Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Sialic acid is een typische monosaccharide-eenheid gevonden in glycoconjugates. Het is betrokken bij een overvloed van moleculaire en cellulaire interacties. Hier presenteren we een methode als u wilt wijzigen van cel oppervlakte sialic zuur expressie metabole glycoengineering met N- acetylmannosamine derivaten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sialic acid (Sia) is een zeer belangrijke constituent van glycoconjugates, zoals N- en O- glycanen of Glycolipiden. Als gevolg van zijn positie op de niet-reducerende termini van oligo - en polysacchariden, alsmede haar unieke chemische kenmerken, is sialic acid betrokken in een veelheid van verschillende receptor-ligand interacties. Door aanpassing van de expressie van sialic zuur op het celoppervlak, zal bijgevolg sialic acid-afhankelijke interacties worden beïnvloed. Dit kan nuttig zijn voor het onderzoeken van sialic zuur-afhankelijke interacties en heeft de potentie om bepaalde ziekten op een positieve manier beïnvloeden. Via metabolische glycoengineering (MGE), kan de uitdrukking van sialic zuur op het celoppervlak worden gedifferentieerd. Hierin, worden cellen, weefsels, of zelfs hele dieren behandeld met C2 gemodificeerde derivaten van N- acetylmannosamine (ManNAc). Deze amino suikers worden fungeren als sialic zuur voorloper moleculen gemetaboliseerd tot de overeenkomstige sialic acid-soorten en uitgedrukt op glycoconjugates. Toepassing van deze methode produceert intrigerende effecten op verschillende biologische processen. Bijvoorbeeld, het kan drastisch verminderen de expressie van polysialic zuur (polySia) in behandelde neuronale cellen en beïnvloedt daarmee neuronale groei en differentiatie. Hier, laten we de chemische synthese van twee van de meest voorkomende C2 gemodificeerde N- acylmannosamine-derivaten, N- propionylmannosamine (ManNProp) en N- butanoylmannosamine (ManNBut), en verder laten zien hoe deze niet-natuurlijke amino suikers kunnen worden toegepast in cel cultuur experimenten. De expressie van gemodificeerde sialic zuur soorten is gekwantificeerd door hoge prestatie vloeibare chromatografie (HPLC) en verder geanalyseerd via massaspectrometrie. De gevolgen voor de polysialic zure expressie zijn toegelicht via westelijke vlek met behulp van een commercieel verkrijgbare polysialic zuur antilichaam.

Introduction

Sialic acid is een monosacharide die meestal op de niet-reducerende termini van glycoconjugates, zoals N- en O- glycanen of Glycolipiden gevonden kan worden. Onder alle monosacchariden heeft sialic zuur enkele unieke chemische kenmerken. Het heeft een 9 C-atoom ruggengraat, een carboxylic groep in de positie van de C-1, die gedeprotoneerde en daardoor negatief geladen onder fysiologische omstandigheden en een amino-functie in de C-5 positie. Hoewel meer dan 50 natuurlijk voorkomende varianten van sialic zuur op datum1 gekenmerkt, is de overheersende vorm van sialic zuur gevonden bij de mens N- acetylneuraminic zuur (Neu5Ac). Andere zoogdieren express ook hogere hoeveelheden N- glycolylneuraminic zuur (Neu5Gc)2,3.

Als gevolg van de blootgestelde positie in glycoconjugates, is sialic acid betrokken bij een overvloed van receptor-ligand interacties, bijvoorbeeld de binding hemagglutinine afhankelijk van het influenza-virus gastheer cellen4. Een epitoop sialic zuur met belangrijke biologische functies, vooral tijdens de embryogenese en in het zenuwstelsel, is polysialic zuur. Polysialic acid is een polymeer van maximaal 200 Alfa 2,8-linked sialic zuren. De grote eiwit drager van polysialic zuur is het neurale cel adhesie molecuul (NCAM). Polysialic zuur expressie moduleert de zelfklevende eigenschap van de NCAM in die polysialic zuur expressie de hechting vermindert en plasticiteit met het zenuwstelsel5verhoogt.

Wijzigingen in de expressie van (poly) sialic zuur zal uiteindelijk invloed op een veelheid van verschillende biologische interacties. Dit kan worden gebruikt om de afhankelijke processen van de bekende sialic zuur op een moleculair niveau, om nieuwe glycoconjugate interacties te ontdekken, of mogelijke therapeutische benaderingen te verkennen te bestuderen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar waaraan de expressie van sialic zuur op het celoppervlak kan worden gedifferentieerd, bijvoorbeeld behandeling met sialic zuur specifieke glycosidases (sialidases), inhibitie van enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van sialic zuur6 ,7,8, neerhalend of wijzigen van de uitdrukking van het sleutelenzym van sialic zuur biosynthese9.

Een ander veelzijdige methode om het moduleren van sialic zuur expressie is MGE (ook bekend als metabole oligosaccharide engineering, MOE). Hierin, worden cellen, weefsels, of zelfs dieren behandeld met niet-natuurlijke derivaten van ManNAc die C2-amino wijzigingen dragen. Als voorloper moleculen voor sialic zuur, na cellulaire opname, deze ManNAc-analogen zijn unidirectionele verloederde aan niet-natuurlijke sialic zuren en kunnen worden uitgedrukt op sialylated glycoconjugates. Cellen behandeld met ManNAc derivaten uitvoering alifatische C2-wijzigingen, zoals ManNProp of ManNBut, nemen N- propionylneuraminic zuur (Neu5Prop) of N- butanoylneuraminic zuur (Neu5But) in hun glycoconjugates-10 , 11. met behulp van functionele groepen ingevoerd om de C2-positie van de ManNAc, de voorkomende niet-natuurlijke sialic zuren kan worden gekoppeld, bijvoorbeeld via de Staudinger-afbinding of de azide basen cycloadditie, met fluorescente kleurstoffen en daarom gevisualiseerd op de cel-oppervlakte12.

De uitdrukking van deze niet-natuurlijke sialic zuren intrigerende gevolgen heeft voor vele biologische processen, met inbegrip van pathogenen infecties, de hechting en de migratie van tumorcellen, algemene cel adhesie, evenals vascularisatie en differentiatie (voor revisie Zie: Wratil et al. 13). interessant, MGE met N-acyl bewerkt mannosamines kan ook worden gebruikt om zich te mengen met de expressie polysialic zuur. Polysialic zuur wordt gegenereerd door twee verschillende polysialyltransferases (ST8SiaII en ST8SiaIV). Is gebleken, dat polysialyltransferase ST8SiaII wordt geremd door onnatuurlijke sialic zuur precursoren, zoals ManNProp of ManNBut14,15. Bovendien is gebleken in menselijke neuroblastoma cellen dat ManNProp of ManNBut toepassing ook sialylation in totaal15 vermindert.

MGE met N-acyl gewijzigd mannosamines is een eenvoudige methode die met succes is uitgevoerd, niet alleen in het zoogdier- en cultuur van de cel van de bacteriën maar ook in hele dieren van verschillende soorten, zoals Caenorhabditis elegans16, toe te passen zebravis17, of muizen18,19,20,21. Vooral ManNAc derivaten alifatische wijzigingen, met inbegrip van ManNProp en ManNBut, rekening houdend met zijn verwaarloosbaar cytotoxisch zijn, zelfs in millimolar concentraties in de cel kweekmedium of bloed plasma. Bovendien, ze zijn relatief makkelijk te synthetiseren.

Hier, we leveren details over het gebruik van MGE met N-acetyl mannosamines bewerkt. Ten eerste, de chemische synthese van twee van de meest gebruikte ManNAc derivaten op dit gebied, ManNProp en ManNBut, wordt uitgelegd. Vervolgens laten we zien hoe MGE kan worden toegepast in een experiment in vivo . Als voorbeeld, de neuroblastoom cellijn Kelly werd gekozen om aan te tonen van verminderde expressie van het polysialic-epitoop door Western blot na behandeling met de ManNAc-derivaten. De niet-natuurlijke sialic zuren op het celoppervlak werden gekwantificeerd door HPLC en verder geanalyseerd via massaspectrometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van Buffers en reagentia

  1. Bereiding van 3 mM natrium methoxide oplossing
    1. Ontbinden 8.1 mg natrium methoxide in 50 mL methanol (3 mM) in een 100 mL glazen fles met een roer-bar. Bewaren bij kamertemperatuur (RT) voor meerdere weken.
  2. Voorbereiding van Tris-HCl buffer
    1. Combineren van 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl en 146 mg EDTA in een 100 mL glazen fles met een roer-bar en los op in 80 mL water.
    2. Natriumhydroxide-oplossing (1 M, in water) of HCl (20%, in water) toevoegen aan het roeren oplossing, met inachtneming van de pH met een pH-meter, en breng de pH op 8.0.
    3. Voeg de hoeveelheid water die nodig zijn om een eindvolume van 100 mL. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 µm steriele filtersysteem.
      Opmerking: 100 mL Tris-HCl buffer bevat 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl en 5 mM EDTA (pH 8.0). De oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor enkele weken.
  3. Bereiding van de oplossing van de aprotinin
    1. Los 10 mg aprotinin in 1 mL water (1,54 mM). Aliquot de oplossing van de aprotinin in 10 x 1,5 mL-kunststof buizen (van elke 100 µL). Bewaren bij-20 ° C gedurende enkele weken.
  4. Bereiding van de oplossing van de leupeptin
    1. Los 10 mg leupeptin in 2 mL water (10 mM). Aliquot de leupeptin oplossing 10 x 1,5 mL-kunststof buizen. Bewaren bij-20 ° C gedurende enkele weken.
  5. Bereiding van phenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF) oplossing
    1. Los 34.8 mg PMSF in 2 mL ethanol (100 mM). Aliquot de oplossing van de PMSF in 10 x 1,5 mL-kunststof buizen. Bewaren bij-20 ° C gedurende enkele weken.
  6. Bereiding van de oplossing van de 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB)
    1. Combineer 15.62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoethanol, en 48 µL natrium bisulfiet-oplossing (39%), en voeg 9,6 mL water (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoethanol en 0,19% natrium bisulfiet). Aliquot de DMB oplossing in 40 x 1,5 mL-kunststof buizen (elke 250 µL). Winkel beschermd tegen licht bij-20 ° C gedurende enkele weken.
  7. Bereiding van 1 M trifluoroacetic acid (TFA) oplossing
    1. Voeg 770.3 µL van 100% TFA 9.23 mL water in een plastic tube van 15 mL (1 M). Bewaren bij 4 ° C voor enkele weken.
  8. Bereiding van 120 mM TFA oplossing
    1. 92,4 µL TFA (100%) aan 9.91 mL water (120 mM) in een plastic tube van 15 mL toevoegen. Bewaren bij 4 ° C voor enkele weken.
  9. Bereiding van 400 mM natriumhydroxide (NaOH)-oplossing
    1. Los 160 mg NaOH in 10 mL water (400 mM) in een plastic tube van 15 mL. Bewaren bij 4 ° C voor enkele weken.
  10. Voorbereiding van westelijke vlek lysis buffer
    1. Los 5,84 g NaCl, 0,1 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2en 1 g Triton-X100 in 100 mL water en breng de pH op 7,8. Bewaren bij 4 ° C. Voeg 100 µL van elke proteaseinhibitor (aprotinin, leupeptin en PMSF) voordat u de lysis-buffermengsel.
  11. Voorbereiding van het natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide-gel elektroforese (SDS-PAGE) buffer
    1. Los van 0,3 g Tris, 1,5 g glycine en 0,1 g SDS in 100 mL water en breng de pH op 7.3. Winkel op RT.
  12. Voorbereiding voor westelijke vlek buffer
    1. Los van 0,3 g Tris, 1.1 g glycine in 90 mL water en voeg 10 mL ethanol. Winkel op RT.
  13. Voorbereiding van het blokkeren van de oplossing
    1. Los 1 g magere gratis melk macht in 25 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Altijd vers bereid.

2. synthese van ManNProp en verwante N-acyl-gewijzigd Mannosamines

  1. Los 431.2 mg mannosamine hydrochloride in 10 mL 3 mM natrium methoxide oplossing in een 50 mL glazen fles met een roer-bar.
  2. Koel het mengsel op het ijs tot 0 ° C. Aan de roeren oplossing, Voeg langzaam ontkleuring 210 µL propionyl chloride (2,4 mmol) of 248 µL butanoyl chloride (2,4 mmol) voor het synthetiseren van ManNProp of ManNBut, respectievelijk. Incubeer het roeren mengsel bij 0 ° C gedurende 4 uur.
  3. Breng de oplossing kwantitatief over in een plastic buis van 50 mL. Poke 4-8 gaatjes in het deksel van de kunststof buis met een dunne naald. Snel de oplossing met behulp van vloeibare stikstof te bevriezen en daarna lyophilize (bevriezing droog) het 48 uur of tot het volledig is opgedroogd.
  4. Meng 350 g silicagel 60 met 750 mL ethyl-acetaat/methanol/water (15:2:1) (dit is een schorsing). Vul een glazen kolom (35 mm diameter en 70 cm lengte) met de silica gel 60 schorsing en was de bereid kolom met een extra 100 mL ethyl-acetaat/methanol/water (15:2:1) voor gebruik.
  5. Los van de gedroogde producten uit stap 2.3 (5 g gedroogde product) in 10 mL ethyl-acetaat/methanol/water (15:2:1) en laden ze met behulp van een pipet op de silica gel kolom. Verzamel 4 mL breuken na 500 mL (voor ManNProp). Opmerking: ManNBut zal Elueer uit de kolom ongeveer na 700 mL.
  6. Breng de eluted breuken in 15 mL plastic buizen. Poke 3-6 gaatjes in het deksel van de kunststof buis met een dunne naald. Snelle bevriezen de oplossing met behulp van vloeibare stikstof en vervolgens het lyophilize totdat het volledig is opgedroogd.
    Opmerking: De gelyofiliseerd producten kunnen worden opgeslagen voor enkele maanden op RT.
  7. Controleer of de zuiverheid van de producten door de Spectrometrie van de massa (zie punt 9).
    Opmerking: U kunt ook zuiverheid kan ook worden gecontroleerd door 1H nucleaire magnetische resonantie (NMR).

3. de celkweek

  1. Cultuur Kelly neuroblastoom cellen in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) opslagmedium met 10% foetale runderserum 100 U penicilline, 100 mg streptomycine, 2 mM L-glutamine bevat 5 mM ManNAc, 5 ManNProp, of 5 mM ManNBut, bij 37 ° C en 5% CO2.
    Opmerking: Cellen gekweekt in medium zonder ManNAc of zijn analogen worden gebruikt als een besturingselement.
  2. Vóór toepassing van de mannosamines, los van de Kelly neuroblastoom cellen door ze aan het broeden voor 10 min met trypsine/EDTA (0,25%, 0,02%, in PBS) en rekenen met behulp van een Neubauer-kamer of cel counter. Zaad de cellen bij gedefinieerde aantallen gebaseerd op de grootte van de plaat/schotel.
    1. Voor het meten van sialic zuur monosacchariden, seed 1 x 105 cellen in 500 µL medium in een 48-well weefselkweek plaat. Zaad voor de analyse van polysialic zuren, 1 x 106 cellen in 3 mL medium op een 6 cm diameter cel cultuur schotel. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Vervang het medium elke 24 h.
      Opmerking: Het effect van MGE toeneemt met de totale tijd van behandeling. Voor hoge metabole efficiëntie door de cellen te behandelen voor 5-7 dagen.
  3. Na de behandeling, decanteren in het medium. De afwas platen/met PBS. Loskoppelen van de cellen door ze aan het broeden voor 10 min met trypsine/EDTA (0,25%, 0,02%, in PBS). Neutraliseer de trypsine door dezelfde hoeveelheid cel kweekmedium aan de vrijstaande cellen toe te voegen. Breng de vrijstaande cellen in 15 mL plastic buizen. De monsters gedurende 3 minuten op 500 x g centrifugeren en verwijder het supernatant.
    1. Voeg toe 5 mL PBS en centrifuge cellen (zie stap 3.3). Herhaal de procedure wassen twee meer tijden.
      Opmerking: De pellet gewassen cel zonder supernatant kan worden achtergelaten bij-20 ° C voor meerdere dagen. Als de expressie van polysialic zuur worden opgehelderd is blijven van hoofdstuk 10.

4. cellysis voor HPLC analyse

  1. Voorbereiding van HPLC lysis buffer
    1. Het combineren van 5 mL Tris-HCl buffer, 5 µL aprotinin oplossing, 20 µL leupeptin oplossing en 50 µL PMSF oplossing.
      Opmerking: 5 mL HPLC Lysis buffer bevat 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinin, 40 µM Leupeptin, en 1 mM PMSF (pH 8.0). Deze buffer dient altijd bereid verse voorafgaand aan cellysis.
  2. Resuspendeer de verzamelde cel pellets (stap 3.3) elk in 500 µL ijskoude HPLC-lysisbuffermengsel, en ultra-Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters met een ultra sonic processor naald driemaal voor een periode van 30 s bij middelhoge amplitudes. Koel de monsters in de ijskast voor minstens 1 min tussen de cycli.

5. scheiding van de membraan-breuk

  1. Centrifugeer het lysed celsteekproeven voor 2 h op 20.000 x g- en 4 ° C. Scheid het supernatant (ongeveer 480 µL), die vertegenwoordigt cytosolische eiwitten bevatten, in 1,5 mL plastic buizen. Bepaal de concentratie van de eiwitten van deze fracties met behulp van, bijvoorbeeld, de Bradford of de bicinchoninic zuur (BCA) bepaling.
    Opmerking: De eiwitconcentratie (ongeveer 1 mg/mL) van de cytosolische breuken kan later worden gerelateerd aan de gemeten hoeveelheden van de gerespecteerde sialic acid-soorten. De pellet vertegenwoordigt de membraan breuk, die is gebruikt in stap 6.1.

6. zure hydrolyse

Opmerking: Oligo- en polysacchariden in de celmembranen zijn gehydrolyseerd tot monosachariden. Verder, mogelijk O-wijzigingen in de monosacchariden zijn gehydrolyseerd, als goed. Dit is nodig voor de kwantitatieve analyse van de HPLC, omdat de overgrote meerderheid van sialic zuren in de membraan breuken zijn vanzelfsprekend in glycoconjugates en kan eventueel het dragen van O-acetyl of O- lactolyl wijzigingen.

  1. Voeg 150 µL 1 M TFA-oplossing voor de gescheiden membraan breuken (pellet uit punt 5). Incubeer de monsters gedurende 4 uur bij 80 ° C met schudden bij 200-600 rpm.
  2. De monsters voor ongeveer 30 min op 20.000 x g en 21 ° C met behulp van 0,5 mL filter buizen met 3 kDa uitsluiting membranen, totdat het volume van de bovenste fase minder dan 20 µL is centrifugeren.
    Opmerking: Deze stap is belangrijk om te beschikken over hogere moleculaire puin.
  3. Overdracht van de lagere fase met kleinere moleculen, met inbegrip van de soorten van sialic zuur, in 2 mL plastic buizen. Poke 2-4 gaten in de doppen van de kunststof buizen met een dunne naald. Snelle bevriezen van de monsters met behulp van vloeibare stikstof en dan lyophilize ze 's nachts.
    Opmerking: De gedroogde monsters kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen op RT. vervangen een GLB zonder gaten voor langere opslag.

7. fluorescerende Labeling

  1. Resuspendeer de gedroogde monsters in 10 µL 120 mM TFA oplossing en voeg 50 µL DMB oplossing. Pipetteer monsters in donkere 1,5 mL buizen om hen te beschermen tegen ultraviolet licht.
  2. Voor normen, los 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, in water) of 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, in water) in 10 µL 120 mM TFA oplossing in donkere 1,5 mL tubes. Voeg 50 µL DMB oplossing.
  3. Incubeer de celmembraan monsters en de normen voor 1,5 h bij 56 ° C beschermd tegen licht. Na incubatie, voeg toe 4 µL 400 mM NaOH oplossing aan elk monster om te stoppen met de labeling reactie.

8. HPLC analyse

Opmerking: Gelabelde monsters worden geanalyseerd op een HPLC-systeem dat is uitgerust met een C18 RP kolom (110 Å, 3 µm deeltjesgrootte, 4.6 x 150 mm), een fluorescentiedetector en een breuk-verzamelaar. De gebruikte extractiemiddelen zijn water, methanol en acetonitril. Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen voorafgaand aan de metingen, ontgas als het HPLC-systeem een interne degasser ontbreekt.

  1. De temperatuur van de kolom ingesteld op 40 ° C en configureer de fluorescentiedetector met 373 nm voor excitatie en 448 nm voor emissie, respectievelijk. Injecteer 10 µL monstervolume en scheid de sondes voor 50 min op 0,5 mL/min debiet met methanol/acetonitril/water (6:8:86) als de elutievloeistof. Verzamelen voor de analyse van de Spectrometrie van de massa, de pieken van belang.
    Opmerking: Neu5Gc naar verwachting eluaat na 6-8 min, Neu5Ac na 9-12 min, Neu5Prop na 17-23 min en Neu5But na 38-44 min. De gefractioneerde monsters kunnen worden opgeslagen voor verschillende h bij 4 ° C beschermd tegen licht.
  2. Na het meten van elk monster, wassen van de kolom voor 7,5 min op 1,0 mL/min debiet (≈ 1,5 kolom volumes) met methanol/acetonitril/water (6:25:69) en opnieuw equilibreer het systeem voor 7,5 min op 1,0 mL/min debiet met methanol/acetonitril/water (6:8:86).
  3. Bereken de oppervlakte onder de kromme van de pieken van de sialic zuur van belang met behulp van de besturingssysteemsoftware van de respectieve HPLC-systeem22voor kwantitatieve analyse.
    Opmerking: Verkregen gegevens kan worden gerelateerd aan de Neu5Ac of de Neu5Gc-standaard en de concentraties van de gemeten eiwit in de cytosolische breuken (zie rubriek 5.1).

9. massaspectrometrie analyse van Sialic zuur monosacchariden

Opmerking: HPLC retention pieken van belang kunnen worden verder geanalyseerd door vloeistofchromatografie (LC) electrospray-ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS), om te verifiëren of de soort onnatuurlijke sialic zuur.

  1. Voor spectrometrische analyse, injecteren 20 µL van verzamelde monster in een LC/Mass Selective Detector (MSD) systeem met 79,9% methanol, 20% isopropylalcohol en 0,1% mierenzuur als eluens, 0,5 mL/min debiet, 4 kV capillaire spanning en capillaire temperatuur 350 ° C 22 , 23.
  2. Selecteer in de evaluatiesoftware van de respectieve LC/MSD-systeem, het hoogtepunt van belang in het chromatogram totale ion. Bekijk de massaspectrum van de opgelost piek. De positieve massa/lading verhouding tussen 300 en 700 weergeven
    Opmerking: DMB etikettering van sialic zuren leidt tot een toename in de moleculaire massa van 116.2 g/mol. De sialic-zuur DMB-geëtiketteerden soorten hebben de volgende moleculaire massa's: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g/molaire Common adducten acetonitril, natrium of isopropyl-alcohol.

10. westelijke vlekkenanalyse Polysialic zuur in Kelly neuroblastoom cellen

  1. Voorbereiding van cel lysates
    1. 1 mL lysis-buffermengsel van westelijke vlek aan de cel pellets toevoegen uit stap 3.3 en vortex. Incubeer gedurende 30 min op ijs. Vortex elke 5 min. Centrifugeer de monsters gedurende 1,5 uur op 20.000 x g- en 4 ° C. Het verzamelen van de bovendrijvende substantie die de eiwitten uit de lysed cellen bevatten.
    2. Bepaal de eiwitconcentratie van de eiwitfracties, bijvoorbeeld, de Bradford of de BCA-bepaling. Verdun de monsters aan een eiwitconcentratie van 1,5 µg/µL in lysis-buffermengsel.
    3. De SDS-pagina de monsters voorbereiden door toevoeging van 10 µL Laemmli monster buffer aan 90 µL eiwitoplossing (1,5 µg/µL) en kook het monster voor 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. 8% SDS-acrylamide gels met 20-30 µL zakken en 0,75 of 1 mm dikte gebruiken. Draaien van de gel op 25 mA voor 2 h op RT.
    2. Verwijder voorzichtig de glasdeel van de gel. Knip uit en gooi het bovenste gedeelte van de gel met de lading zakken. Plaats de gel op een nitrocellulose membraan (0,2 µm), eerder gedrenkt in westelijke vlek buffer. De eiwitten overbrengen in nitrocellulose overeenkomstig de aanbevelingen van het systeem (bijvoorbeeld 250 mA gedurende 1 uur bij 4 ° C).
    3. Verwijder het membraan van het nitrocellulose uit het Bevlekkende systeem. Vlek de vlek met Ponceau rood om aan te visualiseren van de eiwitten. Het membraan van het nitrocellulose overboeken naar een kunststof kamer en voeg 10 mL oplossing blokkeren. Incubeer gedurende 1 h op RT of overnacht bij 4 ° C.
    4. Decanteren in de blokkerende oplossing en voeg monoklonaal anti-polySia 735 antilichaam (1 µg/mL) in PBS. Incubeer het membraan gedurende 1 uur op RT of overnacht bij 4 ° C. Na incubatie, wassen het membraan ten minste driemaal voor 5 min met PBS.
    5. Voeg polyklonale anti-muis IgG secundair antilichaam (1 µg/mL) gekoppeld aan horseradish peroxidase (HRP) of een fluorescerende label in PBS. Incubeer het membraan gedurende 1 uur op RT. Na incubatie, wassen het membraan ten minste driemaal voor 5 min met PBS.
    6. Overdracht van het membraan op een bord van een passende imager. Het signaal volgens de instructies van de fabrikant te detecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC chromatogrammen van de fluorescentie die het label van de Neu5Ac en de Neu5Gc-normen zijn afgebeeld in Figuur 2. Met behulp van de hierin beschreven methode, GC DMB-label Neu5Gc meestal tussen 7-9 min elutie tijd en DMB-Neu5Ac tussen 10-12 min. Diverse kleinere toppen in het chromatogram staan meestal tussen 2-6 min. Deze pieken vertegenwoordigen spoorverontreiniging DMB en reactie tussenproducten25.

Figuur 3 toont representatieve chromatogrammen van cel lysates. In vergelijking met de chromatogrammen van de normen van DMB-label (Figuur 2), in deze chromatogrammen diverse ongedefinieerde toppen zijn zichtbaar. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de interne onreinheid van cel lysates en op het feit dat DMB niet alleen reageert met sialic zuur soorten, maar ook met andere α-keto zuren in cel lysates, met inbegrip van pyruvaat, succinaat en α-ketoglutarate26aanwezig. De aanwezigheid van kleine hoeveelheden sialic zuren, rekening houdend met O-acetyl wijzigingen die hebben niet al gekloofd door azijnzuur hydrolyse kunnen ook worden besproken als een reden voor deze niet-gedefinieerde pieken23. Chromatogrammen uit lysed onbehandelde cellen worden vergeleken met chromatogrammen uit cellen die zijn eerder behandeld met ManNAc of zijn analogen. Zoals hier wordt weergegeven, wordt behandeling met ManNAc vaak leidt tot een bijna volledige uitputting van de Neu5Gc op het celoppervlak. In chromatogrammen lysed cellen behandeld met Neu5Prop of Neu5But, pieken zijn zichtbaar lijken niet in chromatogrammen van onbehandelde cellen. Deze pieken (voor ManNProp behandeld cellen op ongeveer 19 min elutie tijdstip en voor de ManNBut behandelde cellen bij 42 min) geven het uiterlijk van de overeenkomstige niet-natuurlijke sialic zuren, Neu5Prop en Neu5Gc. Zoals beschreven in paragraaf 8.3 van het protocol, kunnen de HPLC chromatogrammen worden geanalyseerd om te kwantificeren van de hoeveelheden van de verschillende sialic-zuur-soorten in de cel lysates.

Het feit dat verschillende HPLC retention pieken komen met bepaalde soorten sialic acid overeen is geverifieerd via de Spectrometrie van de massa. Vertegenwoordiger ESI-MS gegevens uit verzamelde HPLC pieken van belang zijn afgebeeld in Figuur 4: het spectrum van de verzamelde DMB-Neu5Ac behoud piek in het bovenste linker paneel, DMB-Neu5Gc in het bovenste rechter paneel, en de twee soorten van de niet-natuurlijke sialic zuur, DMB-Neu5Prop en DMB-Neu5But in het lagere linker- en panelen. De reactie met DMB leidt tot een toename in de moleculaire massa van 116.2 Da, ten opzichte van de sialic-zuur-soorten die niet zijn gemarkeerd met deze kleurstof. In de massaspectra, bij het weergeven van de verhouding van de positieve massa/lading van de geïnjecteerde monsters tussen 300 en 700, zijn diverse toppen zichtbaar. Dit is gevolg van adductie van de vorming van de gerespecteerde DMB-geëtiketteerden sonde. Naast het geprotoneerd ion [M + H]+, de natrium adducten [M + nb]+ en [M + 2Na-H]+ verschijnen. Aangezien acetonitril (ACN) aanwezig tijdens de LC-analyse is het als een adduct gevonden kan worden in de massaspectra (weergegeven voor DMB-Neu5Gc, Figuur 4: bovenste rechter paneel). Als gevolg van fragmentatie veroorzaakt door collisional decompensation activeringen gegenereerd in de regio electronspray vervoer tussen het capillair en de eerste skimmer, gedehydreerd sialic zuur soorten [M + H]+-H2O kan ook worden waargenomen (zie afbeelding voor DMB-Neu5Ac, Figuur 4: bovenste linker paneel)23,27. In het configuratiemenu LC GC DMB-Neu5Gc kort na de spoorverontreiniging of gedeeltelijk gereageerde DMB-soorten. Daarom kan de verzamelde DMB-Neu5Gc-sonde veroorzaakt door deze reactie tussenproducten onzuiverheden bevatten. Dit dient als een verklaring voor het uiterlijk van ongedefinieerde pieken in de massaspectrum van DMB-Neu5Gc (Figuur 4: bovenste rechter paneel).

Behandeling van Kelly cellen van het neuroblastoom met ManNProp of ManNBut leidt tot verminderde expressie van polysialic zuur op NCAM, zoals blijkt uit de westelijke vlekkenanalyse van de celmembraan van lysed cellen (Figuur 5). Polysialic zuur wordt doorgaans als een uitstrijkje doen om haar heterogeniteit in grootte en last van (≈ 200 kDa). Behandeling met ManNAc-analogen leidt tot een vermindering van polysialic zuur op het oppervlak van cellen: hoe langer de alifatische N-acyl zijketen, hoe sterker de reductie28.

Figure 1
Figuur 1: Het algemene beginsel van MGE met N-acyl bewerkt mannosamines. Na behandeling met de N-acyl bewerkt mannosamines, deze ManNAc-analogen zijn unidirectionally verloederde (intracellulaire metabolisme) naar de overeenkomstige niet-natuurlijke sialic zuren. Deze worden getransporteerd naar het Golgi, overgebracht naar de respectieve oligosaccharide acceptor door sialyltransferases en op het celoppervlak uitgedrukt in sialosides (hier, een glycoproteïne). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: vertegenwoordiger chromatogrammen van DMB-label sialic zuur normen. DMB-label Neu5Ac (bovenste deelvenster) en Neu5Gc (lagere paneel) werden geanalyseerd door HPLC. Retentie tijden (onderbroken lijnen) en piek gebieden van beide zuren sialic werden vastgesteld na het injecteren van 10 ng soorten gerespecteerde DMB-label in het HPLC-systeem. In de hierin aangegeven representatieve chromatogrammen, DMB-Neu5Gc na ongeveer een 8 min retentietijd en DMB-Neu5Ac bij 11 min, respectievelijk geëlueerd. Diverse kleinere toppen in het chromatogram staan meestal tussen 2-6 min, vertegenwoordigen spoorverontreiniging DMB en reactie tussenproducten. Een klein deel van DMB-label Neu5Ac verschijnt als een kleine onzuiverheden in de DMB-Neu5Gc-standaard (lagere paneel). Dit cijfer wordt gewijzigd van referentie22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: karakterisering van membraan-gebonden sialic zuren door DMB-HPLC. Cellen werden gekweekt bij afwezigheid (onbehandeld, bovenste deelvenster) of aanwezigheid met 5 mM ManNAc (tweede paneel van boven), ManNProp (derde bord van boven), of ManNBut (lagere paneel), respectievelijk voor 7 dagen. Het medium was veranderd elke 24 h. cellen zijn geoogst en membraan breuken waren voorbereid, aangeduid met DMB en geanalyseerd door HPLC. Ten opzichte van de chromatogrammen van DMB-label sialic zuur normen (Figuur 2), werden pieken bij de retentietijden tussen 8-9 min DMB-Neu5Gc en pieken tussen 10-11 min als DMB-Neu5Ac genoemd. Ten opzichte van de pieken verkregen injecteren van DMB-label sialic zuur normen, Toon chromatogrammen van cel lysates extra, niet-gedefinieerde pieken. Dit is te wijten aan de interne onreinheid van de sondes, evenals het feit dat DMB kan reageren, niet alleen met sialic zuur in de cel lysates aanwezig, maar ook met andere α-keto zuren in cel lysates, met inbegrip van pyruvaat, succinaat en α-ketoglutarate aanwezig. Bergtoppen die alleen in de chromatogrammen van monsters van cellen gekweekt in aanwezigheid van N weergegeven-acyl bewerkt mannosamine-analogen geven de overeenkomstige DMB-label niet-natuurlijke sialic zuren. Dit cijfer wordt gewijzigd van referentie22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: massa van spectra van DMB-label sialic zuur soorten gevonden in cel lysates. HPLC retention pieken van belang (Zie Figuur 3) werden verzameld en vervolgens geanalyseerd door ESI-MS. 20 µL van het verzamelde ingehouden pieken waren geïnjecteerd in de LC-MSD-systeem. Reactie met DMB leidt tot een toename van de moleculaire massa van 116.2 Da, ten opzichte van de overeenkomstige soorten spoorverontreiniging sialic zuur. De positieve massa/lading verhouding spectrogrammen verkregen van verschillende sialic zuur soorten worden afgebeeld (DMB-Neu5Ac: bovenste linker paneel, DMB-Neu5Gc: bovenste rechter paneel, DMB-Neu5Prop: lagere linker paneel, DMB-Neu5But: lagere rechter paneel). Verschuldigde zijn adduct vorming diverse toppen zichtbaar. Naast het geprotoneerd ion [M + H]+, natrium adducten [M + nb]+ en [M + 2Na-H]+ verschijnen. Acetonitril, die tijdens de analyse van de LC aanwezig is, kan ook worden gevonden als een adduct (bovenste rechter paneel). Gedehydrateerde DMB-Neu5Ac, die wordt gegenereerd door fragmentatie in het instrument [M + H]+-H2O kan worden waargenomen (bovenste linker paneel). De verzamelde DMB-Neu5Gc-sonde kan bevatten verontreinigingen veroorzaakt door spoorverontreiniging DMB, evenals reactie tussenproducten gezien als extra ongedefinieerde pieken (bovenste rechter paneel). ACN, acetonitril; H, waterstof; NB, natrium. Dit cijfer wordt gewijzigd van referentie22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: analyse van de polysialylation van NCAM. Kelly neuroblastoom cellen werden gekweekt in de afwezigheid of aanwezigheid van 5 mM ManNAc, ManNProp of ManNBut voor 7 dagen. Cellen zijn geoogst en eiwitten werden gescheiden op 8% SDS-acrylamide gels en geanalyseerd door westelijke vlek met behulp van monoklonaal anti-polySia antistof 735. Merk op dat polySia wordt weergegeven als een uitstrijkje als gevolg van de heterogeniteit in aantal Sia, wat resulteert in verschillende maten en beschuldiging van polySia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Als het chemisch gesynthetiseerde derivaten van ManNAc, ManNProp en ManNBut worden geanalyseerd via massaspectrometrie, moet alleen de juiste massa piek voor beide specimens worden geïdentificeerd. Daarom kunnen de producten worden geacht te hebben een zuiverheid van meer dan 99%. Kleine hoeveelheden van Neu5Gc, die normaal gesproken niet wordt gevonden in menselijke cellen29, zijn in de fracties van de membraan van de lysed cellen aangetroffen. Dit gebeurt meest waarschijnlijk door een bergings-traject dat Neu5Gc van foetale runderserum sialoglycoconjugates in de media30 werft. Behandeling met de natuurlijke voorloper van sialic zuur biosynthese, ManNAc, verlaagt drastisch de uitdrukking van de Neu5Gc-epitoop op het celoppervlak.

Toepassing van de gewijzigde mannosamines is verwaarloosbaar giftig voor alle cellen die tot nu toe onderzocht. Cellen aanvaarden meer millimolar suiker concentraties binnen het medium, die noodzakelijk is, aangezien er geen specifieke vervoerders voor N- acylmannosamines. Het is aangetoond dat signaaltransductie trajecten zijn geactiveerd voor de aanvraag van N- acylmannosamines, die invloed kunnen hebben op cel groei of differentiatie31,-32. Dit is te wijten aan een gewijzigde sialylation patroon of weerspiegelt directe effecten op de gewijzigde sialylation is tot nu toe niet bekend. Groei van cellen in aanwezigheid van de C2-gewijzigd ManNAc-analogen, ManNProp of ManNBut resultaten in de expressie van niet-natuurlijke sialic zuur soorten uitvoering van de overeenkomstige N-acylsubstitutie. De metabole efficiëntie van de twee getest N-acyl bewerkt mannosamines varieert. Behandeling met ManNProp leidt meestal tot uitdrukking van de overeenkomstige Neu5Prop op het celoppervlak en een verminderde expressie van zowel de Neu5Ac als de Neu5Gc. Andere N-acyl bewerkt mannosamine-analogen, zoals N- cyclopropylcarbamyl mannosamine, de neiging om een nog hogere metabole efficiëntie22.

Eerdere studies is gebleken dat sialic precursoren met polysialylation interfereren. Polysialic zuren worden bijna uitsluitend uitgedrukt op de NCAM. Interessant is dat kan NCAM worden polysialylated door twee verschillende polysialyltransferases uitgedrukt in het Golgi (ST8SiaII en ST8SiaIV). Het bleek dat ManNProp, ManNBut en andere N-acyl-gemodificeerde mannosamines mengen met polysialylation en dat dit is voornamelijk te wijten aan interactie met ST8SiaII14. Deze sialyltransferase wordt uitgedrukt tijdens de ontwikkeling en is belangrijk voor de ontwikkeling van de hersenen. Interessant ook, veel tumoren van neuronale oorsprong opnieuw express ST8SiaII verhogen hun maligniteit en waardoor ze verder kan niet worden getraceerd vanaf het immuunsysteem33. In tegenstelling, leidt de toepassing van ManNAc tot een toename van polySia, omdat het leidt tot een toename van CMP-Neu5Ac, dat is de natuurlijke substraat van beide polysialyltransferases.

MGE is een unieke methode te voeren roman sialic zuren op proteïnen van belang (bijvoorbeeld Erytropoëtine) en te moduleren daardoor haar functie. Bovendien kan het worden gebruikt te moduleren cel oppervlakte glycosylatie, die mogelijk belangstelling voor vele ziekten, zoals kanker, aangezien veel kankercellen proberen te ontsnappen van het immuunsysteem door het uiten van hoge niveaus van sialic zuur. De methode die hier gepresenteerd kunt: eerst, uitvoeren van glycoengineering met behulp van celculturen, en ten tweede, om te analyseren ontworpen glycanen te bewijzen van succesvolle glycoengineering. De methode is zeer robuust en tot nu toe geen valkuilen worden gemeld; in tegenstelling, heeft de methode uitgebreid chemische actieve groepen standaardinteracties Klik-chemie op cellen13introduceren.

Hier presenteren we twee ManNAc-analogen met alifatische N-acyl kant keten wijzigingen die zijn relatief eenvoudig te synthetiseren, zelfs door laboratoria met minder apparatuur en minder ervaring in de chemische synthese. Groepen die meer vertrouwd zijn met organische chemie kunnen synthetiseren van andere ManNAc-analogen met meer complexe structuren en gebruiken deze voor MGE, met inbegrip van de zogenaamde 'bioorthogonal'-analogen, die kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld om te visualiseren van sialylated glycoconjugates. Er zijn test artikelen waarin een overzicht wordt gegeven van de N-acetyl-mannosamine-derivaten die tot op heden13,34hebben al gesynthetiseerd. N- azidoacetyl mannosamine (ManNAz), een stof die vaak wordt gebruikt, te visualiseren sialylated glycanen, is commercieel beschikbaar. Vanwege de lage membraan permeabiliteit van ManNAc-analogen, kan het nuttig zijn derivaten van deze suikers met beveiligde hydroxyl-groepen, bijvoorbeeld peracetylated-ManNAc-analogen. Na het invoeren van het cytoplasma, de bescherming van groepen zijn gekloofd door cytoplasmatische esterasen, waardoor het vrijgeven van de actieve monosacchariden35,36,,37. Peracetylated ManNAc-analogen bloot echter hogere cytotoxiciteit ten opzichte van de overeenkomstige onbeschermde derivaten.

In dit manuscript kozen wij vereeuwigd neuroblastoom cellen voor onze experimenten met MGE. In het algemeen kan MGE (vooral met ManNProp en ManNBut) worden toegepast in een breed scala van cellijnen, met inbegrip van vereeuwigd cellijnen (Zie Wratil et al. 13 voor voorbeelden) en primaire cellen38,39. Bovendien werd MGE met succes gebruikt om te wijzigen sialylation in vivo in C. elegans40, zebravis17,41,20,42van de19,van de muis en rat 43 , 44. de behandeltijd en de concentratie van de ManNAc-analogen in MGE experimenten om de metabole efficiëntie van deze methode kunnen worden gevarieerd. Uit onze ervaring corresponderen langere behandeling en hogere concentraties met betere vervanging van de natuurlijk voorkomende soorten van sialic zuur in glycoconjugates door gewijzigde Neu5R. Wanneer zeer hoge concentraties van ManNAc derivaten worden gebruikt moeten, dienen de cytotoxiciteit van de behandeling worden beoordeeld, bijvoorbeeld door de MTT-bepaling of de bepaling van de vermindering van de resazurin.

In dit manuscript raden we u ultra-ultrasoonapparaat voor homogenisering van de cel. Andere cellysis methodes werden getest in ons laboratorium, met inbegrip van de douncing op het ijs (ongeveer 250 strokes) en Franse pers verstoring (10.000 psi, 4 gangen), met vergelijkbare resultaten met betrekking tot de hoeveelheid sialic zuur gedetecteerd in de monsters. Het voordeel van ultra geluid homogenisering is dat het weinig tijd nodig en niet de toevoeging van DNAase aan de monsters voorafgaand aan cellysis vereist.

We onze analyse gericht op het membraan breuken van cel lysates, omdat wij wilden laten zien veranderingen in de sialylation van membraan gebonden glycoconjugates. Sialic zuur derivaten en de concentraties ervan kunnen ook worden gemeten in het cytosol van cellen, nadat de membraan breuk heeft zijn gescheiden door middel van centrifugeren high-speed, gebruikend de zelfde methode zoals hierboven beschreven. De concentraties van sialic zuur in het cytosol zijn echter maximaal 100 x lager in vergelijking met sialic zuur expressie op de celmembraan7. Grotere hoeveelheden cellen zijn dus nodig om betrouwbare resultaten te genereren. Het zwembad van cytosolische, geactiveerd CMP-sialic zuur kan niet indirect worden gemeten door de behandeling vooraf de cytosolische breuken van cel lysates met natriumboorhydride vóór hydrolyse7,45. Om te hydrolyseren sialic zuur in glycoconjugates en sialic zuur met hydroxyl wijzigingen, werden de cellen geïncubeerd met 1 M TFA. Andere zure oplossingen kunnen worden gebruikt voor hydrolyse, evenals, bijvoorbeeld, propionzuur 2 M, 2 M azijnzuur of 1 M HCl.

Een mogelijke aangetroffen kwestie tijdens de HPLC analyse is dat de pieken van belang met niet-gedefinieerde pieken elkaar overlappen. Dit is met name problematisch wanneer de hoeveelheid sialic zuur in een monster wordt berekend door het oppervlak onder de kromme van een bepaalde piek. Als u wilt scheiden een piek van belang van een niet-gedefinieerde piek, de acetonitril-concentratie in de HPLC-oplosmiddel kan worden aangepast (± 3%). We raden gestage oplosmiddel concentraties gebruiken voor HPLC analyse, geven het voordeel van de voorbereiding van het oplosmiddel mengsel vóór chromatografie. Daarom onze methode vereist slechts één HPLC pomp en is haalbaar voor een brede waaier van verschillende HPLC systemen. Als meer dan één pomp beschikbaar in het HPLC-systeem is, een isocratic verloop met toenemende concentraties van acetonitril kan worden toegepast, bijvoorbeeld 4-9% in 35 min45. Met behulp van deze techniek, zal de retentietijd van bepaalde HPLC pieken aanzienlijk worden gewijzigd. Deze strategie kan ook bijdragen tot betere scheiding van overlappende pieken. Laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS) met succes werd opgericht om te controleren of de expressie van bewerkt sialic zuur soorten op de cel oppervlakte45, en dus dient als equivalent van de ESI-MS methode hier gepresenteerd .

Als gevolg van de hydrophilicity van ManNAc-analogen en het gebrek aan specifieke vervoerders voor de opname van deze derivaten46, zijn hoge concentraties in MGE experimenten met deze verbindingen nodig. Up-scaled experimenten en, met name bij de in vivo proeven zijn grote hoeveelheden van het respectieve ManNAc-analogen dus noodzakelijk tonen een mogelijke beperking van deze techniek. Aan de andere kant, afhankelijk van de gebruikte cellijnen, is een bepaalde minimum aantal behandelde cellen nodig om betrouwbare resultaten in de HPLC analyse te verkrijgen. Uit onze ervaring is een minimum van ongeveer 100.000 Adherente cellen of cellen die 150.000 schorsing (1-2 wells van een 96-wells-plaat met confluente cellen) voldoende. Dit kan een knelpunt, worden als de analyse worden ingekrompen moet, bijvoorbeeld bij bevolkingsonderzoek benaderingen.

Met de methoden in dit manuscript gepresenteerd, kunnen sialic acid en derivaten daarvan worden opgespoord in cel lysates. Echter kunnen niet de structuur en de samenstelling van de glycoconjugates in cellen die zijn behandeld met ManNAc derivaten worden beoordeeld met de hierin beschreven techniek. Oplossen van de structuur van glycoconjugates, e.g.,N- en O- glycanen, in het algemeen vereist grotere ervaring en een glycomics faciliteit47. Om onze kennis, tot nu toe geen gegevens zijn beschikbaar over de verschillende structuur van glycoconjugates uit cellen die zijn behandeld met ManNAc-analogen.

Westelijke vlekkenanalyse van polysialic zuur is een zeer snelle en gemakkelijke methode. Volgens deze methode verkregen gegevens zijn echter niet kwantitatieve, aangezien de detectie antilichamen en Chemoluminescentie gebruikt. Het gebruik van HPLC methoden is daarom een voordeel ten opzichte van westelijke bevlekken. Niettemin, is het raadzaam methode immunoblotting, want het is gemakkelijk toe te passen en bekend te werken zeer betrouwbaar.

De expressie van sialic zuur op het celoppervlak kan ook worden gewijzigd volgens andere methoden dan MGE. Zoals hierboven beschreven, kunnen de cellen worden behandeld met sialidase, een enzym dat cleaves sialic zuur residuen van glycoconjugates in een relatief aspecifieke wijze. Sialidase behandeling induceert daarom hyposialylation in de behandelde cellen. Sialidase behandeling is echter een vrij beperkt techniek, want het is niet van toepassing in de in vivo experimenten, cytotoxische en niet haalbaar voor lange tijd behandeling. Een andere techniek voor het opwekken van hyposialylation in cellen is met behulp van remmers van sialic zuur biosynthese. Is er een verscheidenheid van remmers beschikbaar dat hetzij het sleutelenzym van sialic zuur biosynthese, de UDP -N- acetylglucosamine-2-epimerase richten /N- acetylmannosamine-kinase (GNE/Microsoft Natural Keyboard), of de groep van sialyltransferases6, 7,8,48. Een van deze verbindingen, een C3-gefluoreerde sialic zuur, analoog, bleek te verlagen van de expressie van sialic zuur in levende muizen49. Dieren behandeld met deze stof echter toonde lever bijzondere waardevermindering, onomkeerbare nierfunctie en mislukking te gedijen49. Deze resultaten bevestigen de cruciale rol van Neu5Ac in de leverfunctie en nierfunctie en verder de grenzen van sialylation remmers voor in vivo experimenten aangeven. Een derde methode voor het genereren van cellen met gewijzigde cel oppervlakte sialylation is door te interfereren met de uitdrukking van enzymen die cruciaal voor de biosynthese van de sialic zuur zijn. Een knock-down van de GNE/Microsoft Natural Keyboard in vereeuwigd cellen, bijvoorbeeld, werd aangetoond dat het renderen van deze cellen hyposialylated 9. De mogelijkheid om relatief gemakkelijk knock-in en - out genen in mobiele en in vivo met behulp van de roman en goed herkend CRISPR-Cas9-techniek zou kunnen leiden tot nieuwe ontdekkingen met betrekking tot sialic zuur biosynthese en cel oppervlaktewater sialylation.

Het voordeel van MGE vergeleken met de hier beschreven technieken is dat het is gemakkelijk toe te passen en aanpasbaar aan een groot aantal verschillende experimenten, uit in vitro onderzoeken naar cel gebaseerde testen en in vivo experimenten. Een alternatieve methode tot het meten van de expressie en de concentraties in celsteekproeven soorten verschillende sialic acid is door krachtige anion-uitwisseling chromatografie (HPAEC) met gepulseerd elektrochemische detectie50. Met behulp van die deze methode, de uitdrukking van sialic zuur wordt rechtstreeks gemeten en niet na labelen met een fluorescente kleurstof. Het voordeel van deze methode is dat het ook kan worden gebruikt voor het analyseren van monosacchariden dan sialic zuur en derivaten daarvan in de cel - en eiwit-samples. Helaas is de gevoeligheid van HPAEC lager in vergelijking met fluorimetrische detectie van DMB-sialic zuur. HPAEC is dus beperkt tot experimenten met de beschikbaarheid van grote steekproef bedragen51.

De hierin beschreven methoden kunnen worden gebruikt om te onthullen van onbekende kenmerken van glycoconjugates. Een veelheid van voorbeelden voor het gebruik van MGE te onderzoeken sialic zuur afhankelijke interacties al bestaat13, de haalbaarheid van deze techniek in de context van een breed scala van experimentele opstellingen tonen.

MGE met N- acetylmannosamines wordt tegenwoordig voornamelijk gebruikt door onderzoekers op het gebied van glycobiology. Wij hopen dat deze techniek zal worden herkend door een breder publiek als een veelzijdig instrument te wijzigen van glycoconjugates. Andere gebieden, met inbegrip van de immunologie, virologie, neurologie of oncologie baat zal hebben bij deze techniek aan te passen voor hun eigen doeleinden. Deze cross-over onderzoek mogelijk inschakelen van de ontdekking van nog niet in kaart gebrachte gebieden, en daarom geven een beter inzicht in gezondheid en ziekte. In de vroege studies, bijvoorbeeld, werd deze techniek gebruikt voor de productie van glycoproteïnen met gemodificeerde glycosylatie, die later voor in vivo vaccinatie dienen. In bepaalde gevallen, behandeling met dergelijke vaccins glycoengineered leiden tot de productie van antilichamen die blootgesteld geavanceerde avidity en toxiciteit voor de respectieve doelstellingen52,-53. Anderen met succes gebruikt MGE te ontwikkelen van een model voor gerichte tumor therapie in muizen54. Een andere studie toonde aan dat de systemische in vivo injectie van ManNProp zenuw regeneratie55bevorderd. In het geval van polySia, werd aangetoond dat het afnemen van de uitdrukking van deze epitoop in cellen van het neuroblastoom door de methoden gepresenteerd in dit manuscript, verhoogt de gevoeligheid van deze tumorcellen aan straling of behandeling met geneesmiddelen tegen kanker56.

De bedragen van sialic zuur gemeten binnen monsters kunnen verschillen afhankelijk van de gebruikte methode voor het loskoppelen van de behandelde cellen. In dit manuscript, werd incubatie met trypsine gebruikt om cellen los te maken. Als andere technieken worden gebruikt moeten, zoals het schrapen van de cellen of lange tijd behandeling met PBS + EDTA, kunnen de bedragen van sialic zuur gemeten in de voorbeelden verschillen. Zelfs de incubatietijd met trypsine aanpassing kan een invloed hebben op de sialic zuur concentraties gemeten later. Uit onze ervaring, zou de impact van de cel detachement methode op de bedragen van sialic zuur gemeten is minder dan 15%, maar als resultaten moeten worden genormaliseerd en vergeleken, dit een belangrijk knelpunt. Bovendien, de methode voor lysis van de cellen kan invloed hebben op de uitkomsten van de analyse van HPLC. Dus, is het raadzaam de lezer om te standaardiseren van mobiele-detachement en lysis in hun experimenten.

Om te bereiken scheiding van de breuk van de membraan in cel lysates, we gebruikten centrifugeren voor 2 h bij 20.000 x g- en 4 ° C (hoofdstuk 5.1). Andere protocollen centrifugeren invloed kunnen zijn op de scheiding en dus de hoeveelheid sialic zuur gedetecteerd in de monsters. Een kritieke verbinding binnen dit protocol is DMB, want het is zeer gevoelig voor licht en na verloop van tijd degradeert. Hier wordt afgeraden om aliquoot kleine porties van de DMB-oplossing en winkel als voorraden bij - 20 ° C, beschermd tegen licht (punt 1.6.1). Op deze manier de DMB-oplossing kan worden opgeslagen voor enkele weken. Als de resultaten van DMB-HPLC analyse signalen voor sialic zuur soorten verminderen of het verhogen van signalen binnen de eerste 6 min van de HPLC-meting blijkt, vertegenwoordigen DMB en haar reactieproducten, nieuwe DMB-oplossing moet worden bereid. Doe niet opnieuw bevriezen en hergebruik DMB-oplossing na het ontdooien het. Na DMB labelen, moeten onmiddellijk alle monsters worden geanalyseerd. Als grotere aantallen (> 10) monsters worden geanalyseerd, moeten deze monsters worden onderverdeeld in kleinere badges en geleidelijk voorzien van DMB. Zowel de labeling reactie tijden evenals de sondes DMB-label moeten worden beschermd tegen licht op alle. Na elutie, moeten de soorten DMB-label sialic zuur onmiddellijk worden geanalyseerd door ESI-MS. directe koppeling van de HPLC met het systeem van de ESI-MS (in een LC-ESI-MS-setup) is niet nodig, maar kan nuttig zijn om een hogere kwaliteit van de Spectrometrie van de massa analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken L. D. Nguyen voor proeflezen van het manuscript en voor de vruchtbare discussies. Bovendien, we danken J. Dernedde en H. G. Nguyen voor uw hulp bij het voorbereiden van de video-shoot. De meeste scènes van de video werden doodgeschoten in de laboratoria van R. Tauber. Wij danken ook het Max-Planck-Instituut voor de Kolloïden en grensvlakken en voor ons gratis toegang te geven tot hun massaspectrometrie faciliteit. RH werd gesteund door de DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics