Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь показано, как анализ in situ Proximity Ligation Assay (PLA) может использоваться для обнаружения и визуализации прямых белково-белковых взаимодействий между АТМ и р53 в культурах суспензионных клеток, подверженных генотоксическому стрессу.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bahjat, M., Bloedjes, T. A., van der Veen, A., de Wilde, G., Maas, C., Guikema, J. E. Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (124), e55703, doi:10.3791/55703 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ответ на повреждение ДНК организует восстановление повреждений ДНК, которые происходят спонтанно, вызваны генотоксическим стрессом или появляются в контексте запрограммированных разрывов ДНК в лимфоцитах. К числу первых, которые активируются при индукции повреждения ДНК, относятся мутантная киназа Ataxia-Telangiectasia (ATM), ATM- и Rad3-родственная киназа (ATR) и каталитическая субъединица ДНК-зависимой белковой киназы (DNA-PKcs). Центральные регуляторы сети, которые контролируют восстановление ДНК, апоптоз и выживаемость клеток. В рамках подавляющего опухоль пути АТМ и АТР активируют р53 через фосфорилирование, тем самым регулируя транскрипционную активность р53. Повреждение ДНК также приводит к образованию так называемых очагов, индуцированных ионизирующим излучением (IRIF), которые представляют собой комплексы датчика повреждения ДНК и восстанавливающие белки, которые накапливаются в местах повреждения ДНК, которые визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако совместная локализация белков в IRIF не обязательно подразумевает dПрямое белково-белковое взаимодействие, поскольку разрешение флуоресцентной микроскопии ограничено.

In situ Proxyimity Ligation Assay (PLA) - это новый метод, который позволяет осуществлять непосредственную визуализацию белково-белковых взаимодействий в клетках и тканях с беспрецедентной специфичностью и чувствительностью. Этот метод основан на пространственной близости специфических антител, связывающихся с представляющими интерес белками. Когда опрошенные белки находятся в пределах ~ 40 нм, реакция амплификации инициируется олигонуклеотидами, которые конъюгированы с антителами, и продукт амплификации визуализируется флуоресцентной мечением, что дает сигнал, который соответствует субклеточному расположению взаимодействующих белков. Используя установленное функциональное взаимодействие между АТМ и р53 в качестве примера, здесь показано, как PLA можно использовать в культурах суспензионных клеток для изучения прямых взаимодействий между белками, которые являются неотъемлемыми частями ответа на повреждение ДНК.

Introduction

Ущерб ДНК вызывает высокорегулярную последовательность событий, включающих белково-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации, которые обеспечивают эффективный и быстрый ремонт ДНК, тем самым защищая геномную целостность 1 . Как правило, репарация ДНК изучается в клетках, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения, путем мониторинга образования так называемых ионизирующих излучений фокусов (IRIF) с помощью (конфокальной) флуоресцентной микроскопии. Многие репарации ДНК и ДНК, чувствительные к повреждениям ДНК, образуют IRIF, которые представляют собой белковые комплексы, которые зарождаются на участках хроматина, поддерживающих повреждение ДНК 2 , 3 . Расположение и разрешение IRIF со временем дают важное представление о пространственно-временной организации репарации ДНК и могут указывать на участие различных путей восстановления ДНК. Характер повреждения ДНК и стадии клеточного цикла, в которой достигается повреждение, определяет, какой путь восстановления ДНК активирован. Fo Например, в клетках, активно участвующих в репликации ДНК (S-фаза), гомологичная рекомбинация (HR) является доминирующим способом восстановления ДНК, тогда как в клетках в G1- или G2 / M-фазе клеточного цикла, Преобладает путь восстановления гомологичного концевого соединения (NHEJ). Одним из ранних событий после повреждения ДНК является активация ДНК-чувствительных киназ Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM), которая в основном активна в G1- и G2 / M-фазах клеточного цикла и регулирует NHEJ, И Ataxia Telangiectasia и Rad3-родственный белок (ATR), который действует в S-фазе путем активации HR. Оба АТМ и АТР представляют собой плейотропные киназы, которые фосфорилируют многие белки, которые участвуют в репарации ДНК, гибели клеток и выживании 4 . Было показано, что обе киназы фосфорилируют и активируют белок-супрессор опухоли р53 после воздействия генотоксического стресса, указывая, что эти киназы являются предшественниками медиаторов основной оси подавления опухолей"Xref"> 5 , 6 .

Образование и состав IRIF обычно оценивают путем определения совместной локализации различных белков с использованием двухцветного иммунофлуоресцентного окрашивания и микроскопии, однако не все белки, которые являются частью ремонтных белковых комплексов, образуют IRIF, что ограничивает применимость этого подхода. Кроме того, (конфокальная) иммунофлуоресцентная микроскопия ограничивается дифракционными свойствами света, что приводит к довольно плохим пространственным разрешением около 200-300 нм, превышающим размер большинства субклеточных структур, что существенно запрещает прямой опрос белково-белковых взаимодействий при Молекулярный уровень. Таким образом, совместная локализация образцов окраски иммунофлюоресценции, обнаруженная (конфокальной) флуоресцентной микроскопией, необязательно является показательной для прямых белково-белковых взаимодействий. Недавно были разработаны новые технологии с высоким разрешением, такие как трехмерные структуры(3D-SIM) 7 , который был успешно использован для изучения формирования IRIF 53BP1 и BRCA1 на наномасштабных деталях, выявляя характеристики пространственного распределения этих белков, которые не были обнаружены с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 8 .

Для обнаружения белково-белковых взаимодействий in vivo можно использовать несколько других методов, таких как совместное иммунопреципитация, методы вытягивания и двухгибридные скрининг-дрожжи. Однако эти методы довольно громоздки, требуют больших количеств клеток или белков или включают избыточную экспрессию белков, которая вводит экспериментальные артефакты. Совсем недавно был разработан новый метод, который позволяет визуализировать и количественно определять белково-белковые взаимодействия in situ ( т.е. в клетках и в тканях), который называется анализом лигирования близости (PLA) 9 , 10 . PrИмариновые антитела, которые распознают два представляющих интерес белка, обнаруживаются вторичными антителами, которые конъюгированы с олигонуклеотидами (так называемые PLA-зонды). Если два разных вторичных антитела достаточно близки из-за взаимодействий между белками, распознаваемыми первичными антителами, конъюгированные олигонуклеотиды гибридизуются и могут быть лигированы с образованием замкнутого кольцевого ДНК-субстрата. Этот круглый субстрат затем амплифицируют путем амплификации окружности качения и визуализируют с комплементарными флуорохромовыми комплементарными олигонуклеотидами. Используя PLA, субклеточная локализация белково-белкового взаимодействия сохраняется, так как флуоресцентно меченый продукт амплификации скользящего круга остается прикрепленным к PLA-зондам. Разрешение этого анализа составляет <50 нм, на основании нахождения, что диаметр антитела составляет приблизительно 7-10 нм 11 . Усиление прокатного круга может иметь место только в случае, если две пары антител (первичный + секонDary) физически взаимодействуют по периметру, который определяется их размером (10 + 10 + 10 + 10 = 40 нм). Шаг усиления сигнала увеличивает чувствительность анализа PLA и позволяет обнаруживать взаимодействия едва выраженных белков. PLA генерирует точечные фокусные сигналы, которые могут быть определены количественно на основе клеток, с помощью которых можно оценивать внутри- и межклеточные изменения в белково-белковых взаимодействиях.

Образование и состав восстановительных комплексов ДНК и IRIFs в основном изучают в клеточных линиях клещей, таких как линия U2OS эпителиальных клеток костной остеосаркомы человека, линия клеток эмбриональной почки человека HEK293 и линия эпителиальных клеток ретинального эпителия RPE-1, Растут и легко трансфицируются. Культуры клеток суспензии, такие как лимфоидные и миелоидные клеточные линии, используются реже, поскольку они менее подвержены трансфекции и обычно не прилипают к покровным, что требует дополнительной / альтернативной ст.Eps для визуализации. Однако разрешение повреждения ДНК очень важно в контексте лимфоидных и миелоидных злокачественных новообразований, так как ответ на повреждение ДНК часто зависит от геномных (драйверов) аберраций в этих опухолях, играя ключевую роль в злокачественной трансформации нормальных лимфоидных и миелоидных ( Предшественник) 12 , 13 , 14 .

Этот протокол описывает, как PLA может использоваться для оценки и количественного определения белково-белковых взаимодействий после индукции повреждения ДНК в культурах суспензионных клеток. Здесь выполняется PLA для определения и визуализации взаимодействий между ATM и p53 при повреждении ДНК в клетках лейкемии человека B-клеток, которые индуцируются для того, чтобы подвергнуться остановке клеточного цикла G1-фазы. Следует отметить, что представленный здесь протокол не ограничивается изучением взаимодействий ATM и p53 в клетках лейкемии, арестованных G1, но также может быть использован для визуализации другого белково-белкового взаимодействияВ различных типах клеток и в культурах суспензионных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Лечение клеток и индукция повреждения ДНК

  1. Культивируют клеточные линии BCR-ABL + B-клеток человека BCR-ABL + BV173 или SUP-B15 в IMDM, дополненные 20% FCS, 50 мкМ β-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина, 100 ед. / Мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 . Считайте клетки и планшеты при 2 × 10 6 клеток / мл в 6-луночных планшетах в 5 мл / лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Необязательно могут использоваться линии подвески различного происхождения.
  2. Чтобы остановить клетки BCR-ABL + B-ALL в G1-фазе клеточного цикла, добавьте 5 мкМ метансульфоната иматиниба (STI571) и инкубируйте в течение ночи.
    1. Необязательно, опустите этот шаг при изучении белково-белковых взаимодействий в течение клеточного цикла или в типах BCR-ABL-отрицательных клеток.
  3. Вызывают повреждение ДНК путем добавления 50 нг / мл неокарзиностатина (NCS) к культуре и инкубируют в течение 2 часов.
    1. С другой стороны,Индуцируют повреждение ДНК путем облучения клеток с использованием радиоактивного источника [ 137 Cs] со скоростью 0,5 Гр / мин в дозе 5 Гр. После облучения клетки восстанавливают в течение 2 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 .
  4. Необязательно, чтобы оценить участие активности киназы АТМ в ответ на повреждение ДНК, добавить 5 мкМ ингибитора киназы АТМ KU55933 до добавления NCS или облучения.
  5. Подготовьте 1x PBS + 10% BSA путем наслаивания 5 г фракции-V BSA поверх 50 мл 1x PBS в стакане или колбе Эрленмейера и дайте сидеть при RT до растворения BSA. Не встряхивайте и не перемешивайте, так как это приведет к вспениванию. Медленно фильтруйте через фильтр 0,22 мкм и держите на льду.
  6. Убирайте клетки и дважды промывайте ледяным 1x PBS. Подсчитайте клетки и ресуспендируют при 2 × 10 6 / мл в 1x PBS + 10% BSA. Держите клетки на льду.

2. Цитоцентрифугирование, фиксация и пермеабилизация

  1. Подготовьте4% раствора параформальдегида в 1х PBS свеже. Добавить 2 г PFA в 50 мл 1x PBS и инкубировать в качающейся водяной бане с температурой 55 ° C до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Фильтруют раствор через фильтр 0,22 мкм и хранят при комнатной температуре до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Необязательно, фиксатор PFA 4% можно хранить замороженным при -20 ° C. После замораживания оттаивайте только один раз для использования. В противном случае решение 4% PFA в PBS можно купить напрямую.
  2. Осторожно отполируйте слайды с микроскопом размером 76 мм x 26 мм с безворсовой тканью и обезжирьте их, помещая в 96% этанол в банку Coplin в течение 5 минут. Позвольте микроскопии сместиться в воздухе на 10 минут.
  3. Собрать микроскопические слайды в цитоскопические / цитологические воронки с площадью 6 мм. Предварительно покрытые слайды путем пипетирования 50 мкл 1x PBS + 10% BSA в каждую воронку и центрифуги в течение 1 мин при 500 об / мин.
  4. Добавьте 100 мкл суспензии клеток (равную 0,2 × 10 6 клеток) в каждую воронку и центрифугируйте в течение 5 мин при 500 об / мин. Для каждой комбинации антител в leТребуются препараты ast 4 (эксперимент с двумя антителами, два контроля с одним антителом, без контроля антител).
  5. Осторожно разоберите воронки и не прикасайтесь к пятнам. Немедленно перейти к фиксации образца.
    1. При желании, разрежьте сушки на воздухе в течение как минимум 30 минут. После сушки на воздухе оберните отдельные листы в алюминиевой фольге и храните при -20 ° C до использования. При использовании замороженных препаратов обязательно протащите слайды, обернутые в бумажное полотенце, чтобы предотвратить открытую конденсацию на слайдах.
  6. Нарисуйте круг (приблизительный диаметр 15-20 мм) вокруг пятна с помощью блока фиксации пера PAP (наконечник 5 мм).
  7. Добавьте 50 мкл 4% раствора фиксации PFA к каждому пятну и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
  8. Промывают клетки 3 раза в течение 5 минут с помощью 1x PBS в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
  9. Высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса и удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пиЖивотное, не касаясь пятна, или наклоняя слайд. Добавьте 50 мкл 0,25% Triton-X в 1x PBS к каждому пятну и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре без перемешивания.
  10. Промойте слайды 3 раза в течение 5 минут в ~ 50-60 мл 0,05% Tween-20 в TBS (TBS-T) в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Таким образом можно обрабатывать 10 слайдов.

3. Блокировка и первичная интубация антител

  1. Удалите TBS-T и высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса. Удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пипетку, не касаясь пятна, или наклоняя слайд. Коротко встряхните блокирующий раствор и добавьте одну каплю (~ 40 мкл) в каждое пятно. Инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C в предварительно разогретой увлажненной камере.
  2. Подготовьте коктейль с антителами, смешав козьим анти-АТМ с 1: 1000 и кролик-антифосфо-Ser15-p53 при 1: 100 в разбавителе коммерческого антитела, разбавителе вихревых антител перед использованием. Для контрольного экспериментаTs, готовят растворы антител, содержащие только козьим анти-АТМ, и только антитело кролика-антифосфо-Ser15-p53 (контроль с одним антителом).
  3. Удалите блокирующий раствор, но будьте осторожны, чтобы клетки не высушивались до добавления разведений антител. Добавьте 30 мкл каждого разбавителя для коктейлей антител и инкубируйте в увлажненной камере в течение ночи при 4 ° C.
  4. Подготовьте промывочный буфер A и промывочный буфер B на месте, растворяя содержимое одного мешка буфера A и буфера B в конечном объеме 1000 мл воды каждый.
    1. Альтернативно, подготовьте промывочный буфер А, растворяя 8,8 г NaCl, 1,2 г Трис-основания и 0,5 мл Tween-20 в 800 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl и добавьте до конечного объема 1000 мл.
    2. Альтернативно, подготовьте промывочный буфер B, растворяя 5,84 г NaCl, 4,24 трис-основания и 26,0 г Трис-HCl в 500 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,5, используя HCl. Добавить воду до конечного объема 1000 мл.
    3. ФильтрОба решения через фильтр 0,22 мкм.
  5. Промойте слайды 2 раза в течение 5 минут с 1x буфером для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с мягким перемешиванием.

4. Зонды PLA, лигирование и амплификация

  1. Подготовьте PLA-зонды, разбавив анти-козьим PLUS и кроличьим MINUS как 1: 5 в коммерческом разбавителе антител. Удалите 1x бункер для промывки in situ A из слайдов и добавьте 30 мкл пробной смеси PLA к каждому пятну. Инкубируйте 1 час при 37 ° C в предварительно нагретой увлажненной камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Любая комбинация зондов PLUS и MINUS PLA с вторичными антителами может быть использована (антимышина, против кролика, против коз), если применяемые первичные антитела возникают у разных видов, а комбинация PLA-зондов всегда должна быть Содержат зонд PLUS и зонд MINUS.
  2. Вымойте слайды 2 раза в течение 5 минут с ~ 50-60 мл 1x буфера для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. </ Li>
  3. Подготовьте раствор лигирования-лигазы на льду, добавив 1 мкл лигазы к 39 мкл раствора лигирования и добавьте 40 мкл раствора лигирования-лигазы к каждому пятну. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C в предварительно нагретой увлажненной камере.
  4. Промойте слайды 2 раза в течение 5 минут с помощью ~ 50-60 мл 1x буфера для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
  5. Подготовьте смесь Amplification-Polymerase на льду путем разбавления исходного раствора Amplification 1: 5 в воде. Затем добавляют 0,5 мкл полимеразы к 39,5 мкл 1х раствора для амплификации для каждого пятна.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Реактивы амплификации чувствительны к свету и должны быть защищены от прямого воздействия света. Усилитель-реагент поставляется в четырех разных цветах (RED: возбуждение 594 нм, излучение 624 нм, FarRED: возбуждение 644 нм, излучение 669 нм, ORANGE: возбуждение 554 нм, излучение 576 нм, ЗЕЛЕНЫЙ: возбуждение 501 нм, излучение 523 нм) Убедитесь, что доступная установка микроскопии имеетПодходящие свойства возбуждения и фильтры для имитации этих цветов.
  6. Отключите 1x буфер для промывки in situ A и добавьте 40 мкл смеси Amplification-Polymerase на одно место. Инкубируйте в течение 100 мин при 37 ° С в предварительно разогретой увлажненной камере.

5. Монтаж и обработка изображений

  1. Подготовьте 0,01x буфер для промывки in situ B, добавив 1 мл 1x промывочного буфера B в 99 мл воды.
  2. Отключите смесь Amplification-Polymerase и промойте слайды 2 раза в течение 10 минут с помощью 1x буфера для промывки in situ B в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
  3. Вымойте слайды 1 мин в 0,01-кратном буфере для промывки B.
  4. Удалите избыток 0,01x промывочного буфера B и высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса. Удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пипетку, не касаясь пятна, или наклоняя слайд.
  5. Развернуть DAPI-содержащий монтажный материал 1: 5 в монтажной среде без DAPI, чтобы избежать перенапряжения ядер.
  6. Добавьте 25-30 мкл монтажной среды, содержащей 1: 5 DAPI, к покровному стеклу 24 мм x 24 мм и поднимите крышку с помощью ползуна, слегка надавите на то, чтобы не было захваченных пузырьков воздуха. Запечатайте покровное лаком для ногтей и подождите не менее 15 минут до изображения.
  7. Проанализируйте слайды с использованием (конфокального) флуоресцентного микроскопа.
    1. Подсчитайте количество точечных PLA-сигналов на ячейку по меньшей мере в 4 полученных полях изображения (20x объектив, считая по меньшей мере 20 клеток на состояние или комбинацию антител, на основе расчета мощности с использованием ожидаемого среднего 7 ± 5 сигналов в обработанных клетках, И 2 ± 2 сигнала в необработанных клетках с вероятностью ошибки типа I 0,05 и мощностью 80%, как сообщалось ранее 15 ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Наилучшее разрешение достигается путем приобретения Z-стека и деконволюции с использованием пакетов программного обеспечения ( например , ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). ЗнакДолжно быть легко видно в пределах ядерного периметра, как определено окрашиванием DAPI.
    2. Не считайте сигналы, которые явно появляются за пределами ядер. Как правило, обработка NCS или γ-облучение приводит к приблизительно 5-10 сигналам PLA PHOSO-p53 / ATM на клетку. Элементы управления «одним антителом» могут давать некоторый фоновый сигнал, но это не должно превышать 1-2 PLA-сигналов на 1 из каждых 20 ячеек.
    3. Для публикации и презентаций, захватите изображения, используя цель погружения 40X или 63X. Слайды могут храниться при температуре 4 ° C и должны быть защищены от воздействия света.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Показано, что фосфорилирование р53 в остатке Ser15 зависит от активности киназы АТМ 16 . Чтобы продемонстрировать и подтвердить специфичность метода PLA на цитоспиновых препаратах культур суспензионных клеток, показано, что индукция повреждения ДНК через 2 часа NCS-обработка клеток BCR-ABL + B-ALL, арестованных в G1-фазе клеточного цикла Привели к специфическому взаимодействию между АТМ и фосфо-Ser15-p53, как и ожидалось. Пунктуальные сигналы PLA наблюдались в ядре большинства клеток, обработанных NCS ( рис. 1B ), со средним значением 7 PLA-сигналов на клетку 15 , тогда как эти сигналы не были обнаружены в клетках, которые не обрабатывались NCS ( фиг. 1A ) , Предварительная обработка клеток специфическим ингибитором АТМ-киназы KU55933 до индукции повреждения ДНК явно уменьшала количество сигналов PLA до среднего значения2 PLA сигналы / ячейка ( рис. 1C ). Сигналы PLA ATM-phospho-Ser15-p53 были обнаружены исключительно в ядре, как и ожидалось. Эксперименты с PLA, в которых отсутствовали либо антитела против коата-анти-АТМ, либо антитело кролика-антифосфо-Ser15-p53 (контроль «одного антитела»), не приводили к каким-либо конкретным сигналам PLA ( фиг.1D и 1E ). Количественная оценка и статистический анализ этих результатов представлены на рисунке 1F (адаптировано из Ochodnicka et al., J.Immunol., 2016). 15 .

Рисунок 1
Рисунок 1: PLA in situ для взаимодействия ATM / phospho-Ser15-p53 в BV173 человеческих BCR-ABL + клетках. ( А ) Клетки обрабатывали в течение ночи 5 мкМ иматиниба (специфический ингибитор аблкиназы, который провоцирует клеточно-циклический цикл G1В анамнезе BCR-ABL +), с иматинибом и 50 нг / мл NCS, которые индуцировали повреждение ДНК ( B ) или с иматинибом и предварительно обработали 5 мкМ специфического ингибитора киназы АТМ KU55933 до лечения NCS ( C ) , Показаны эксперименты с PLA с одним антителом для антител против коата-анти-АТМ (D) и кролика-антифосфо-Ser15-p53 ( E ). Красные флуоресцентные точечные сигналы представляют собой близость белка in situ (<50 нм) АТМ и белков фосфо-Ser15-p53. Шкала шкалы = 5 мкм (белые линии). ( F ) Показана количественная оценка количества сигналов PLA по меньшей мере в 20 клетках, обработанных в разных экспериментальных условиях. Горизонтальные линии представляют собой средства; Статистические значения были определены односторонним дисперсионным анализом (ANOVA; *** p <0,001). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом отчете показано, что PLA может использоваться для определения и визуализации специфического взаимодействия между белками в культурах суспензионных клеток. Следует отметить, что описанный здесь протокол не ограничивается изучением комплексов восстановления ДНК, но также применяется для визуализации и количественного определения других белково-белковых взаимодействий в культурах суспензионных клеток. Показано, что киназа АТМ взаимодействует с фосфорилированным р53 в G1-арестованных клетках BCR-ABL + B-ALL при воздействии индуцирующего повреждения ДНК агента. Ранее метод PLA использовался нами, чтобы показать, что ATM и фактор транскрипции FOXO1 взаимодействуют в клетках BCR-ABL + B-ALL, однако это взаимодействие, скорее всего, не привело к зависящему от АТФ фосфорилированию FOXO1. В подтверждение данных PLA было подтверждено иммунопреципитация эндогенных АТФ / АТР-фосфорилированных белков, которые, в отличие от установленных субстратов Р53 и NBS1, FOXO1 не фосфорилируются банкоматом при индукции DПовреждение НС 15 . Кроме того, подход PLA был успешно применен для изучения образования комплексов восстановления несоответствия ( например , взаимодействия между MSH2 и MSH6) в различных клеточных линиях клеток лимфомы человека (данные не показаны). В этих конкретных контекстах метод PLA предложил альтернативный подход для поддержки наших результатов. Показано, что PLA позволяет полуколичественную оценку белково-белковых взаимодействий между экспериментальными условиями и дает представление об изменениях между клетками в этих взаимодействиях.

Анализ специфических белково-белковых взаимодействий в клетках (подверженных различным экспериментальным условиям), как правило, был сложным и подвержен экспериментальным артефактам. Как правило, белковая совместная иммунопреципитация была методом выбора, но требует большого количества клеток и / или белков, по существу запрещая анализ белково-белковых взаимодействий в редкой клеткеТипа или между белками, которые выражены на низких уровнях. Более того, сверхэкспрессия белков в (нерелевантных) моделях линий клеток часто приводит к артефактам сверхэкспрессии, и результаты могут быть очень трудными для подтверждения / подтверждения in vivo или в соответствующих типах клеток. Кроме того, совместное иммунопреципитация требует лизиса клеток и солюбилизации белков, что может привести к потере сигнала, когда белок-белковые взаимодействия слабы. Важно отметить, что совместное иммунопреципитация белков и дрожжево-двухгибридные подходы не способны обнаруживать внутри- и межклеточные изменения в белково-белковых взаимодействиях. Техника PLA предлагает привлекательную и легкую альтернативу для этих методов и обеспечивает важную дополнительную информацию. PLA может использоваться в стандартной (диагностической) лабораторной обстановке, поскольку она не требует высокоспециализированных навыков, превышающих возможности проведения иммуногистохимии.

Разработка микроскопии с высоким разрешением позволилаАнализ молекулярной архитектуры белковых комплексов. Однако этот метод недоступен и включает специализированную исследовательскую инфраструктуру. PLA предлагает доступный, простой и дешевый альтернативный подход для изучения формирования белкового комплекса с сопоставимым разрешением. Очевидным ограничением метода PLA является наличие специфических первичных антител, выращенных у разных видов. Однако сейчас несколько компаний предлагают специальные (и проверенные) комбинации антител, которые упрощают использование метода PLA.

Исследования по вовлечению белков в восстановление повреждений ДНК и ответ на повреждение ДНК в значительной степени зависят от анализа формирования и состава IRIF. Однако следует отметить, что совместная локализация белков в IRIF не обязательно подразумевает прямые белок-белковые взаимодействия. Метод PLA предлагает уникальную возможность более детально изучить протеины для восстановления ДНК и образование ремонтных комплексов. SpАтиэтемпоральный анализ образования таких комплексов может быть отображен более подробно с использованием PLA. Более того, это позволит исследователям оценить образование ремонтных комплексов в тканях и клинических образцах пациентов, которые были обработаны повреждающими ДНК агентами или терапиями, которые могут дать важное представление об эффективности этих методов лечения и могут даже помочь в выборе Пациентов, которые получат наибольшую пользу от этих методов лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследования в лаборатории Guikema финансируются за счет схемы инновационных исследовательских стимулов из Нидерландской организации по научным исследованиям (грант VIDI 016126355) и KiKA Stichting Kinderen Kankervrij '(проект 252).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV173 cell line DSMZ AC-20 BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line DSMZ ACC-389 BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco (Life Technologies) 21980-032
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich F7524 lot #: 064M3396
L-glutamine Gibco (Life Technologies) 25030-024
penicillin/streptomycin Gibco (Life Technologies) 15140-122
imatinib methanesulfonate LC Laboratories I-5508 Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin Sigma Aldrich N9162 Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933 Selleckchem S1092 Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides Waldemar Knittel VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker Sigma Aldrich Z377821-1EA
Cytospin funnel Q Path Labonord SAS 003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit Sigma Aldrich DUO92105 Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM Bethyl Laboratories A300-136A PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 Cell Signaling Technology 9284 We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Vectashield antifading mounting medium Vector Labs H-1000
4% paraformaldehyde in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Also available from various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (9), a012716 (2013).
  2. Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35, (2), 101-108 (2010).
  3. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9, (12), 1219-1228 (2010).
  4. Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316, (5828), 1160-1166 (2007).
  5. Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17, (4), 453-456 (1997).
  6. Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13, (2), 152-157 (1999).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320, (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125, (Pt 15), 3529-3534 (2012).
  9. Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14, (1), 82-86 (2003).
  10. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, (3), 227-232 (2008).
  11. Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72, (11), 2371-2376 (2000).
  12. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, (7267), 1071-1078 (2009).
  13. Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52, (4), 567-582 (2011).
  14. Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9, (7), e101685 (2014).
  15. Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. (2016).
  16. Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281, (5383), 1674-1677 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics