الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا، ويتبين كيف يمكن في الموقع التقريب التقارب القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى) يمكن استخدامها للكشف وتصور التفاعلات البروتين البروتين مباشرة بين أتم و p53 في الثقافات خلية تعليق تتعرض للإجهاد السامة الجينات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bahjat, M., Bloedjes, T. A., van der Veen, A., de Wilde, G., Maas, C., Guikema, J. E. Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (124), e55703, doi:10.3791/55703 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

استجابة الحمض النووي الضرر يبرر إصلاح آفات الحمض النووي التي تحدث بشكل عفوي، والناجمة عن الإجهاد السمية الجينية، أو تظهر في سياق فواصل الحمض النووي المبرمج في الخلايا الليمفاوية. الكيناز المتحول (أتم) كيناز (أتم) و كيناز المرتبط ب ATM3 و Rad3 (أتر) والوحدة الفرعية الحفازة للبروتين كيناس المعتمد على الحمض النووي (دنا-يكس) هي من بين الأولى التي يتم تنشيطها عند تحريض تلف الحمض النووي، وهي أجهزة تنظيم مركزية للشبكة التي تتحكم في إصلاح الحمض النووي، موت الخلايا المبرمج، وبقاء الخلية. كجزء من مسار قمعي للورم، أتم و أتر تفعيل p53 من خلال الفسفرة، وبالتالي تنظيم النشاط النسخي من p53. يؤدي تلف الحمض النووي أيضا إلى تشكيل ما يسمى بؤر الإشعاعات المؤينة (إريف) التي تمثل مجمعات استشعار الحمض النووي الضرر وإصلاح البروتينات التي تتراكم في مواقع تلف الحمض النووي، والتي تصور بواسطة المجهر مضان. غير أن التوطين المشترك للبروتينات في إريفس لا يعني بالضرورة دالتفاعلات البروتين البروتين مباشرة، كما أن قرار المجهر مضان محدودة.

في الموقع التقريب التقارب القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى) هو أسلوب الرواية التي تسمح التصور المباشر من البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا والأنسجة مع خصوصية لم يسبق لها مثيل والحساسية. وتستند هذه التقنية على القرب المكاني للأجسام المضادة المحددة ملزمة للبروتينات ذات الاهتمام. عندما البروتينات استجواب في غضون ~ 40 نانومتر يتم تنشيط رد فعل التضخيم من قبل قليل النوكليوتيدات التي مترافق إلى الأجسام المضادة، ويتم تصور المنتج التضخيم من قبل وضع العلامات الفلورسنت، مما أسفر عن إشارة التي تتوافق مع الموقع تحت الخلوية من البروتينات المتفاعلة. باستخدام التفاعل الوظيفي القائم بين أتم و p53 كمثال على ذلك، هو موضح هنا كيف يمكن استخدام جيش التحرير الشعبى الصينى في الثقافات خلية تعليق لدراسة التفاعلات المباشرة بين البروتينات التي هي جزء لا يتجزأ من استجابة تلف الحمض النووي.

Introduction

يسبب تلف الحمض النووي سلسلة من التنظيمات العالية من الأحداث التي تنطوي على التفاعلات البروتين البروتين والتغييرات بعد متعدية التي تضمن إصلاح فعال وسريع من الحمض النووي، وبالتالي الحفاظ على السلامة الجينية 1 . عادة، يتم دراسة إصلاح الحمض النووي في الخلايا المعرضة للإشعاع المؤين من خلال رصد تشكيل ما يسمى بؤر الإشعاعات المؤينة (إريف) من قبل (متحد البؤر) المجهر مضان. العديد من إصلاح الحمض النووي والبروتينات الاستشعار عن الضرر الحمض النووي تشكل إريفس، والتي تمثل المجمعات البروتين التي نواة في مواقع الكروماتين الحفاظ على تلف الحمض النووي 2 ، 3 . موقع وحل إريفس مع مرور الوقت يعطي نظرة ثاقبة هامة في المنظمة المكانية الزمانية من إصلاح الحمض النووي، وقد تشير إلى تورط مسارات إصلاح الحمض النووي المختلفة. طبيعة الضرر الحمض النووي ومرحلة دورة الخلية التي يتم تحقيق الضرر يحدد أي مسار إصلاح الحمض النووي يتم تفعيلها. فو ، في الخلايا التي تشارك بنشاط في تكرار الحمض النووي (S- المرحلة)، إعادة التركيب مثلي (هر) هو مسار إصلاح الحمض النووي المهيمن، في حين أنه في الخلايا في G1- أو G2 / M- المرحلة من دورة الخلية، متماثل نهاية انضمام (نهيج) مسار إصلاح تسود. واحدة من أقدم الأحداث التي تلحق الضرر الحمض النووي هو تنشيط الحمض النووي كينسيس الاستشعار عن الأكسار أتاكسيا تيلانجيكتاسيا البروتين المتغير (أتم)، التي هي في الغالب نشطة في G1- و G2 / M- مراحل دورة الخلية وينظم نهيج، و أتاكسيا تيلانجيكتاسيا والبروتين ذات الصلة Rad3 (أتر)، الذي يعمل في S- المرحلة من خلال تفعيل الموارد البشرية. كل من أجهزة الصراف الآلي و أتر هي كيناسيس بليوتروبيك جدا أن الفسفوريلات العديد من البروتينات التي تشارك في إصلاح الحمض النووي، موت الخلايا والبقاء على قيد الحياة 4 . وقد أظهرت كل من كيناز للفوسفهوريلات وتفعيل p53 البروتين الكابتة للورم بعد التعرض للإجهاد السمية الجينية، مشيرا إلى أن هذه كيناسس هي وسطاء المنبع من محور محوري ورم إشارة قمعية"كريف"> 5 ، 6 .

يتم تقييم تكوين وتكوين إيريفس عادة عن طريق تحديد المشاركة في توطين البروتينات المختلفة باستخدام ثنائي اللون تلطيخ المناعي والمجهر، ومع ذلك، ليس كل البروتينات التي هي جزء من المجمعات إصلاح البروتين تشكل إيريفس، مما يحد من تطبيق هذا النهج. وعلاوة على ذلك، (متحد البؤر) المجهر المناعي محدودة بخصائص حيود الضوء، مما أدى إلى قرار المكانية الفقيرة بدلا من حوالي 200-300 نانومتر، وتجاوز حجم معظم الهياكل تحت الخلوية، والتي تحظر أساسا الاستجواب المباشر للتفاعل البروتين البروتين في المستوى الجزيئي. على هذا النحو، والمشاركة في توطين أنماط تلطيخ المناعي كما تم الكشف عنها من قبل (متحد البؤر) المجهر مضان ليست بالضرورة مؤشرا لتفاعلات البروتين البروتين مباشرة. في الآونة الأخيرة، تم تطوير تقنيات فائقة الدقة الجديدة، مثل ستروك ثلاثي الأبعاد(3D-سيم) 7 ، والتي استخدمت بنجاح لدراسة 53BP1 و BRCA1 أريف تشكيل على التفاصيل نانو على نطاق، وكشف عن خصائص التوزيع المكاني لهذه البروتينات التي لا يمكن الكشف عن طريق متحد البؤر المسح المجهري بالليزر 8 .

ويمكن استخدام العديد من الطرق الأخرى للكشف عن التفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي ، مثل شارك في مناعي، وأساليب المنسدلة والخميرة نهجين الهجينة الفرز. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات مرهقة نوعا ما، تتطلب كميات كبيرة من الخلايا أو البروتينات أو تنطوي على أوفيركسريسيون من البروتينات، والذي يدخل التحف التجريبية. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير تقنية جديدة تسمح التصور وكمي من البروتينات التفاعلات البروتين في الموقع ( أي في الخلايا والأنسجة)، وهو ما يسمى التقريب التقارب التقارب (بلا) 9 ، 10 . العلاقات العامةيتم الكشف عن الأجسام المضادة إيماري التي تعترف اثنين من البروتينات من الفائدة من قبل الأجسام المضادة الثانوية التي مترافق إلى قليل النوكليوتيدات (ما يسمى تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى). إذا كان اثنين من الأجسام المضادة الثانوية مختلفة قريبة بما فيه الكفاية بسبب التفاعلات بين البروتينات المعترف بها من قبل الأجسام المضادة الأولية، وأوليغونوكليوتيدس مترافق تهجين ويمكن ليغاتد لتشكيل الركيزة الحمض النووي دائرية مغلقة. يتم تضخيم هذا الركيزة دائرية في وقت لاحق من قبل المتداول دائرة التضخيم، وتصور مع أوليغونوكلأوتيدس التكميلية متلألئ مترافق. باستخدام جيش التحرير الشعبى الصينى، يتم الحفاظ على توطين تحت الخلوية من التفاعل البروتين البروتين كما يبقى فلوريسنتلي المسمى المتداول دائرة التضخيم المنتج تعلق على تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى. القرار من هذا الفحص هو <50 نانومتر، استنادا إلى النتيجة التي يبلغ قطرها الأجسام المضادة حوالي 7-10 نانومتر 11 . المتداول دائرة التضخيم لا يمكن إلا أن تأخذ مكان في حالة اثنين من أزواج من الأجسام المضادة (الابتدائي + سيكونداري) التفاعل الجسدي داخل محيط التي يتم تعريفها من قبل حجمها (10 + 10 + 10 + 10 = 40 نانومتر). خطوة التضخيم إشارة يزيد من حساسية الفحص جيش التحرير الشعبى الصينى ويمكن الكشف عن التفاعلات من البروتينات أعرب بالكاد. جيش التحرير الشعبى الصينى يولد منقط، وبؤر إشارات مثل أنماط التي يمكن كميا على أساس كل خلية، والتي من خلالها يمكن تقييم التباين داخل و خلوي في التفاعلات البروتين البروتين.

تكوين وتكوين المجمعات إصلاح الحمض النووي و إيريفس درس في الغالب في خطوط الخلايا ملتصقة مثل العظام العظام العظام الخلايا الظهارية خط U2OS، الإنسان الجنينية خط خلية الكلى HEK293 والشبكية الشبكية خط الخلايا الظهارية ربي-1، تزايد وسهلة ل ترانسفيكت. وتستخدم الثقافات خلية تعليق مثل الخلايا اللمفاوية وخلايا الخلايا النخاعية أقل في كثير من الأحيان، وهذه هي أقل قابلية للترنسفكأيشن وعموما لا تلتزم كوفرسليبس، مما يتطلب ست /إبس، ب، التصوير. ومع ذلك، فإن حل تلف الحمض النووي ذو صلة كبيرة في سياق الأورام الخبيثة اللمفاوية والخلايا النخاعية، حيث يتأثر رد فعل تلف الحمض النووي في كثير من الأحيان بانحرافات الجينوم (السائق) في هذه الأورام، ولعب دورا محوريا في التحول الخبيث للالمفاوية العادية والنخاعي ( السلف) 12 ، 13 ، 14 .

يصف هذا البروتوكول كيف جيش التحرير الشعبى الصينى يمكن استخدامها لتقييم وكمية التفاعلات البروتين البروتين بعد تحريض تلف الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق. هنا، يتم تنفيذ جيش التحرير الشعبى الصينى لتحديد وتصور التفاعلات بين أجهزة الصراف الآلي و p53 على تلف الحمض النووي في خلايا سرطان الدم الخلايا B البشرية التي يتم تحريضها للخضوع لل G1 مرحلة اعتقال دورة الخلية. من ملاحظة، بروتوكول المعروضة هنا لا يقتصر على دراسة أتم والتفاعلات p53 في خلايا اللوكيميا اعتقلت G1، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتصور البروتين البروتين الأخرى إنتيراكتيونس في أنواع الخلايا المختلفة والثقافات خلية تعليق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. علاج الخلايا والحمض النووي الضرر الحث

  1. ثقافة خلايا الخلايا الليمفاوية الحادة BCR- عبل + B خلايا الخلايا الليمفاوية الحادة B1717 أو سوب-B15 في إدم تستكمل مع 20٪ فس، 50 ميكرومتر β ميركابتويثانول، 2 ملي L- الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ كو 2 . عد الخلايا وصفيحة في 2 × 10 6 خلية / مل في لوحات 6 آبار، في 5 مل / جيدا.
    ملاحظة: اختياريا، خطوط الخلايا تعليق من أصل مختلف يمكن استخدامها.
  2. لإيقاف خلايا بكر-عبل + B-آل في مرحلة G1 من دورة الخلية، إضافة 5 ميكرومتر من ميثان سلفونات إماتينيب (STI571)، واحتضان بين عشية وضحاها.
    1. اختياريا، حذف هذه الخطوة عند دراسة البروتين البروتين التفاعلات طوال دورة الخلية أو في بكر-عبل سلبية أنواع الخلايا.
  3. استخراج الحمض النووي الضرر بإضافة 50 نانوغرام / مل نيوكارزينوستاتين (نس) إلى الثقافة، واحتضان لمدة 2 ساعة.
    1. بدلا من ذلك،تحفيز تلف الحمض النووي عن طريق تشعيع الخلايا باستخدام مصدر مشع [ 137 كس] في 0.5 غراي / دقيقة، بجرعة 5 غراي. بعد التشعيع، والسماح للشفاء الخلية لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ كو 2 .
  4. اختياريا، لتقييم مشاركة نشاط أتم كيناز ردا على تلف الحمض النووي، إضافة 5 ميكرومتر من أتم كيناز المانع KU55933 قبل إضافة نس أو العلاج التشعيع.
  5. إعداد بس 1X + 10٪ بسا عن طريق طبقات 5 غرام من جزء-V بسا على رأس 50 مل من برنامج تلفزيوني 1X في كوب أو إرلنمير قارورة، والسماح الجلوس في رت حتى يتم حل بسا. لا يهز أو يحرك لأن هذا سوف يسبب رغوة واسعة. مرشح ببطء من خلال مرشح 0.22 ميكرون والحفاظ على الجليد.
  6. حصاد الخلايا وغسل مرتين مع الجليد الباردة 1X بس. عد الخلايا و ريسوسبيند في 2 × 10 6 / مل في برنامج تلفزيوني 1X + 10٪ بسا. إبقاء الخلايا على الجليد.

2. سيتوسنتريفوغاتيون، تثبيت و بيرمابيليزاتيون

  1. حضر4٪ الحل بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني 1X طازجة. إضافة 2 غرام من بفا إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني 1X واحتضان في 55 درجة مئوية تهز حمام الماء حتى الحل واضح. تصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في رت حتى الاستخدام.
    ملاحظة: اختياريا، 4٪ بفا تثبيتي يمكن تخزينها المجمدة في -20 درجة مئوية. بعد التجميد، ذوبان الجليد مرة واحدة فقط للاستخدام. خلاف ذلك، 4٪ بفا الحل في برنامج تلفزيوني يمكن شراؤها مباشرة.
  2. بعناية تلميع 76 مم × 26 مم الشرائح المجهرية مع الأنسجة الخالية من الوبر و إزالة الشحوم عن طريق وضع في الإيثانول 96٪ في جرة كوبلين لمدة 5 دقائق. السماح للشرائح المجهرية الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة.
  3. تجميع شرائح المجهري في مسارات سيتوسبين / الخلايا مع مساحة 6 مم. قبل الشرائح قبل بيبتينغ 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X + 10٪ بسا في كل قمع وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 500 دورة في الدقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية (مساوية 0.2 × 10 6 خلايا) إلى كل قمع وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 دورة في الدقيقة. لكل تركيبة الأجسام المضادة، في ليمطلوب أست 4 الاستعدادات (تجربة مزدوجة الأجسام المضادة، واثنين من الضوابط الأجسام المضادة واحد، لا مكافحة الأجسام المضادة).
  5. تفكيك بعناية مسارات التحويل، وتأكد من عدم لمس البقع. انتقل إلى عينة التثبيت فورا.
    1. اختياريا، والسماح الشرائح الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد التجفيف بالهواء، التفاف الشرائح بشكل فردي في رقائق الألومنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. عند استخدام الاستعدادات المجمدة، تأكد من ذوبان الجليد الشرائح ملفوفة في منشفة ورقية لمنع التكثيف العلني على الشرائح.
  6. رسم دائرة (القطر التقريبي 15-20 ملم) حول بقعة باستخدام مانع السائل قلم باب (5 ملم طرف).
  7. إضافة 50 ميكرولتر من 4٪ بفا تثبيت الحل لكل بقعة واحتضان لمدة 30 دقيقة في رت.
  8. غسل الخلايا 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1X في جرة كوبلين في رت مع التحريض لطيف.
  9. تجفيف الشرائح حول البقع مع الأنسجة الخالية من الوبر وإزالة الكثير من السائل من بقعة ممكن باستخدام بيالحيوانات الأليفة دون لمس البقعة، أو عن طريق إمالة الشريحة. إضافة 50 ميكرولتر من 0.25٪ تريتون- X في برنامج تلفزيوني 1X لكل بقعة واحتضان لمدة 10 دقيقة في رت دون الإثارة.
  10. غسل الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق في ~ 50-60 مل من 0.05٪ توين -20 في تبس (تبس-T) في جرة كوبلين في رت مع التحريض لطيف. 10 الشرائح يمكن معالجتها في وقت واحد في هذا الشكل.

3. حجب وحضانة الأجسام المضادة الأولية

  1. انقر فوق تبس-T وجفف الشرائح حول البقع مع الأنسجة خالية من الوبر. إزالة الكثير من السائل من بقعة ممكن باستخدام ماصة دون لمس بقعة، أو عن طريق إمالة الشريحة. دوامة قريبا الحل حجب وإضافة قطرة واحدة (~ 40 ميكرولتر) إلى كل بقعة. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب قبل تحسنت.
  2. إعداد كوكتيل الأجسام المضادة عن طريق خلط الماعز ومكافحة أتم في 1: 1،000 والأرنب المضادة للفوسفات- Ser15-p53 في 1: 100 في مخفف الأجسام المضادة التجارية، دوامة مخفف الأجسام المضادة قبل الاستخدام. للتحكم إكسيريمنتيسي، وإعداد التخفيفات الأجسام المضادة التي تحتوي فقط على الماعز المضادة لل أتم وفقط الأرنب المضادة للفوسفو- Ser15-p53 الأجسام المضادة (الضوابط واحد الأجسام المضادة).
  3. انقر قبالة حل حجب ولكن الحرص على عدم السماح للخلايا تجف قبل إضافة التخفيفات الأجسام المضادة. إضافة 30 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة تخفيف كوكتيل واحتضان في غرفة ترطيب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. إعداد في الموقع غسل غسل العازلة A وغسل العازلة B عن طريق إذابة محتوى الحقيبة واحدة من العازلة ألف والمزيج العازلة B في الحجم النهائي من 1000 مل من الماء لكل منهما.
    1. بدلا من ذلك، وإعداد غسل العازلة ألف عن طريق إذابة 8.8 غرام من كلوريد الصوديوم، 1.2 غرام من تريس قاعدة و 0.5 مل من توين 20 في 800 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك وإضافة إلى الحجم النهائي من 1000 مل.
    2. بدلا من ذلك، وإعداد غسل العازلة B عن طريق إذابة 5.84 غرام من كلوريد الصوديوم، 4.24 من تريس قاعدة و 26.0 غرام من تريس-حمض الهيدروكلوريك في 500 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. إضافة الماء إلى الحجم النهائي من 1،000 مل.
    3. منقيكلا الحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
  5. غسل الشرائح 2 مرات لمدة 5 دقائق مع 1X في الموقع العازلة غسل A في جرة كوبلين في رت مع التحريض لطيف.

4. تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، ربط والتضخيم

  1. إعداد تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى عن طريق تمييع مكافحة الماعز بلوس ومكافحة الأرنب مينوس على حد سواء 1: 5 في مخفف الأجسام المضادة التجارية. اضغط قبالة 1X في الموقع غسل العازلة A من الشرائح وإضافة 30 ميكرولتر من جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق خليط إلى كل بقعة. احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب قبل تحسنت.
    ملاحظة: أي مزيج من الأجسام المضادة الثانوية بلوس و تحقيقات مينوس جيش التحرير الشعبى الصينى يمكن استخدامها (مكافحة الماوس، ومكافحة الأرنب، ومكافحة الماعز)، طالما يتم رفع الأجسام المضادة الأولية تطبيقها في أنواع مختلفة، وينبغي الجمع بين تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى دائما تحتوي على مسبار بلوس ومسبار مينوس.
  2. غسل الشرائح 2 مرات لمدة 5 دقائق مع ~ 50-60 مل 1X في الموقع العازلة غسل A في جرة كوبلين في رت مع التحريض لطيف. </ لى>
  3. إعداد حل ليغاس ربط على الجليد بإضافة 1 ميكرولتر من ليغاس إلى 39 ميكرولتر من ربط الحل وإضافة 40 ميكرولتر من ربط ليغاس حل لكل بقعة. احتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب قبل تحسنت.
  4. غسل الشرائح 2 مرات لمدة 5 دقائق مع ~ 50-60 مل 1X في الموقع العازلة غسل A في جرة كوبلين في رت مع التحريض لطيف.
  5. إعداد خليط التضخيم-البلمرة على الجليد عن طريق تمييع حل الأسهم التضخيم 1: 5 في الماء. ثم إضافة 0.5 ميكرولتر من البلمرة إلى 39.5 ميكرولتر من 1X حل التضخيم لكل بقعة.
    ملاحظة: كاشف التضخيم حساسة للضوء وينبغي حمايتها من التعرض المباشر للضوء. كاشف التضخيم يأتي في أربعة ألوان مختلفة (الأحمر: الإثارة 594 نانومتر، الانبعاثات 624 نانومتر؛ فاريد: الإثارة 644 نانومتر، الانبعاثات 669 نانومتر، البرتقال: الإثارة 554 نانومتر، الانبعاثات 576 نانومتر، الأخضر: الإثارة 501 نانومتر، الانبعاثات 523 نانومتر) تأكد من أن الإعداد المجهري المتاحة لديها قخصائص الإثارة مناسبة والمرشحات لصورة هذه الألوان.
  6. اضغط قبالة 1X في الموقع غسل العازلة A وإضافة 40 ميكرولتر من التضخيم-خليط البلمرة في بقعة. احتضان لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب قبل تحسنت.

5. تركيب والتصوير

  1. إعداد 0.01X في الموقع غسل العازلة B بإضافة 1 مل من 1X غسل العازلة B إلى 99 مل من الماء.
  2. انقر قبالة خليط التضخيم-البلمرة وغسل الشرائح 2 مرات لمدة 10 دقيقة مع 1X في الموقع غسل العازلة B في جرة كوبلين في رت مع التحريض لطيف.
  3. غسل الشرائح 1 دقيقة في 0.01X غسل العازلة B.
  4. الاستفادة من الزائدة غسل 0.01X العازلة B وتجفيف الشرائح حول البقع مع الأنسجة الخالية من الوبر. إزالة الكثير من السائل من بقعة ممكن باستخدام ماصة دون لمس بقعة، أو عن طريق إمالة الشريحة.
  5. تمييع دابي التي تحتوي على وسط تصاعد 1: 5 في وسط تصاعد دون دابي لتجنب أوفيرستينينغ من النوى.
  6. إضافة 25-30 ميكرولتر من 1: 5 دابي تحتوي على تصاعد المتوسطة إلى 24 مم × 24 مم ساترة والتقاط غطاء زلة مع الشريحة، وتطبيق ضغط طفيف لضمان عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين. ختم ساترة مع طلاء الأظافر والانتظار لا يقل عن 15 دقيقة قبل التصوير.
  7. تحليل الشرائح باستخدام (متحد البؤر) مضان المجهر.
    1. حساب عدد إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى منقط لكل خلية في ما لا يقل عن 4 حقول صورة المكتسبة (20X الهدف، عد ما لا يقل عن 20 خلية لكل حالة أو تركيبة الأجسام المضادة، استنادا إلى حساب الطاقة باستخدام المتوسط ​​المتوقع للإشارات 7 ± 5 في الخلايا المعالجة، و 2 ± 2 إشارات في الخلايا غير المعالجة، مع احتمال وجود خطأ من النوع الأول من 0.05، وقوة 80٪، كما ذكر سابقا 15 ).
      ملاحظة: يتم تحقيق أفضل قرار من خلال الاستحواذ على Z- المكدس و ديكونفولوتيون باستخدام حزم البرامج (على سبيل المثال ، إيماجيج، لايكا اكتساب جناح (لاس)). علامةيجب أن يكون لس يمكن تمييزها بسهولة داخل المحيط النووي، كما هو محدد من قبل تلطيخ دابي.
    2. لا تحسب الإشارات التي تظهر بوضوح خارج النوى. عادة، العلاج نس أو أشعة results النتائج في ما يقرب من 5-10 فوشو p53 / أتم جيش التحرير الشعبى الصينى إشارات لكل خلية. قد تعطي الضوابط "الأجسام المضادة أحادية" بعض إشارة الخلفية، ولكن هذا لا ينبغي أن يتجاوز 1-2 إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى لكل 1 من كل 20 خلية.
    3. لأغراض النشر والعرض، التقاط الصور باستخدام هدف النفط الغمر 40X أو 63X. يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية ويجب حمايتها من التعرض للضوء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد أظهرت الفسفرة من p53 في بقايا Ser15 أن تعتمد على أتم كيناز النشاط 16 . لإثبات وتأكيد خصوصية تقنية جيش التحرير الشعبى الصينى على الاستعدادات سيتوسبين من الثقافات خلية تعليق، ويظهر أن تحريض تلف الحمض النووي من قبل 2 ساعة العلاج نس من خلايا بكر-عبل + B-آل القبض في المرحلة G1 من دورة الخلية أدى إلى التفاعل المحدد بين أجهزة الصراف الآلي والفوسفو- Ser15-p53، كما هو متوقع. وقد لوحظت إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى منقط في نواة غالبية الخلايا تعامل مع نس ( الشكل 1B )، مع متوسط ​​7 إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى لكل خلية 15 ، في حين لم يتم الكشف عن هذه الإشارات في الخلايا التي لم تعامل مع نس ( الشكل 1A ) . قبل المعالجة من الخلايا مع محددة أتم كيناز المانع KU55933 قبل تحريض تلف الحمض النووي يقلل بوضوح عدد إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى إلى متوسط2 جيش التحرير الشعبى الصينى إشارات / خلية ( الشكل 1C ). تم الكشف عن إشارات ال أتم-فوسفهو-Ser15-p53 بلا بشكل حصري في النواة، كما هو متوقع. التجارب على جيش التحرير الشعبى الصينى حيث تم حذف إما الماعز المضادة لل أتم أو الأرنب المضادة للفوسفو- Ser15-p53 الأجسام المضادة (السيطرة "الأجسام المضادة واحد") لم تسفر عن أي إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى محددة ( أرقام 1D و 1 E ). يتم عرض الكمي والتحليلات الإحصائية لهذه النتائج في الشكل 1F (تكييفها من أوكودنيكا وآخرون J.Immunol. 2016) 15 .

شكل 1
الشكل 1: جيش التحرير الشعبى الصينى في الموقع لتفاعلات أتم / فوسفو-Ser15-p53 في BV173 الإنسان بكر-عبل + الخلايا. ( A ) تم علاج الخلايا بين عشية وضحاها مع 5 ميكرومتر إماتينيب (محددة المانع كيناز أبل أن يثير خلية G1 المرحلة سيكله)، مع إماتينيب و 50 نانوغرام / مل نس، التي تسببت في تلف الحمض النووي ( B )، أو مع إماتينيب ومعالجتها مسبقا مع 5 ميكرومتر من أتم كيناز محددة المانع KU55933 قبل العلاج نس ( C ) . التحكم في الأجسام المضادة يتم عرض تجارب جيش التحرير الشعبى الصينى للأجسام المضادة الماعز (أ) (D) والأرانب المضادة للفوسفات- Ser15-p53 ( E ). تمثل الإشارات الحمراء المنقطية الفلورية في بروتين القرب في الموقع (<50 نانومتر) من أتم وبروتينات الفوسفو- Ser15-p53. الحانات مقياس = 5 ميكرون (خطوط بيضاء). ( F ) ويظهر الكمي لعدد من إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى في ما لا يقل عن 20 خلية تعامل في ظل ظروف تجريبية مختلفة. وتمثل الخطوط الأفقية الوسائل؛ تم تحديد الدلالات الإحصائية بواسطة تحليل التباين أحادي الاتجاه (أنوفا؛ *** p <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا التقرير، يتضح أن جيش التحرير الشعبى الصينى يمكن استخدامها لتحديد وتصور التفاعل المحدد بين البروتينات في الثقافات خلية تعليق. من ملاحظة، بروتوكول الموصوفة هنا لا يقتصر على دراسة المجمعات إصلاح الحمض النووي ولكن ينطبق أيضا على تصور وقياس التفاعلات البروتين البروتين الأخرى في الثقافات خلية تعليق. ويظهر أن أتم كيناز يتفاعل مع p53 فوسفهوريلاتد في G1 - اعتقلت بكر-عبل + B-آل الخلايا عندما تتعرض لعامل الحمض النووي الناجم عن الضرر. سابقا، تم استخدام تقنية جيش التحرير الشعبى الصينى لإظهار أن أجهزة الصراف الآلي وعامل النسخ FOXO1 تفاعلت في خلايا بكر-عبل + B-آل، ومع ذلك، فإن هذا التفاعل على الأرجح لم يؤدي إلى الفسفرة المعتمدة على أجهزة الصراف الآلي من FOXO1. لدعم بيانات جيش التحرير الشعبى الصينى، تم تأكيده من قبل إمونوبريسيتوراتيون من أتم / أتر فوسفهوريلاتد البروتينات الذاتية التي، على النقيض من ركائز أتم p53 و NBS1، FOXO1 لا فوسفهوريلاتد بواسطة أتم عند تحريض Dنا الضرر 15 . بالإضافة إلى ذلك، تم تطبيق نهج جيش التحرير الشعبى الصينى بنجاح لدراسة تشكيل المجمعات إصلاح عدم تطابق (على سبيل المثال التفاعل بين MSH2 و MSH6) التفاعلات في مختلف خلايا الخلايا الليمفاوية خلية B البشرية (لا تظهر البيانات). وفي هذه السياقات الخاصة، قدمت تقنية جيش التحرير الشعبى الصينى نهجا بديلا لدعم نتائجنا. ويتبين أن جيش التحرير الشعبى الصينى يسمح للتقييم شبه الكمي للتفاعلات البروتين البروتين بين الظروف التجريبية ويعطي نظرة ثاقبة الاختلاف خلية إلى خلية في هذه التفاعلات.

تحليل تفاعلات البروتين البروتين محددة في الخلايا (عرضة لظروف تجريبية مختلفة) وعادة ما كانت صعبة وتخضع للتحف التجريبية. عموما، كان البروتين المناعي المشترك هي طريقة الاختيار ولكن يتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا و / أو البروتينات، وتحظر أساسا تحليل التفاعلات البروتين البروتين في الخلايا النادرةأنواع أو بين البروتينات التي يتم التعبير عنها في مستويات منخفضة. وعلاوة على ذلك، أوفيركسريسيون من البروتينات في (غير ذات الصلة) نماذج خط الخلية غالبا ما يؤدي إلى التحف أوفيركسريسيون، والنتائج يمكن أن يكون من الصعب جدا لتأكيد / التحقق من صحة في الجسم الحي ، أو في أنواع الخلايا ذات الصلة. أيضا، شارك في مناعي يتطلب تحلل الخلايا وذوبان البروتينات، والتي يمكن أن تؤدي إلى فقدان إشارة عندما البروتين البروتين التفاعلات ضعيفة. الأهم من ذلك، البروتين المشترك المناعي والمخاليط اثنين من نهج الهجين غير قادرين على الكشف عن الاختلافات داخل و بين الخلوية في التفاعلات البروتين البروتين. تقنية بلا تقدم بديلا جذابا وسهلا لهذه التقنيات، وتوفر رؤية إضافية هامة. جيش التحرير الشعبى الصينى يمكن استخدامها في إعداد مختبر (التشخيص) القياسية لأنها لا تتطلب مهارات عالية التخصص تتجاوز القدرة على أداء المناعية.

وقد سمح تطوير المجهر فائقة الدقة في العمقتحليل البنية الجزيئية لمجمعات البروتين. هذه التقنية، ومع ذلك، ليست متاحة بسهولة ويتضمن بنية تحتية بحثية مخصصة. جيش التحرير الشعبى الصينى يوفر نهجا بديلا وبسيطة ورخيصة بديل للدراسة من تشكيل البروتين معقدة، مع قرار مماثل. ومن القيود الواضحة لتقنية جيش التحرير الشعبى الصينى توافر أضداد أولية محددة تثار فى أنواع مختلفة. ومع ذلك، تقدم العديد من الشركات الآن مجموعات مخصصة (والتحقق من صحة) الأجسام المضادة التي تبسيط استخدام تقنية جيش التحرير الشعبى الصينى.

دراسات على تورط البروتينات في إصلاح تلف الحمض النووي واستجابة الحمض النووي تلف تعتمد بشكل كبير على تحليل تشكيل إيريف وتكوينها. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المشاركة في توطين البروتينات في إيريفس لا يعني بالضرورة التفاعلات البروتين البروتين مباشرة. تقنية جيش التحرير الشعبى الصينى يوفر فرصة فريدة لدراسة البروتينات إصلاح الحمض النووي وتشكيل المجمعات إصلاح في مزيد من التفاصيل. ليرة سوريةتحليل أتيوتيمبورال لتشكيل مثل هذه المجمعات يمكن تعيينها بمزيد من التفصيل باستخدام جيش التحرير الشعبى الصينى. وعلاوة على ذلك، فإنه سيتم السماح للباحثين لتقييم تشكيل المجمعات إصلاح في الأنسجة والعينات السريرية للمرضى الذين تم علاجهم مع العوامل أو العلاجات الضارة الحمض النووي، والتي قد توفر نظرة هامة على فعالية هذه الطرائق العلاج وربما حتى تساعد في اختيار من المرضى الذين سيستفيدون أكثر من هذه العلاجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وتمول البحوث في مختبر غويكيما من خلال برنامج الحوافز البحثية الابتكارية من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (منحة فيدي 016126355) و 'ستيكتينغ كينديرف كانكرفريج' كيكا (مشروع 252).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV173 cell line DSMZ AC-20 BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line DSMZ ACC-389 BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco (Life Technologies) 21980-032
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich F7524 lot #: 064M3396
L-glutamine Gibco (Life Technologies) 25030-024
penicillin/streptomycin Gibco (Life Technologies) 15140-122
imatinib methanesulfonate LC Laboratories I-5508 Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin Sigma Aldrich N9162 Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933 Selleckchem S1092 Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides Waldemar Knittel VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker Sigma Aldrich Z377821-1EA
Cytospin funnel Q Path Labonord SAS 003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit Sigma Aldrich DUO92105 Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM Bethyl Laboratories A300-136A PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 Cell Signaling Technology 9284 We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Vectashield antifading mounting medium Vector Labs H-1000
4% paraformaldehyde in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Also available from various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (9), a012716 (2013).
  2. Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35, (2), 101-108 (2010).
  3. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9, (12), 1219-1228 (2010).
  4. Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316, (5828), 1160-1166 (2007).
  5. Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17, (4), 453-456 (1997).
  6. Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13, (2), 152-157 (1999).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320, (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125, (Pt 15), 3529-3534 (2012).
  9. Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14, (1), 82-86 (2003).
  10. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, (3), 227-232 (2008).
  11. Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72, (11), 2371-2376 (2000).
  12. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, (7267), 1071-1078 (2009).
  13. Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52, (4), 567-582 (2011).
  14. Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9, (7), e101685 (2014).
  15. Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. (2016).
  16. Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281, (5383), 1674-1677 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics