복부 색소 침착 정량화

Genetics

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Summary

이 작품은 디지털 이미지 분석을 사용하여 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 표현형 획득과 데이터 분석 사이의 절차를 합리화하고 표본 장착, 이미지 수집, 픽셀 값 추출 및 특성 측정을 포함합니다.

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Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

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Abstract

색소 침착은 형태 적으로 간단하지만 매우 가변적 인 특성으로 종종 적응의 중요성이 있습니다. 그것은 형태 학적 표현형의 발달과 진화를 이해하기위한 모델로서 광범위하게 사용되어왔다. Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 은 특히 ​​유용하여 연구원은 형태학의 내부 및 내부 특이성 변이의 기초가되는 좌위를 확인할 수있었습니다. 그러나, D. melanogaster 복부 색소 침착은 색소 침착 데이터에 적용 할 수있는 통계 분석의 형태를 제한하는 정량적 인 것이 아니라 정량적으로 정량적으로 분석되어왔다. 이 작품은 성인 D. melanogaster 의 복부 색소 침착 패턴의 다양한 측면을 정량화 할 수있는 새로운 방법론을 설명 합니다. 이 프로토콜에는 표본 장착, 이미지 캡처, 데이터 추출 및 분석이 포함됩니다. 이미지 캡처 및 분석 기능 매크로에 사용되는 모든 소프트웨어오픈 소스 이미지 분석을 위해 작성되었습니다. 이 방법의 장점은 다른 이미징 시스템에서 재현성이 높은 방법론을 사용하여 색소 특성을 정확하게 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 기법은 성인 D. melanogaster 의 tergal pigmentation 패턴의 변이를 측정하는 데 사용 되었지만 ,이 방법은 무수히 많은 유기체에서 색소 침착 패턴에 유연하고 광범위하게 적용될 수 있습니다.

Introduction

색소 침착은 종, 개체군, 개개인간에, 심지어 개체 발생 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 동안 개인 내에서도 거대한 표현형의 변화를 보여줍니다. 다양한 동물에서 색소 침착에 대한 수많은 연구가 있지만 염색은 Drosophila melanogaster에서 가장 잘 연구되었을 것입니다. 분자 유전학의 모든 힘이 색소 침착을 조절하는 발달 및 생리적 메커니즘을 밝혀 내고 이러한 메커니즘이 어떻게 발전하는지 1 , 6 . D. melanogaster 7 8 에서 색소의 생화학 적 합성을 조절하는 유전자와 시간 및 공간적 di를 조절하는 유전자에 대해 많이 알려져있다 .이 생합성에 대한 스트라이핑 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . 또한, 유전지도 작성은 D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 에서 착색의 내부 및 내부 특이적인 차이점을 나타내는 유전자 좌의 위치를 ​​확인했다. 행동 18 , 19 , 면역 19 , 20 과 같은 착색과 pleiotropic 특성 사이의 관계도 착색 패턴 15 , 21 , 22 의 적응 의미를 가지고 탐험되었습니다. 이와 같이, D. melanogaster의 색소 침착 은 강력하면서도 단순한 m복잡한 표현형의 개발과 진화를위한 odel.

성인에서 색소 침착 D. melanogaster 는 특히 날개와 지느러미 흉부와 복부에서 몸 전체에 뚜렷한 무늬가 특징입니다. 그러나 대부분의 연구 관심을받은 것은 배 쪽 복부에있는 각 큐티 큘라 플레이트 (tergite)의 착색입니다. 유전 적 17 , 23 및 환경 24 , 25 요인 때문에이 색소 침착 ( 그림 1A- F )에 상당한 차이가 있습니다. 복강 각질의 큐티클은 전방 및 후방 발달 구획으로 구성되며 ( 그림 1G ), 각 구별은 색소 침착 및 장식에 따라 더 세분화 될 수 있습니다. 전방 구획에는 6 개의 큐티클유형 (a1-a6)을 포함하고 후방 구획은 세 가지 (p1-p3)를 포함한다 ( 그림 1G ). 이 중 p1, p2 및 a1 표피는 일반적으로 미연 신 (un-stretched abdomens)의 표층 아래에 ​​접혀있어 숨겨져 있습니다. 확실하게 눈에 보이는 표피는 큐티클 유형 a4 (중간 정도의 털이있는 털이)와 a5 (털이 큰 털이있는)로 구성되어 있고 밴드의 뒷부분 가장자리로 구성된 무거운 색소의 밴드를 특징으로합니다. ( 그림 1G )보다 강하게 색소 침착되었다. 이 밴드의 앞부분은 가볍게 착색 된 털이 많은 큐티클의 영역으로, 뒤쪽으로 (a3) ​​딱딱하고 앞쪽으로는 (a2)가 없습니다. 파리 사이의 색소 침착의 변이는 색소의 강도와 색소의 폭 모두에서 관찰된다. 일반적으로, 변이는 대부분의 후부 분절 (복부 분절 5, 6 및 7)에서 가장 크며, 더 많은 전 안부 분절에서 더 낮다 (복부3과 4 장) 24 . 또한, D. melanogaster 색소 침착에 성적 이형성이 있으며, 남성은 일반적으로 5 번째 및 6 번째 복부 tergites를 완전히 색칠합니다 ( 그림 4C ).

D. melanogaster 의 복부 색소 침착에 대한 대부분의 연구에서, 색소 침착은 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 의 척도에서 정 성적으로 27 , 28 , 29 또는 semi-quantitatively로 측정 된 패턴을 가진 범주 형 또는 서수 형으로 처리되었습니다. , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . 이러한 방법은 필연적으로 정밀도 부족으로 고통 받고 있으며 색소 침착의 주관적인 평가에 의존하기 때문에 여러 연구에서 데이터를 비교하기가 어렵습니다. 몇몇 저자들은 착색 38,39의 공간적 차원, 특정 큐티클 유형 23 , 25 , 39 , 40 의 착색 강도 또는 복부 용제 전체의 착색 강도 평균을 41 , 42 , 43 로 계량화했습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 정량화 방법은 복부 색소 침착의 강도와 공간 분포를 동시에 측정하지 않으므로 색소 침착이 abd에서 어떻게 변하는 지에 대한 뉘앙스를 포착하지 않습니다ominal tergite. 또한, 이러한 정량화 방법들 (38 , 41 , 42 , 43) 중 몇 가지는 복부 표피의 해부 및 장착을 필요로한다. 이것은 시간이 많이 걸리고 샘플을 파괴하므로 추가적인 형태 학적 분석에 사용할 수 없습니다. 복부 색소 침착의 발달과 진화에 대한 이해가 심화됨에 따라 공간 분포와 색소 침착을 신속하고 정확하게 측정 할 수있는보다 정교한 도구가 필요합니다.

이 방법의 전반적인 목표는 D. melanogaster 에서 복부 색소 침착에 대한 복제 가능하고 정확한 측정을 얻기 위해 디지털 이미지 분석을 이용하는 입니다. 이 방법론은 세 단계로 구성됩니다. 첫째, 성충은 비파괴 적으로 장착되고 등 쪽 복부의 디지털 이미지가 촬영됩니다. 둘째, ImageJ 매크로를 사용하여 사용자는 a2 큐티클의 앞쪽에서 세 번째 및 네 번째 복부 세그먼트의 a5 큐티클 (녹색 상자, 그림 1G )의 후방까지 연장되는 픽셀의 앞 / 뒤쪽 스트립을 정의합니다. 이 스트립의 너비에 걸친 평균 픽셀 값은 장축을 따라 추출되어 테르가 트의 전방에서 후방으로 변화함에 따라 색소의 공간 분포와 강도를 포착하는 프로파일을 생성합니다. 셋째, R 스크립트는 큐빅 스플라인을 사용하여 수학적으로 착색 프로파일을 설명하는 데 사용됩니다. 그런 다음 R 스크립트는 스플라인과 첫 번째 및 두 번째 미분을 사용하여 a2-a5 표피의 너비, 안료 밴드의 너비 및 염색의 최대 및 최소 레벨을 추출합니다. 따라서이 방법은 복부 색소 침착의 깊이와 공간 특성을 정량화합니다.

이 방법론은 세 번째 및 네 번째 복부 tergites의 착색을 정량화,이들은 이전의 많은 연구 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42의 초점이었으며, 오직 더 많은 후부 표적과 배타적으로 또는 조합으로 사용되었다. 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 tergites보다 덜 변하지 만, 세 번째 및 네 번째 tergites은 남성에서 완전히 색칠되지 않습니다, 그래서이 프로토콜은 남성과 여성 모두에 적용 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된대로, 프로토콜은 여성의 다섯 번째와 여섯 번째 복부 tergites의 색소를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 염색 프로파일의 특성을 추출하는 데 사용되는 스크립트의 사소한 수정을 통해 다양한 방법으로 색소 침착의 변이를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다유기체.

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Protocol

1. 시편 설치

참고 : 이미징하기 전에 죽은 파리를 물에 70 % 에탄올에 보관하십시오.

  1. 60 mm x 15 mm 페트리 접시에 끓는 물에 용해 된 1.25 % 한천 10 ML을 부어 그것을 설정할 수 있습니다.
  2. 해부 현미경, 젤의 표면에 ~ 20mm 옹이, 2mm 폭, 1mm 깊이 홈을 만들기 위해 미세 포인트 포셉 한 켤레를 사용합니다. 미세 포셉을 사용하여 성인 파리의 복부 측면을 그루브에 삽입하고 파리의 등쪽면을 젤 위에 돌출시킵니다.
    참고 : 젤이 느슨하면 시편을 손상시키지 않고 쉽게 위치를 변경할 수 있습니다. 더럽고 부서지며 시간이 지나면 사용할 수 없지만 동일한 홈을 여러 표본에 사용할 수 있습니다. 그런 다음 사용자는 동일한 젤에 다른 홈을 만들 수 있습니다. 각 접시는 200 파리를 이미지하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 물에서 70 % 에탄올로 표본을 완전히 덮어 왁스 같은 큐티클의 빛 반사를 줄이고 날개 손상을 방지하십시오.시험편 조작.

2. 현미경 설정

참고 : 이미지 수집 컨트롤 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결된 해부 범위, 전송 된 광원, 디지털 카메라 및 거위 목처럼 찬 광원을 사용하여 이미지를 수집합니다. 소프트웨어 지침은 ImageJ 45 를 통합 한 오픈 소스 소프트웨어 인 Micro-Manager v1.4.20 44 에만 해당됩니다.

  1. 현미경, 디지털 카메라, 이중 구즈넥 차가운 광원 및 컴퓨터를 켭니다.
  2. 이미지 캡처 소프트웨어를 실행하여 Micro-Manager 창과 ImageJ 창을 엽니 다. ImageJ 창에서 "이미지"> "유형"> "8 비트"를 클릭하여 모든 이미지를 8 비트로 설정하십시오. Micro-Manager 창에서 "라이브"를 클릭하면 카메라에서 실시간 미리보기를 보여주는 "스냅 / 라이브"창이 열립니다.
    1. "스냅 / 라이브"창의 크기를 최대화하십시오세서리. Micro-Manager 창의 "Contrast"탭에서 풀다운 "Display mode"메뉴에서 "Grayscale"을 선택하십시오.
  3. 차가운 광원을 최대 강도로 켜고 각 거위 목의 끝을 스테이지에서 약 120mm (왼쪽과 오른쪽에 각각 하나씩) 위치시킵니다.
    참고 : 파리 복부 주위에 반사광이 울릴 수도 있지만 사용자는 환형 조명기를 사용할 수도 있습니다.
  4. 수동으로 현미경 배율을 60X로 설정하여 시야에서 스테이지의 지름이 약 3mm 인 영역을 캡처합니다.
  5. 스테이지에 2mm 무대 마이크로 미터를 놓습니다 (필요한 경우 배경을 흰색으로 전환). 실시간 미리보기를 보면서 무대 마이크로 미터에 초점을 맞추고 "노출"상자에 노출 시간을 ms 단위로 입력하여 마이크로 관리자 창에서 노출을 조정하십시오.
  6. 공간적으로 카메라를 교정하려면 t에서 "직선"도구를 선택하십시오.그는 ImageJ 창을 열고 스테이지 마이크로 미터의 길이를 그립니다. ImageJ 윈도우에서 "Analyze"> "Set Scale"을 클릭하여 "Set Scale"창을 열고 "Known distance"상자에 μm로 마이크로 미터의 길이를 입력 한 다음 "Unit of length" 상자.
    1. "Set Scale"창이 "pixels / μm"단위로 스케일을 표시하는지 확인하십시오. 눈금을 적어두고 "확인"을 클릭하십시오.
  7. "Snap / Live"창에서 "Stop"을 클릭 한 다음 "Snap"을 클릭하여 스테이지 마이크로 미터의 이미지를 캡처하십시오.
  8. 필요한 경우 이미지를 다시 공간적으로 조정할 수 있도록 이미지를 8 비트 회색조 TIFF로 저장하십시오. ImageJ 윈도우에서 "파일"> "다른 이름으로 저장"> "Tiff ..."를 클릭하십시오. 파일 브라우저에서 파일을 저장할 위치를 지정하고 파일 이름을 지정하고 "저장"을 클릭하십시오.
  9. 무대를 검은 색과 장소로 전환하십시오.무대에서 한천 (단계 1.1-1.2)에 탑재 비행을 들고 페 트리 접시.
  10. 현미경을 통해보고 염소 패턴을 가장 잘 볼 수 있도록 등쪽 중간 선이 곧게 펴지도록 파리를 배치하십시오. 날개와 부속 장치를 움직여 복부의 시야가 방해받지 않도록하십시오. 색소 표피 (a2-a5)가 보이지 않으면 복부를 옆으로 꽉 짜내십시오 (물의 70 % 에탄올에 저장된 파리의 복부가 팽창하기 때문에 일반적으로 필요하지 않습니다).
    참고 : 플라이를 배치 할 때 사용자는 더 낮은 배율 (20X)을 사용해야 할 수도 있습니다. 진행하기 전에 배율을 60X로 돌려 주어야합니다.
  11. 파리의 등 복부에 수동으로 초점을 맞 춥니 다. 수동으로 광원의 팁을 조정하여 등 복부의 그림자와 반사를 최소화합니다.
  12. 컴퓨터 화면에서 실시간 미리보기를보고 Micro-Manager 창의 "대비"탭에서 픽셀 값 막대 그래프를 사용하는 동안,단계 2.4에서 설명한대로 노출을 조정하여 미리보기 이미지의 픽셀 값 범위를 최대화하십시오.
  13. 파리와 페트리 접시를 제거하고 플라이와 같은 위치에서 시야를 중심으로 전압계에 연결된 LED (430-660 nm의 스펙트럼 출력)로 교체하십시오. LED와 전압계를 광도계로 사용하고 LED에 닿는 빛에 의해 생성 된 전압을 기록하십시오 (~ 125 mV).
    참고 : LED 및 전압계는 단일 실험 내에서 여러 이미징 세션에서 조명 수준이 일정하도록 보장하는 데 사용됩니다.
  14. 실험 기간 동안 광원의 위치 나 강도, 현미경의 배율 또는 카메라의 노출을 더 이상 변경하지 마십시오.

3. 시편 이미징

  1. 한천 (단계 1.1-1.3)에 검은 색 현미경 stage.Ajust에 장착 된 비행 자세를 유지 페트리 접시를 놓으십시오 제 3과 fourt복부 세그먼트가 보이고 지느러미 정중선은 단계 2.9에서 설명한대로 곧게 펴집니다. 진행하기 전에 배율이 60 배인지 확인하십시오.
  2. 수동으로 세 번째와 네 번째 등 쪽 복부 tergites 초점에 현미경 초점을 맞 춥니 다. 단계 2.6에서 설명한대로 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 이미지를 8 비트 회색조 TIFF로 얻습니다.
    참고 : 이미지를 컬러로 캡처 한 다음 분석을 위해 그레이 스케일로 변환 할 수 있습니다.
  3. 단계 2.7에서 설명한대로 이미지를 "SESH000_sampleID.tiff"로 저장하십시오.
    참고 : [SESH]는 상수이고, [000]은 세션 번호이며 변수이지만 3 자릿수 여야하며 [sampleID]는 사용자가 원하는 모든 것이지만 추가 밑줄 (_) 문자를 포함 할 수는 없으며 일정한 길이 여야합니다. [표본 ID]는 색소 침착 데이터 ( 예 : 온도 또는 혈통) 분석에 사용 된 요소에 대한 세부 정보를 포함해야하며 특유한 비 알파벳하이픈 (-)과 같은 대문자. 이렇게하면 표준 통계 소프트웨어를 사용하여 [sampleID]에서 이러한 요소를 쉽게 파싱 할 수 있습니다.
  4. 무대에서 페트리 접시를 제거하고 다음 표본과 파리를 교체하십시오. 조명 수준, 배율 또는 노출을 추가 조정하지 않고 모든 표본이 이미 찍힐 때까지 3.1-3.3 단계를 반복합니다.

4. 여러 세션에서 이미징

  1. 이미지를 여러 세션으로 가져와야하는 경우 세션 전반에 걸쳐 광도, 노출 및 배율을 유지하십시오. 각 세션이 시작될 때 카메라의 공간 보정 (2.4 단계)과 스테이지의 광도 (LED / 전압계로 측정, 단계 2.12)를 확인하십시오.
  2. 필요한 경우, 이미지를 공간적으로 다시 보정하는 기능을 보장하기 위해 스테이지 마이크로 미터의 이미지를 캡처하고 저장합니다 (2.5-2.7 단계).
  3. 적어도 15 개의 대조 표본을 사용하고 각 세션에서 무작위로 이미지를 재사용하십시오w를 사용하여 세션 효과를 감지하고 제거합니다. 세션 사이의 중복 대조 표본이 동일한 [표본 ID]이지만 [SESH000]이 서로 다른지 확인하십시오.
    참고 : 대조 표본은 수집되어 저장되며 실험 시료와 동일하게 장착되지만 반복적으로 촬영됩니다. 정확한 대조 표본 수는 사용자의 실험 설정에 따라 달라집니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.

5. 이미지 분석

참고 : 이미지 분석은 ImageJ 45 에서 수행되며 "Pigmentation.ijm 측정"보조 매크로를 보조 파일로 사용합니다.

  1. 분석 할 모든 이미지를 같은 폴더에 놓습니다.
  2. ImageJ를 시작하고 "Plugins"> "Macro"> "Run"을 클릭하고 파일 브라우저에서 "Pigmentation.ijm 측정"을 선택한 다음 "열다."
    참고 : 모든 후속 단계는 매크로 내에 있습니다. 각 단계는 개별 매크로 명령입니다.
  3. "필요한 이미지를 저장할 폴더 선택"이라는 "작업 필요"대화 상자가 열립니다. "확인"을 클릭하고 파일 브라우저를 사용하여 이미지가 들어있는 폴더를 선택한 다음 "선택"을 클릭하십시오.
  4. "필요한 작업을 저장할 폴더를 선택하십시오."라는 "작업 필요"대화 상자가 열립니다. "OK"를 클릭하고 파일 브라우저를 사용하여 염색 프로파일을 저장할 폴더를 선택하십시오. "선택"을 클릭하십시오.
  5. 대화 상자가 열리면서 "샘플 ID에 몇 개의 문자가 있습니까?"라고 묻습니다. 데이터 입력 상자에 3.3에서 지정한대로 [SampleID]의 문자 수를 입력하고 "확인"을 클릭하십시오.
  6. "ROI는 얼마나 넓습니까?"라는 질문을하는 대화 상자가 열립니다. 데이터 입력 상자에 전방 십자형 커서의 픽셀 너비를 입력합니다.( 그림 1G , 그림 2A2A '의 녹색 직사각형)을 읽어야합니다. "확인"을 클릭하십시오. 기본값은 20 픽셀입니다.
    참고 : 염색 프로파일은 머리카락과 털로 인한 노이즈를 줄이기 위해 줄보다는 큐티클 스트립을 통해 읽습니다. 이 스트립의 너비는 이미지의 해상도에 따라 다르지만 복부 폭의 1 / 20 ~ 1 픽셀이어야합니다.
  7. 매크로가 첫 번째 파리의 이미지를 열고 대화 상자에 현재 파리를 측정할지 ( "예"클릭), 다음 파리로 이동 ( "아니오"클릭) 또는 매크로 ( "취소"를 클릭하십시오).
  8. "ANTERIOR에서 POSTERIOR로 지느러미 복부의 정중선을 정의하십시오."라는 대화 상자가 열립니다. "직선"도구가 이미 선택됩니다. 앞쪽에서 뒤쪽까지 선 그리기등 쪽 복부의 정중선을 정의한다. "확인"을 클릭하십시오. 그림 2A2A ', 황색 선을 참조하십시오.
    참고 : 이것은 이미지의 방향을 변경하여 등 쪽 정중선이 화면에서 가로로 놓이고 왼쪽이 앞쪽에 오도록하여 후속 단계를 더 쉽게 만듭니다.
  9. "Tergite 4의 POSTERIOR 가장자리를 안료 밴드 바로 뒤에 정의하십시오."라는 대화 상자가 열립니다. "직선"도구가 이미 선택됩니다. 구형 중간 선 가장자리에서 오른쪽 가장자리로 선을 그어 선의 중심 (흰색 사각형으로 표시)이 안료 밴드 (표피 a5)의 후부 가장자리 바로 뒤쪽에 위치하도록합니다. "확인"을 클릭하십시오. 그림 2A2A ', 마젠타 색 선을 참조하십시오.
    참고 : R 스크립트는 색소 프로파일에서 안료 밴드의 후방 가장자리를 자동으로 감지합니다.
  10. 대화 상자상자가 열리 며 "착색 된 큐티클 (a2)의 앞쪽 가장자리에 Tergite 4의 원형 가장자리를 정의하십시오." "직선"도구가 이미 선택됩니다. 앞쪽 중간 선 가장자리에서 오른쪽 가장자리로 선을 그어 선의 중심 (흰색 사각형으로 표시)이 색소 표피 (표피 a2)의 앞쪽 가장자리에 놓 이도록합니다. "확인"을 클릭하십시오. 그림 2A2A ' , 시안 색 선을 참조하십시오.
    참고 : R 스크립트는이 점을 표백제의 색소 표피의 앞쪽 가장자리로 정의합니다. 이미지에서 색소 침착 프로파일을 읽는 관심 영역 (ROI)이 매크로에 표시됩니다 (녹색 장방형, 그림 2A2A ', 그림 2B2B '에서 확대). 또한 매크로는 ROI에 대한 색소 침착 프로파일을 보여주는 두 번째 창을 엽니 다 ( Figur e 2C 및 2C '), 여기에서 x 축은 프로파일의 후방 모서리로부터의 픽셀 수로 표현되는 위치이고, y 축은 각 위치의 평균 픽셀 값입니다.
  11. 매크로에 의해 열리는 착색 프로파일의 플롯을 봅니다. 필요한 경우 프로필 창에서 "라이브"를 클릭하여 색소 침착 프로파일에 영향을 줄 수있는 구조 ( 예 : 털)가 없도록 ROI 위치를 조정합니다. 프로필이 만족 스러우면 "확인"을 클릭하십시오.
  12. Tergite 3에 대해 5.8-5.11 단계를 반복하십시오.
    참고 : 매크로는 색소 프로파일을 두 개의 CSV 파일 (각각 "SESH000_samplename_TX_profile.csv")로 내 보냅니다. 여기서 [SESH000_samplename]은 이미지 이름이고 [TX]는 세 번째 및 네 번째 표준의 경우 T3 또는 T4입니다.
  13. 매크로는 다음 이미지를 엽니 다. 모든 이미지가 분석 될 때까지 5.7-5.13 단계를 반복하십시오.
jove_title "> 6. 데이터 전처리, 분석 및 세션 수정

참고 : 모든 데이터 분석은 R 47 에서 수행되며 제공된 "Pigmentation.R"분석 스크립트를 사용합니다. 아래에서 "L ..."은 분석의 각 부분에 대해 실행할 스크립트의 줄을 나타냅니다. 분석 수행 방법에 대한 추가 정보는 보충 정보를 참조하십시오.

  1. R 스크립트를 편집하여 작업 디렉토리 (L6)를 설정하고 .csv 프로파일이 들어있는 폴더 (L11)에 대한 파일 경로를 정의하십시오.
  2. L13-15를 실행하여 프로필 폴더에 저장된 착색 프로필 목록을 생성하십시오.
  3. 프로파일을 단일 데이터 프레임으로 읽으려면 "reader"및 "addPrimaryKey"기능 (L17-41)을로드하고 실행하십시오.
  4. L43에서 스크립트를 편집하여 2.5 단계에서 결정한대로 μm / 픽셀 단위로 이미지의 공간 보정을 지정합니다.
  5. "adjus"를로드하고 실행하십시오.그림 2C2C '의 프로파일 위치를 ROI의 픽셀 - 투 - 후 - 에지 (ROI)에서 ROI의 μm 전치로 변환하는 "tments"기능 (L46-58)과 (0 = 검정, 255 = 흰색)에서 색소 값 (0 = 색소 없음, 255 = 최대 색소)까지의 프로파일 값 (y 축, 그림 2C2C '
  6. "spline.der.er"함수 (L60-71)를로드하고 실행하여 착색 프로파일과 그 첫 번째 및 두 번째 미분 ( 그림 2D -2F2D '- 2F ')의 3 차 스플라인을 생성합니다.
  7. 먼저 "coord"와 "assmbly.coord"함수 (L74-163)를 실행하여 안료 밴드의 후방 (T 3 )과 전방 (T 2 ) 모서리의 위치를 ​​추출합니다 ( 그림 2D2D ')와 a2 큐티클의 후단 모서리 (T1, 도 2D2D ')를 추출한 다음 T 3 및 T 1 에서 각각 취한 최대 (P max ) 및 최소 (P min ) 색소 값을 추출한다.
    참고 : a2 큐티클의 앞쪽 가장자리는 이미 5.9 단계에서 정의되었습니다.
  8. 옵션 : "chek"기능 (L165-175)을로드하고 실행하여 "coord"기능이 무작위로 선택된 착색 프로파일에 대해 T 1-3 위치 를 정확히 식별하는지 확인하십시오.
  9. "Session", "Sample", "Tergite", "id"(Sample 및 Tergite의 연결), "P max "라는 제목의 데이터 테이블을 생성하려면 인덱스 및 메트릭 함수 (L178-193) "P min ", "W band "(안료 밴드 폭 = T3 - T2) 및 "W tergite "(색소 c의 폭uticles a2-a5, = T3).
  10. "수정"기능 (L196-234)을로드하고 실행하여 세션 효과로 인해 발생하는 불필요한 요소에 대해 P max 와 P min 을 수정하는 데이터 테이블을 생성하십시오. 일시적으로 인접한 세션에서 다시 촬영 한 대조군 표본의 P max 또는 P min 의 평균 증가 (또는 감소)를 사용합니다.

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Representative Results

프로토콜은 복부 색소 침착에 온도를 키우는 효과를 탐색하는 데 사용되었습니다. 이전 연구에 의하면 발달 온도의 증가는 D. melanogaster 30 , 32를 포함 하여 여러 종의 초파리 에서 복부 색소 침착의 확산을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 특히, 복부 tergites 3과 4, 착색의 범위 (안료 밴드의 폭) 17 ° C에서 25 ° C로 감소하고 25 ° C에서 28 ° C 24,36 동일하게 유지됩니다. 이 연구는 1-10 등급 (0 : 안료 밴드 없음, tergite 완전 황색, 5 : 색소 밴드는 tergite의 50 %, 10 : tergite는 완전히 어둡다)의 색소 침착 정도를 기록했다. 정량적 방법론이 이러한 표현형 소성을 포착 할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 착색은 th17 번 (일곱 개의 파리), 25 ° C (아홉 개의 파리), 그리고 28 ° C (아홉 개의 파리)에서 알에서 성충으로 자란 표정 상 야생형 여성 파리의 등화선의 세 번째 및 네 번째 복부 tergites. 세션 효과에 의해 도입 된 불필요한 요인을 제거 할 때 보정 절차의 효과를 확인하기 위해 동일한 파리의 색소 침착을 다시 촬영하고 1, 2, 4 및 8 일 후에 다시 측정했습니다. 그러나 조명 조건과 세션 간 노출은 수정 절차에 대한 세션 효과가 제거되도록 의도적으로 변경되었습니다. 이미지는 Dryad 디지털 저장소에 게시되었습니다.

첫 번째 질문은 세션에서 색소 침착 측정법의 체계적인 차이가 있는지 여부입니다. 이것은 R48lme4 패키지를 사용하여 혼합 모델에 적합하게 조사되었다. M ijk = S i + A j +S 는 세션 (무작위 효과), A 는 측정되는 복부 tergite (무작위 효과), ε 은 다음과 같이 나타낼 수 있습니다. ε ijkM ij = A j + ε ij = P max 및 P min 잔여 오류 (아래 첨자는 변수 내의 레벨 임). 로그 우도 비 (log-likelihood ratio) 테스트를 사용하여 세션을 임의의 요소로 포함하는 것이 적합성을 크게 개선했는지 여부를 테스트했습니다. 그랬다 ( 표 1 ). 예상대로 REML 48 을 통해 생성 된 분산 구성 요소를 조사한 결과 세션 효과로 인한 변동은 P max 와 P min 의 총 분산의 67 %와 70 %를 차지하는 것으로 나타났습니다 ( 표 1 ).

15 개의 무작위로 선발 된 대조 표적 (세 번째 또는 네 번째, 파리에서17 ° C, 25 ° C 또는 28 ° C에서 적색)을 선택하고 평균 P maxP min의 변화를 사용하여 세션을 통해 나머지 표적의 색소 침착을 교정했습니다. 보정 된 색소 침착도 측정에 대한 분석을 반복하면 세션 효과가 제거되고 ( 표 1 ) 세션 효과로 인한 전체 분산의 비율이 0으로 줄어 듭니다. 잔여 오차는 추정치이며 세션 효과가 제거 된 후의 측정 오차이며 P max 와 P min 각각 22 %와 27 %이다 ( 표 1 )

다음으로, 보정 된 데이터를 사용하여 착색 및 크기의 상이한 측면에 대한 온도의 영향을 검출 할 수 있는지를 결정 하였다. 혼합 모델 M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm 가 데이터에 맞추어졌다. 여기서 T D 는 tergite (세 번째 또는 네 번째), X 는 개별 파리 (random factor)입니다. 색소 침착과 온도 사이의 관계가 선형 24 , 36 이 아니기 때문에 T 는 범주 적 요인으로 취급되었습니다. 착색의 최대 및 최소 수준 ( Pmax Pmin) 및 색소 밴드 및 표석 ( W 밴드Wtergite )의 을 테스트 하였다. 안료 밴드 ( R band = W band / W tergite )의 상대 폭에 대한 온도의 영향도 시험 하였다. 데이터는 안료 밴드의 절대 (W 밴드 ) 및 상대 ( R 밴드 ) 폭이 17 ° C에서 25 ° C로 감소한 것을 보여 주었으며 (Tukey 사후 테스트, 모두 P <0.05), 25 ° C ~ 28 ° C (Tukey 사후 테스트, 표 2 , 그림 3A3B ) 이는 이전의 연구 24 , 36 과 일치한다. 동일한 패턴이 색소 형성의 최대 및 최소 수준, Pmax 및 Pmin ( 표 2 , 도 3C )에 대해 관찰되었다. 색소 침착 수준에 대한 온도의 영향은 이전에 기술되지 않았지만, 네 번째 복부 tergite의 색소 형성의 최소 수준은 야생형 개체군에서 안료 밴드의 폭과 양의 상관 관계가 있음을 보여주는 다른 연구와 일치하는 것으로 처음에는 나타남 39 . 그러나이 연구의 데이터는 PmaxW 밴드 사이에 양의 관계를 나타내지 만 Pmin과 W 밴드 사이에 음의 관계를 나타냅니다( 표 3 ). 현재 연구와 이전 연구의 차이점은 복부 색소 침착의 수준과 정도 사이의 상관 관계에 유전 및 환경 요인이 어떻게 영향을 미치는지에 대한 차이를 반영 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고이 대표 결과는이 프로토콜이 질적 방법론을 통해 이전에 확립 된 색소 침착 패턴을 식별 할 수있을뿐만 아니라 정 성적 방법론으로는 검출 할 수없는 새로운 것을 밝힐 수 있음을 보여줍니다.

tergite의 폭에 대한 온도의 영향은 더 복잡했다. D. melanogaster 에서 몸과 기관의 크기는 온도 49 에서 비선형 적으로 감소합니다. 이전의 연구에 따르면 제 5 복부 태거의 폭은 16.5 ° C에서 25 ° C로 10 % 감소하고 25 ° C에서 29 ° C 50 °까지 4 % 감소합니다. 폭의 유의하지 않은 감소가 있었지만제 4 복부 tergite는 17 ° C에서 25 ° C까지, 제 3 및 제 4 복부 tergites 모두 폭이 25 ° C에서 28 ° C로 증가했습니다 ( 표 2 , 그림 3D ). 복부 tergites의 너비가 본질적으로 사용자 (프로토콜의 단계 5.9-5.10)에 의해 정의되기 때문에, 현재 연구와 이전 연구 사이의 불일치는 R 스크립트가 색소 프로파일에서 Werger 를 추출하는 방식 때문이 아닐 수 있습니다. 오히려 그것은 복부 부분이 측정되는 방식, 파리의 유전형 및 측정되는 복부 tergite의 정확한 양상의 차이를 반영 할 수 있습니다.

다음 질문은 방법론이 기존의 색소 평가를 사용하여 수집 된 데이터와 비교 가능한 데이터를 생성 할 수 있는지 여부입니다. 이 방법들은 일반적으로 관찰자에게 각 플라이를 주관적으로 지느러미 중 하나에 할당하도록 요청합니다pigmentation 15 , 30 , 32 , 33 , 34 의 정도에 따라 phenotypic 클래스의 숫자 따라서 따라서 안료 밴드의 너비를 평가하는 관찰자의 능력에 의존합니다. 이 객관적 방법이 주관적 방법과 얼마나 잘 비교해보기 위해 다섯 명의 관찰자에게 네 번째 복강암의 색소 폭의 폭을 기준으로 45 개의 여성 복부 이미지를 순위 지정하도록 요청 받았다. 이 방법론을 사용하여 측정 한 관찰자의 평균 순위와 W 밴드를 기준으로 한 순위를 비교했습니다. 주관적 및 객관적 순위 ( Supplementary Information.pdf의 보충 자료 1 , Spearmen 's = 0.7342, P <0.0001) 간에는 강한 상관 관계가있었습니다.

또 다른 질문 제기ImageJ 의 선형 측정 도구를 사용하여 안료 밴드의 너비를 손으로 (시각적 인 방법으로) 측정하는 것과 비교하여 색소 침착 스플라인에서 W 밴드 를 추출하는 방법이 무엇이었습니다. 다시, 두 가지 방법론을 사용하여 수집 된 데이터 간에는 강한 상관 관계가 발견되었다 ( 보충 그림 2 , 보충 정보 .pdf, OLS, r 2 = 0.49 , P <0.0001). 계산 방법이 안료 밴드를 일관되게 "시각적"방법보다 좁은 것으로 측정했지만, 회귀 계수는 1과 크게 다르지 않았습니다 ( P> 0.05).

마지막으로 제기 된 질문은이 방법이 다른 상황에서 복부 색소 침착을 측정하는 데 사용될 수 있는지 여부입니다. 이 방법론은 f max , P min , W band 및 W tergite 를 추출 할 수있다.여성에서 제 5 및 제 6 복부 tergites 및 남성에서 세 번째 및 네 번째 복부 tergites ( 그림 4 ). 또한, 방법론은 흑체 ( e 1 )에 대한 파리 돌연변이 체에서 P max 및 P min 의 증가를 정량화하는데 사용될 수 있는데, 이는 체내의 큐티클 색소 침착 증가 및 안료 앞 큐티클의 특이한 증가를 나타낸다 밴드 (28) ( 도 4 ).

그림 1
그림 1 : D. melanogaster의 복부 색소 침착 ( A - F ) 세 가지 온도 (17 ° C, 25 ° C 및 28 ° C)에서 양육 된 두 가지 유전자형의 암컷 복부 색소 침착의 변이. A3과 A4는 3 번째와 4 번째 복부 전이 테스. ( G ) 지느러미 복부 용적 (torsite)은 전방 및 후방 구획을 포함하며, 이들 중 일부는 신장되지 않은 복부에서 확실하게 볼 수있다. 구획은 구별 된 큐티클 유형으로 더 세분됩니다 : a1 : 착색되지 않고 털이 없습니다. a2 : 엷은 색소와 털이있다. a3 : 옅은 색소, 털 및 보통 털; a4 : 짙은 색소, 털 및 보통 털; a5 : 짙은 색소, 털 및 큰 털; a6 : 착색되지 않은 털과 모발. p3 : 착색되지 않은 털과 모발. p2 : 착색되지 않고 털이 없다. 및 p1 : 유색 안료 및 모자이크 처리. 안료 밴드는 큐티클 a4와 a5로 구성됩니다. 색소 큐티클 (a2-a5, 녹색 상자) 만 분석에 사용됩니다. 스케일 바 = 200 μm (AF). 모든 이미지의 대비가 색소 침착 패턴을 강조하기 위해 조정되었으며 이미지는 실례입니다. 대표 결과를 생성하는 데 사용되는 조정되지 않은 이미지는 Dryad 디지털 저장소에 보관됩니다..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 복부 색소 침착을 정량화하기위한 이미지 및 데이터 분석. ( A - F )와 ( A - F )는 서로 다른 표본에 대한 것이며 분석이 다른 품질의 이미지를 다루는 방법을 보여줍니다. ( A ) 사용자는 먼저 복부의 중앙선 (황색 선), 표석의 앞쪽 가장자리 (시안 선) 및 안료 밴드 (마젠타 선)의 후부 가장자리 약간 뒤에있는 선을 정의합니다. ImageJ 매크로는 전방 및 후방 선의 중간 점 (흰색 파선)에서 선을 그어 그 선을 확대하여 ROI (검은 색 상자)를 확대하고 ( B )로 확대합니다. ( C ) ImageJ 매크로 다음 ex는 ROI의 전후 축을 따라 평균 픽셀 값을 추적합니다. 이 단계에서 프로파일은 후방에서 전방으로 읽혀집니다. ( D - E ) R 매크로는 평균 픽셀 값을 색소 값으로 변환하고, 착색 프로파일의 방향을 반전시키고, 입체 스플라인 ( S (x) ) ( D )으로 맞추고, 첫 번째 ) ) ( E )와 두 번째 ( S (x) ) 미분 값을 구합니다. 스크립트는 다음을 식별합니다. T 3 , 최대 색소 침착의 위치, 여기서 S (x) 는 0에서> 0으로 전환하고 스플라인의 후방에서 전방으로 이동합니다. T 2 , 착색의 감소가 가장 크고 S (x) 가 최대 인 위치; 및 t 1 , tergite 착색이 최소이고 S (x) 가> 0에서 <0으로 전이하는 위치, 전방으로 이동하는 fROM T 2 ,. 확실하게 보이는 tergite의 전방 (큐티클 a2의 전방)은 사용자에 의해 정의됩니다. (AF) S (x) 가 색소 밴드 앞쪽을 0으로 교차하지 않기 때문에 일차 미분 계수를 사용하여 T 1 을 찾을 수없는 경우, 스크립트는 T 1S (x) 가> T 2 에서 앞쪽으로 움직일 때 0에서 <0. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 여성의 복부 색소 침착의 여러 측면에 대한 온도의 영향 D. melanogaster . ( A ) 안료 밴드 폭 ( W 밴드 , F그림 1). ( B ) 표백석의 비율로서의 안료 밴드 ( R 밴드 ). ( C ) 최대 ( P 최대 , 상단 라인) 및 최소 ( P 최소 , 낮은 라인) 착색. ( D ) tergite의 폭 ( tergite ). 포인트는 선형 혼합 효과 모델에서 최소 제곱 평균입니다 (표 2). 오차 막대는 표준 오차를 나타내며 마커에 의해 가려 질 수 있습니다. 검은 선은 세 번째 복부 테르 타이 트입니다. 회색 선은 네 번째 복부 용암입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 세 번째와 네 번째 복부 tergites 사이의 착색의 차이. 이것은 ( A 에보니 1 명의 암컷, ( B ) 야생형 암컷, ( C ) 야생형 남성, 야생형 암컷의 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 tergites. ( D ) 최대 착색, P max . ( E) 최소 착색, P min . ( F ) 안료 밴드의 너비, W 밴드 . ( G ) 안료 밴드의 상대 너비, R 밴드 . 다른 문자가있는 막대는 크게 다릅니다 (Tukey HSD post-hoc 검정, P <0.05). 흑단 1을 제외하고 N = 6, N = 4 인 경우 N = 6. 스케일 막대 = ( A - C )의 경우 200 μm. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 모든 이미지의 대비가 색소 침착 패턴을 강조하기 위해 조정되었으며 이미지는 실례입니다. 제발 cli이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<td> 4.08 (78 %)
모델 비교 분산 구성 요소 (총 대비 %)
색소 형성 특성 모델 df 로그 가능성 방정식 (%) 방정식 (%) 방정식 (%)
P 최대 보정되지 않음 M ij = A i + ε ij -678.28 1.94 (14 %) 11.86 (86 %)
Mijk = Si + Aj + εijk 4 -457.95 440.66 *** 4.08 (26 %) 10.71 (67 %) 1.14 (7 %)
P 보정되지 않음 M ij = A i + ε ij -875.03 6.05 (9 %) 59.39 (91 %)
Mijk = Si + Aj + εijk 4 -664.58 420.91 *** 16.67 (22 %) 53.08 (70 %) 6.31 (8 %)
P 최대 보정 됨 M ij = A i + ε ij -445.05 1.15 (22 %)
Mijk = Si + Aj + εijk 4 -444.88 0.3378 4.08 (78 %) 0.01 (<1 %) 1.14 (22 %)
P 보정 됨 M ij = A i + ε ij -649.9 16.67 (73 %) 6.24 (27 %)
Mijk = Si + Aj + εijk 4 -649.9 0 16.67 (73 %) 0 6.31 (27 %)

표 1 : tergite 및 세션 효과의 선형 혼합 효과 모델. tergite 및 세션의 효과에 대한 선형 혼합 효과 모델REML을 통해 추정 된 분산 성분을 사용하여 5 회의 세션에서 재현 된 50 개의 표적의 복부 색소 침착 ( P maxP min ). 모델은 선형 혼합 효과 모델이었습니다. M : 안료 측정; A : 개별 tergite 측정; S : 세션; ε : 잔여 오류. 중요한 X²는 굵게 표시됩니다. * p <0.05. ** p <0.01. *** p <0.001.

특성 온도 Tergite 온도
x Tergite
P max F- 비율 8.14 55.59 6.6
0.002 <0.001
P F- 비율 4.41 66.11 6.36
0.026 <0.001 0.002
W 밴드 F- 비율 113.93 0.01 0.64
<0.001 0.931 0.531
목표 F- 비율 1.79 0.92 5.11
0.191 0.338 0.007
R 밴드 F- 비율 27.66 0.08 1.46
<0.001 0.782 0.23

표 2 : 온도 및 tergite 정체성의 영향. 온도와 tergite 정체성의 효과 50 세 tergites의 복부 색소 침착의 다른 측면에 대해 5 회의 세션에서 재 측정했다. 모델은 선형 혼합 효과 모델이었으며, 개별 플라이는 무작위 요인으로 포함되었습니다. P max : 최대 착색 (보정); P : 최소 착색 (보정); W 밴드 : 안료 밴드의 너비; W tergite : tergite의 너비; R 밴드 : 안료 밴드의 상대 너비. 유의 한 고정 인자는 굵게 표시 하였다 ( P < 0.05).

요격 W 밴드 온도 Tergite
17˚C 25˚C 제삼
P max β 234.35 0.069 0.063 -1.178 -0.588
에프 29.93 5. 97 54.82
<0.001 0.008 <0.001
P β 223.96 -0.137 3.931 -3.024 -1.54
에프 19.33 span = "2"> 9.66 62.02
<0.001 0.001 <0.001

표 3 : 색소 수준에 안료 밴드 폭, 온도 및 tergite 정체도의 효과. 안료 밴드 폭, 온도 및 tergite 정체도가 50 개 tergites의 색소 수준에 미치는 영향은 5 회의 세션에서 재 측정되었습니다. 모델은 선형 혼합 효과 모델이었으며, 개별 플라이는 무작위 요인으로 포함되었습니다. P max : 최대 착색 (보정); P : 최소 착색 (보정); W 밴드 : 안료 밴드의 너비; R 밴드 : 안료 밴드의 상대 너비.

보충 파일 1. Supplementaly 정보.y_Information.pdf "target ="_ blank ">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2. Pigmentation.R 스크립트의 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Supplemental File 3. Pigmentation.ijm의 측정 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

시뮬레이션 R 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 방법론은 다중 하류 분석에 적합한 양적 형태로 색소 침착 데이터를 정확하고 신속하며 반복적으로 수집 할 수있게합니다. 이 방법은 파리의 등선에서 복부 색소 침착에 대한 온도 효과에 대한 자료를 수집하는 데 사용되었습니다. 그러나 전향 적 유전학 연구에서 개인, 개체군 또는 종 사이의 색소의 차이를 결정하는 유전자를 식별하거나 특정 유전자의 색소 침착 패턴에 미치는 영향을 조사하기위한 역 유전 연구에 사용할 수 있습니다. 상기 한 바와 같이, D. melanogaster 색소 침착의 개발 및 진화를 연구 한 수많은 연구가 있었지만,이 방법론이 색소 침착 데이터를 정량적 형태로 포착하는 정밀도는보다 강력한 통계적 접근법을 가능하게한다. 이것은 차례로 연구원이 착색 패턴을 분석 할 때 샘플을 적게 사용하거나 더 미세하게 해명 할 수있게 해줍니다.착색의 양상. 또한이 방법은 파리의 절개를 필요로하지 않으므로 형태 학적 측정이나 유전자형 분석과 같은 추가 분석을 위해 샘플을 연속적으로 사용할 수 있습니다. 실제로,이 방법은 마취 된 파리에 사용될 수 있으며, 그 후 선택적으로 그들의 착색 특성에 기초하여 사육 될 수있다.

이미지 분석을 통해 색소 침착을 측정 할 때 발생할 수있는 한 가지 문제점은 색소 값이 색소 침착 수준보다는 이미지를 촬영 한 노출 및 조명 조건을 반영한다는 점입니다. 고정 된 조명 레벨, 조명 위치, 배율 및 노출을 사용하면 이러한 문제를 완화하는 데 도움이되지만 세션 효과를 완벽하게 제어하려면 각 세션에서 몇 가지 반복 제어 이미지를 사용해야 할 수 있습니다. 이 방법은 각 세션마다 15 개의 대조 표본을 재 이미징하고 P max와 P min 을 사용하여 세션 효과를 감지하고 제거합니다. 그러나 재 이미징해야하는 정확한 대조 표본의 수는 사용되는 이미징 하드웨어 및 소프트웨어, 사용자가 관심을 갖는 색소의 양상 및 처리 사이의 가변성 및 각 이미지에서 얼마나 많은 이미지가 사용되는지에 따라 달라집니다 세션. 동일한 표본을 5 회의 세션에 걸쳐 다시 묘사하는 예비 실험을 실시하면 세션 효과, 표본 동일성에 따른 분산 및 잔류 분산 (정정 후 측정 오차 추정치)으로 인해 사용자가 분산을 계산할 수 있습니다 세션 효과) ( 표 1 ). 그런 다음이 값을 사용하여 세션 효과를 탐지하고 제어하기 위해 각 세션에서 필요한 제어 이미지 수를 추정 할 수 있습니다. 간단한 R 스크립트가 작성되었으며 세션을 통한 색소 침착을 시뮬레이트하기 위해 예비 실험의 데이터를 사용합니다. 사용할 수 있습니다.세션 당 제어 이미지의 수가 세션 효과를 제거하기에 충분한 지 확인하십시오. 이 스크립트는 보충 파일로 제공됩니다.

사용자가 세션 내에서 불쾌한 요인이 염려되는 경우 John et al., 2016 41 에서 설명한 것처럼 세션을 통해 동일한 표본을 여러 번 다시 이미지 할 수 있습니다. 이 경우 단일 제어 견본에 대한 [sampleID]는 세션 ( 예 : control1, control2, control3 )에서 다시 이미지화 할 때마다 변경해야합니다. 그렇지 않으면 이미징 소프트웨어가 이전 이미지를 동일한 이름의 새 이미지로 바꿉니다. 보정 기능은 동일한 시편이 세션 내에서 세션간에 여러 번 다시 촬영되는지 또는 동일한 대조군 세트가 세션간에 이미지화되는지 여부와 상관없이 시간적으로 인접한 세션간에 동일한 [sampleID]가있는 중복 이미지에 보정을 적용하고 보정합니다. 에 관계없이 th제어 이미지가 찍히고, 세션은 블록으로 취급되어야하며 가능한 경우 수정 후 남은 세션 효과를 통계적으로 제어 할 수 있도록 무작위 블록 디자인을 사용해야합니다. 이것이 실패하면, 표본을 세션에 임의로 할당하여 세션 효과가 실험적 요인과 혼동되지 않도록해야합니다.

이 프로토콜은 각 표백제에 대한 색소 침착의 변화를 나타내는 색소 분포의 생성에 의존합니다. 이 프로필을 생성하는 한 가지 문제는 복부 큐티클을 덮는 검은 머리카락입니다.이 검은 머리카락은 바지 타이트를 가로 지르는 임의의 전후방 선에 의해 항상 양분됩니다. 이 프로토콜은 큐티클 밴드를 통해 평균 색소 분포를 취함으로써 이러한 모발에서 발생하는 소음을 줄입니다. 그럼에도 불구하고 큐티클의 얇은 선을 기반으로하는 프로파일을 생성하려는 경우 사용자는 단계 5.6에서 ROI의 너비를 1 픽셀로 설정할 수 있습니다. 또한 사용자는동일한 이미지를 여러 번 반복하여 색소 프로필의 횡 방향 위치를 변경하여 세그먼트 내의 안료 밴드 폭의 변화를 캡처합니다. 그러나이 경우 ImageJ 매크로가 같은 이름의 프로필을 덮어 쓰므로 사용자는 동일한 이미지를 여러 번 복사하고 5.1 단계를 수행하기 전에 각 복사본에 고유 한 이름을 지정해야합니다.

착색 프로파일을 생성 할 때 두 번째 중요한 고려 사항은 Pigmentation R 스크립트 분석에서 스플라인 .der.er 함수 (L63) 내에 정의 된 3 차 스플라인의 평활화 매개 변수입니다. 적절한 스무딩 매개 변수는 이미징 설정 및 해상도에 따라 다릅니다. 프로필을 과도하게 평탄화하면 T 1 , T 2T 3 좌표를 계산하는 데 사용되는 스플라인 프로파일의 특성이 손실 될 수 있습니다 ( 그림 2D2D '). 반대로 언더 스무딩은프로파일 소음과 결과적으로 좌표 추출 정확도. Chek 함수는 스플라인과 그 미분의 그래픽 요약을 생성하며 적절한 평활화 매개 변수를 선택하는 시각적 큐로 사용할 수 있습니다.

여기에 설명 된 방법은 암컷과 수컷 D. melanogaster 에서 제 3 및 제 4 복부 tergites의 착색에 대한 데이터를 포착하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 대표 결과는 여성의 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 부분의 색소 침착을 측정하는 데에도 사용될 수 있음을 나타냅니다. 또한이 방법은 색소 침착에 영향을 미치는 유전자 돌연변이 체에 의한 표현형의 차이를 발견 할 수 있습니다. ImageJ 매크로와 R 스크립트는 다른 D. melanogaster 종의 복부에서 색소 침착을 측정하거나 색소 패턴이 고정 관념 인 경우 다른 분류군의 다른 신체 부위의 색소 침착을 쉽게 측정하도록 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 방법론RGB로 이미지를 캡처하고 각 채널을 개별적으로 분석하여 색소 색의 양상을 측정 할 수 있습니다.

일반적으로,이 방법론은 신기원 인 phenomics 51 , 52 의 일부이다. phenomics의 목표는 질병을 포함하여 표현형에 영향을 미치는 유전 적 및 환경 적 상호 작용을보다 잘 이해하고 이러한 상호 작용이 어떻게 생물 다양성을 발생시키는지를 이해하기 위해 대규모의 다차원 표현형 데이터 세트를 생성 및 분석하는 것입니다. 그러나 phenomics가 그 잠재 성을 발휘하기 위해서는 표현형 데이터를 얻기위한 방법론이 간단해야하며 자유로이 사용할 수있을뿐만 아니라 다른 표현형에도 쉽게 적용 할 수 있어야합니다. 표준 장비를 사용하여 캡처 한 이미지를 분석하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용함으로써이 방법론은 이러한 목표를 달성하는 데 도움이됩니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 National Science Foundation에서 IOS-1256565 및 IOS-1557638을 AWS에 기부하여 지원되었습니다. 우리는 Patricia Wittkopp과 3 명의 익명의 평론가들에게이 백서의 이전 버전에 대한 도움이되는 의견에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

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References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20, (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282, (1813), (2015).
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