Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Biochemistry

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Summary

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

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Bahjat, M., Bloedjes, T. A., van der Veen, A., de Wilde, G., Maas, C., Guikema, J. E. Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (124), e55703, doi:10.3791/55703 (2017).

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Abstract

La risposta al danno del DNA orchestra la riparazione delle lesioni del DNA che si verificano spontaneamente, sono causate da stress genotossico o appaiono nel contesto di interruzioni del DNA programmate nei linfociti. Tra le prime che sono attivate dopo l'induzione del danno del DNA, sono state individuate le chinasi mutanti (ATM) di Ataxia-Telangiectasia mutata (ATM), kinasi ATM- e Rad3-correlata (ATR) e la subunità catalitica della proteina-chinasi dipendente dal DNA (DNA-PKcs) Regolatori centrali di una rete che controlla la riparazione del DNA, l'apoptosi e la sopravvivenza cellulare. Come parte di un percorso che sopprime il tumore, ATM e ATR attivano la p53 attraverso la fosforilazione, regolando così l'attività trascrizionale della p53. Il danno del DNA provoca anche la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) che rappresentano complessi di sensori di danni del DNA e proteine ​​di riparazione che si accumulano nei siti di danni del DNA, visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. La co-localizzazione delle proteine ​​in IRIF, tuttavia, non implica necessariamente dLe interazioni proteiche proteiche, in quanto la risoluzione della microscopia a fluorescenza è limitata.

In locazione Proximity Ligation Assay (PLA) è una tecnica innovativa che consente la visualizzazione diretta delle interazioni proteico-proteiche in cellule e tessuti con specificità e sensibilità senza precedenti. Questa tecnica si basa sulla prossimità spaziale di anticorpi specifici legati alle proteine ​​di interesse. Quando le proteine ​​interrogate sono all'interno di ~ 40 nm una reazione di amplificazione viene innescato da oligonucleotidi che sono coniugati agli anticorpi e il prodotto di amplificazione è visualizzato mediante etichettatura fluorescente, dando un segnale che corrisponde alla localizzazione subcellulare delle proteine ​​interagenti. Utilizzando l'interazione funzionale stabilita tra ATM e p53, è qui dimostrato come il PLA possa essere utilizzato nelle colture di cellule di sospensione per studiare le interazioni dirette tra le proteine ​​che costituiscono parte integrante della risposta del danno del DNA.

Introduction

Il danno del DNA innesca una serie altamente regolamentata di eventi che coinvolgono le interazioni proteico-proteiche e le modificazioni post-traslazionali che garantiscono una riparazione efficiente e rapida del DNA, salvaguardando così l'integrità genomica 1 . In genere, la riparazione del DNA viene studiata in cellule esposte a radiazioni ionizzanti monitorando la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) mediante microscopia a fluorescenza (confocale). Molte protezioni del DNA e proteine ​​che danno i danni del DNA formano IRIFs, che rappresentano complessi proteici che nucleate nei siti di cromatin che sostengono il danno del DNA 2 , 3 . L'ubicazione e la risoluzione degli IRIF nel corso del tempo danno un'importante conoscenza dell'organizzazione spaziale della riparazione del DNA e possono indicare il coinvolgimento di diversi percorsi di riparazione del DNA. La natura del danno del DNA e la fase del ciclo cellulare in cui il danno è raggiunto determina quale percorso di riparazione del DNA è attivato. fo R, in cellule attivamente impegnate nella replicazione del DNA (fase S), la ricombinazione omologa (HR) è il percorso di riparazione dominante del DNA, mentre nelle cellule nella fase G1 o G2 / M del ciclo cellulare, Predominano il percorso di riparazione homologous end-joining (NHEJ). Uno degli eventi più iniziali che segue il danno del DNA è l'attivazione delle proteine ​​della telangiectasia-mutato (ATM) di Ataxia Telangiectasia-Mutated (ATM), che è prevalentemente attiva nelle fasi G1 e G2 / M del ciclo cellulare e regola NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Rad3-related protein (ATR), che agisce in fase S attivando HR. Entrambi ATM e ATR sono cinasi molto pleiotropici che fossicole molte proteine ​​che sono coinvolte nella riparazione del DNA, nella morte cellulare e nella sopravvivenza 4 . Entrambe le chinasi sono state dimostrate di fosforilazione e attivazione della proteina tumor-suppressor p53 a seguito dell'esposizione a stress genotossico, indicando che queste chinasi sono mediatori a monte di un asse di segnalazione suppressivo del tumore pivotal"Xref"> 5 , 6 .

La formazione e la composizione degli IRIF è tipicamente valutata determinando la co-localizzazione di diverse proteine ​​usando la colorazione immunofluorescenza a due colori e la microscopia, tuttavia non tutte le proteine ​​che fanno parte dei complessi proteici di riparazione formano IRIF che limita l'applicabilità di questo approccio. Inoltre, la microscopia di immunofluorescenza (confocale) è limitata dalle proprietà di diffrazione della luce, con una risoluzione spaziale piuttosto scarsa di circa 200-300 nm, superando le dimensioni delle strutture subcellulari più basse, il che proibisce essenzialmente l'interrogazione diretta delle interazioni protein-proteine ​​a Il livello molecolare. Come tale, la co-localizzazione dei modelli di colorazione delle immunofluorescenza rilevata dalla microscopia a fluorescenza (confocale) non è necessariamente indicativa per le interazioni proteiche-proteiche dirette. Recentemente, sono state sviluppate nuove tecnologie super-risoluzione, come ad esempio strutture struzionali tridimensionali(3D-SIM) 7 , che è stato utilizzato con successo per studiare la formazione di IRBF 53BP1 e BRCA1 a dettagli di nano scala, rivelando le caratteristiche di distribuzione spaziale di queste proteine ​​che non sono state rilevate dalla microscopia a scansione laser a confocale 8 .

Molti altri metodi possono essere utilizzati per rilevare interazioni protein-proteine in vivo , quali co-immunoprecipitazione, metodi di abbattimento e approcci di screening a due hibridi di lievito. Tuttavia, queste tecniche sono piuttosto ingombranti, richiedono grandi quantità di cellule o proteine ​​o coinvolgono un'eccessiva espressione delle proteine, che introduce artefatti sperimentali. Più di recente è stata sviluppata una nuova tecnica che consente la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni proteiche-proteiche in situ ( cioè nelle cellule e nei tessuti), chiamata Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . PrGli anticorpi secondari che riconoscono due proteine ​​di interesse sono rilevati da anticorpi secondari che sono coniugati a oligonucleotidi (cosiddette sonde PLA). Se i due diversi anticorpi secondari sono sufficientemente stretti a causa delle interazioni tra le proteine ​​riconosciute dagli anticorpi primari, gli ioligonucleotidi coniugati si ibridano e possono essere legati per formare un substrato DNA circolare chiuso. Questo substrato circolare viene successivamente amplificato mediante amplificazione a circuito circolare e visualizzata con oligonucleotidi complementari con fluorochrome. Utilizzando PLA, la localizzazione subcellulare dell'interazione proteico-proteica viene mantenuta quando il prodotto di amplificazione del cerchio di laminazione a fluorescenza è rimasto collegato alle sonde PLA. La risoluzione di questo saggio è <50 nm, basata sulla constatazione che il diametro di un anticorpo è di circa 7-10 nm 11 . L'amplificazione del cerchio rotante può avvenire solo nel caso in cui due paia di anticorpi (primario + seconDary) interagiscono fisicamente all'interno del perimetro definito dalla loro dimensione (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). La fase di amplificazione del segnale aumenta la sensibilità del test PLA e consente la rilevazione delle interazioni di proteine ​​appena espresse. PLA genera segnali di punta, simili a foci simili, che possono essere quantificati su base cellulare per cui è possibile valutare la variazione intra-cellulare e inter-cellulare nelle interazioni proteico-proteine.

La formazione e la composizione dei complessi di riparazione e IRIF sono principalmente studiati in linee cellulari aderenti come la linea cellulare U2OS osteosarcoma ossea umana, la linea cellulare HEK293 embrionale umana e la linea cellulare epiteliale RPE-pigment retinica, Crescente e facile da trasfettare. Le colture di cellule di sospensione, come quelle lineari di linfoidi e mieloidi, vengono utilizzate meno frequentemente, poiché queste sono meno suscettibili alla trasfezione e generalmente non si adattano a coverlips, richiedendo quindi ulteriori / alternative stEps per l'imaging. La risoluzione dei danni del DNA è però molto rilevante nel contesto delle malignità linfoidi e mieloide, in quanto la risposta dei danni al DNA è spesso influenzata dalle aberrazioni genomiche (driver) in questi tumori, svolgendo un ruolo fondamentale nella trasformazione maligna di linfoidi e mieloidi normali ( Progenitori) le cellule 12 , 13 , 14 .

Questo protocollo descrive come il PLA possa essere utilizzato per valutare e quantificare le interazioni proteico-proteiche dopo l'induzione del danno del DNA nelle colture di cellule di sospensione. Qui, PLA viene eseguita per determinare e visualizzare le interazioni tra ATM e p53 sul danno del DNA nelle cellule di leucemia delle cellule umane B che sono indotte a subire un arresto del ciclo cellulare in fase G1. Da notare, il protocollo qui presentato non è limitato allo studio di interazioni ATM e p53 nelle cellule di leucemia arrestate da G1, ma può anche essere utilizzato per visualizzare altri interazioni proteico-proteicoIn vari tipi di cellule e colture di cellule di sospensione.

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Protocol

1. Trattamento delle cellule e dell'induzione del danno del DNA

  1. Coltivare la linfoblastica acuta linfoblastica BV173 o SUP-B15 umana in IMDM integrata con 20% FCS, 50 μM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina a 37 ° C in atmosfera di 5% CO 2 . Contare le cellule e la piastra a 2 x 10 6 cellule / mL in piatti a 6 pozzetti, a 5 mL / pozzetto.
    NOTA: Opzionalmente, le linee cellulari di sospensione di diversa origine possono essere utilizzate.
  2. Per arrestare le cellule BCR-ABL + B-ALL nella fase G1 del ciclo cellulare, aggiungere 5 μM di metanesolfonato imatinib (STI571) e incubare per una notte.
    1. Facoltativamente, ignorate questo passaggio quando si studiano le interazioni proteico-proteiche durante tutto il ciclo cellulare o nei tipi di cellule negativi BCR-ABL.
  3. Indurre il danno del DNA aggiungendo alla cultura 50 ng / ml di neocarzinostatina (NCS) e incubare per 2 ore.
    1. In alternativa,Indurre il danno del DNA irraggiando le cellule utilizzando una sorgente radioattiva [ 137 Cs] a 0,5 Gy / min, ad una dose di 5 Gy. Dopo irradiazione, lasciare la cella recuperare per 2 ore a 37 ° C in atmosfera di 5% CO 2 .
  4. Facoltativamente, per valutare il coinvolgimento dell'attività di ATM-chinasi in risposta al danneggiamento del DNA, aggiungere 5 μM di inibitore ATM kinasi KU55933 prima dell'aggiunta di NCS o del trattamento di irradiazione.
  5. Preparare 1x PBS + 10% BSA stratificando 5 g di frazione-V BSA sopra 50 ml di 1x PBS in un bicchiere o Erlenmeyer e lasciar sedere a RT finché BSA non si scioglie. Non scuotere né agitare perché questo provocherà una schiuma estensiva. Lentamente filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm e tenerlo su ghiaccio.
  6. Celle di raccolta e lavare due volte con 1x PBS a ghiaccio freddo. Contare le cellule e risospendere a 2 x 10 6 / mL in 1x PBS + 10% BSA. Mantenere le cellule sul ghiaccio.

2. Cytocentrifugazione, fissazione e permeabilizzazione

  1. Preparare laSoluzione 4% di paraformaldeide in 1x PBS fresco. Aggiungere 2 g di PFA a 50 ml di 1x PBS e incubare in un bagno d'acqua agitante a 55 ° C fino a quando la soluzione è chiara. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 μm e conservare a RT fino all'uso.
    NOTA: Facoltativamente, il fissatore di PFA al 4% può essere conservato congelato a -20 ° C. Dopo il congelamento, scongelare solo una volta per l'uso. Altrimenti, la soluzione al 4% di PFA in PBS può essere acquistata direttamente.
  2. Lucidare accuratamente le esposizioni a microscopia da 76 mm x 26 mm con tessuto privo di lanugine e sgrassarle collocandolo nel 96% di etanolo in un vaso Coplin per 5 min. Lasciare che la microscopia scivoli in aria per 10 minuti.
  3. Assemblare le diapositive di microscopia nelle celle di citospina / citologia con una superficie di 6 mm. Le pastiglie di pre-strato pipettano 50 μl di 1x PBS + 10% BSA in ogni imbuto e centrifugano per 1 min a 500 giri / min.
  4. Aggiungere 100 μL della sospensione cellulare (pari a 0,2 x 106 cellule) ad ogni imbuto e centrifugare per 5 minuti a 500 giri / min. Per ogni combinazione di anticorpi, alleSono necessari preparati 4 (esperimento a doppio anticorpo, due controlli monocomponenti, nessun controllo degli anticorpi).
  5. Smontare con cura gli imbuti e assicurarsi di non toccare le macchie. Procedere immediatamente alla fissazione del campione.
    1. Facoltativamente, lasciare che le diapositive siano asciugate all'aria per almeno 30 minuti. Dopo essiccazione ad aria, avvolgere le diapositive individualmente in fogli di alluminio e conservare a -20 ° C fino all'uso. Quando si utilizzano preparati congelati, assicurarsi di scongelare le diapositive avvolte in un tovagliolo di carta per evitare una condensa estesa sulle diapositive.
  6. Disegnare un cerchio (diametro approssimativo 15-20 mm) attorno al punto usando un bloccante liquido a penna PAP (punta da 5 mm).
  7. Aggiungere 50 μl di soluzione di fissazione del 4% di PFA ad ogni punto e incubare per 30 minuti a RT.
  8. Lavare le cellule 3 volte per 5 min con 1x PBS in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera.
  9. Asciugare le diapositive intorno ai punti con un tessuto privo di lanugine e rimuovere il più liquido dal punto più possibile utilizzando un piAnimale domestico senza toccare il punto, o inclinando la diapositiva. Aggiungere 50 μl di 0,25% Triton-X in 1x PBS a ciascun punto e incubare per 10 minuti a RT senza agitazione.
  10. Lavare le diapositive 3 volte per 5 min in ~ 50-60 mL di 0,05% di Tween-20 in TBS (TBS-T) in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera. 10 diapositive possono essere elaborate simultaneamente in questo modo.

3. Blocco e incubazione primaria dell'anticorpo

  1. Toccare TBS-T e asciugare le diapositive attorno ai punti con un tessuto privo di lanugine. Rimuovere il più liquido dal punto possibile utilizzando un pipetta senza toccare il punto, o inclinando la slitta. Poco vorticate la soluzione di blocco e aggiungete una goccia (~ 40 μL) ad ogni punto. Incubare per 1 ora a 37 ° C in una camera umidificata pre-riscaldata.
  2. Preparare il cocktail anticorpale mescolando il capra anti-ATM a 1: 1,000 e il coniglio anti-fosforo-Ser15-p53 a 1: 100 in diluente anticorpale commerciale, diluente anticorpo vortex prima dell'uso. Per esperimento di controlloTs, preparare le diluizioni degli anticorpi contenenti solo il capra-anti-ATM e solo l'anticorpo coniglio-anti-fosforo-Ser15-p53 (controlli monocomponenti).
  3. Toccare la soluzione di blocco, ma fate attenzione a non lasciare le cellule asciutte prima di aggiungere le diluizioni degli anticorpi. Aggiungere 30 μL di ciascuna diluizione del cocktail anticorpale e incubare in una camera umidificata per una notte a 4 ° C.
  4. Preparare il tampone di lavaggio in situ e il tampone di lavaggio B dissolvendo il contenuto di un sacchetto di miscela di Buffer A e Buffer B in un volume finale di 1.000 mL di acqua ciascuno.
    1. In alternativa, preparare il tampone di lavaggio A dissolvendo 8,8 g di NaCl, 1,2 g di Tris-base e 0,5 ml di Tween-20 in 800 ml di acqua. Regolare il pH a 7,4 utilizzando HCl e aggiungere ad un volume finale di 1000 mL.
    2. In alternativa, preparare il bucato di lavaggio B sciogliendo 5,84 g di NaCl, 4,24 di Tris-base e 26,0 g di Tris-HCl in 500 ml di acqua. Regolare il pH a 7,5 con HCl. Aggiungere acqua a un volume finale di 1.000 mL.
    3. FiltroEntrambe le soluzioni attraverso un filtro da 0,22 μm.
  5. Lavare le diapositive 2 volte per 5 min con 1 tampone di lavaggio in situ in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera.

4. Prove PLA, Ligation e Amplification

  1. Preparare sonde PLA diluendo il MINUS anti-capra PLUS e anti-coniglio MINUS entrambi 1: 5 nel diluente anticorpale commerciale. Toccare il tampone di lavaggio 1x in situ dai diapositive e aggiungere 30 μL della miscela di sonde PLA ad ogni punto. Incubare 1 h a 37 ° C in una camera umidificata pre-riscaldata.
    NOTA: Qualsiasi combinazione di anticorpi secondari PLUS e MINUS PLA possono essere utilizzati (anti-mouse, anti-coniglio, anti-capra) a condizione che gli anticorpi primari applicati siano sollevati in diverse specie e la combinazione delle sonde PLA Contengono una sonda PLUS e una sonda MINUS.
  2. Lavare le diapositive 2 volte per 5 min con ~ 50-60 mL di tampone di lavaggio in situ 1 in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera./ Li>
  3. Preparare la soluzione Ligation-Ligase su ghiaccio aggiungendo 1 μL di Ligase a 39 μL di soluzione di legame e aggiungere 40 μL di soluzione di Ligation-Ligase a ciascun punto. Incubare 30 minuti a 37 ° C in una camera umidificata pre-riscaldata.
  4. Lavare le diapositive 2 volte per 5 min con ~ 50-60 mL di tampone di lavaggio in situ 1 in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera.
  5. Preparare la miscela Amplification-Polymerase sul ghiaccio diluendo la soluzione di magazzino Amplification 1: 5 in acqua. Quindi aggiungere 0,5 μl di polimerasi a 39,5 μL di soluzione di amplificazione 1x per ogni punto.
    NOTA: I reagenti di amplificazione sono sensibili alla luce e devono essere protetti contro l'esposizione diretta alla luce. Il reagente di amplificazione è disponibile in quattro diversi colori (ROSSO: eccitazione 594 nm, emissione 624 nm, FarRED: eccitazione 644 nm, emissione 669 nm, ORANGE: eccitazione 554 nm, emissione 576 nm, VERDE: eccitazione 501 nm, emissione 523 nm) Assicurarsi che la configurazione microscopia disponibile sia sLe proprietà di eccitazione e filtri per immagini di questi colori.
  6. Toccare il tampone di lavaggio 1x in situ e aggiungere 40 μL di miscela di amplificazione-polimerasi per punto. Incubare per 100 min a 37 ° C in una camera umidificata pre-riscaldata.

5. Montaggio e Imaging

  1. Preparare il bucato B di lavaggio in situ 0,01x, aggiungendo 1 ml di 1x Tampone di lavaggio B a 99 ml di acqua.
  2. Toccare la miscela Amplification-Polymerase e lavare le diapositive 2 volte per 10 min con 1 tampone di lavaggio in situ B in un vaso Coplin a RT con agitazione leggera.
  3. Lavare le diapositive 1 min in tampone di lavaggio 0,01x.
  4. Toccare l'eccesso di lavaggio B di 0.01x e asciugare le diapositive attorno ai punti con un tessuto privo di lanugine. Rimuovere il più liquido dal punto possibile utilizzando un pipetta senza toccare il punto, o inclinando la slitta.
  5. Diluire il supporto di montaggio contenente DAPI 1: 5 in mezzo di montaggio senza DAPI per evitare la sovraesposizione dei nuclei.
  6. Aggiungere 25-30 μL di supporto 1: 5 di supporto contenente DAPI a una copertura di 24 mm x 24 mm e raccogliere il coperchio con il vetrino, applicare una leggera pressione per assicurare che non ci siano bolle d'aria intrappolate. Sigillare la copertura con unghie e attendere almeno 15 minuti prima dell'immagine.
  7. Analizzare le diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza (confocale).
    1. Conta il numero di segnali PLA punta per cellula in almeno 4 campi immagine acquisiti (obiettivo 20x, contando almeno 20 celle per condizione o combinazione di anticorpi, basata su un calcolo di potenza utilizzando una media prevista di 7 ± 5 segnali nelle cellule trattate, E 2 ± 2 segnali nelle cellule non trattate, con una probabilità di un errore di tipo I di 0,05 e una potenza dell'80%, come riportato in precedenza 15 ).
      NOTA: La migliore risoluzione è ottenuta mediante l'acquisizione di una Z-stack e la deconvoluzione utilizzando pacchetti software ( ad esempio ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). Il segnaleDeve essere facilmente riconoscibile all'interno del perimetro nucleare, come definito dalla colorazione DAPI.
    2. Non contare segnali che appaiono chiaramente al di fuori dei nuclei. Tipicamente, il trattamento NCS o l'irraggiamento γ provocano circa 5-10 segnali PLA phosho-p53 / ATM per cellula. I controlli "singolo anticorpo" possono dare un segnale di fondo, ma questo non dovrebbe superare i segnali di PLA per 1 su ogni 20 cellule.
    3. Per scopi di pubblicazione e presentazione, catturare immagini utilizzando un obiettivo di immersione 40X o 63X. Le diapositive possono essere conservate a 4 ° C e devono essere protette da esposizione alla luce.

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Representative Results

La fosforilazione del p53 al residuo Ser15 è risultata dipendente dall'attività di ATM kinasi 16 . Per dimostrare e confermare la specificità della tecnica PLA sulle preparazioni citospiniche di colture di cellule di sospensione, si è dimostrato che l'induzione del danno del DNA mediante trattamento a 2 ore di NCS di cellule BCR-ABL + B-ALL arrestate nella fase G1 del ciclo cellulare Ha determinato l'interazione specifica tra ATM e fosfo-Ser15-p53, come previsto. Punctate segnali PLA sono stati osservati nel nucleo della maggior parte delle cellule trattate con NCS ( Figura 1B ), con una media di 7 segnali PLA per cellula 15 , mentre questi segnali non sono stati rilevati in cellule che non sono state trattate con NCS ( Figura 1A ) . Il pre-trattamento delle cellule con l'inibitore specifico ATM kinasi KU55933 prima dell'induzione del danno del DNA ha chiaramente diminuito il numero di segnali PLA a una media di2 segnali PLA / cella ( Figura 1C ). I segnali PLA ATM-fosfo-Ser15-p53 sono stati esclusivamente rilevati nel nucleo, come previsto. Gli esperimenti PLA in cui l'omicidio anti-capra anti-ATM o l'anticorpo anti-fosforo-Ser15-p53 del coniglio non è stato omesso (controllo "singolo anticorpo") non ha prodotto alcun segnale PLA specifico ( figure 1D e 1E ). Quantificazione e analisi statistiche di questi risultati sono presentate in Figura 1F (adattata da Ochodnicka et al., J. Immunol. 2016).

Figura 1
Figura 1: PLA in situ per ATM / fosfo-Ser15-p53 Interazioni in BV173 Cellule umane BCR-ABL +. ( A ) Le cellule sono state trattate durante la notte con 5 μM di imatinib (inibitore specifico Abl-chinasi che provoca un ciclo cellulare a fase G1( B ), o con imatinib e pre-trattati con 5 μM di inibitore specifico ATM kinasi KU55933 prima del trattamento NCS ( C ), con imatinib e 50 ng / mL NCS, . Sono mostrati gli esperimenti PLA per il controllo monocomponente per gli anticorpi anti-capsule anti-ATM (D) e coniglio-anti-fosforo-Ser15-p53 ( E ). I segnali a punta rossi a fluorescenza rappresentano la prossimità proteica in situ (<50 nm) di ATM e proteine ​​fosfo-Ser15-p53. Barre di scala = 5 μm (linee bianche). ( F ) La quantificazione del numero di segnali PLA in almeno 20 cellule trattate in diverse condizioni sperimentali è mostrata. Le righe orizzontali rappresentano mezzi; Significative statistiche sono state determinate mediante un'analisi unica di varianza (ANOVA; p <0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questa relazione, è dimostrato che PLA può essere utilizzato per determinare e visualizzare l'interazione specifica tra le proteine ​​nelle colture di cellule di sospensione. Da notare, il protocollo descritto qui non è limitato allo studio dei complessi di riparazione del DNA ma si applica anche per visualizzare e quantificare altre interazioni proteine-proteine ​​nelle colture cellulari di sospensione. Si è dimostrato che l'ATM kinasi interagisce con p53 fosforilato nelle cellule BCR-ABL + B-ALL arrestate da G1 quando sono esposti ad un agente che indica danni al DNA. In precedenza, la tecnica PLA è stata usata da noi per dimostrare che ATM e fattore di trascrizione FOXO1 hanno interagito con le cellule BCR-ABL + B-ALL, tuttavia questa interazione non ha probabilmente dato luogo alla fosforilazione a base di ATM di FOXO1. A sostegno dei dati PLA, è stato confermato da immunoprecipitazione di proteine ​​endogene ATM / ATR-fosforilate che, contrariamente ai substrati ATM stabiliti p53 e NBS1, FOXO1 non è fosforilato da ATM su induzione di DDanni 15 . Inoltre, l'approccio PLA è stato applicato con successo per studiare la formazione di complessi di riparazione di mismatch ( ad esempio, l'interazione tra MSH2 e MSH6) in varie linee cellulari umane di linfoma B (dati non mostrati). In questi contesti particolari, la tecnica PLA ha offerto un approccio alternativo per supportare i nostri risultati. È dimostrato che il PLA consente la valutazione semiquantitativa delle interazioni protein-proteine ​​tra le condizioni sperimentali e fornisce una visione della variazione delle cellule a cellule in queste interazioni.

L'analisi di interazioni proteine-proteine ​​specifiche nelle cellule (esposte a diverse condizioni sperimentali) è stata tipicamente impegnativa e soggetta a manufatti sperimentali. Generalmente, la co-immunoprecipitazione di proteine ​​è il metodo di scelta, ma richiede un gran numero di cellule e / o proteine, essenzialmente vietando l'analisi delle interazioni proteine-proteiche in celle rareTipi o tra proteine ​​che vengono espresse a bassi livelli. Inoltre, l'eccessiva espressione delle proteine ​​nei modelli di linee cellulari (irrilevanti) spesso porta ad artefatti di sovraespressione e i risultati possono essere molto difficili da confermare o convalidare in vivo o nei tipi di cellule pertinenti. Inoltre, la co-immunoprecipitazione richiede la lisi delle cellule e la solubilizzazione delle proteine, che possono provocare la perdita del segnale quando le interazioni proteico-proteiche sono deboli. Importante, la co-immunoprecipitazione della proteina e gli approcci di lievito-bi-ibrido non sono in grado di rilevare variazioni intra-intercellulari nelle interazioni proteine-proteine. La tecnica PLA offre un'alternativa attraente e facile per queste tecniche e fornisce importanti conoscenze supplementari. PLA può essere utilizzato in un laboratorio standard (diagnostico) in quanto non richiede abilità altamente specializzate oltre la capacità di eseguire immunohistochemistry.

Lo sviluppo di microscopia super-risoluzione ha permesso l'approfondimentoAnalisi dell'architettura molecolare dei complessi proteici. Questa tecnica, tuttavia, non è facilmente disponibile e coinvolge un'infrastruttura di ricerca dedicata. PLA offre un approccio alternativo accessibile, semplice e economico per lo studio della formazione di complessi proteici, con una risoluzione paragonabile. Una ovvia limitazione della tecnica PLA è la disponibilità di anticorpi primari specifici raccolti in diverse specie. Tuttavia, molte aziende offrono ora combinazioni anticorpali dedicate (e convalidate) che semplificano l'uso della tecnica PLA.

Studi sul coinvolgimento delle proteine ​​nella riparazione dei danni del DNA e sulla risposta del danno del DNA dipendono fortemente dall'analisi della formazione e della composizione IRIF. Tuttavia, va notato che la co-localizzazione delle proteine ​​in IRIFs non implica necessariamente interazioni proteiche-proteiche dirette. La tecnica PLA offre un'opportunità unica per studiare le proteine ​​del DNA e la formazione di complessi di riparazione in modo più dettagliato. La spL'analisi atiotemporale della formazione di tali complessi può essere mappata in dettaglio con PLA. Inoltre, permetterà ai ricercatori di valutare la formazione di complessi di riparazione nei tessuti e negli esemplari clinici di pazienti trattati con agenti o terapie che danneggiano il DNA, che possono fornire un'importante conoscenza dell'efficacia di queste modalità di trattamento e potrebbero addirittura aiutare nella selezione Dei pazienti che beneficeranno maggiormente di questi trattamenti.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca nel laboratorio di Guikema è finanziata dal programma Innovative Research Incentives dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (convalida VIDI 016126355) e dal progetto "Stichting Kinderen Kankervrij 'KiKA (progetto 252).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV173 cell line DSMZ AC-20 BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line DSMZ ACC-389 BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco (Life Technologies) 21980-032
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich F7524 lot #: 064M3396
L-glutamine Gibco (Life Technologies) 25030-024
penicillin/streptomycin Gibco (Life Technologies) 15140-122
imatinib methanesulfonate LC Laboratories I-5508 Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin Sigma Aldrich N9162 Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933 Selleckchem S1092 Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides Waldemar Knittel VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker Sigma Aldrich Z377821-1EA
Cytospin funnel Q Path Labonord SAS 003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit Sigma Aldrich DUO92105 Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM Bethyl Laboratories A300-136A PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 Cell Signaling Technology 9284 We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Vectashield antifading mounting medium Vector Labs H-1000
4% paraformaldehyde in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Also available from various other vendors

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References

  1. Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (9), a012716 (2013).
  2. Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35, (2), 101-108 (2010).
  3. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9, (12), 1219-1228 (2010).
  4. Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316, (5828), 1160-1166 (2007).
  5. Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17, (4), 453-456 (1997).
  6. Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13, (2), 152-157 (1999).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320, (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125, (Pt 15), 3529-3534 (2012).
  9. Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14, (1), 82-86 (2003).
  10. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, (3), 227-232 (2008).
  11. Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72, (11), 2371-2376 (2000).
  12. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, (7267), 1071-1078 (2009).
  13. Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52, (4), 567-582 (2011).
  14. Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9, (7), e101685 (2014).
  15. Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. (2016).
  16. Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281, (5383), 1674-1677 (1998).

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