Quantificazione della pigmentazione addominale in

Genetics

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Summary

Questo lavoro presenta un metodo per quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster utilizzando l'analisi di immagine digitale. Questo metodo semplifica le procedure tra l'acquisizione di fenotipi e l'analisi dei dati e include il montaggio del campione, l'acquisizione di immagini, l'estrazione del valore dei pixel e la misurazione del tratto.

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Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

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Abstract

La pigmentazione è un tratto morfologicamente semplice ma altamente variabile che spesso ha un significato adattativo. Ha servito ampiamente come modello per comprendere lo sviluppo e l'evoluzione dei fenotipi morfologici. La pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster è stata particolarmente utile, consentendo ai ricercatori di identificare i loci che sono alla base delle variazioni inter- e intraspecifiche della morfologia. Fino ad oggi, tuttavia, la pigmentazione addominale D. melanogaster è stata ampiamente analizzata qualitativamente, attraverso un punteggio piuttosto che quantitativo, che limita le forme di analisi statistica che possono essere applicate ai dati di pigmentazione. Questo lavoro descrive una nuova metodologia che consente la quantificazione di vari aspetti del pattern di pigmentazione addominale di D. melanogaster adulte . Il protocollo include il montaggio del campione, la cattura delle immagini, l'estrazione dei dati e l'analisi. Tutto il software utilizzato per le macro delle funzioni di acquisizione e analisi delle immaginiScritta per l'analisi delle immagini open source. Il vantaggio di questo approccio è la capacità di misurare con precisione i tratti di pigmentazione utilizzando una metodologia altamente riproducibile in diversi sistemi di imaging. Mentre la tecnica è stata utilizzata per misurare la variazione nei modelli di pigmentazione della terna di D. melanogaster adulte , la metodologia è flessibile e si applica generalmente ai modelli di pigmentazione in innumerevoli organismi diversi.

Introduction

La pigmentazione mostra enormi variazioni fenotipiche tra specie, popolazioni e individui, e anche all'interno di individui durante l'ontogenesi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Sebbene ci siano innumerevoli studi di pigmentazione in un'ampia varietà di animali, la pigmentazione è stata forse meglio studiata in Drosophila melanogaster , dove è stato utilizzato il pieno potere della genetica molecolare per chiarire i meccanismi di sviluppo e fisiologici che regolano la pigmentazione e come questi meccanismi evolvono 1 , 6 . Molti sono noti sui geni che regolano la sintesi biochimica dei pigmenti in D. melanogaster 7 , 8 ei geni che controllano la temporale e la spazialità diStribuzione di questa biosintesi 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Inoltre, la mappatura genetica ha individuato i siti genetici che sottendono le differenze intra- e interspecifiche nella pigmentazione in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Sono stati esplorati anche i rapporti tra la pigmentazione e le caratteristiche pleiotropiche, come il comportamento 18 , 19 e l'immunità 19 , 20 , così come il significato adattativo dei modelli di pigmentazione 15 , 21 , 22 . Come tale, la pigmentazione in D. melanogaster è emersa come un potente ma semplice mOdel per lo sviluppo e l'evoluzione di fenotipi complessi.

La pigmentazione nell'adulto D. melanogaster è caratterizzata da pattern distinti di melanizzazione sul corpo, in particolare sulle ali e sul torace dorsale e sull'addome. È la pigmentazione di ogni piastra cuticolare (tergita) sull'addoma dorsale, tuttavia, che ha ricevuto la più attenzione. C'è una notevole variabilità in questa pigmentazione ( Figura 1A- F ), a causa sia dei genetici 17 , 23 che quelli ambientali 24 , 25 fattori. La cuticola di un tergite addominale è costituita da compartimenti di sviluppo anteriori e posteriori ( Figura 1G ), ciascuno dei quali può essere ulteriormente suddiviso a seconda della pigmentazione e dell'ornamento 26 . Il vano anteriore comprende sei cuticolaI tipi (a1-a6) e lo scomparto posteriore comprendono tre (p1-p3) ( Figura 1G ). Di queste, la cuticola p1, p2 e a1 sono tipicamente piegate sotto il tergite in abdomeni non stretti in modo che siano nascosti. La cuticola affidabile è caratterizzata da una banda di pigmentazione pesante, qui indicata come una "banda di pigmento", composta da tipi di cuticola a4 (pelosa con setole moderate) e a5 (pelose con grandi setole), con il bordo posteriore della banda Più pigmentato del bordo anteriore ( Figura 1G ). Anteriore a questa fascia è una regione di cuticola pelosa leggermente pigmentata, che ha setole posteriormente (a3) ​​ma non anteriormente (a2). La variazione della pigmentazione tra le mosche è osservata sia nell'intensità della pigmentazione che nella larghezza della fascia di pigmento. In generale, la variazione è più grande nei segmenti più posteriori (segmenti addominali 5, 6 e 7) ed è più bassa nei segmenti più anteriori (addome addominale3 e 4) 24 . Inoltre, c'è un dimorfismo sessuale nella pigmentazione di D. melanogaster , con i maschi in genere hanno completamente pigmentati quinto e sesto tergi addominali ( Figura 4C ).

Nella maggior parte degli studi di pigmentazione addominale in D. melanogaster , la pigmentazione è stata trattata come un tratto categorico o ordinale, con il modello misurato 27 , 28 , 29 o semi-quantitativamente su scala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Questi metodi inevitabilmente soffrono di una mancanza di precisione, e poiché si basano sulla valutazione soggettiva della pigmentazione, è difficile confrontare i dati tra gli studi. Alcuni autori hanno quantificato le dimensioni spaziali della pigmentazione 38 , 39 , l'intensità della pigmentazione di un particolare tipo di cuticola 23 , 25 , 39 , 40 , o l'intensità media della pigmentazione nel tergite addominale nel suo complesso 41 , 42 , 43 . Tuttavia, questi metodi di quantificazione non misurano sia l'intensità e la distribuzione spaziale della pigmentazione addominale contemporaneamente e pertanto non catturano le sfumature di come la pigmentazione varia inTergita propria. Inoltre, molti di questi metodi di quantificazione 38 , 41 , 42 , 43 richiedono la dissezione e il montaggio della cuticola addominale. Ciò richiede tempo e distrugge il campione, rendendolo non disponibile per ulteriori analisi morfologiche. Poiché la comprensione dello sviluppo e dell'evoluzione della pigmentazione addominale si approfondisce, saranno necessari strumenti più sofisticati per misurare rapidamente e con precisione sia la distribuzione spaziale che l'intensità della pigmentazione.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare l'analisi delle immagini digitali per ottenere una misura replicabile e più precisa della pigmentazione addominale in D. melanogaster . La metodologia comprende tre fasi. In primo luogo, la mosca adulta è montata in modo non distruttivo e viene presa un'immagine digitale dell'addome dorsale. In secondo luogo, utilizzando una macro ImageJ, l'utenteDefinisce una striscia anteriore-posteriore di pixel che si estende dall'anteriore della cuticola a2 alla parte posteriore della cuticola a5 (casella verde, figura 1G ) sia sul terzo che sul quarto segmento addominale. Il valore medio di pixel lungo la larghezza di questa striscia viene quindi estratto lungo il suo asse lungo, generando un profilo che cattura la distribuzione spaziale e l'intensità della pigmentazione in quanto cambia dall'anteriore alla posteriore del tergito. In terzo luogo, uno script R viene utilizzato per descrivere il profilo di pigmentazione matematicamente utilizzando una spline cubica. Lo script R poi utilizza la spline e il suo primo e secondo derivato per estrarre la larghezza della cuticola a2-a5, la larghezza della fascia di pigmento e i livelli massimi e minimi di pigmentazione. Il metodo quantifica quindi sia le caratteristiche spaziali che la profondità della pigmentazione addominale.

Questa metodologia quantifica la pigmentazione del terzo e del quarto tergi addominale,Che sono stati al centro di numerosi studi precedenti 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , esclusivamente o in combinazione con più tergiti posteriori. Sebbene meno variabile rispetto al quinto e al sesto tergi addominale, i terzi e terzi non sono completamente pigmentati nei maschi, quindi questo protocollo può essere applicato sia ai maschi che alle femmine. Tuttavia, come indicato qui, il protocollo può essere utilizzato per misurare la pigmentazione nel quinto e sesto tergi addominale nelle femmine. Inoltre, piccole modifiche degli script utilizzati per estrarre le caratteristiche del profilo di pigmentazione dovrebbero permettere che il metodo venga utilizzato per quantificare la variazione della pigmentazione in un'ampia varietà di altreorganismi.

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Protocol

1. Montaggio del campione

NOTA: Conservare le mosche morte in etanolo al 70% in acqua prima dell'immagine.

  1. Versare 10 ml di agar 1,25% agar disciolto in acqua bollente in un piatto di Petri da 60 mm x 15 mm e lasciarlo impostare.
  2. Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare una coppia di pinze a punta fine per fare una scanalatura di 20 mm, una scanalatura profonda di 2 mm di profondità da 1 mm sulla superficie del gel. Utilizzando pinze fine, incorporare il lato ventrale di un mosca adulto nella scanalatura, con il lato dorsale della mosca che proietta sopra il gel.
    NOTA: L'allentamento del gel consente un semplice riposizionamento senza danneggiare il campione. La stessa scanalatura può essere usata per più esemplari, anche se diventa sporca, spezzata e inutilizzabile nel tempo. L'utente può quindi eseguire un'altra scanalatura nello stesso gel. Ogni piastra può essere usata per immagini ~ 200 mosche.
  3. Completamente coprire il campione in etanolo al 70% in acqua per ridurre le riflessioni della luce dalla cuticola cerosa e per evitare danni alle ali duranteManipolazione dei campioni.

2. Impostazione del microscopio

NOTA: Le immagini vengono acquisite utilizzando un campo di dissezione, una base di luce trasmessa, una fotocamera digitale e una fonte di luce fredda a gooseneck collegata ad un computer che esegue il software di acquisizione di immagini. Le istruzioni del software sono specifiche di Micro-Manager v1.4.20 44 , che è un software open source che incorpora ImageJ 45 .

  1. Accendere il microscopio, la fotocamera digitale, la fonte di luce fredda a doppio fascio e il computer.
  2. Esegui il software di acquisizione delle immagini per aprire una finestra Micro-Manager e una finestra ImageJ. Nella finestra ImageJ fare clic su "Image"> "Type"> "8-Bit" per impostare tutte le immagini come 8 bit. Fai clic su "live" nella finestra Micro-Manager per aprire una finestra "Snap / Live" che mostra un'anteprima in tempo reale dalla fotocamera.
    1. Massimizza la dimensione della finestra "Snap / Live" se nesario. Selezionare "Scala di grigi" nel menu "Modalità di visualizzazione" a discesa nella scheda "Contrasto" della finestra Micro-Manager.
  3. Accendere la fonte di luce fredda fino alla sua massima intensità e posizionare le punte di ciascun collo a circa 120 mm dalla fase, una sulla sinistra e una sulla destra.
    NOTA: Gli utenti possono anche utilizzare un illuminatore anulare, anche se questo può generare un anello di luce riflessa attorno all'addome mosca.
  4. Impostare manualmente l'ingrandimento del microscopio a 60x in modo che il campo visivo cattura una superficie di circa 3 mm sul palco.
  5. Posizionare un micrometro di fase a 2 mm sul palco (passando lo sfondo a bianco, se necessario). Mentre guardi l'anteprima dal vivo, concentrarsi sul micrometro di fase e regolare l'esposizione nella finestra Micro-Manager immettendo il tempo di esposizione in ms nella casella "Esposizione".
  6. Per calibrare la fotocamera spazialmente, selezionare lo strumento "linea retta" in tLui ImageJ finestra e disegnare una linea la lunghezza del micrometro di fase. Nella finestra ImageJ fare clic su "Analizza"> "Imposta scala" per aprire la finestra "Imposta scala", inserire la lunghezza del micrometro in μm nella casella "Distanza nota" e immettere "μm" nell'unità di "lunghezza" scatola.
    1. Vedere che la finestra "Imposta scala" visualizza la scala in "pixel / μm". Prendi nota della scala e fai clic su "OK".
  7. Nella finestra "Snap / Live", fare clic su "Stop" e poi su "Snap" per catturare un'immagine del micrometro di fase.
  8. Salvare l'immagine come una TIFF in scala di grigi a 8 bit per garantire la possibilità di calibrare spazialmente le immagini, se necessario. Nella finestra ImageJ fare clic su "File"> "Salva con nome"> "Tiff ..." Specificare dove salvare il file nel file browser, denominare il file e fare clic su "Salva".
  9. Commutare il palco in nero e postoUn piatto di Petri che tiene una mosca montata in agar (punti 1.1-1.2) sul palco.
  10. Guardate attraverso il microscopio e posizionate la mosca per assicurare che la linea mediana dorsale sia dritta per vedere meglio il pattern di pigmentazione. Spostare le ali e le appendici per assicurare che la vista dell'addome non sia ostacolata. Se la cuticola pigmentata (a2-a5) non è visibile, estrarre lateralmente l'addome fino a quando non è (anche se l'addome delle mosche è conservato in etanolo al 70% in acqua, quindi questo non è di solito necessario).
    NOTA: quando si posiziona la mosca, potrebbe essere necessario utilizzare un ingrandimento inferiore (20X). L'ingrandimento deve essere restituito a 60X prima di procedere.
  11. Messa a fuoco manuale sull'addome dorsale della mosca. Regolare manualmente le punte della sorgente luminosa per ridurre al minimo le ombre e la riflessione sull'addome dorsale.
  12. Guardando l'anteprima dal vivo sullo schermo del computer e utilizzando l'istogramma del valore di pixel nella scheda "Contrasto" della finestra Micro-Manager,Regolare l'esposizione come descritto nel punto 2.4 per massimizzare l'intervallo di valori dei pixel dell'immagine di anteprima.
  13. Rimuovere il piatto di mosca e Petri e sostituirli con un LED (uscita spettrale di 430-660 nm) collegato ad un contatore di tensione, centrato nel campo visivo nella stessa posizione del mosca. Utilizzare il misuratore di tensione e LED come misuratore di luce 46 e registrare la tensione generata dalla luce che colpisce il LED (~ 125 mV).
    NOTA: il LED e il contatore di tensione vengono utilizzati per garantire che i livelli di luce siano costanti in sessioni di imaging multiple in un singolo esperimento.
  14. Per la durata dell'esperimento, non modificare ulteriormente la posizione o l'intensità della sorgente luminosa, l'ingrandimento del microscopio o l'esposizione della fotocamera.

3. Esemplare Imaging

  1. Posizionare un piatto di Petri in possesso di una mosca montata in agar (punti 1.1-1.3) sullo stadio del microscopio nero. Regolare la posizione del mosca in modo che il terzo e quattroH segmenti addominali sono visibili e la linea mediana dorsale è dritta, come descritto al passaggio 2.9. Assicurarsi che l'ingrandimento sia a 60x prima di procedere.
  2. Messa a fuoco manuale il microscopio in modo che il terzo e il quarto terzitomi addominali dorsali siano a fuoco. Utilizzare il software di acquisizione di immagini per acquisire un'immagine come un TIFF in scala di grigi a 8 bit, come descritto nel passaggio 2.6.
    NOTA: L'immagine può essere acquisita a colori e successivamente convertita in scala di grigi per l'analisi.
  3. Salvare l'immagine come "SESH000_sampleID.tiff", come descritto nel punto 2.7.
    NOTA: qui [SESH] è costante, [000] è il numero della sessione ed è variabile ma deve essere di tre cifre e [sampleID] è qualunque cosa desideri, anche se non deve contenere caratteri di sottolineatura (_) aggiuntivi Deve essere di lunghezza costante. [SampleID] dovrebbe includere dettagli sui fattori utilizzati nell'analisi dei dati di pigmentazione ( ad esempio, temperatura o linea di origine), separati da un carattere non-alfabetiCarattere cal, come un trattino (-). Ciò consente a questi fattori di essere facilmente analizzati da [sampleID] usando un software statistico standard.
  4. Rimuovere il piatto di Petri dal palco e sostituire la mosca con il prossimo campione. Ripetere i passaggi 3.1-3.3 finché tutti gli esemplari non sono stati riprodotti, senza aggiustare ulteriormente i livelli di illuminazione, l'ingrandimento o l'esposizione.

4. Imaging in diverse sessioni

  1. Se le immagini devono essere assunte in più sessioni, mantenere l'intensità della luce, l'esposizione e l'ingrandimento in tutte le sessioni. All'inizio di ogni sessione, controllare la calibrazione spaziale della fotocamera (punto 2.4) e l'intensità della luce sul palco (misurata con il LED / tensione, punto 2.12).
  2. Cattura e salva un'immagine del micrometro di fase (passaggi 2.5-2.7) per garantire la possibilità di calibrare spazialmente le immagini, se necessario.
  3. Utilizzare almeno 15 esemplari di controllo e riesaminarli in modo casuale in ogni sessione allo alloW per la rilevazione e l'eliminazione degli effetti di sessione. Assicurarsi che i campioni di controllo duplicati tra le sessioni hanno lo stesso [sampleID] ma diversi [SESH000].
    NOTA: i campioni di controllo sono le mosche raccolte, memorizzate e montate in modo identico a campioni sperimentali, ma vengono riprogettati in sessioni. Il numero preciso degli esemplari di controllo dipenderà dall'installazione sperimentale dell'utente. Vedere la discussione per ulteriori dettagli.

5. Analisi delle immagini

NOTA: L'analisi delle immagini è condotta in ImageJ 45 e utilizza la macro "Measurement of Pigmentation.ijm", fornita come file aggiuntivo.

  1. Posiziona tutte le immagini da analizzare nella stessa cartella.
  2. Avviare ImageJ e eseguire la macro "Measurement of Pigmentation.ijm" facendo clic su "Plugins"> "Macro"> "Esegui", selezionando "Measurement of Pigmentation.ijm" nel browser del file e facendo clic su "Aperto."
    NOTA: tutti i passaggi successivi sono all'interno della macro. Ogni passo è un comando macro singolo.
  3. Si noti che viene aperta una finestra di dialogo "Action Required" che indica "Scegli la cartella in cui sono memorizzate le immagini". Fai clic su "OK" e utilizza il browser file per selezionare la cartella contenente le immagini e quindi fare clic su "scegli".
  4. Si noti che una finestra di dialogo "Azione richiesta" verrà aperta, indicando "Scegli la cartella in cui si desidera memorizzare i dati". Fare clic su "OK" e utilizzare il browser file per selezionare la cartella desiderata per salvare i profili di pigmentazione. Fai clic su "scegli".
  5. Notare che verrà aperta una finestra di dialogo che chiede "quanti caratteri nel tuo ID campione"? Nella casella di immissione dati, immettere il numero di caratteri in [SampleID], come specificato al passaggio 3.3, e fare clic su "OK".
  6. Notare che verrà aperta una finestra di dialogo che chiede "Quanto è largo il ROI?" Nella casella di immissione dati, immettere la larghezza dei pixel dell'anteriore-Striscia posteriore lungo la quale deve essere letto il profilo di pigmentazione (rettangolo verde, figura 1G , figura 2A e 2A '). Fare clic su "OK"; Il valore predefinito è di 20 pixel.
    NOTA: Il profilo di pigmentazione viene letto attraverso una striscia di cuticola, piuttosto che una linea, per ridurre il rumore dovuto a peli e setole. La larghezza di questa striscia dipenderà dalla risoluzione dell'immagine, ma dovrebbe essere ~ 1/20 della larghezza dell'addome, in pixel.
  7. Si noti che la macro apre l'immagine del primo volo e una finestra di dialogo chiede se misurare la mosca corrente (fare clic su "Sì") per passare alla prossima mosca (fare clic su "No") oppure per uscire dalla finestra Macro (fare clic su "Annulla").
  8. Si noti che verrà aperta una finestra di dialogo che indica "Definire la linea mediana dell'addome dorsale, da ANTERIOR a POSTERIOR". Lo strumento "lineare" sarà già selezionato. Disegnare una linea dall'anteriore al posteriorePer definire la linea mediana dell'addome dorsale. Fare clic su "OK"; Vedi figura 2A e 2A ', linea gialla.
    NOTA: viene utilizzato per riorientare l'immagine in modo che la linea mediana dorsale sia orizzontalmente sullo schermo, con l'anteriore a sinistra, facendo più facilmente i passaggi successivi.
  9. Si noti che verrà aperta una finestra di dialogo che indica "Definire il bordo POSTERIOR di Tergite 4 appena dietro la fascia di pigmento". Lo strumento "lineare" sarà già selezionato. Disegnare una linea dal bordo della mediana posteriore al bordo laterale destro, in modo tale che il centro della linea (contrassegnato da un quadrato bianco) sia posteriormente posizionato sul bordo posteriore della banda di pigmento (cuticola a5). Fai clic su "OK"; Vedere la Figura 2A e 2A ', linea magenta.
    NOTA: lo script R rileverà automaticamente il bordo posteriore della fascia di pigmento dal profilo di pigmentazione.
  10. Si noti una finestra di dialogoSi apre la scritta "Definire il bordo ANTERIOR di Tergite 4 al bordo anteriore della cuticola pigmentata (a2)". Lo strumento "lineare" sarà già selezionato. Disegnare una linea dal bordo mediano anteriore al bordo laterale destro, in modo che il centro della linea (contrassegnato da un quadrato bianco) si trovi sul bordo anteriore della cuticola pigmentata (cuticola a2). Fai clic su "OK"; Vedere la Figura 2A e 2A ' , linea ciano.
    NOTA: lo script R definirà questo punto come il bordo anteriore della cuticola pigmentata del tergito. Sull'immagine, la macro mostrerà la regione di interesse (ROI) lungo la quale viene letto il profilo di pigmentazione (rettangolo verde, figura 2A e 2A ', ingrandita nella figura 2B e 2B '). La macro aprirà anche una seconda finestra che mostra il profilo di pigmentazione per il ROI ( fig E 2C e 2C '), dove l'asse x è la posizione, espressa come numero di pixel dal bordo posteriore del profilo e l'asse y è il valore medio di pixel in ogni posizione.
  11. Visualizza le trame del profilo di pigmentazione che verrà aperta dalla macro. Se necessario, fare clic su "Live" nella finestra del profilo per regolare la posizione del ROI in modo che non includa strutture ( es. Setole) che influenzerebbero il profilo di pigmentazione. Una volta che il profilo è soddisfacente, fai clic su "OK".
  12. Ripetere i passaggi 5.8-5.11 per Tergite 3.
    NOTA: La macro esporta i profili di pigmentazione come due file CSV, ognuno denominato "SESH000_samplename_TX_profile.csv", dove [SESH000_samplename] è il nome dell'immagine e [TX] sia T3 o T4 per il terzo e il quarto tergit.
  13. Notare che la macro apre l'immagine successiva. Ripetere i passaggi 5.7-5.13 finché tutte le immagini sono state analizzate.
Jove_title "> 6. Preprocesso dei dati, analisi e correzione della sessione

NOTA: Tutte le analisi dei dati sono condotte in R 47 e usano lo script "Analisi di pigmento.R" fornito. Di seguito, "L ..." indica quali linee di script da eseguire per ciascuna parte dell'analisi. Vedere le informazioni supplementari per ulteriori dettagli sull'esecuzione dell'analisi.

  1. Modificare lo script R per impostare la directory di lavoro (L6) e definire il percorso di file nella cartella contenente i profili the.csv (L11).
  2. Esegui L13-15 per generare un elenco dei profili di pigmentazione memorizzati nella cartella del profilo.
  3. Caricare e gestire le funzioni "reader" e "addPrimaryKey" (L17-41) per leggere i profili in un singolo frame di dati.
  4. Modificare lo script a L43 per specificare la calibrazione spaziale delle immagini in μm / pixel, come determinato nel passaggio 2.5.
  5. Caricare e eseguire il "regolazione"(L46-58) per convertire la posizione del profilo (asse x, figura 2C e 2C ') dai pixel-da-posteriore-edge-of-ROI a μm-from-front-edge-of-ROI e (0 = nero, 255 = bianco) al valore di pigmento (0 = nessun pigmento, 255 = pigmento massimo), il valore del profilo (asse y, figura 2C e 2C ').
  6. Caricare ed eseguire la funzione "spline.der.er" (L60-71) per generare la spline cubica dei profili di pigmentazione e dei suoi primi e secondi derivati ​​( Figura 2D -2F e 2D '- 2F ').
  7. Caricare ed eseguire le funzioni "coord" e "assmbly.coord" (L74-163), innanzitutto per estrarre la posizione dei bordi posteriori (T3) e anteriori (T 2 ) della fascia di pigmento ( figura 2D e 2D ';) E il bordo posteriore della cuticola a2 (T1, Figura 2D e 2D ') e quindi estrarre rispettivamente i valori di pigmentazione massima (P max ) e minima (P min ), assunti rispettivamente in T 3 e T 1 .
    NOTA: Il bordo anteriore della cuticola a2 è già stato definito nel passaggio 5.9.
  8. Facoltativo: caricare ed eseguire la funzione "chek" (L165-175) per verificare se la funzione "coordina" identifica correttamente le posizioni T 1-3 per un profilo di pigmentazione selezionato a caso.
  9. Caricare ed eseguire le funzioni di indice e metriche (L178-193) per generare una tabella dati con le intestazioni "Session", "Sample", "Tergite", "id" (una concatenazione di Sample e Tergite), " Pmax " "P min ", "W band " (larghezza della fascia pigmentata, = T3 - T2) e "W tergite " (larghezza del pigmento cUticoli a2-a5, = T3).
  10. Caricare e eseguire la funzione "correzione" (L196-234) per generare una tabella dati che corregge P max e P min per eventuali fattori di fastidio derivanti da effetti di sessione. Utilizzare l'aumento medio (o diminuzione) di P max o P min dai campioni di controllo riprogettati in sessioni adiacenti temporanee.

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Representative Results

Il protocollo è stato utilizzato per esplorare l'effetto dell'allevamento della temperatura sulla pigmentazione addominale. Studi precedenti hanno dimostrato che un aumento della temperatura di sviluppo produce una diminuzione della diffusione della pigmentazione addominale in diverse specie di Drosophila , tra cui D. melanogaster 30 , 32 . In particolare, nei tergiti addominali 3 e 4, la portata della pigmentazione (larghezza della banda di pigmento) diminuisce da 17 ° C a 25 ° C e rimane la stessa da 25 ° C a 28 ° C 24 , 36 . Questi studi hanno segnato l'estensione della pigmentazione su una scala 1-10 (0: nessuna fascia di pigmento, tergita completamente gialla; 5: banda di pigmento occupa il 50% del tergito; 10: tergita completamente scura). Per stabilire se la metodologia quantitativa potrebbe catturare questa plasticità fenotipica, la pigmentazione è stata misurata in thTerzo e terzo terzo addominale di una linea isogenica di mosche femminili apparentemente selvatiche, allevati da uovo ad adulto a 17 ° C (sette mosche), 25 ° C (nove mosche) e 28 ° C (nove mosche). Per determinare l'efficacia della procedura di correzione per rimuovere i fattori di nuocenza introdotti dagli effetti di sessione, la pigmentazione delle stesse mosche è stata ricalcolata e riesamata una, due, quattro e otto giorni dopo. Le condizioni di illuminazione e l'esposizione tra le sessioni erano tuttavia cambiate appositamente per assicurare che vi siano stati effetti di sessione per la rimozione della procedura di correzione. Le immagini sono state pubblicate sul repository digitale Dryad.

La prima domanda è stata la presenza di differenze sistematiche nelle misure di pigmentazione per sessioni. Questo è stato esaminato usando il pacchetto lme4 in R 48 per adattarsi ai modelli misti M ijk = S i + A j +Ε ijk e M ij = A j + ε ij sia P max che P min , dove M è la misura del pigmento, S è la sessione (effetto casuale), A è il tergite addominale che viene misurato (effetto casuale) e ε L'errore residuo (gli indici sono livelli all'interno delle variabili). È stato utilizzato un test del rapporto di probabilità di probabilità per verificare se l'inclusione della sessione come fattore casuale ha migliorato significativamente la misura; Ha fatto ( Tabella 1 ). Come previsto, l'esame dei componenti della varianza (generato tramite REML 48 ) ha indicato che la variazione dovuta agli effetti di sessione rappresentava rispettivamente il 67% e il 70% della varianza totale in P max e P min ( Tabella 1 ).

Quindici terziti di controllo selezionati in modo casuale (terzo o quarto, da mosche reaRossi a 17 ° C, 25 ° C o 28 ° C) e sono state utilizzate variazioni nella loro media P max e P min per correggere le misure di pigmentazione dei restanti terziti durante le sessioni. Ripetendo l'analisi sulle misure di pigmentazione corrette, elimina gli effetti della sessione ( tabella 1 ) e riduce la percentuale di varianza totale a causa degli effetti di sessione a zero. L'errore residuo è una stima, un errore di misura dopo che gli effetti della sessione sono stati rimossi ed è stato rispettivamente del 22% e del 27% per P max e P min ( Tabella 1 )

Successivamente, i dati corretti sono stati utilizzati per determinare se l'effetto della temperatura su diversi aspetti della pigmentazione e della dimensione potrebbe essere rilevato. Il modello misto M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm è stato montato sui dati, dove T D è la terzita (terza o quarta) e X è la mosca individuale (fattore casuale). Poiché il rapporto tra la pigmentazione e la temperatura non è lineare 24 , 36 , T è stato trattato come un fattore categorico. Sono stati testati i livelli massimi e minimi di pigmentazione ( P max e P min ) e la larghezza della fascia di pigmento e del tergite ( fascia W e W tergite ). È stato anche testato l'effetto della temperatura sulla larghezza relativa della banda di pigmento ( R band = W band / W tergite ). I dati hanno mostrato che la larghezza assoluta della fascia di pigmento e relativa ( fascia R ) della fascia di pigmento è scesa da 17 ° C a 25 ° C (Tukey test post-hoc, P <0,05 per tutti) e non cambia significativamente da 25 ° C a 28 ° C (test Tukey post-hoc, Tabella 2 , Figura 3A e 3B ), che è coerente con gli studi precedenti 24 , 36 . Lo stesso schema è stato osservato per il livello massimo e minimo della pigmentazione, P max e P min ( Tabella 2 , Figura 3C ). L'effetto della temperatura sul livello della pigmentazione non è stato descritto prima, ma sembra inizialmente coerente con altri studi che dimostrano che il livello minimo di pigmentazione nel quarto tergite addominale è positivamente correlato con la larghezza della fascia di pigmento nelle popolazioni di tipo selvatico 39 . Tuttavia, mentre i dati di questo studio indicano una relazione positiva tra la banda P max e W , essi mostrano una relazione negativa tra P min e W band( Tabella 3 ). Questa differenza tra gli studi attuali e quelli precedenti può riflettere le differenze in cui i fattori genetici e ambientali influenzano la correlazione tra il livello e l'estensione della pigmentazione addominale. Tuttavia, questi risultati rappresentativi mostrano che il protocollo è in grado non solo di identificare modelli di pigmentazione precedentemente stabiliti attraverso metodologie qualitative, ma anche di rivelare nuovi che le metodologie qualitative non sono in grado di rilevare.

L'effetto della temperatura sulla larghezza del tergito era più complesso. In D. melanogaster , le dimensioni del corpo e dell'organo diminuiscono in modo non lineare con la temperatura 49 . Studi precedenti suggeriscono che la larghezza del quinto tergite addominale diminuisce del 10% da 16,5 ° C a 25 ° C e un ulteriore 4% da 25 ° C a 29 ° C 50 . Mentre c'era una diminuzione non significativa della larghezza diIl quarto tergite addominale da 17 ° C a 25 ° C, sia il terzo che il quarto tergi addominale sono aumentati in larghezza da 25 ° C a 28 ° C ( Tabella 2 , Figura 3D ). Poiché la larghezza dei tergiti addominali è essenzialmente definita dall'utente (passi 5.9-5.10 nel protocollo), la disparità tra gli studi correnti e quelli precedenti è improbabile che sia dovuta al modo in cui lo script R estrae W tergite dal profilo di pigmentazione. Piuttosto, può riflettere le differenze nel modo in cui viene misurato il segmento addominale, nei genotipi delle mosche e negli aspetti precisi dei tergiti addominali in fase di misura.

La prossima domanda è stata se la metodologia potrebbe generare dati comparabili ai dati raccolti utilizzando le valutazioni esistenti di pigmentazione. Questi metodi solitamente chiedono all'osservatore di assegnare ognuno ogni mosca ad una delle pinneIl numero di classi fenotipiche basate sulla portata della pigmentazione 15 , 30 , 32 , 33 , 34 e quindi si basano sulla capacità dell'osservatore di valutare la larghezza della banda di pigmento. Per verificare quanto questo metodo obiettivo sia paragonato a metodi soggettivi, sono stati invitati cinque osservatori a classificare 45 immagini di abdomeni femminili sulla base della larghezza della fascia di pigmento del quarto tergite addominale. La classifica media degli osservatori è stata confrontata con la classifica basata sulla banda W, misurata con questa metodologia. C'era una forte correlazione tra la classificazione soggettiva e obiettiva ( Supplementare Figura 1 , in Informazioni Aggiuntive.pdf), Spearmen's = 0.7342, P <0.0001).

Un'altra domanda postaÈ stato come questo metodo estrarre la fascia W dalla spline di pigmentazione rispetto alla misurazione della larghezza della fascia di pigmento a mano (metodo visivo) utilizzando lo strumento di misura lineare in ImageJ . Ancora una forte correlazione è stata riscontrata tra i dati raccolti utilizzando le due metodologie ( Supplementary Figure 2 , in Information Supplementary.pdf, OLS, r 2 = 0.49 , P <0.0001). Sebbene il metodo computazionale misurasse costantemente la banda del pigmento come più stretta rispetto al metodo "visivo", il coefficiente di regressione non era significativamente diverso da 1 ( P> 0,05).

La domanda finale è stata posta se questa metodologia potrebbe essere utilizzata per misurare la pigmentazione addominale in altri contesti. La metodologia potrebbe estrarre la banda P max , P min , W e W tergite per la fIfth e sesto tergi addominali nelle femmine e terzo e terzo tergi addominale nei maschi ( Figura 4 ). Inoltre, la metodologia potrebbe essere utilizzata per quantificare l'aumento di P max e P min in mutanti mutanti per ebano ( e 1 ), che mostrano un aumento della pigmentazione cuticolica nel corpo e un aumento specifico della pigmentazione della cuticola anteriore al pigmento Banda 28 ( figura 4 ).

Figura 1
Figura 1: pigmentazione addominale in D. melanogaster . ( A - F ) Variazione della pigmentazione addominale nelle femmine di due genotipi allevati a tre temperature (17 ° C, 25 ° C e 28 ° C). A3 e A4 sono tergi terzi e terze addominali Rispettivamente. ( G ) Il tergito addominale dorsale comprende uno scompartimento anteriore e posteriore, solo le cui parti sono affidabili in abdesi non allungati. I compartimenti sono ulteriormente suddivisi in diversi tipi di cuticola: a1: non pigmentato, senza peli; A2: leggermente pigmentati e peli; A3: capelli leggermente pigmentati e moderata setola; A4: pigmentato pigro, peli e bruschi moderati; A5: pigmentati scuri, peli e grandi setole; A6: non pigmentati e peli; P3: non pigmentato e peli; P2: non pigmentato e senza peli; E p1: non pigmentati e tessellati. La fascia di pigmento è costituita da cuticole a4 e a5. Nell'analisi vengono utilizzate solo le cuticole pigmentate (a2-a5, green box). Barre di scala = 200 μm in (AF). Il contrasto di tutte le immagini è stato regolato per evidenziare il modello di pigmentazione e le immagini sono illustrative. Le immagini non adeguate utilizzate per generare i risultati rappresentative vengono depositate sul repository digitale Dryad..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Analisi di immagini e dati per la quantificazione della pigmentazione addominale. ( A - F ) e ( A - F ) sono per diversi esemplari e mostrano come l'analisi tratta con immagini di diversa qualità. ( A ) L'utente definisce prima la linea mediana dell'addome (linea gialla), il bordo anteriore della linea tergita (linea ciana) e una linea leggermente posteriore al bordo posteriore della fascia pigmentata (linea magenta). La macro ImageJ attira una linea dal punto centrale delle linee anteriori e posteriori (linea bianca tratteggiata), che si allarga per formare un ROI (scatola nera), ingrandita in ( B ). ( C ) La macro ImageJ quindi exTraccia il valore medio del pixel lungo l'asse anteriore-posteriore del ROI. Si noti che in questa fase il profilo viene letto dal posteriore all'anteriore. ( D - E ) La macro R converte i valori medi di pixel in un valore di pigmentazione, inverte la direzione del profilo di pigmentazione, si adatta con una spline cubica ( S (x) ) ( D ) e calcola il primo ( S ) ) ( E ) e secondo ( S (x) ) derivato della spline ( F ). Lo script poi identifica: T 3 , la posizione della pigmentazione massima, dove S (x) passa da <0 a> 0, muovendosi anteriormente dalla parte posteriore della spline; T 2 , la posizione in cui la diminuzione della pigmentazione è la più grande e S (x) è massima; E T 1 , la posizione in cui la pigmentazione tergita è al minimo e S (x) transizioni da> 0 a <0, muovendo anteriormente fRom T 2 ,. L'anteriore del tergite affidabile (anteriore della cuticola a2) è definito dall'utente. (AF) Nel caso in cui la prima derivata non possa essere utilizzata per trovare T 1 , in genere perché S (x) non attraversa 0 anteriormente alla banda di pigmento, lo script definirà T 1 come la posizione in cui le transizioni S (x) da> Da 0 a <0 quando si muove anteriormente da T 2 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: L'effetto della temperatura su diversi aspetti della pigmentazione addominale nel D. melanogaster femminile . ( A ) Larghezza della fascia di pigmento ( fascia W , FIgure 1). ( B ) Banda del pigmento come proporzione di tergita ( fascia R ). ( C ) La pigmentazione massima ( P max , linee superiori) e minima ( P min , linee inferiori). ( D ) Larghezza del tergito ( W tergite ). I punti sono i mezzi minimi quadrati dai modelli lineari a effetto misto (tabella 2). Le barre di errore rappresentano l'errore standard e possono essere oscurate dai marcatori. La linea nera è terzo terzo addominale. La linea grigia è il quarto tergite addominale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Differenze nella pigmentazione tra terzo e terzo addominale. Questo è mostrato in ( A ebano 1 femmine, ( B ) femmine di tipo selvatico, ( C ) maschi selvatici, e il quinto e sesto tergi addominale nelle femmine selvatiche. ( D ) Massima pigmentazione, P max . ( E) Minima pigmentazione, P min . ( F ) Larghezza della fascia di pigmento, fascia W. ( G ) Larghezza relativa della fascia di pigmento, fascia R. Le barre con lettere diverse sono significativamente diverse (Tukey HSD test post-hoc, P <0,05). N = 6 per tutti eccetto l'ebano 1 , dove N = 4. Barre di scala = 200 μm in ( A - C ). Le barre di errore rappresentano l'errore standard. Il contrasto di tutte le immagini è stato regolato per evidenziare il modello di pigmentazione e le immagini sono illustrative. Per favore cliCk qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

<Td> 4,08 (78%)
Confronto di modelli Componenti di varianza (% del totale)
Pigmentazione Trait Modello df Log-verosimiglianza Equazione (%) Equazione (%) Equazione (%)
P max non corretto M ij = A i + ε ij 3 -678,28 1,94 (14%) 11,86 (86%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -457,95 440,66 *** 4,08 (26%) 10,71 (67%) 1,14 (7%)
P min Non corretto M ij = A i + ε ij 3 -875,03 6,05 (9%) 59,39 (91%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -664,58 420,91 *** 16,67 (22%) 53,08 (70%) 6,31 (8%)
P max corretto M ij = A i + ε ij 3 -445,05 1,15 (22%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -444,88 0,3378 4,08 (78%) 0.01 (<1%) 1,14 (22%)
P min corretto M ij = A i + ε ij 3 -649,9 16,67 (73%) 6,24 (27%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -649,9 0 16,67 (73%) 0 6,31 (27%)

Tabella 1: Modelli lineari a effetto misto dell'effetto di tergite e sessione. Modelli lineari a effetto misto dell'effetto di tergi e sessione su aLa pigmentazione bdominale ( P max e P min ) di 50 tergiti è stata misurata in cinque sessioni, con componenti di varianza stimati tramite REML. I modelli erano modelli lineari a effetto misto. M : Misura della pigmentazione; A : misurata tergita individuale; S : sessione; Ε : errore residuo. Significato X² sono mostrati in grassetto. P <0,05. ** p <0.01. *** p <0,001.

Tratto Temperatura tergite Temperatura
X Tergite
P max F- versa 8.14 55.59 6.6
P 0.002 <0.001
P min F- versa 4.41 66.11 6.36
P 0.026 <0.001 0.002
W band F- versa 113.93 0.01 0.64
P <0.001 0,931 0,531
W tergite F- versa 1.79 0.92 5.11
P 0,191 0,338 0,007
R F- versa 27.66 0,08 1,46
P <0.001 0.782 0.23

Tabella 2: Effetto della temperatura e dell'identità tergita. L'effetto della temperatura e dell'identità di tergita Su diversi aspetti della pigmentazione addominale in 50 tergi re-misurati in cinque sessioni. I modelli erano modelli lineari a effetto misto, con mosca individuale inclusa come fattore casuale. P max : pigmento massimo (corretto); P min : pigmentazione minima (corretto); W band : larghezza della fascia di pigmento; W tergite : larghezza del tergite; R band : larghezza relativa della banda di pigmento. I fattori fissi significativi sono indicati in grassetto ( P < 0,05).

Intercettare W band Temperatura tergite
17c 25 ° C Terzo
P max β 234,35 0.069 0,063 -1,178 -0,588
F 29,93 5.97 54.82
P <0.001 0.008 <0.001
P min β 223,96 -0,137 3.931 -3,024 -1,54
F 19.33 span class = "2"> 9.66 62.02
P <0.001 0.001 <0.001

Tabella 3: Effetto della larghezza di banda del pigmento, della temperatura e dell'identità della tergita a livello di pigmentazione. Effetto della larghezza di banda del pigmento, della temperatura e dell'identità della tergita a livello di pigmentazione in 50 tergi re-misurati in cinque sessioni. I modelli erano modelli lineari a effetto misto, con mosca individuale inclusa come fattore casuale. P max : pigmento massimo (corretto); P min : pigmentazione minima (corretto); W band : larghezza della fascia di pigmento; R band : larghezza relativa della banda di pigmento.

Supplemental File 1. Informazioni aggiuntive.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Fare clic qui per scaricare questo file.

File aggiuntivo 2. Analisi dello script Pigmentation.R. Clicca qui per scaricare questo file.

File aggiuntivo 3. Measurement of Pigmentation.ijm Fare clic qui per scaricare questo file.

Simulazione R Script. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questa metodologia consente l'acquisizione precisa, rapida e ripetibile di dati di pigmentazione in una forma quantitativa adatta a più analisi a valle. Il metodo è stato utilizzato per acquisire dati sull'effetto della temperatura sulla pigmentazione addominale in una linea isogenica di mosche. Tuttavia, la metodologia potrebbe essere utilizzata negli studi di avanzamento genetico per identificare i geni che stanno alla base delle differenze di pigmentazione tra individui, popolazioni o specie o studi reverse-genetici per esplorare gli effetti di geni specifici sui modelli di pigmentazione. Sebbene, come sopra discusso, ci sono stati innumerevoli studi che hanno esplorato lo sviluppo e l'evoluzione della pigmentazione D. melanogaster, la precisione con cui questa metodologia raccoglie i dati di pigmentazione in forma quantitativa permette di approcci statistici più potenti. Ciò a sua volta consente ai ricercatori di utilizzare meno campioni quando analizza i modelli di pigmentazione, o permette loro di chiarire più sottiliAspetti della pigmentazione. Inoltre, questo metodo non richiede la dissezione della mosca, permettendo che il campione venga successivamente utilizzato per ulteriori analisi, come ad esempio misure morfologiche o genotipizzazioni. Infatti, la metodologia potrebbe essere potenzialmente utilizzata su mosche anestetizzate, che potevano essere selettivamente allevati sulla base delle loro caratteristiche di pigmentazione.

Un potenziale problema con la misurazione della pigmentazione attraverso l'analisi delle immagini è che i valori di pigmentazione possono riflettere l'esposizione e le condizioni di illuminazione sotto cui è stata presa un'immagine, piuttosto che il livello della pigmentazione stessa. Utilizzando livelli di illuminazione fissa, posizioni di luce, ingrandimento e esposizione contribuisce a alleviare questi problemi, è probabile che sarà ancora necessario eseguire diverse ripetizioni di controllo in ogni sessione per controllare completamente gli effetti della sessione. Questo metodo include la reimaging di 15 esemplari di controllo ogni sessione e l'utilizzo delle modifiche tra le sessioni in P maX e P min per rilevare ed eliminare gli effetti di sessione. Tuttavia, il numero preciso di esemplari di controllo che dovrebbero essere rielaborati dipenderà dall'hardware e dal software in uso, dall'aspetto della pigmentazione di interesse per l'utente e da quanto variabile tra i trattamenti e quante immagini siano prelevate in ciascuno sessione. L'esecuzione di un esperimento preliminare in cui gli stessi esemplari vengono ripresi in cinque sessioni consentirà all'utente di calcolare la varianza dovuta agli effetti di sessione, alla varianza dovuta all'identità del campione e alla varianza residua (che è una stima dell'errore di misurazione dopo la correzione Per gli effetti di sessione) ( Tabella 1 ). Questi valori possono quindi essere utilizzati per stimare quante immagini di controllo devono essere eseguite in ogni sessione per rilevare e controllare gli effetti della sessione. È stato scritto un semplice script R e utilizza dati da un simile esperimento preliminare per simulare misure di pigmentazione in sessioni. Può essere usatoPer verificare che il numero di immagini di controllo per sessione sia sufficiente per rimuovere gli effetti della sessione. Questo script è fornito come file aggiuntivo.

Se gli utenti sono preoccupati che ci siano fattori di nuocenza all'interno di sessioni, possono anche reimagiare lo stesso esemplare più volte durante la sessione, come descritto in John et al., 2016 41 . In questo caso, [sampleID] per il campione di controllo singolo deve essere modificato ogni volta che viene ripreso in una sessione ( ad esempio, control1, control2, control3, ecc. ); Altrimenti, il software di imaging sostituirà l'immagine precedente con la nuova immagine dello stesso nome. La funzione di correzione basa la sua correzione su immagini duplicate con lo stesso [sampleID] tra sessioni temporaneamente adiacenti e correggerà se lo stesso esemplare viene ripetuto più volte all'interno e tra le sessioni o se vengono ripresi gli stessi esempi di controllo tra le sessioni. Indipendentemente da come thLe immagini di controllo elettronico vengono prese, le sessioni devono essere trattate come blocchi e, laddove possibile, gli utenti dovrebbero impiegare un disegno di blocco casuale in modo che gli effetti di ogni sessione che rimangano dopo la correzione possano essere controllati statisticamente. In caso contrario, i campioni devono essere assegnati in modo casuale alle sessioni in modo che gli effetti di sessione non siano confusi con i fattori sperimentali.

Il protocollo si basa sulla generazione di un profilo di pigmentazione che rappresenta la variazione della pigmentazione in ogni tergita. Un problema con la generazione di questo profilo sono i peli scuri che coprono la cuticola addominale, che sono invariabilmente bisettati da qualsiasi linea anteriore-posteriore che attraversa il tergito. Il protocollo riduce il rumore generato da questi peli prendendo il profilo di pigmentazione in media in una fascia di cuticola. Tuttavia, gli utenti possono impostare la larghezza del ROI a 1 pixel nel punto 5.6 se desiderano generare profili basati su una sottile linea di cuticola. Inoltre, gli utenti possono analizzare tHa la stessa immagine più volte, modificando la posizione laterale del profilo di pigmentazione per catturare le variazioni della larghezza della fascia di pigmento all'interno di un segmento. In questo caso, tuttavia, gli utenti dovrebbero copiare la stessa immagine più volte e dare a ciascuna copia un nome univoco prima di eseguire il passaggio 5.1, poiché la macro ImageJ sovrascriverà i profili dello stesso nome.

Una seconda considerazione importante quando si genera il profilo di pigmentazione è il parametro di lisciatura della spline cubica, definita nella funzione spline.der.er (L63) nello script di analisi di pigmento R. Il parametro di lisciatura appropriato dipende dalla configurazione e dalla risoluzione dell'immagine. L'over-smoothing di un profilo può provocare una perdita delle caratteristiche del profilo di spline utilizzato per calcolare le coordinate di T 1 , T 2 e T 3 ( Figura 2D e 2D '). Al contrario, la sottovalutazione aumenta il valoreIl rumore del profilo e di conseguenza l'accuratezza delle estrazioni di coordinate. La funzione chek produce un riepilogo grafico della spline e dei suoi derivati ​​e può essere utilizzato come indicatore visivo per scegliere un parametro adeguato di livellamento.

La metodologia qui descritta si concentra sulla cattura di dati sulla pigmentazione del terzo e terzo tergi addominale in D. melanogaster femminile e maschile. Tuttavia, i risultati rappresentativi indicano che può essere utilizzato anche per misurare la pigmentazione del quinto e sesto segmento addominale delle femmine. Inoltre, la metodologia può rilevare le differenze di fenotipo causate da mutanti di geni che influenzano la pigmentazione. Gli macro ImageJ e gli script R possono essere facilmente modificati per misurare la pigmentazione negli abdesi di diverse specie di D. melanogaster o persino la pigmentazione di altre parti del corpo in altri taxa, purché il pattern di pigmentazione sia stereotipato. Infine, la metodologiaPotrebbe anche essere adattato per misurare aspetti del colore della pigmentazione catturando immagini in RGB e analizzando separatamente ciascun canale.

In generale, questa metodologia fa parte del campo emergente dei fenomeni 51 , 52 . L'obiettivo del fenomeno è quello di generare e analizzare grandi set di dati fenotipici multidimensionali per comprendere meglio le interazioni genetiche e ambientali che influenzano il fenotipo, compresa la malattia, e come queste interazioni si evolvono per generare la diversità biologica. Perché i fenomeni possano soddisfare il suo potenziale, le metodologie per l'acquisizione di dati fenotipici devono essere semplici e facilmente adattati a diversi fenotipi, nonché liberamente disponibili. Utilizzando software open source per analizzare le immagini acquisite utilizzando apparecchiature standard, questa metodologia aiuta a raggiungere questo obiettivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation per IOS-1256565 e IOS-1557638 a AWS. Ringraziamo Patricia Wittkopp e tre anonimi recensori per i loro commenti utili su una versione precedente di questo articolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

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References

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