddybde.

2. Bakteriel kultur og frø ( Figur 1a )

  1. Start kolonier på Luria Broth (LB) agarplader fra glycerolbestanddele og brug inden for to uger. Vælg kolonier af de ønskede stammer fra LB agarplader og start natten over kulturer af P. aeruginosa. Inkubér natten over kulturer i ca. 18 timer ved 37 ° C under omrystning ved 220 omdr./min. I R2A medium.
    BEMÆRK: Kolonier bør vælges inden for to uger efter plating for at sikre, at mutationerne og fluorescerende reportergenene bevares. Alle P. aeruginosa arbejde skal udføres under BSL-2 betingelser.
  2. Brug en diamantskribent til sektionen siliciumpladen til individuelle chips, der indeholder ensembler af forskellige størrelser og tonehøjde arrays. Sørg for, at hver chip indeholder det fulde komplement af brøndstørrelser og pladser til undersøgelsen.

figur 1
Figur 1: Fremstilling og cellesædsprocedure. ( A ) Microwell arrayer aÆtset i siliciumskiver overtrukket med et tyndt lag af parylen (i). For at fugtige brøndene og / eller funktionalisere overfladen tilsættes en proteinopløsning i en dråbe oven på arraysne (ii). Proteinopløsningen fjernes, waferne tørres, og en ny opløsning indeholdende de ønskede bakterier tilsættes (iii). Bakterieopløsningen fjernes efter en inkubationsperiode, og waferne får lov at tørre, efterlader bakterier i brøndene og på overfladen (iv). De overfladeassocierede bakterier fjernes med parylenehæftning og efterlader bakterier, der er podet rent i mikrobrøndene og stadig levedygtige på grund af 2% glycerolmediet, hvilket hjælper med at holde brøndene hydreret (v). Siliciumchipsne placeres derefter array-side ned på en agaroseglas-belagt glasdæksel, der føder bakteriel vækst i mikrobrøndene (vi). ( B ) Layout af subarrayer på en enkelt siliciumanordning. Hver undergruppe indeholder et sæt identiske brønde. Diameteren af ​​microwells på tværs af alle sub-aRrays rækkevidde i diameter fra 5-100 μm og er organiseret ved 2x, 3x eller 4x brønddiameterhældningen, som betegnes af de hvide til mørkegrå farver på bundpanelets skematiske. Når brønddybderne er overfladiske (<10 μm), er brønddiametrene 5 og 10 μm sjældent nyttige, generelt på grund af manglende celler, der koloniserer disse meget små brønde. I dette arbejde blev kun data fra brønde med 15-100 μm diametre analyseret. Klik her for at se en større version af denne figur.

BEMÆRK: Som vist i figur 1b indeholder en komplet chip en del arrays af brønde med diametre fra 5 til 100 μm, med tre forskellige pitcher ( dvs. 2x, 3x og 4x diameteren), der gentager 4 gange.

  1. Anbring en 150 μl dråbe på 500 μg / ml bovint serumalbumin (BSA) i PBS-opløsningOven på arrayet for at vådte microwells. Inkubér BSA-opløsningen i 1 time på chippen ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
    1. Opret kammeret ved at fylde bunden af ​​en tom pipette tip kasse med fosfatbuffet saltvand (PBS).
      BEMÆRK: Andre stoffer, som f.eks. Specifikke lectiner, kan bruges i stedet for BSA til at funktionalisere overfladen af ​​microwells.
  2. Mens inkubering af siliciumchips med BSA-opløsning centrifugeres kulturerne ved 2.500 omdrejninger pr. Minut (svarende til et gennemsnit på 950 xg) i 5 minutter og resuspenderes dem derefter i 500 μl frisk R2A-medium med 2% glycerol.
    1. Bestem OD af kulturen ved anvendelse af et UV-vis spektrometer ved 600 nm. Juster det til en OD på 0,02 ved anvendelse af 2% glycerol R2A medium.
      BEMÆRK: Glycerol hjælper med at forhindre brøndene i at tørre ud under parylene-løft.
  3. Efter inkubation fjernes BSA opløsningen og skylles 3x med PBS ved at fjerne og udskifte væskedråbeT dækker silicium mikrowell array. Tør under nitrogen.
  4. Tilsæt 150 μl 0,02 OD kulturer til hver af de tørre arrays anbragt i et fugtigt kammer. Inkubér i 1 time ved 4 ° C for at tillade bakterier at klæbe til brøndvæggene.
    BEMÆRK: Køling er ikke nødvendig til inkubation. 4 ° C inkubationstiden kan bruges til at forhindre vækst af bakterier, før billeddannelsen begynder, så man kan visualisere den rumlige organisering af samfundene forud for væksten. Rum-temperatur inkubation kan også anvendes. Begge protokoller resulterer i tilsvarende vækstkurver.

3. Mikroskopopsætning

  1. Før start af bakterieinkubationen på siliciumchipsen, skal du tænde for miljøet på scenekontrollen (se materialebordet) og justere indstillingerne på kontrolboksen, så fugtigheden (~ 100%) og temperaturen (30-32) ° C, se trin 3.2) kan ækvilibrere før tilsætning af prøver.
  2. Niveau prøveholderen og linje indTerior omkring prøven med PBS- gennemblødte laboratorietørkere (se Materialebordet ) for at øge fugtigheden i kammeret til dugpunkt. Indstil temperaturen for kammeret til 30 ° C og det af kammerlåget til 32 ° C for at reducere kondens på billedplanet.
    BEMÆRK: Slidholderen passer ind i levende cellekammeret med en pakning, der er ca. 1 cm tyk. Prøveholderen er nivelleret med hjælp fra et bobleniveau, som er anbragt oven på prøveholderen. Prøveholderen kan vippes lidt og forbliver forseglet i pakningen til niveau.
  3. Mens kulturer inkuberer på siliciumchips, skal du tænde strømkontakten for kviksølvlampen manuelt mindst 30 minutter før billeddannelsen. Tænd kameraet og det automatiske mikroskopstrin manuelt. Åbn den software, der bruges til at styre mikroskopet og det perifere udstyr, og sørg for, at udstyret er anerkendt af softwaren.
    BEMÆRK: Forstørrelse er 10X med NA = 0,3.
  1. Mikrobølgeovn tidligere fremstillede agaroseopløsninger ( dvs. 2% agarose i R2A-medium) indtil en flydende tilstand er nået, ca. 60 s.
  2. Våd bagsiden af ​​en 75 mm x 22 mm, # 1,5 glasdæksel med ethanol og placer den i længderetningen, centreret over en glideskinne på 2 x 3 "(50 x 75 mm). Placer to PDMS afstandsstykker (tykkelse på ~ 1 mm) Langs de lange kanter af dækslip og skift glasdækslet så at ca. 1 mm af dækslet overhænger glidens kant.
  3. Hæld 5 ml flydende agaroseløsning oven på glasdækslet, lige nok til helt at dække det og læg en anden 2 x 3 "glasskinne oven på forsamlingen for at" sandwich "den flydende agar mellem dækslet og glideren.
    BEMÆRK: Dette styrer dybden af ​​agarose, hvilket gør den samlede tykkelse af dækslip og hærdet agarose lig med tykkelsen til PDMS afstandsstykker.
  4. Tillad glideskærm-dæk-agaroseglasglass-sandwich til at indstille, indtil agaroseopløsningen begynder at størkne; Overfør det derefter til et køleskab. Efter 15 minutter fjernes overskydende fast agarose og skæres om glasdækslet. Flyt dette til en ren skål og læg den i køleskab indtil brug.

5. Tætning af brøndene med en agarose-belagt overlap og billeddannelse

  1. Efter at inkubationsperioden for bakterier er afsluttet, fjern den agarose-coatede dæk fra køleskabet og tilbered siliciumchipsen som følger.
    1. Dyp siliciumchips i ultrature vand, en ad gangen, i 10 s hver. Sæt dem på deres kanter på en lab tørret eller væv, indtil det meste af overskydende væske er drænet fra kanterne af chips.
    2. Skær et stykke tape for at matche kantlængden af ​​hver siliciumchip. Placér båndet på den parylene, der dækker siliconen, og brug det til hurtigt at skrælle parylene-belægningen.
    3. OmgOmdrej hver skrællet chip og placér hver chip således, at microwell-arraysiden vender (og kommer i kontakt med) den agarose-belagte side af en agarose-belagt coverlip. Pas på ikke at flytte eller skifte chippen, når den berører agarosen for at forhindre væksten af ​​bakterier uden for brøndene.
  2. Placer det samlede mikrowell array / agarose coverlip i glidebolten på scene-top miljø kontrol kammer på miscroscope.
    1. Brug omgivende lys eller styrt lys ( f.eks. En lommelygte) til at lokalisere arrays af interesse. Brug den kommercielle software til at styre det automatiserede trin for at gemme disse positioner (se materialebordet). Sluk for omgivende eller styret lys, efter at positionerne er gemt.
    2. I den kommercielle software åbner du panelet "ND Acquisition".
      BEMÆRK: Dette panel indeholder en menu til automatisk opbevaring til en bestemt mappe, samt programmerbar billedindsamling. Til disse eksperimenter, Bruges "Tid", "XY" og "λ" menuerne.
    3. For at gemme placeringerne i softwaren skal du klikke på "XY menuen" og derefter tjekke en tom kasse på venstre side for hver position, der skal gemmes. Klik også på knappen "Inkluder Z".
  3. Få billeder over tid ved de ønskede bølgelængder og 10 forstørrelse ved hjælp af de relevante fluorescensfilterbiter (se Materialebordet).
    1. Brug kontrolsoftwaren og gemte arraypositioner til at flytte til hvert gemt sted og fokusere på brøndene. Klik på hvert XY-sted i den gemte liste og juster fokuset ved hjælp af Green Flourescence Protein (GFP) filteret. Gem den nye z-position ved at klikke på pilen, der peger på z-stedet.
      BEMÆRK: Denne proces kan være tidskrævende. Overvej at tage forholdsregler for at øge forstærkningen og bruge det neutrale tæthedsfilter for at reducere lysintensiteten for at forhindre photobleaching.
    2. Bestem z-akseafstanden mellem brændpunktsplaner for hver bølgelængde ved at bemærke forskellen i z-akse-positionen, når den fokuseres på overfladen af ​​arrayet. Vælg 2-3 steder fra arrayet med den blandede rød / grønne bakteriepopulation og fokus med det Røde Fluorescensprotein (RFP) filter.
      1. Subtrahere afstanden mellem brændpunktsplanerne ved hjælp af GFP- og RFP-fluorescensfiltre og tilføj denne fokalplanjustering under menuen "λ".
        BEMÆRK: Hvis arrayet f.eks. Vises fokuseret i GFP-kanalen ved en z-placering på 50 μm, og det samme array vises fokuseret i RFP-kanalen ved 55 μm, skal du tilføje +5 ud for RFP optisk konfiguration i "λ "Menuen.
    3. Start time-lapse image-opkøb.
      BEMÆRK: For de her viste eksperimenter blev RFP- og GFP-billeder erhvervet for hver matrixposition med 30 minutters intervaller ved brug af multimediebilledkøb gennem en kommerciel software, der styrerKameraet, lukkeren, filterhjulet og motoriseret scene.
      1. Indstil "interval" til 30 minutter og "eksperimentets varighed" til 24 timer under "Tid" -menuen. Klik på "Kør nu".
        BEMÆRK: Ved at køre "Tid", "XY" og "X" -kasserne, vil kørende programmet flytte scenen til billedet hvert sted ( dvs. de gemte XYZ-placeringer), tage et billede i en bølgelængde, flyt z-positionen For at tage højde for fokalplanforskelle ( dvs. lambda- eller bølgelængdekontrol), tag det andet billede, gå videre til næste arrayplacering (multipoint) og loop dette med 30 min intervaller (time-lapse).
  4. Få belysningskontrolbilleder.
    BEMÆRK: Brug menuerne "ND Acquisition", "Time" og "XY" til at tage billeder af 4 steder, 25x hver.
    1. Tag en serie af 100 "darkfield" billeder ved at slukke for alle lyskilder og tageEt "billede" af et standardbillede. Disse billeder vil optage kamera støj. Brug den længste eksponeringstid, der blev brugt under timelapsen (trin 5.3.3).
    2. Tag en serie af 100 "belysningsfelt" billeder ved at billedere et standardglas ( dvs. ensartet RFP eller GFP intensitet) på et par forskellige steder for at indfange den ujævn belysning ved de givne eksperimentelle forhold. Vælg en eksponeringstid, der maksimerer signalet uden at opnå mætning.

6. Analyse

  1. Behandle billedstablerne ved hjælp af en billedanalysesoftware ( f.eks. ImageJ).
    1. Konverter de overførte billeder til tiff-filformat ved hjælp af den kommercielle software. Upload billeder til billedanalyseprogrammet ved at klikke på "File"> "Import"> "Image Sequence."
    2. Opret et "Correction Image" ved at gennemsnitlige alle "darkfield" og "illumination field" billeder. SubtracT det gennemsnitlige "darkfield" billede fra det gennemsnitlige "belysningsfelt" billede ved at vælge "Process"> "Image Calculator". Vælg de to billeder, "Image1" og "Image2" og derefter "Subtract" i "Operation" feltet. Klik på "OK".
      1. I gennemsnit skal du lægge korrektionerne (eller mørkefelt) billederne, klikke på "Billede"> "Stabler"> "Z-projekt"> "Gennemsnitlig projektion".
    3. Udfør billedregistrering, hvis det er nødvendigt. Udfør derefter baggrundsundertrækning ved at klikke på "Process"> "Træk baggrund." Indtast en radius ( f.eks. 125) i "radius" feltet og vælg "glidende paraboloid".
    4. Udfør belysningskorrektion ved hjælp af "Process"> "Calculator Plus". Vælg følgende parametre: operation, divide; I1, godt billede I2, korrektion billede; K1, korrektion billede betyder; Og k2, 0. Klik på "CreSpiste nyt vindue. "
      BEMÆRK: Dette datasæt krævede ikke registrering, men i andet arbejde blev ImageJ Plugin StackReg brugt med "Oversættelse" -transformationen. Til baggrundsintertraktionen skal du bruge den samme glidende paraboloidradius for hvert billedsæt. For eksempel, hvis de største brønde afbildet har en pixelradius på 100, skal du bruge en radius større end 100 ( fx 125) for hvert billedsæt.
  2. Bestem væksten af ​​hver stamme i microwells.
    1. Vælg områder af interesse (ROI) omkring hver mikrorel i de ønskede arrays ved hjælp af ImageJ "MicroArray" plugin.
      1. Klik på "Reset Grid" i menuen "MAP". Angiv rækker, kolonner og diameter (baseret på brøndens størrelse og nummer på arrayet, se figur 1b ). Vælg "cirkel" fra menuen "ROI form".
      2. Hold "Alt" nøglen, mens du vælger det øverste venstre ROI med musen for at flytte tHan ROI array. Hold "Skift" nøglen, mens du vælger ROI'en til venstre for at ændre størrelsen af ​​arrayet. Hold "skift" nøglen, mens du vælger et afkast fra højre side af arrayet, men ikke i hjørnerne for at ændre afkastet af investeringsafkastet.
      3. Brug ovenstående kommandoer til at passe ROI-rækken over brøndene i et billede. Klik på "Mål RT."
        BEMÆRK: Plugin'et eksporterer de ønskede målinger fra hvert afkast. Brug tre ROI-størrelser, der skaber koncentriske ringe rundt om brøndene for at samle lokalt baggrundssignalet ( dvs. signalet fra den midterste ring, der trækkes fra den ydre ring) og fluorescensmålinger ( dvs. signalet fra den indre ring).
    2. Indsamle dataene i et regnearksoftware og beregne baggrundssignalet. Importer det til en brugerdefineret scripting software til yderligere analyse.
  3. Data organisation og analyse
    1. Importer dataene og organiser dataeneIndsamlet i ImageJ i en matrix i følgende rækkefølge for alle tider: kolonne 1, sub-array nummer; Kolonne 2, brønd række Kolonne 3, brøndkolonne; Kolonne 4, gennemsnitlig intensitet Kolonne 5, baggrundsintensitet Og kolonne 6, gennemsnitlig intensitet - baggrundsintensitet.
      1. Adskille resultaterne fra mCherry og GFP opkøbet i forskellige matricer. Gem resultaterne fra hver undergruppe og hver farve i en anden celle i en celle array.
        BEMÆRK: Denne organisation gør det lettere at flytte frem og tilbage mellem billeddata og måleresultater, rense dataene og sikre, at målene præcist repræsenterer dataene.
    2. Juster for autofluorescens af P. aeruginosa .
      BEMÆRK: I eksperimenter, der involverer co-kultur af GFP og mCherry-stammer, bør en mCherry-only chip analyseres for at fastslå forholdet mellem mCherry og grøn autofluorescens.
      1. Plot mCherry-versus-GFP signalet fra alle mCherry ΔretS &# 916; tse / i1-6 brønde på alle tidspunkter for at bestemme forholdet mellem mCherry-signalet og autofluorescensen i GFP-kanalen. Subtrahere autofluorescenssignalet fra co-kulturer.
    3. Tegn kurverne og pas på en ændret logistisk ligning til hver bane for at udpakke parametre ved at bruge mindst kvadrater, der passer i enten et regnearksoftware eller en brugerdefineret skriptsoftware.
    4. Se efter korrelationer mellem og blandt GFP og mCherry-bane parametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den eksperimentelle platform, der præsenteres her, er designet til high-throughput og high-content undersøgelser af bakterielle samfund. Designet gør det muligt at analysere tusindvis af samfund, der vokser i brønde i forskellige størrelser, samtidig. Med denne microwell array design kan afhængigheden af ​​den endelige samfunds sammensætning på indledende såningstætheder, brøndstørrelse og kemiske miljø bestemmes. Dette arbejde demonstrerer væksten af ​​et to-medlems community i microwell-arrayet og fremsætter metoder til analyse af samfundsammensætning og organisation.

Modelsystemet der blev anvendt her, blev designet i Mougous lab for at studere type VI sekretion i P. aeruginosa . Systemet består af flere mutantstammer, der indeholder enten GFP eller mCherry fluorescerende reportere. I dette arbejde anvendtes 2 forskellige stammer. Den første er en GFP-mærket ΔretS-mutant, der er konstitutivelY udtrykker de toksiske effektorproteiner associeret med type VI-sekretion, hvilket resulterer i højere niveauer af celledød i modtagelige celler. Den anden er en RFP-mærket ΔretSΔtse / i1-6 stamme, der er en deletionsmutant, som mangler alle seks kendte effektorproteiner, og som har vist sig at være mere modtagelig for type VI-patogenese 22 , 23 , 24 . Vækstbanerne for hver art blev sporet individuelt og inden for to medlemsgrupper ( dvs. co-kultur inden for matrixplattformen).

ΔretS- og ΔretSΔtse / i1-6-mutanterne blev podet på tre arrays, hver for sig og også blandet sammen i et 1: 2-forhold og derefter billedet hvert 30. minut i 20 timer. Bakterievækst i brøndene ophørte mellem 6 og 12 h efterfrøning. Eksempler på fluorescerende billeddata er vist i figur 2 og 3. Figur 2 viser vækst over tid af ΔretS- og ΔretSΔtse / i1-6-stammerne i 45 μm diameterbrønde, og Figur 3 viser tilstanden af ​​de samme tomedlemsamfund omkring 6 h eftersædning (hps) i brønde i forskellige størrelser.

Figur 2
Figur 2: Prøve billeder fra en tidskursus samkultur Væksteksperiment. To mutanter af P. aeruginosa , der udtrykker enten mCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (rød) eller GFP (ΔretS) (grøn), udsås sammen i et 2: 1 mCherry: GFP-forhold i microwell-arrays. På billedet er der sammensatte billeder taget på 3 forskellige tidspunkter eftersøgende i de 45 μm diameter brønde. Klik her for at se en større versionAf denne figur.

Figur 3
Figur 3: Område for brønddiametre inkluderet i Microwell Array Device. Repræsentative billeder af tomedlemsamfund fanget ved 8 timers vækst. Generelt viser mCherry (ΔretSΔtse / I1-6) (rød) eller GFP (ΔretS) (grønne) kolonier minimal kolokalisering, der forbliver inden for forskellige områder i mikrobrøndene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Før opkøb af målingerne blev der udført en glidende parabaloid baggrundsundertrækning. Et belysningskorrektionstrin blev anvendt således, at signalet fra hver mikrowell billedet i et givet eksperiment kunne sammenlignes kvantitativt. Disse metoder har været pOprigtigt beskrevet 25 . Ved hjælp af microarray-pluginet i ImageJ blev den gennemsnitlige intensitet af de røde og grønne bakterier målt i de korrigerede billeder sammen med et lokalt baggrundssignal. Det lokale baggrundssignal blev subtraheret fra brøndsignalet, og GFP-signalet blev justeret for at korrigere for autofluorescensen af P. aeruginosa- co-kulturer (autofluorescens bestemt fra mCherry ΔretSΔtse / i1-6-only arrays) . Når alle disse korrektioner blev udført, kunne de kvantitative vækstbaner af mCherry- og GFP-udtrykkende bakterier udtages. Eksempelvækstbaner fra 20 og 50 μm diameterbrønde er vist i figur 4 .

Figur 4
Figur 4: Vækstkurver for mono- og co-kulturer af P. aeruginosa type VI-sekretionsmutanter.( A og d ) GFP-ΔretS monokulturvækstkurver i henholdsvis 20 μm og 50 μm brønde. ( B og e ) mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 monokulturvækstkurver i henholdsvis 20 og 50 μm brønde. (C og f) Co-kultur af en 1: 2 ratio blanding af GFP (grøn) og mCherry (rød) P. aeruginosa stammer. Vækstkurver er plottet fra, hvornår billedopsamlingen begyndte, ca. 2 h eftersædning (hps). Klik her for at se en større version af denne figur.

Vækstbanerne fra mono- og co-kulturen af P. aeruginosa stammer indikerer , at der er en vis variation i vækst fra godt til godt, og at denne variabilitet øges i brønde med mindre dimensioner. Imidlertid er den gennemsnitlige intensitet ikke signifikant påvirket af vel size. Der ser ikke ud til at være en dramatisk eller klar negativ effekt på væksten af ​​den modtagelige stamme (ΔretSΔtse / i1-6), når ΔretS-stammen er til stede. Den samlede intensitet for hver stamme faldt, men dette skyldtes en lavere startkoncentration af hver stamme i brøndene, idet den totale OD blev holdt konsistent på tværs af eksperimenter, ikke den enkelte OD af hver stamme. Det er imidlertid svært at afgøre, hvilke faktorer der er vigtigst for at forstå bakteriens vækst i disse brønde ved blot at kigge på vækstbaner alene. Derfor var hver bane egnet til en modificeret logistisk funktion 26 ( figur 5a ), således at relevante parametre kunne udvindes og bruges til at analysere bakterievækstdata. Hver bane blev transformeret ved at tage signalets naturlige logbog divideret med begyndelsessignalet. En modificeret logistisk funktion med tre parametre svarende til et maksimalt signal (A), maksimaltHastighed (μ) og en forsinkelsestid (τ), blev anvendt til at passe til hver bane.

I betragtning af den kendte vekselvirkning mellem GFP-ΔretS og mCherry-ΔretSΔtse / i1-6-stammerne kan man antage at væksten af ​​mCherry-stammen ville hæmmes i samkulturer med GFP-ΔretS-stammen 22 , 24 . Ved hjælp af de ekstraherede parametre er det muligt at se efter positive eller negative sammenhænge mellem parametrene udtaget fra GFP og mCherry-baner. Den indledende parameteranalyse foreslog, at samkulturen af ​​disse arter havde en ubetydelig virkning på deres samlede vækst. Variabiliteten set i vækstkurverne skyldes sandsynligvis miljøfaktorer, såsom indledende såddensitet, som bliver mere variabel ved mindre brønddiametre ( figur 5b ). Væsentlige negative virkninger på mCherry-stammen på grund af tilstedeværelsen af GFP-ΔretS blev ikke observeret. For eksempel blev der ikke fundet noget fald i mCherry-ekspression, når der var et højere forhold af GFP-ΔretS i brøndene, når der blev tegnet det maksimale mCherry-signal i forhold til forholdet mellem det oprindelige GFP-til-RFP-signal.

Figur 5
Figur 5: Fluorescerende vækstbaner passer til en ændret logistisk ligning. ( A ) Eksempelkurven normaliseres og tilpasses derefter til en modificeret logistisk ligning ved at justere tre parametre, en maksimal intensitet (A), en maksimalhastighed (μ) og en forsinkelsestid (τ). ( B ) Indledende mCherry-signal mod oprindeligt GFP-signal i individuelle brønde med forskellige diametre. ( C ) Det maksimale mCherry-reportersignal plottet i forhold til forholdet mellem initialintensiteten af ​​de GFP-udtrykkende bakterier til de RFP-udtrykkende bakterier.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Tidligere arbejde i Mougous Lab viste, at virkningerne af type VI-sekretion kræver direkte celle-til-cellekontakt mellem udskillende og modtagelige celler, og at en længere kontaktperiode resulterer i mere cellysis 23 . Derfor mener vi, at de eksponentielle vækst i de to mutanter i disse arrays simpelthen udelukker de kontaktmedierede patogene effekter i dette modelsystem. I brønde i alle størrelser vokser GFP- og mCherry-udtrykkende bakterier i forskellige patches ( figur 2 og 3 ). I stedet for at fokusere på vækstrater kan bakteriegrupper, der indeholder kontaktmedierede patogene aktører, derfor bedre studeres ved hjælp af rumlige analyser. For eksempel, snarere end focusiNg på den integrerede intensitet, som er repræsentativ for det samlede antal røde eller grønne celler i en brønd, giver dette microwell format mulighed for at tælle nummeret og placeringen af ​​røde og / eller grønne pixels. Det er muligt at analysere væksten af ​​individuelle kolonier eller patches i disse brønde, idet der fokuseres på grænserne, hvor de røde og grønne signaler overlapper hinanden ( figur 6a ). Kvantificering af lokaliseringshændelser og nærmeste naboanalyser kan derefter udføres for at se nærmere på egenskaber som patchstørrelse, patchvæksthastighed og patchoverlapning inden for individuelle brønde. Rumlige analyser vil blive understøttet af højere forstørrelse billeddannelse og konfokal mikroskopi ( figur 6b ).

Figur 6
Figur 6: Den rumlige organisation af forskellige arter kan analyseres ved hjælp af epifluorescerende og konfokal mikroskopi. ( B og c ) Konfokale billeder (20X forstørrelse, NA = 0,8) med en diameter på 15 μm ~ 7,5 μm dybe brønde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel præsenterede en microwell array-enhed og eksperimentelle protokoller designet til at muliggøre høj-gennemgang og højindhold levende celle billedbaseret analyse af bakteriel samfund udvikling. Mens demonstrationens fokus her var at studere virkningerne af kontaktmidlet type VI-sekretion på fællesskabsudvikling, var arraysne designet til at være fleksible og rumme undersøgelsen af ​​en bred vifte af mikrobielle samfund og mikrobe-mikrobe interaktioner. Arbejdet her fokuserer udelukkende på brugen af ​​bakterier, der konstitutivt udtrykker fluorescerende markører for at muliggøre en let sporing af medlemmets overflod og placering. Muligheden for at prøve biologisk materiale fra individuelle brønde efter vækst eller forstyrrelse ved at ændre det kemiske miljø kunne imidlertid primært bruges til at identificere samfundsammensætning og genekspression.

Hvert siliciumapparat består af dusinvis af arrays, der indeholder mikrobrønde med forskellige brøndeDiametre, organiseret på enten en 2x, 3x eller 4x diameter stigning og ætset til en dybde mellem 3 og 3,5 μm. Fordi næringsstoffer og sekundære metabolitter kan diffundere frit gennem og på tværs af agarose låget, blev forskellige tonehøjde subarrayer inkluderet for at muliggøre undersøgelse af, hvordan signalering mellem mikrobølger eller lokal næringsdepletion påvirker samfundsudviklingen. I denne demonstration forekom vækst og samfundsudvikling ikke at være påvirket af microwell-afstand eller placering inden for arrays. Den lave dybde blev valgt til at forenkle billedanalyse, hvilket begrænser al mikrobiell vækst og udvikling til et enkelt billedplan. Imidlertid er dybere brønde (20 μm dyb) tidligere blevet anvendt og kan let moduleres dybt ved at variere varigheden af ​​silicium-ætseprocessen. Forøgelse af aspektforholdet mellem brøndene ændrer i det væsentlige graden af ​​indeslutning oplevet af cellerne i det indre af brøndene, hvilket effektivt ændrer forholdet af det totale brøndvolumenTil det område, gennem hvilket næringsstoffer diffunderer i toppen af ​​brønden. Denne række array konfigurationer kan bruges til at studere virkningerne af well-to-well eller intra-well signalering.

En begrænsning ved anvendelse af silicium til fremstilling af microwells er, at den er uigennemsigtig for synligt lys. Som følge heraf kan rutinemæssige analyser, der er afhængige af lysoverførsel ( f.eks. Lysfelt, fase eller differential interferens kontrastbilleddannelse) ikke anvendes til overvågning af vækst. Løbende forskning og udvikling i vores gruppe har fokuseret på at tilpasse denne silicium microwell konfiguration og eksperimentelle protokol til arbejde med gennemsigtige arrays for at muliggøre højere opløsning fluorescens og brightfield billeddannelse til overvågning og kvantificering 27 . Ved at anvende transparente materialer til fremstilling, såsom SU-8 epoxy på en glasdæksel, er det muligt at erhverve både lysfelt- og fluorescensbilleder med mål, der arbejder på kortere arbejdsstørrelser.Dette gør det muligt at opnå en mere optimal opløsning ved vanddypning eller oliemålsætninger med ≥40X forstørrelse, uden vanskeligheden ved billeddannelse gennem et agarlag, som det er tilfældet med siliciumraceringer.

Som beskrevet i vores tidligere arbejde påvirker såddbetingelserne og brøndgeometrien sædningen af ​​celler i brøndsarrayerne. Ved lave seedætheder eller i små brønde giver høj variation af antal og typer af celler, som indlæses i individuelle brønde, mulighed for en bred og hurtig udforskning af forsøgsparameterrummet. Højere såningstætheder og / eller billeddannelse større brønde giver mere konsistente forhold mellem celletyper og totale inokulumniveauer, hvilket muliggør analyse af stort antal eksperimentelle replikater. Et hurtigt kig på billeder i de tidligste stadier af vækst tyder på, at cellerne vedhæfter og vokser primært langs kanterne af brøndene ( figur 5a ). Det er ikke klart, om dette er en artefakt relateret til sUfortyndet tørring under såningsprocessen eller foreslår en præference for cellefastgørelse til flere kanter. Intentionelt at ændre topografi eller overfladekemi af brøndene på en deterministisk måde kunne afdække hvilke faktorer der har størst indflydelse på cellehæftning og biofilmdannelse.

Vækst af bakterierne i disse brønde understøttes af brugen af ​​et agaroseglasbelagt glasdækslip infunderet med R2A-medium. De metoder, der er beskrevet for at oprette denne agarose-belagte dæklip sikrer en jævn tykkelse, hvorigennem billedet og en forholdsvis konstant z-position giver mulighed for samtidig at tegne flere siliciumchips. Anvendelsen af ​​ultra-ren agarose som geleringsmiddel og et minimalt medium frem for et komplet medium resulterer i en renere, mindre autofluorescerende baggrund, hvilket øger det samlede signal-støjforhold. Når man er afhængig af fluorescens til kvantitativ sporing af mikrobielle samfund, er det vigtigt at holde imagiNg betingelser konsekvent og være akut opmærksom på bidrag fra autofluorescens, photobleaching og ikke-ensartet belysning. Desuden er det ønskeligt at anvende tykt agaroslag, som det er anvendt her, for eksperimenter, der kræver langvarig billedforøgelse. Tyndere lag (~ 100 μm tykke) kan laves for at muliggøre højere forstørrelse billeddannelse. Det er imidlertid svært at holde samlingen fugtig nok til at forhindre, at det tynde lag tørrer ud.

Selv om den indledende analyse af vækstparametre og indledende inokulationsniveauer endnu ikke har afsløret nogen signifikante korrelationer for det simple system, der beskrives her, fremhæver de viste protokoller og data dybden af ​​information, som kan udvindes fra billeder af samfundsudvikling over tid. Rumlig organisation inden for brøndene udvikler sig som enkeltartskolonier, der udvides fra de første "nucleation" -steder. Faktorer der er forbundet med den oprindelige fastgørelsesdensitet ( dvs. stammende perhaPs fra den større præference af en art for brøndoverfladen sammenlignet med en anden) eller vækstrate for individuelle pletter kan dramatisk påvirke fællesskabets udvikling. Subtere interaktioner, som dem, der medieres af kontakt mellem arter (patches), der er etableret meget sent i vækstprocessen, kan kræve en mere dybdegående analyse af billeddataene.

Microwell array platformen og protokollen, der præsenteres her, muliggør hurtig samling og højindholdsanalyse af mikrobiel samfundsudvikling og mikrobe-mikrobe interaktioner. Fremtidigt arbejde, der muliggør kontrol af det lokale kemiske miljø, ved at ændre sammensætningen af ​​medium i agarlocket eller ved direkte modulering og prøveudtagning via integrerede mikrofluidika, bør muliggøre forsøgsprotokoller, der bevæger sig ud over at efterligne naturlig indeslutning og nichestørrelse og begynde at Undersøge virkningen af ​​dynamisk skiftende miljøer, ligner dem, der findes i naturen. Fremtidigt arbejde vil øgeArray design med integrerede mikrofluidika, der kan bruges til dynamisk modulering af det lokale kemiske miljø og til prøve væske fra individuelle brønde. Yderligere arbejde på udvikling af optisk klare microwell arrayer, der kan bruges til højere opløsning og brightfield tracking af samfundsvækst er beskrevet andetsteds 27 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgements

Microwell-arrays blev fremstillet og karakteriseret ved Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Finansiel støtte til dette arbejde blev ydet gennem Oak Ridge National Laboratory Director's Research and Development Fund. Forfatterne vil også gerne takke J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) for levering af P. aeruginosa stammer anvendt i disse undersøgelser .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Parylene N Specialty Coating Systems CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater Specialty Coating Systems Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010
Silicon Wafer WRS Materials 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>,
adhesion promoter Shin-Etsu Microsci MicroPrime P20 adhesion promoter
postive tone photoresist Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)
Quintel Contact Aligner Neutronix Quintel Corp NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool Oxford Instruments Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher
R2A Broth TEKnova R0005
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Multimode Plate Reader Perkin Elmer Enspire, 2300-0000
Fluorescent Microscope Nikon Eclipse Ti-U
Automated Stage Prior ProScan III
CCD camera Nikon DS-QiMc
Stage-top environmental control chamber In Vivo Scientific STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190144
UltraPure Agarose ThermoFisher Scientific 16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip Nexterion High performance #1.5H coverslips
Fluorescence Reference Slides Ted Pella 2273
Physical Stylus Profilometer KLA Tencor P-6
lab wipes Kimberly Clark Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial software Nikon NIS Elements
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss
filter cubes Nikon Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
  2. Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (10), 4152-4157 (2011).
  3. Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73, (22), 7300-7307 (2007).
  4. Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105, (47), 18188-18193 (2008).
  5. Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
  6. Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
  7. Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72, (1), 212-220 (2006).
  8. Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136, (6), 1989-2002 (2009).
  9. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36, (5), 347-355 (2011).
  10. Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11, (5), 337-348 (2013).
  11. Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14, (2), 93-105 (2015).
  12. Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4, (1), 63-75 (2014).
  13. Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14, (10), 3742-3748 (2013).
  14. Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9, (6), (2015).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (46), 17290-17295 (2006).
  16. Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333, (6050), 1764-1767 (2011).
  17. Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (14), 5624-5629 (2013).
  18. Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4, (2), 1-8 (2013).
  19. van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14, (1), 116 (2014).
  20. Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
  21. Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11, (5), e0155080 (2016).
  22. Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7, (1), 25-37 (2010).
  23. LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109, (48), 19804-19809 (2012).
  24. Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92, (3), 529-542 (2014).
  25. Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11, (1), e0145081 (2016).
  26. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56, (6), 1875-1881 (1990).
  27. Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34, (6), 06KI03 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics