Entrega sistémica de microARN mediante Virus Adeno-asociado recombinante serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores

Genetics
 

Summary

Aquí describimos la entrega de microRNA usando un serotipo de virus adeno-asociado recombinante 9 en un modelo de ratón de una enfermedad neuromuscular. Una sola administración periférica en ratones dio lugar a la sobreexpresión de miRNA sostenida en el músculo y neuronas del motor, proporcionando una oportunidad de estudio miRNA función y potencial terapéutico en vivo.

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Pourshafie, N., Lee, P. R., Chen, K. l., Harmison, G. G., Bott, L. C., Fischbeck, K. H., Rinaldi, C. Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (138), e55724, doi:10.3791/55724 (2018).

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Abstract

ARN de interferencia vía el camino de los miRNA endógenos regula la expresión génica mediante el control de la síntesis de proteínas a través del silenciamiento génico postranscripcional. En los últimos años, la regulación génica mediada por miRNA ha demostrado potencial para el tratamiento de los trastornos neurológicos causados por un aumento tóxico del mecanismo de la función. Sin embargo, entrega eficiente a los tejidos Diana ha limitado su aplicación. Aquí hemos utilizado un modelo de ratón transgénico para la atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), una enfermedad neuromuscular causada por la extensión del polyglutamine en el receptor de andrógenos (AR), para probar el silenciamiento génico por una nueva miRNA AR metas identificada, miR-298. Sobreexpresa miR-298 usando un vector de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) serotipo 9 para facilitar la transducción de las células no se dividen. Una sola inyección de la vena de la cola en ratones SBMA inducida por la sobreexpresión sostenida y generalizada de miR-298 en músculo esquelético y neuronas motoras y dio lugar al mejoramiento del fenotipo neuromuscular en los ratones.

Introduction

MiRNAs son no-codificación RNAs, 21-23 nucleótidos de longitud, que juegan un papel importante en la regulación de la expresión génica y control de diversas vías metabólicas y celulares. 1 expresión génica está regulada principalmente por inducir degradación de silenciamiento o ARNm postranscripcional del gen. 2 MiRNAs son generalmente complementarios a la región 3' no traducida (UTR) de codificación de genes, aunque vinculante a los 5' UTR y regiones de la meta que ARNm también se ha descrito la codificación. 3

Como se expande la comprensión actual de los papeles de miRNA en la patogenia de enfermedades humanas, modulación farmacológica de miRNAs individuales o familiares de miRNA se está convirtiendo en una opción terapéutica viable. En comparación con otras estrategias de inhibición de la RNA, miRNAs tienen muchas ventajas: miRNAs son menos tóxicos y menos inmunogénica y puede entregar fácilmente en las células debido a su pequeño tamaño. 4 , 5 , 6 MiRNAs tienen varios objetivos dentro de las redes celulares, por lo tanto posibles efectos off-target y preocupaciones de seguridad deben tomarse en cuenta, junto con una entrega eficaz a los tejidos diana.

Enfermedades neuromusculares se adquieren o heredan las condiciones que afectan los músculos y las neuronas motoras. La segmentación de las drogas al músculo esquelético, es un área emergente de investigación, donde el principal desafío es lograr amplia distribución dentro de la ventana terapéutica. 7 las neuronas motoras son más difíciles de dirigir, principalmente porque el acceso de drogas está impedido por la barrera hematoencefálica.

Se utilizaron modelos de ratón y cultura de célula de atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA) en este estudio. SBMA es una enfermedad neuromuscular provocada por un aumento tóxico del mecanismo de la función, en la que se ven afectadas músculos y las neuronas motoras. 8 , 9 SBMA (enfermedad de Kennedy; OMIM #313200) es X-ligado enfermedad, caracterizada por debilidad muscular y atrofia, causada por la extensión de la repetición CAG en el gene de AR, que codifica una zona ampliada del polyglutamine en la proteína de la AR . 10 ningún tratamiento modificador de la enfermedad es actualmente disponible para este desorden. El modelo de ratón transgénico utilizado en este estudio recoge las características de la enfermedad, incluyendo la especificidad de género, patología de la neurona motora y atrofia muscular progresiva. 11

En este estudio, nuestros esfuerzos se centraron en la identificación de un miRNA que directamente regula expresión del transgen mutante de AR y en el diseño de un modo seguro y eficiente de entrega de lo miRNA en la médula espinal y el músculo esquelético de nuestro modelo de ratón de la enfermedad.

Aquí identificamos un miRNA relativamente no caracterizado, miRNA-298 (número MIMAT0004901),12 para reducir directamente expresión de AR mutante en modelos SBMA. Para lograr la entrega de miR-298 a los tejidos diana, utilizamos una estrategia viral, virus adeno-asociado recombinante del serotipo 9 (rAAV9). rAAV9 es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y mediando a largo plazo expresión génica en las células no se dividen, incluyendo las neuronas. 13 una sola administración sistémica de AAV9-miR-298 dio lugar a la expresión sostenida de la miRNA, transduction eficiente de los músculos y las neuronas motoras, abajo-regulación de la expresión de AR y mejorar el fenotipo de la enfermedad en ratones SBMA. 14 esta metodología puede utilizarse para proporcionar miRNA o antagomirs sobreexpresión en vivo.

Protocol

Todos los procedimientos fueron realizados según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (8 ed., prensa nacional de Academias, revisada 2011) y han sido aprobados por el Comité de cuidado Animal de NINDS.

1. selección de estrategia y miRNA de diseño AAV9-miRNA

  1. Use miRWalk la base de datos predictiva para seleccionar candidato miRNAs que interactúan con la región de mRNA 3' UTR del gen objetivo. 15
    Nota: Restringir longitud mínima semilla de miRNA secuencia nucleótidos por lo menos 7. Seleccionar otros programas de predicción de miRNA establecido (miRanda, miRDB, Targetscan) para el análisis comparativo. Basado en los criterios de selección, aquí, miR-185, 298 miR, miR-873 y miR-877 fueron seleccionados para la evaluación adicional.
  2. Recuperar la secuencia de la miRNA seleccionado de miRBase (http://www.mirbase.org/).
  3. Clon de la pri-mir (60-70 n) y su n de 250-300 que flanquean la secuencia genomic en ambos lados, o una secuencia simulada, en el AAV apropiado vector de cis.
    Nota: La secuencia que flanquean se requiere para la tramitación de microRNA maduro y expresión correcta pri-mir. Seleccionar un vector de cis de rAAV dual-promotor con un casete de expresión que consiste en por ejemplo promotor humano alargamiento factor-1 alfa (EIF1α) seguida del miRNA seleccionado o secuencia simulada y el promotor de citomegalovirus humano (CMV) seguido por la codificación del cDNA la etiqueta fluorescente GFP. El promotor EIFα fue elegido porque garantiza la expresión estable y homogénea, con mínimos riesgos de silenciamiento. Promotores de tejido específicos o condicionales pueden utilizarse, según aplicaciones específicas.
  4. Preparar, purificar, y valorar la AAV, siguientes protocolos publicados. 16
    Nota: Aquí, la clonación de la pri-mir en el AAV vector y producción viral fueron realizados por un fabricante externo.

2. cola inyección en la vena del plásmido de AAV-miRNA

Nota: Este paso tiene el ajuste según el gene de la blanco y la edad y el peso de los ratones. Utilice las directrices institucionales y cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) para determinar el rango de dosis, el volumen y la mejor ruta de administración basada en la edad y el peso de los ratones. Se espera que la GFP fluorescencia señal y miRNA niveles de expresión en los tejidos diana pico a partir de 2 semanas después de la inyección. El siguiente protocolo se refiere a ratones machos en edad adulta temprana. AAV debe manejarse como un biológico bajo los lineamientos de bioseguridad nivel 1.

  1. Dividir el stock de plásmido de AAV-miRNA en alícuotas de μl de 100-200 que contiene una carga viral de 1010-1011 genomas virales por mL (vg/mL) con tampón de fosfato estéril salino (PBS). Equipo de protección personal de laboratorio biológico puede usarse para manejar la solución AAV.
    Nota: Una vez que se descongele una alícuota puede ser almacenado a 4 ° C hasta por dos semanas. Acción viral puede guardarse en el congelador de-80 ° C.
  2. Refrenar el ratón en restrainers disponibles comercialmente como tubo de película plástica o cónica plástica del tamaño adecuado.
  3. Limpie la superficie de la cola con toallitas de alcohol 70%.
  4. Sostenga una almohadilla caliente (28-30 ° C) debajo de la cola para aumentar la vasodilatación para 30 s. alternativamente, caliente los animales utilizando una lámpara de calor rojo (a una distancia de 2-3 pies) o por inmersión de la cola en agua caliente.
  5. A partir de la porción distal de la cola, introducir la aguja (27-30 G) con la alícuota viral, biselado, 15° de la cola, en la vena. Antes de la inyección, asegúrese de que la aguja está insertada correctamente.
    1. Si se siente resistencia durante la inyección, o hinchazón aparece bajo la piel, detener el procedimiento. Retire la aguja y vuelva a insertar la aguja sobre el sitio de inyección anterior.
      Nota: Alternativamente, esto puede lograrse aspirando suavemente la aguja y observar sangre. Aspiración duro-a puede colapsar la vena de la cola. Si la vena palidece durante la inyección, la aguja está insertada correctamente.
  6. Después de terminada la inyección, esperar unos segundos antes de levantar la aguja.
  7. Observar el sitio de inyección para la sangría. Aplique una presión moderada con dos dedos en el sitio hasta que se detiene la sangría.
  8. Devolver el animal a su jaula.

3. comportamiento ensayos

Nota: Todos los experimentos se llevaron a cabo ciegamente por un tercero con ocultación de tratamientos por viales únicamente codificadas. Orden de los tratamientos fue al azar. Al realizar las pruebas descritas a continuación, se deben controlar las condiciones experimentales (tipo de habitación) y hora del día para reducir la variación. Esta prueba debe realizarse en ratones mayores de cuatro semanas para obtener resultados confiables. Ratón experimentaron la evaluación del comportamiento una vez antes de la inyección viral en 5 semanas de edad para obtener la línea base de rendimiento normal. Después de la inyección viral, ratones fueron evaluados una vez por semana a partir de 48 h después de la inyección, hasta a 40 semanas de edad.

  1. Llevar el ratón inyectado con AAV a una habitación tranquila y oscura que esté libre de ruido u otros disturbios al menos 30 min antes de comenzar las pruebas. No molestes a los animales durante este período de aclimatación.
  2. Aclimatar el ratón a la nueva habitación por 30 min y luego comenzar los ensayos de comportamiento siguientes (pasos 3.3 y 3.4). Mantenga un espacio de 10 minutos entre cada ensayo conductual.
  3. Prueba de alambre colgante
    Nota: Esta prueba monitorea la fuerza muscular y disfunción motora.
    1. Utilizar una hoja de relleno para actuar como un amortiguador. Coge el ratón por su cola y coloque en el centro de la rejilla de la rejilla. Elevar la rejilla a 15-20 pulgadas por encima de la superficie y poco a poco invertir la pantalla para permitir que el animal ajustar su control sobre la pantalla.
    2. Una vez que la parrilla es totalmente invertida, iniciar el temporizador y registrar el tiempo de caída.
      Nota: Ratones colgará con cuatro extremidades sobre una rejilla. Si el cable se establece demasiado bajo los ratones no pueden aferrarse. Si los ratones caen fuera de la red antes de 60 s, coloque en la rejilla, el temporizador se restablece y repita este procedimiento hasta dos intentos más. Registrar el mejor rendimiento.
    3. Cuando el tiempo límite de 60 s se alcanza, volver la espalda animal a la jaula.
  4. Ensayo grabado de pie
    Nota: La hoja absorbente debe ser un cauce estrecho cerca de 70 cm largo y 5 cm de ancho con paredes altas de 5 cm.
    1. Sostenga el ratón suavemente por una mano y aplique tinta roja a las patas delanteras y tinta azul para las patas traseras con un cepillo.
    2. Coloque la sábana absorbente en el piso de una pista estrecha.
    3. Permitir que el ratón para caminar o correr sobre una sábana absorbente en una línea recta en la pista de un extremo al otro.
    4. Repita el proceso dos veces más con el ratón utilizando una sábana absorbente y fresca.
    5. Mida la distancia entre dos pasos consecutivos en el movimiento hacia adelante. No incluyen primero y último pocas huellas donde el animal sólo es iniciar y terminar su recorrido.

4. eutanasia y cosecha de tejido

  1. Utilice una cámara de eutanasia o una campana de cristal. Si utiliza una campana de cristal, realizar el procedimiento bajo una campana de humos.
  2. Empapar el algodón con isoflurano y colóquelo en la campana de cristal. Use un separador físico para mantener el animal del contacto físico con el material de anestesia. Coloque el animal en el frasco inmediatamente después de este paso.
    Nota: La campana no debe ser precargada con isoflurano para evitar la posibilidad de hipoxemia en los animales.
  3. Siguen isoflurano exposición hasta 30 s después de la respiración se detiene.
  4. Inmediatamente después de quitar el ratón de la jarra, eutanasia por dislocación cervical.
    Nota: Este paso debe realizarse lo antes posible para evitar la degradación del tejido.
  5. Cosecha el espinal cable primero y luego el músculo esquelético del cuádriceps.
    1. Cosecha de la médula espinal, exponer la parte posterior del ratón y fije las cuatro extremidades en el lado a una tabla de disección.
    2. Lave el sitio de la disección con etanol al 70%.
    3. Realizar la dislocación cervical utilizando una tijera afilada.
    4. Hacer una incisión en la piel en la línea media. Quitar la piel ya sea por corte o desgarro cuidado de la piel en el plano transversal, seguido tirando la piel hacia arriba y sobre la cabeza. Retire el cabezal de corte con las tijeras debajo de los omóplatos y en la región de C1-2 de la columna (que se encuentra adyacente a la base del cráneo).
      1. Cortar la musculatura de la pared abdominal en el lado ventral y lateralmente, seguir una dirección en un momento, hasta llegar a la columna vertebral.
    5. Usando una vértebra de tijera afilada retire a partir de la médula espinal cervical. Quitar las partes laterales de las vértebras por el corte a través de los arcos vertebrales a ambos lados.
    6. Después de quitar las vértebras todas liberar la médula espinal.
  6. Complemento congelar los tejidos cosechados en previamente refrigerado 2-Metilbutano mediante el método siguiente:
    1. La mitad llenan un recipiente de acero inoxidable de 2-Metilbutano y sumerja el cuarto inferior del tazón de fuente en un recipiente llenado de nitrógeno líquido.
    2. Pre-enfriar el 2-Metilbutano en nitrógeno líquido durante 1-2 minutos.
    3. Coloque el músculo esquelético con fórceps en el 2-Metilbutano hasta que se vuelve blanco. Transferir inmediatamente el tejido para hielo seco y luego almacenarlo a-80 ° C.
  7. Para la inmunotinción de la médula espinal, integrar el tejido en bloques de parafina a temperatura ambiente antes de rápido congelamiento como se describe. 17
  8. Para el análisis bioquímico y cuantificación de miRNA,1 Coloque el tejido recolectado en un cryovial y congelar en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras a-80 ° C.

Representative Results

Una carga viral de 10 vg11 de AAV9-miR-298 fue inyectada a través de una sola inyección de la vena de la cola en ratones SBMA 5 semanas de edad. Estos ratones llevan el transgén AR humano anormalmente ampliada del polyglutamine tracto en la AR (AR97Q) y desarrollan signos de enfermedad neuromuscular por 10 semanas de edad (pérdida de peso, la espalda jorobada y atrofia muscular). 11 lumbar de la médula espinal y el músculo cuadriceps se cosecharon a 2, 4, 8 y 12 semanas después de la administración para cuantificación de miRNA, análisis de Bioquímica e inmunohistoquímica (figura 1). Administración del tratamiento y el posterior análisis fueron realizados por investigadores cegados.

Análisis de qRT-PCR demostrado la expresión de miR-298 en el músculo esquelético y la médula espinal dos semanas y cuatro semanas después del tratamiento, con niveles de expresión de pico en 8 semanas en el músculo esquelético y 12 semanas en la médula espinal después de la inyección (figura 2 ). Utilizando un microscopio (Axiovert 100 M), señal de fluorescencia verde fue detectado en el tejido muscular y neuronas de motor espinales por co-localización de GFP y la acetiltransferasa de colina de marcador de la neurona de motor (ChAT) 10 semanas después del tratamiento, cuando los ratones comienzan a mostrar manifestaciones de la enfermedad (figura 2).

Usando el mismo régimen de dosis, una cohorte de ratones SBMA fue al azar para recibir ya sea miR-298 o burlarse en 7 semanas de edad vía la inyección de la vena de la cola para los análisis bioquímicos y caracterización funcional. Inyección fue seguida por peso semanal y evaluación del comportamiento a 40 semanas de edad. Análisis de qRT-PCR demostraron que el miR-298 tratamiento reduce los niveles de mutante AR en tejidos afectados (figura 3) y aumentó el peso corporal y mejora el rendimiento del motor (figura 4) a partir de las 10 semanas después de la inyección.

Figure 1
Figura 1: esquema del diseño del estudio. Para aumentar los niveles de la expresión de miR-298 en vivo, nos inyectó ratones SBMA (A) el vector AAV promotor dual plásmido expresando GFP y miR-298 o mofa. (B) ratones fueron inyectados vía una sola inyección de cola inútil en 7 semanas de edad (etapa pre sintomática). Médula espinal y el músculo cuádriceps se recolectaron de una cohorte de ratones SBMA en diferentes puntos temporales para el análisis de la distribución de tejido (verde). Una cohorte de ratones SBMA trataron y fueron sacrificada a las 16 semanas de edad para análisis bioquímicos (rojo). Análisis de comportamiento y peso se realizaron semanalmente hasta a 40 semanas de edad para la caracterización funcional (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: AAV9-miR-298 entrega en ratones. Utilizando el método descrito aquí, ratones recibieron AAV9-miR-298-GFP o AAV9-mock-GFP mediante inyección intravenosa. MiRNA total se obtuvo de la lumbar de la médula espinal y el músculo cuádriceps en 2,4,8 y 12 semanas después de la inyección. qRT-PCR se realizó para estimar el nivel de expresión de músculo cuádriceps de miR-298 (A) (n = 5) (B) de la médula espinal lumbar (n = 5, P < 0.01). Todos los datos se divulgan como medio ± error estándar promedio. La transducción generalizada del vector AAV en tejidos cosechados en 10 semanas después del tratamiento fue confirmado por la localización de la tinción para la GFP en el músculo del cuadriceps (C) (magnificación original, 10 X. Barra de escala = 100 μm) y (D) motoneuronas en la médula espinal lumbar (magnificación original, 40 X. Barra de escala = 10 μm. GFP (green), ChAT (rojo) y DAPI (azul). La figura ha sido modificada desde doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: MiRNA-298 sobre expresión algo mutante AR en médula espinal y el músculo cuádriceps en los ratones. qRT-PCR se realizó para estimar niveles de expresión de mRNA de la AR en la médula espinal lumbar (A) y (B) del músculo cuadriceps tratados con AAV9-miR-298-GFP o AAV9-mock-GFP. Niveles de transcripción fueron normalizados a snoRNA202 (n = 5 por tratamiento). * P < 0.05, ** P < 0.01. Todos los datos se reportan como error estándar de ±. La figura ha sido modificada desde doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Figure 4
Figura 4: expresión MiR-298 mejora la función motora y reduce la pérdida de peso. Evaluación del comportamiento se realizó una vez por semana (w), entre semana de 5 a 40. Cuerpo peso (izquierda) y colgar rendimiento de alambre (derecha) de ratones (n = 15 por grupo). Todos los datos se reportan como error estándar de ±. La figura ha sido modificada desde doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Discussion

Aquí demostramos una metodología altamente eficiente y accesible para seleccionar y entregar mediante inyección de cola un miRNA usando rAAV9 como un vector viral, músculo esquelético y neuronas del motor en ratones. 14 en comparación con otras estrategias de ARNi, miRNAs son menos inmunógenas y menos tóxicas. 18 además, su pequeño tamaño hacen bien adaptado a la capacidad de embalaje limitada de vectores virales. 2 algoritmos computacionales y herramientas de predicción permiten la identificación de objetivos supuestos miRNA-mRNA. Una vez identificados, deben verificarse los efectos del miRNA en la expresión del gen objetivo. Un enfoque común es sobreexpresar un miRNA dado en vitro y detectar niveles de expresión de proteína objetivo usando análisis occidental. 14 , 19

Varios estudios han utilizado estrategias virales y no virales para la entrega de miRNAs. 13 aquí se utilizó virus adeno-asociado (AAV) como una herramienta de entrega de genes. En comparación con otros vectores virales, AAV provoca baja inmunogenicidad, permite la transferencia de genes a largo plazo, y tiene un amplio espectro de tropismo en la división y las células no se dividen. 18 este método también puede evitar la necesidad de modificación química que puede afectar la funcionalidad y especificidad de la molécula de RNA. Existen varios serotipos de AAV, que en su mayoría están determinados por la composición de las proteínas de la cápside. Estos serotipos difieren en su tropismo y transducen diferentes tipos de células. Es necesario seleccionar el serotipo correcto al considerar el tejido diana. Seleccionamos rAAV9, debido a su eficiencia de transducción alta en el sistema nervioso central y músculo esquelético después de administración periférica19,20. Este enfoque ha demostrado una mayor eficacia de transducción de señales en animales neonatales en comparación con animales adultos, probablemente debido a diferencias en la composición de la matriz extracelular, proporción neurona-glia y madurez de la barrera hemato-encefálica. 21 , 22

Un paso importante en este protocolo es el diseño del vector de expresión. En comparación con los vectores bicistronic, que se ven obstaculizados por la menor expresión del gen segundo en comparación con el primer gen junto a la promotora, el vector dual promotor permite una configuración consecutivas produciendo alta expresión de los miRNA y EGFP, así permitiendo la localización de lo miRNA en tejidos de ratón por inmunofluorescencia.

La inyección intravenosa de AAV9 resultó en alta eficiencia y transducción homogéneo en los tejidos diana, músculo esquelético y neuronas motoras. Esta ruta de inyección permite que la dosis administrada alcanza la circulación sistémica y cruzar la barrera de sangre del cerebro, que es importante para las terapias dirigidas al sistema nervioso central. Además, es un método no invasivo para la entrega al SNC. MiR-298 expresión aumentada de la médula espinal y el músculo después de 2-4 semanas con una sola inyección periférica en 5 semanas de edad. Cuando usando vectores AAV de genoma monocatenario, la síntesis de novo de la segunda hebra de ADN puede explicar la transducción retrasada. 23

Niveles de humano miR-298 eran imperceptibles en ratones tratados 20 semanas después de una administración única, lo que sugiere que las enfermedades crónicas, múltiples inyecciones puede requeridas para alcanzar un beneficio terapéutico. Sin embargo, miRNA degradación con el tiempo puede ser limitante cuando se requiere una administración repetida de por vida. Además, inmunidad adaptativa a vectores AAV puede formar otra barrera para una entrega exitosa gene. 24 así generación de vectores AAV que son inmunológicamente inertes es crucial para la administración repetida y lograr efectos a largo plazo con este prometedor sistema de entrega. 25

Una limitación en el uso de miRNA como una estrategia terapéutica es el riesgo de efectos off-target. MiRNAs pueden interactuar a través de incomplementary base que se aparea con otras transcripciones del gene, que representa un riesgo de seguridad con este enfoque. Mejorado el diseño de las secuencias de RNAi, incluyendo uso de miRNAs no canónico, como mirtrons, que eludir el complejo microprocesador y amplios estudios de seguridad y tolerabilidad a largo plazo son esenciales antes de traducir esta estrategia en una caja de seguridad y terapia eficaz. 26 , 27 , 28

El método descrito aquí fue desarrollado originalmente para la sobreexpresión de miRNA, pero también puede ser utilizada para terapia de inhibición de miRNA usando antagomirs.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores no declaran conflicto de intereses. Agradecemos a laboratorios SignaGen (Rockvile, MD, USA) para la producción de virus AAV9. Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación intramuros del NINDS, NIH. Philip R. Lee fue apoyado por fondos de la división de investigación intramuros de NICHD. Carlo Rinaldi fue apoyado por una beca de la Association Française contre les Myopathies (AFM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306 Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 Purification of miRNA and total RNA
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit ThermoFisher Scientific 4366596 A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs
snoRNA202 Primer ThermoFisher Scientific 1232 Taqman miRNA control assay in mouse
miR-298 Primer ThermoFisher Scientific 2190 Taqman miRNA-298 assay in mouse
Anti-GFP antibody abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade
Red ink pad Dovecraft Essentials
Blue ink pad Dovecraft Essentials
AAV9-GFP vector SignaGen Laboratories SL100840 Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification
mmu-miR-298-5p ThermoFisher Scientific MC12525 mirVana miRNA mimic
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP Vector Biosystems Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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